Mixing molecular system for the reverse progressive treatment of viral infection

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウィルス感染に対する回復化学療法に使用する活性物質及びその応用に関する。

ウィルス病との戦いの問題は未だ完全に解決されていない。

未解決な問題点の一つは、坑ウィルス剤の効果あるいは体自身の坑体を完全に又は部分的に阻害する比較的早いウィルスの変異である。

多ウィルス感染の最も多様なタイプに対して対抗してゆく一つの方法は、有効成分の一つが効能を有する有効成分のカクテルを用いることである。 この原則はサンド社によってガンマグロブリン製品、サンドグロブリンとして実用化されてきた。 これはヨーロッパ中部で見いだされた病気に対する抗体の大部分を保持する2000人以上のヨーロッパ中部のドナーの血液から得た抗体の混合物である。 この製品は従って、多数の異なるタイプの抗体から成るゆえに最も多様な感染に対して効果的である。

ウィルス感染撲滅の従来の試みは、ウィルス複製のプロセスの異なる部分に対する作用に関するものであった。 例えば核酸鎖を破壊して逆転写を阻害するアジドチミジン（AZT）型の薬物がある。 不幸にして、これらの薬物は患者に対してかなりの副作用を起こす。

植物ヘミセルロースからの負電荷の硫酸デキストラン（凡そ10KDAのサッカリドと硫黄の化合物）に関する国際的研究は、このグループの物質がHIV患者の実用的処置の向上を示さないことを明らかにした。

硫酸デキストランによる経口薬物処理は、デキストランの血流ルート及びウィルスと接触する場所での濃度が余り有効でない為問題がある。 また非常に深刻な副作用（ニューロペニア、下痢）を持っている。 臨床的にも、
印象的な効果は発揮されないだろう。

gp120ウィルスに堅く結合し、飽和することによってそれを中和し不活性化する、分離のCD4レセプタータンパクを生産するため、遺伝子工学を用いることが試みられている。 しかし、この人工のCD4を治療剤として用いるためには、多量の人工タンパクを接種することが必要であろう。 正常細胞膜の外側に普通に見られる細胞感覚器の人工的過剰量は、免疫的及び他の反応が無視できない生物に対する多相な刺激源を示す。 可溶性CD4はまたM
HC−IIグリコタンパクと結合しその正常な機能を減じるであろう。 これはたとえばAIDS患者の免疫欠如の程度をさらに増大させる。 さらに、可溶性CD4は高薬量で繰り返し投薬されなければならない（Spektrumder Wissensc
haft Dec.88,p.116）。

この問題に関して提案されている一つの解決策は、gp
120によってなお認識される形態で構造が存在しているC
D4タンパクフラグメントの少片を作ることである。 もしこれが成功したら、このタンパクフラグメントが生体内で免疫的対抗制御及び非常に抵抗力のないAIDS患者に現在未知の異常を引き起こさないかどうかが問題となろう。

1990年M.ランジ（USA,Arztilche Praxis 15,p.28ff.,
Werk−Verlag,D−8032 Grafelfingも参照）は、AIDSおよびARC患者についてノーリターン点への経路が決してウィルスの増殖の問題ではないことを明らかにした。 おそらく、HIVは抗原として作用し、動作中の拡大傾向にある免疫学的病理機構を開始する。 自己免疫疾患類似症は（例えばlupus erythematosus）抗HIV薬物療法の投与だけでは十分でないことを示す。

むしろ治療における自己免疫的独立（永久化）の発達のための規定を含めることが必要不可欠であり、それゆえ抗進行性化学療法の新型を企画し開発する必要がある。

ランジによれば、HIV感染の環境下において、末端の補足的な活性化が生じ、アナフィラキシー因子C5aは腫瘍壊死因子及びインターロイキン１の生産を誘導する。
HIVはこのカスケードの段階的拡大を起こすことができる。 これは数グループの研究者によって証明されている。 この知見に従って、有望な抗HIV化学療法はHIV阻害だけに限定すべきではない。 むしろ、この種の自己免疫性の悪循環機構を少なくとも部分的に妨害もするものでなければならない。

個々の段階的に拡大する多様な有害種（HIV、日和見感染源、自己免疫カスケード等）の相互作用が真の治療的化学療法が可能となる前に、良く理解されるべきである。 この方法でのみ新しい治療方法が開発されるのである。

現在の治療の統計的成功率（例えば、感染後の平均期待寿命13−18箇月、５年後生存率3.4％（サンフラシスコ1981−87,患者4000人、J.Amer.Med.Assoc.263（199
0）,402にて公表）、は純粋に化学療法剤指向する現状の方法は十分でないことを示している。

発明者、WJマッハは、ウィティッチ及びスツルファウスとともに1961年、既に、マッハによって示されたネオーペニクロミン型天然色素の小量（全量）が、人間において内原性制御物質として働き、及び副腎の活性を高めることを示した。

これは、おそらくキノイド単位とともに酸化還元色素が、人間の抗進行性機構を刺激でき、それ自体、タンパクでもホルモンでもなく、非特異的刺激効果によって行なわれるものでもない最初の例示である。

それゆえ、従来のHIV化学療法は、ノーリターン点への発達を抑制する抗進行性要素をも、（免疫学的展望から）備えなければならない。

したがって、本発明の目的は、非経口的に投与でき、
細胞毒性なしに、及び処置を受けた患者に免疫反応を起こさずにウイルスを中和できる活性物質を見いだすことである。

本発明の他の目的は、変成／変異ウイルス型に対して活性は活性物質を見いだすことである。

本発明はウイルス病に対する回復化学療法に使用する活性物質によってこれらの問題を解決するものである。
本活性物質は以下のように得られる。

Ｉ）先ず、木材、リグニン含有材料および植物培養細胞の少なくとも１種を原料として、弱酸性又はアルカリ性の水性媒体中で抽出を行い、抽出液から不溶性固形物を分離除去することにより、第１の多糖体含有リグニン抽出物を得る。

II）他方、木材を炭化して得られる炭化生成物およびリグニン含有材料を炭化して得られるリグニン含有材料炭化生成物の少なくとも一方を原料として、pH7〜14でのアルカリ抽出を行い、抽出液からアルカリ不溶性固形物を分離除去することにより、第２の多糖体含有リグニン抽出物を得る。

III）前記ステップＩにて得た第１の多糖体含有リグニン抽出物と、前記ステップIIにて得た第２の多糖体含有リグニン抽出物とを、pH9〜12のアルカリ性の水性媒体中に入れて、混ぜ合わせた状態に保持し、 この保持により始まり進行する、それら第１の多糖体含有リグニン抽出物と第２の多糖体含有リグニン抽出物との化学反応により、それら第１の多糖体含有リグニン抽出物および第２の多糖体含有リグニン抽出物とは異なる構造の反応生成物を得て、 その反応生成物について、分画分子量が15〜40kDaの限外ろ過を行い、残渣を捨てる一方、ろ液を陽イオン交換材で処理してpH3〜7.0に調製し、この酸性溶液から、
水溶性の、ウィルス感染に対する回復化学療法に使用する活性物質を得る。

好ましくは、前記ステップＩにて、前記水性媒体中での抽出後、抽出液を中性または弱酸性にし、不溶性固形物を分離除去し、さらに分画分子量が100kDa以下の分子ろ過を行って残渣を捨てることにより、 前記第１の多糖体含有リグニン抽出物の分子量が100k
Da以下とする。 これにより得られた溶液はステップIII
で処理する。

本発明の望ましい形態に於て、前記ステップIIにて、
前記アルカリ抽出および前記抽出液からのアルカリ不溶性固形物の分離除去後、PH値８以上でのアルカリフラグメンテーションを起こさせ、分画分子量15〜35kDaの限外ろ過による分子分離を行なうことにより、 前記第２の多糖体含有リグニン抽出物の分子量が40kD
a以下とされる。 これにより得た生成物はステップIIIで処理する。

前記ステップＩで得た前記第１の多糖体含有リグニン抽出物中の多糖体を、ステップIIで得た前記第２の多糖体含有リグニン抽出物中の多糖体と反応させ、反応生成物から固形物を分離し、残渣を更に処理するのが有利である。

前記ステップIIIにて、前記酸性溶液について、粒子ろ過手段による発熱物質の除去を行い、次いで殺菌を行い、しかる後の酸性溶液から活性物質を得るのは好ましい。

前記ステップＩの前記抽出で使用する前記原料は、以下のグループから、選択するのが有利である。

A1;未処理の木材（例えば、粉末形状の心材、軟材、硬材、草木類組成、好ましくは最初の産物、エスパルトなどの草等）、 A2;植物細胞培養により生物工学的に製造された木質組成物、 A3;モノおよび／またはジリグノールからの脱水ポリマーの製法（本発明にいうこの脱水ポリマーの製法は、フロイデンベルクの論文（フロイデベルクＫ、ハルキンJ.
M.、炭水化物におけるリグニンの結合モデル、2814−28
19頁、chem、Ber.93、1960年）に示される製法のことを意味する）、およびその脱水ポリマーの多糖体へのグラフト重合により得られる合成リグニン含有材料、 A4;亜塩素木成セルロースからアルカリ抽出により得た、リグニン−多糖体複合体、 及びこれらの混合物（A1,A2,A3,A4） また、好ましくは前記ステップIIの前記抽出で使用される前記原料は、以下から成るグループから選択する。

B1;リグニン含有材料を自然分解して得た炭化生成物、 B2;木材を、木材腐朽菌の様なリグノールを利用出来る微生物により生分解して得た炭化生成物。

B3;木材を、単離したリグノール分解酵素の効果により生分解して得た炭化生成物。

およびこれらの混合物（B1,B2,B3）、 もし、前記アルカリ性の水性媒体は、KOH、NaOH、LiO
H、及びアンモニアの少なくとも１種を含むものであるなら有利である。 しかし、他の塩基も用いることができる。

本発明の一般的形態では、前記ステップＩで得られる前記抽出液における前記第１の多糖体含有リグニン抽出物の濃度が、重量比で0.05〜10％である。 さらに好ましくは、この生成濃度は重量比で２％未満であり、最も好ましくは重量比で0.1％である。

例えば、前記ステップＩの前記抽出は、Ph14未満で、
室温（20℃）で、１日以上実行される。

また、前記第１の多糖体含有リグニン抽出物は、オートクレーブを使用した、100℃以上の温度で、かつ120℃
まで上昇させる抽出を経て製造される。

ここに、前記ステップIIの前記抽出で使用される前記原料が、リグナイト、着色炭及び褐色炭から成るグループから選択されることが好ましい。

前記アルカリ抽出が、0.1〜0.8Mの濃度でKOHを含む前記水性媒体を用いて室温で行なわれるのが好ましい。 また、0.4Mの濃度でKONを含む前記水性媒体を用いて室温で行なうと、さらに好ましい。

前記アルカリフラグメンテーションは、例えば、KOH
によりpH11とした条件下で、室温で７日以上実施される。

前記ステップIIIにおける前記第１の多糖体含有リグニン抽出物と前記第２の多糖体含有リグニン抽出物との反応は、例えば室温〜120℃の温度で、pHが８〜14で生ずる。

前記ステップIIIの前記限外ろ過は、分画分子量が18
〜38kDaのアルカリ安定限外ろ過膜を使用して低圧限外ろ過によって行なわれるのが特に好ましい。

さらに、前記ステップIIIにて、前記限外ろ過のろ液について、人工の陽イオン交換樹脂によるアルカリイオン交換を行って、pHが４〜6.8となるように調製するのが好ましい。

その後で、前記ステップIIIにおける前記陽イオン交換処理の後の前記酸性溶液は、ろ過により除去された発熱性物質を有し、それは、例えば次にオートクレーブを用い、121℃で、14分以上殺菌される。

前記ステップIIIにて得た前記活性物質の水溶液は、
一般的方法で処理され、必要ならば不活性成分とともに、必要な投与形態に応じた液状製剤に加工される。 例えば外用として溶液を製造するには、基剤溶液とともに加工できる。

前記活性物質の水溶液は、通常の注射用アンプルに加工できる。

前記活性物質は、ウィルス感染との戦いのために用いるのは好ましい。

前記活性物質は、非経口的又は局部的に用いられる外用薬の形式で利用されるのも好ましい。

前記活性物質の好ましい使用の一つは、レトロウィルス、HIV型レトロウィルス、またはAIDSウィルスとの戦いである。

本発明の活性物質は、Pt、Au、又はPdでキレート化された形で用いることも有利である。

本発明の有利な拡張は第２番目の請求項から続く。

LD陰イオンから由来の本発明の活性物質は、異なった分子が接近する化学的に多様な領域であり、異なった薬理的物質を有するシステムユニット（例えば、本発明中に記載の木部の小片化、及び破片から）に包含される。

本発明の活性物質が、新しい抗進行性化学療法剤として、HIV抑制のみでなく、正常又は病気の神経細胞（培養のもの）に対し、延命因子として効果を示す事実が認められる。

さらに、人間に対する長期試験においては、24時間当たり2mgの活性物質量で、毎日２〜７のアンプルによる投与により、重症のインフルエンザ感染（ウィルス、細菌複合感染も同様）を治癒できることを示した。

重症のインフルエンザ感染で苦しんでいる重症の喘息患者でさえ、本発明の活性物質を24時間当たり体重80Kg
当たり10mg投与することによって、喘息患者が避けうる危険状態である5mgを超える量のコルチコステロイドの使用なしに、極めて強力な薬効を得ることができる。

動物での実験的ブロンクロスパズムでは、無毒な量でのブラジキニン痙攣の抑制効果（セロトニン阻害及びプロスタグランシン合成阻害）が達成されている。

これらの効果は、極めて化学療法剤としては一般的でなく、この本発明の活性的物質が、従前のHIV阻害剤よりもM.ランジの要求に（上記引用参照）近いものであることを示している。

本発明の優れた点を以下に列挙する。

HIV感染細胞培養（ヒトリンパ球）に於いて、シンサイチア形成の明瞭な抑制（抗HIV活性）が、細胞無毒濃度範囲で起こった。

中枢神経（海馬又は、大脳皮質から）の厳密に調整された試験条件に於ける細胞培養系に於ては、人為的に障害を受けた神経と障害を受けていない神経双方の生存能力（生存効果）に重大な増加が起こり、進行性の細胞過程（付加的回復効果）の抑制と生物的に比較できるものである。

ニューロンは、HIV及び従来のウィルス（患者に対しては元のままで）双方にとって好ましい標的器官であるから、この性質は特に治療性において重要である。

M.パーキンソン基礎研究の分野から由来した適応試験は、活性物質が、血液脳バリアを通過できる可能性が高いことを示している。

数年間にわたる長期投薬によってさえ、好ましくない感作性は生じていない。 投薬に対する一般的反応、例えば発熱はなく、血液は投薬に関してなんら変化を受けていない。

従来のウィルス（インフルエンザ、水痘など）によって生じた感染について、循環系効率に対する不利な副作用なしに、デフェルベシエンスを伴う急速かつ完全な回復がある。

非タンパク活性物質であるので、共通抗原でも、発熱性物質としても機能しない。

注射による投薬は単純で問題もない。

ARC患者についての治癒薬量は、１週当たり20〜40m
gである。

最も極端な投薬過剰においてさえ（例えば、24時間当たり48mgを反復）急性又は慢性の２次的影響は、局部的にも全体的にも生じていない。

本発明の新規な活性物質の主に強調／表示すべき使用領域は、これらの領域にのみ限定されるものではないが以下のとおりである。

HIV感染 日和見感染によるARC 一般的慢性ウィルス病による細胞破壊 従来の抗腫瘍化学療法剤に対する癌細胞の多抵抗性に対する治療的影響 中枢神経系疾患 本発明についてより詳細に説明する前に、以下で用いられる略称及び他の略号を以下に理解を容易にするために最初に示す。

LD;低ダルトン（低分子量、ここでは最大3000Da） HD:高ダルトン（高分子量、ここでは＞3000Da） P;多糖体鎖、純粋にまたはリグニンとセルロースとの中間結合としての多糖体をともない、リグニン単位に結合するもの。

L;自然に存在するあらゆる種類のリグニン単位（純粋） LD−L;（低ダルトン・リグニン単位、最大3000Da） HD−L;（高ダルトン・リグニン単位） （PLP）；例えば木材粗引き粉を原料としてアルカリpH
の水性媒体中で、木材の生合成によって作られた粉状木材リグニンとして抽出される多糖体高含有リグニン抽出物のことを示し、本発明にいう第１の多糖体含有リグニン抽出物に相当する。

（LPL）；リグナイト、着色炭（硬炭まで）のような木部を炭化して得られる炭化生成物から、アルカリ極性水性媒体を用いて抽出されるものであり、炭化のプロセスで多糖型の吸収できるエネルギーキャリアが強度に使い尽くされている、多糖体低含有リグニン抽出物（炭化以前に微生物の分解による）。 これは、本発明にいう第２
の多糖体含有リグニン抽出物に相当する。

LD（LPL）；炭化のプロセスで生成され、例えばアルカリ性水性媒体を用いて抽出される低ダルトン（pH7以下でも可溶）の多糖体低含有リグニン抽出物であり、炭化の過程で多糖型の吸収可能なエネルギーキャリアが強度に使い尽くされているものである。

LD（PLP）；低ダルトンの多糖体高含有リグニン抽出物（上記参照）。

HD（LDP＝PLP）多糖体高含有リグニン抽出物由来のLDユニットと、多糖体低含有リグニン抽出物由来のLDユニットとの反応生成物である。

LD（PLP＝LPL）；上記反応生成物の低ダルトンフラクションで、本発明に記載の生物的応用に適している。

以下、さらに本発明の利点などについて述べる。

実施中の研究は、発明に係るステップIIIの反応生成物（LDP＝PLP）が、抗ウィルス効果を示す一方、実際的に別作用を有さないことを示している。

本発明の多糖体鎖活性物質の有利性は、タンパクを含まないことで、外来のタンパク質に対して免疫的防御を働かせず、ゆえに、長期間の投薬に適する。

本発明に係る活性物質は、ウィルス（特にHIVウィルス）の宿主細胞への接合及び付着を阻止すると考えられる。 真のタンパク質ではない人工グリコタンパク質で負の免疫反応を引き出し隔離された脳細胞のような殆んどの感覚系において生き残り因子として機能する。

治ゆ薬量（人間体重1Kg当たり0.1mg）においては、長期投薬と同様、活性物質は敏感にする影響は有さず、無毒で副作用もない。 本発明に係る活性物質は、非常にすぐれた水溶性を生ずる親水性の領域を有している。

摘要において、本発明に係る活性物質は、非タンパク構造と無毒性の理由で長期投薬に適するものと言える。

本発明の活性物質の特に有利な点は、生存因子としての性格を有する神経細胞を保護することができる。

本発明の活性物質の極めて特別な利点は、常に殆んどの多様な活性物質の高次構造及び電荷分布がウィルスに与えられているその多様性にある。

多くのウィルス、特にHIVウィルスは、極めて急速に変化、適応しており、それ故、単一の構造はもはや変異しているウィルスに対しては有効ではない。

本発明記載のグリコリグニンは、複雑な多糖ポリオースリグニン系ポリマーであり、その立体的及び電荷分布相関多様性の理由から、広範囲のグリコリセプターを中和することができる。 本発明記載の無タンパク質ポリマー（低分子量及び水溶性）は、敏感に活性化されるキノイン領域（オルト又はパラキノイド）を伴った多糖体鎖を失ったウェニルプロパンユニットから構成される。 物質系の生産相関調整の手段により、このポリマーの種々領域がここに明らかになる。

本発明に係る活性物質がグリコタンパク質センサと分子的接触に来った場合は、例えばウィルス付近において、その活性物質の潜在の多糖体涸渇の領域がたぶんウィルスのグリコタンパク質の多糖体と結合し、そしてこの接触の連続が、それらの間に複合体を形成し、それによりgp120は例えば、中和され、安全にされる。

多糖体側鎖と親和性を有し、グルコ分子において、立体特異的に部分枯渇しているリグノイド分子領域は、天然の、いわゆる炭化産物中、つまり、着色炭、リグナイト、及び微量だが硬炭にも見い出される。 数百年にわたる炭化の過程において、多糖鎖（例、ポリオース）の涸渇が生じ、リグニン単位とセルロースとの生物的連結を形成する。 これは、微生物分解、酸化的長期変換などを通して起こり、これは炭水化物涸渇の炭化産物へ導く。

本発明のさらなる利点は、原位置で神経及び肝臓細胞における測定手段によって実験的に証明できるように、
本物質系が細胞膜へ生物的に侵入できることである。

感染培養細胞に対する活性物質の効果が驚くほど重要であり、本質的に有毒な副作用を生じないことが科学研究により確立されてきた。

従って、活性物質は長期の投薬に適している。 長期投薬に伴う効果の減失は生じない。 疑わしい場合でも、リスクなしに投与できる。 そして、非特異的活性物質と適当に組み合わせることもできる。 一般に回復効果を示し、問題なく注射もできる。

以下の節において、製造実施例及び添付図面を用いて、より詳細に本発明を説明する。 しかし、本発明の適用は、いかなる場合もここに示されたものに限定されない。

図は以下のとうりである。

図1a:本発明の明細書に従った活性物質の製造方法。

図1b:本発明の明細書に従った活性物質の他の製造方法。

図1c:本発明の明細書に従った活性物質の他の製造方法のさらなる変形。

図2a−2c:水中での、実施例１に記載の本発明に係る物質系又はその前駆体溶液の螢光スペクトラム。

図3:本発明に係る物質系の変形のAC13スペクトラム。

図4:グルコール欠如ラット皮質培養中でのLDH活性を示す図。

図5:生体外48時間後の海馬ニューロンでの活性試験図。

図6:活性物質溶液の放射線接続期間として働く吸光測定記録。

実施例１ 本発明に従った活性物質の製造 ステップＩ及びIII 多糖体高含有リグニン抽出物（PLP）の製造及び本発明の活性物質への処理 300gのシベリアカラマツの地上部心材（Laxis sibirf
iaca）を、6000mlの脱ミネラル水中でかくはん下粉末にして分散させ、150gのKOHを加える。 調整液を46−66℃
（誘電体、間欠加温）３日間、撹拌し続ける。 続いて真空ろ過で固形物を分離し残渣を捨て、ろ液を透明になるまで遠心分離し、再溶活性化されたばかりの強酸性人工イオン交換樹脂（アンバーライト1R120）の一部を水素の形で加えて、ガラス電極測定によって一定のpH条件下、pH11.5へゆっくりと調整する。

イオン交換樹脂は分離し、捨てる。 発熱性物質及び粒子を、透明でゴールデンイエローの溶液から、分画分子量10万ダルトンのアルカリ安定限外ろ過膜での限界ろ過により分子分離を行って除去する。 この透明黄色のマトリックス液から20μｌのサンプルを採り、希釈しスペクトラムを見るため、石英セル中で水3mlと混ぜ、450nm、
490nm、及び520nmの波長で一連の螢光反応スペクトラムを記録する。

螢光メーターは、感度に対応して調整し、波長450nm
での相対螢光放射が、100に等しいか、その付近になるようにする。 反応スペクトラムは450nm（記録装置2cm/
分、反応波長進行速度100nm/分、器材：コントロン（スイス）、SFM−23型）調整のため、反応スペクトラムは、490nmと520nmで記録する。

黄色のPLPマトリックス溶液が得られる。

ステップIIIにおける処理 構造変換剤（下記参照）の2mg濃度での段階的追加により、520nm反応スペクラムは、3ml石英セル（螢光滴定）中へ５μ添加のステップにおいて、添加量の増加は、465nmで明確なピークが現われ、全放射波長領域上の放射が強く増加し、394−396nmでの放射が80％相対放射のオーダー付近にまで増加するまで、記録される。 構造変換剤混合液を経由する螢光の増加に必要である構造変換剤の量が決定され（ここでは、0.2％溶液10μｌであった）、そして要素の2.5が乗ぜられる。

この方法で決められる構造変換剤の混合量に、次にマトリックス溶液の有効量が添加される。 指示に従い、例えば0.2％構造変換剤溶液500mlを本調整液（120μｌのマトリックスが0.2％構造変換剤溶液10μｌを必要とし、よって要素2.5でかけ算すれば、4000mlのマトリックスは、2.5の2000倍を生じる）のマトリックス溶液400
0mlへ添加する。 45−60℃で、この溶液を強く混合し、4
5−60℃で４時間反応後、分画分子量30kDaのアルカリ安定性限外ろ過膜を有する限外ろ過ユニットにより分子分離を行う。 次に、残渣を捨て、ろ液をさらに処理する。
Ｈ＋型の高酸性陽イオン交換材により、ろ液をpH5.5に調整し、パイロージェンを除去するためろ過した後直ちに温度で殺菌する。

バッチから、生物用、分析用のサンプルを採取し、螢光分光器を用いる試験及びパイロージェンの不存在面試験方法を確認後、アンプルの製造用に放出される。 注射用に殺菌された0.9％NaCl溶液は、全身投薬用に用いるアンプル用の溶媒として使える。

図2aから2cには、450nm、及び490nm及び520nm（物質グループＡ）の反応波長でのPLP溶液の螢光反応スペクトラムが示されている。 螢光滴定の原理に従って、図2d
及び2eは、波長520nmでの５μｌ段階のPLPの添加（ここでは２段階）の重要な影響を示す。

ここで重要なのは、感応波長466nmでの発射ピーク、
発生及び高さである。

ステップIIにおける処理 多糖体低含有リグニン抽出物（LPL）の製造 600gの粉状のリグナイト（微粉）を撹拌しながら、室温（20℃、重量比1.68％KOH溶液10,000ml中）で分散し、一部を溶解し、９時間後、高速遠沈で固形物と分離し、残渣を捨てる。 24時間後、別の固形物を遠心分離し、固形物を捨てる。 20℃、５日間に及ぶアルカリフラグメンテーションの後、生成物の遠心分離を行って固形物を分離し、次に分画分子量30,000ダルトンのアルカリ安定限外ろ過膜を有する限外ろ過ユニットを通して分子分離を行った。 限外ろ過は6.71のろ液が得られるや否や停止した。 限外ろ液は、新ため活性化された高酸性イオン交換材（アンバーライトIR120）で、ガラス電極測定によってpH5.5へ調整した。

この弱酸溶液は、直ちにパイロージェン除去の為、限外ろ過器中でろ過した。 その後、オートクレーブ中で12
1℃で15分間熱殺菌した。 固定形濃度を測定するためサンプルを採り、85℃で重量が一定になるまで（赤外放射）圧縮した。 所定の濃度へ調整した後、本法により得た限外ろ過を、LPCフラクション又は構造変換剤（前出参照）としてステップＩの生成物との反応に用いた。

説明の為、反応系を図1aに示した。 本工程の可能な変形を図1b及び1cに示した。

LPLフラクションのC13スペクトラムは、以下の節において検討する。

13C NMRスペクトラ サンプルの13CNMRスペクトラムは、すべておよそ168
−180ppmでの穏かな多重線によって表示される天然リグニンの多数のカルボキシル基によって区別される。 NOE
効果及び水素原子核と直接結合しているスピン−スピン相互作用を欠くために、カルボキシル基の炭素原子は、
特に弱い信号を生ずるので、その信号の相対強度よりも濃度が高くなっている。 同様のことが、α−カルボニル基の炭素原子についても真実であり、190.5−198の範囲で吸入するが、その強度はかなり弱い。 158.2ppmでの鋭い単重線は、ｐ−ヒドロキシフェニル基中の４位の炭素原子に最も良く帰属する（炭素原子の標識については、
HDLudemann及びH.Nimz、Mokromol、Chemle、175、240
9（1974）を参照）。 しかしながら関連するモデル物質の測定は、溶媒としてのヘキサドイテロアセトンで実施された。 そして国際滴基準で行われたため（HDLudema
n及びH.Nimz、Mokromol、Chemle、175、2393（197
4））、たぶんシリンジル残基中の３位と５位の炭素原子が、この信号について考慮されなければならない。

93−145ppm領域での広い多重線（７）はグアイアシル残基中の1,2,5及び６位の炭素原子、及びシリンジル残基中の1,2,4及び６位の炭素原子に帰属するはずである。 スペクトラムの低い分解能は、その予備的処理から生じたリグニン中での強い濃縮を示すものである。

脂肪族炭素原子の領域では、信号（８）（９）及び（15）があらゆるリグニンの中で最も重要なタイプの化合物であるアリールグリセリン−β−アリール・エーテル化合物の一般的なリグニン信号として分類することができる。 しかしながら溶媒と外部標準のためにここにいくつか分類上不明確なことがある。 58.6ppmで比較的弱いメトキシ信号は、サンプルの予備処理の間に部分的脱メトキシル化を示した。 構造がよい信号でこの領域にも現れる（10），（11）及び（12）は、一般的なリグニンスペクトラ（HDLudemann及びH.Nimz、Makromol、Chem
ie、175、2409（1974））の中に見い出せる。 それらは、濃縮された炭化水素化合物を示す。

約０−55ppmの領域で広い多重線（17）を説明することも困難である。 ここで、主として脂肪族炭素原子は、
酸素と直接に結合していないものを吸収すべきである。
しかしながら、リグニンでは、本種の原子は非常に少なく、例えば、ピノシノール・ユニット中のβ−炭素原子及びジベンジルラトラヒドロフラン・ユニット中のα−
炭素原子がある。 （参照;HDLudemann及びH.Nimz、Mak
romol、Chemie、175、2393、1974;HDLudemann及びHN
imz、Makromol、Chemie、175、2409（1974）。 これら種の炭素原子（例えばCO− CH ₃ 、−CHOH− CH ₃ 、又は− CH ₃
−Ｃ中のもの）はリグニンの予備的処理の酸化的又は他の段階において始まるか、又は木製材料からリグニン生成するときに既に存在していたものである。

摘要に、本サンプルが、リグニンの性質がもはや区別できない構造的に変形したリグニンから成ることが述べられている。 その信号の分類は、溶媒としてのD20の使用により、より難しくなった。 何故なら、これは類似のリグニンが測定される。 ヘキサドイテロアセトン中で不溶だからである（HDLudemann及びH.Nimz、Makromol、
Chemie、175、2409（1974））。

さらに内部標準の代用での外部標準の使用は、化学的変換に多少影響し、およそ2ppmの変動差が生じる。

0.05−0.315ミリの粒形に粉砕し、そして上記方法で調整した120gのヨーロッパ・ブナ（Fagus sylvaticaL）を混合し、実施例１と類似の方法で処理した。 Laxis sib

irfiacaの心材は、アラボガラクタン（４部ガラクトース:1部アラビノース）を含有するが、オキシメチル・グルクロニン酸及びＬ−アラビノースを含むビーチ・キシウン鎖が存在する。 結果として最終産物の性質は、自動的に変化される。

粉末木材の変形はベックマン及びリシェAngewandte C
hemic 34、285（1921）に従って実施される抽出により実施例１に記載のように処理される。 ここでの抽出は、
オートクレーブ中、121℃、3.5時間で、1M KOHとともに行われる。

実施例３ 本発明に従った活性物質の製造 Ｉ）多糖体高含有リグニン抽出物（PLP）の製造 PLPの製造は実施例２のように行われる。

II）多糖体低含有リグニン抽出物（LPL）の製造 LPLは、実施例１で使われたリグニンの代わりに粉砕したエオシーネ褐色炭から製造される。 そうでない場合は、実施例１に記載のように製造される。

実施例４ 本発明に従った活性物質の製造 Ｉ）多糖体高含有リグニン抽出物（PLP）の製造 210gのカラマツ心材、60gのブナ心材、及び30gの（Pr
unis aviumの果皮を実施例２に記載したように処理する。

II）多糖体低含有リグニン抽出物（LPL）の製造 樹脂、脂肪及びワックスからベンゼンでソックスレー抽出によって通常の方法で純化したミオセーヌ褐色炭を実施例１に記載のように処理した。

実施例５ 本発明に従った活性物質の製造 Ｉ）多糖体高含有リグニン抽出物（PLP）の製造 210gのカラマツ心材とフロイデンベルク（フロイデンベクルＫ、ハルキンJM、1960、炭水化物上でのリグニンの結合モデル、chem、Ber.93、2814−2819）に従った
90gの合成木材を実施例２に記載の方法を用いてPLPへ加工した。

他の方法は実施例１に従って実施した。

実施例６ 本発明に従った活性物質の製造 ブナ材粉末（fagus sylvatica L.）に由来し、NaClO ₂
で脱リグニンされた（フェックル1981による、ミュンヘン大学からの論文）亜塩素酸ホロセルロースからのアルカリ抽出液（A5）とフェンゲル（1976、Holzforschung
30、PP73−78）に従い４％KOHでアルカリ抽出した抽出液とを、固形分分離し、殺菌し及び３日目の初めに900m
l（濃度0.12％、固形含量、リグニン残量2.3％）中のリグニン（実施例１により製造）から得たLPL溶液へ加える。 2.1％溶液（pH11.4）の容積は9100mlでだった。 フラグメンテーション期間は９日間だった。 溶液は、次に図1b中に記載のように処理し、続いて固形物の分離を行い、見掛けカット値制限が18−38kDで、pH値が８−14であるアルカリ安定膜を有する限外ろ過を通して分子ろ過を行う。 その後、その溶液は、H ⁺イオン交換材により酸性化し、無菌フィルターを通す。 得られたろ液はオートクレーブ中121℃で熱殺菌し、さらに実施例１に記載のように処理できる。

実施例７ 本発明に従った活性物質の製造 ステップI: 100gの磨砕した（粉末様）シナモン幹を６日間60℃で脱ミネラル水（pHはKOHで８−９に調整）中KOH溶液1000
gとともに抽出する。 この処理期間中、材料の循環は酸素導入によって維持される。 その後、固形物を遠沈により分離し、捨てる。 この方法で得たPLP溶液は、オートクレーブ中で熱減菌し、加熱条件下アルカリ性媒体へ実施例１のステップIIのLPL生成物といっしょに同時的に移動する。 以後の処理は実施例１中の記載のように実施する。

この製造方法は図1cに要約されている。

実施例８ 実施例３からの生成物と同一である粉砕した着色炭（エオシーヌ）600gを110gKOHの60g NaOHを脱ミネラル水中、２−５時間かくはんした溶液10l中で、室温下、
アルカリ条件でフラグメンテーションを起こさせる。 水酸化物の溶解前、20gの高度に機械的に分散させた活性炭を水へ加える。 この活性炭部は、以下の予備遠心分離により、沈澱とともに分離される。 それ故、後にフラグメンテーションに使いられる生成物の純化の準備段階を意味する。

もし、例えば4000〜5000r.pmでのビーカー遠心分離機が必要ならば、高容量遠心分離機中での予備的な遠沈が必要とされる。 何故なら、遠心分離（縦型分離シリンダをもつ高速遠心分離機、約40,000rpmでもよい）による最大重力効果を伴う固形物の分離（工程の次の段階）は、もし沈澱量が精製シリンダの効率を低下させる場合は直ちに停止してしまうからである。 これは工業的製造を不可能にする。 予備の遠心分離が収集されたら、
10l当たり8gの活性炭と混合し、直ちに超遠心分離行う。

必要ならば、純化シリンダが、実際に透明となり、わずかな沈でんがみられる程度になるまでくり返す。

この確実に事前に精製された生成物（活性物質の粗製のアルカリ溶液）を室温に保ち、アルカリ自己分解を起こすようにする。 進行中のpH測定を分解工程中実施する。 さらに、上記超遠心ぶりを真の溶解性及び分子反応性をもたない、常に形成される薬理学的に望ましくないフラグメント凝縮物の沈でんを断続的に除去する為、少なくとも２回試験的に実施する。

残渣は捨て、限外ろ過ユニットは十分にアルカリ洗浄され、ろ液は、次の調整段階に従う。 本発明の特定のステップは、最終生成物の構造に重要性をもたないように見えるが、実際に今、限外ろ液のアルカリ塩と、高酸性人工樹脂、イオン交換器（末端が水素の形）の間に生じる接触が最終産物の構造にとって付加的な分子物理学的重要性を持つ工程でもある。

アルカリ性の限外ろ液の酸性化は、例えば、酸の添加及びイオン交換器カラムの使用でされ、実は全く不適当である。 なぜなら、後者の場合、カラムは容易にブロックされ、完全に使用不可のろ液が得られるからである。

本発明に従い、イオンの除去（ Na ⁺及びK ⁺イオンの除去）が反応槽内の一バッチ工程で実施され、このイオン除去工程はガラス電極測定によって持続的に電子的にモニターされる。

目的のpH値は5.1であり、この値が得られた後は、イオン交換材の添加を直ちに止めねばならない。 本発明は、脱イオン化が、猶も部分的にアルカリ性生成物の継続的に循環している条件下で実施したり、乱流形成の手段により得られた注意が調整可能な循環ポンプにより、
高イオン交換材濃度が形成されていない領域を作られたりする。 （望ましくない機能生成物系は、生成物の最終品質が減じられることによって構造の不特定な変換を起こす。） 活性物質の構造的輪郭が現在のところ、満足的に測定できないために、本発明に特定された、最小の実験的にひき出された反応ステップとの一致が、本発明に記載のものと薬品的に同一である活性物質を製造するための方法を最もよく保証しつづける。

無菌フィルターは、イオン交換材との接触の間中、溶液中へ入って来ていた。 脱イオンされた活性物質粒子を取り除くために用いられ、使用後直ちにオートクレーブ中で減菌する（例えば121℃、20分間）。 この活性物質溶液は完全かつ完全に４〜20℃で18ヵ月間保存でき、例えば、アンプル溶液（例：溶媒0.9％生理的食塩水）の製造に使用できる。 ここでの活性炭の使用は非常に特異的な精製作業ではない。 その代わり特別の分解工程での反応状態に影響する問題である。 原則として活性炭粉末タイプの活性炭が使用されるべきである。 （この種の活性炭の詳細な特徴の例:5％水溶液のpH値が20゜濾過で4.
0−7.0;メチレンブルーの吸着能力:0.15％溶液で12ml/
0.1g以上） 活性炭の多くの異なる機能的視点は活性炭へ酸性、塩基性の性質を付与する表面酸化物量に関連して必要不可欠である。 それは疎水性黒鉛のように純粋な炭素表面であるけれども、親水性領域で原位置の表面酸化物を形成するので、活性炭は水で温めるので、分解の過程における反応状況に対して影響を及ぼす。 さらに、活性炭の粒径分布も重要である。 薬50％が40ミクロンより小さい粒子でなければならない。 この粒径分布に基づいて、活性炭添加物は、ろ過システムの使用なしに技術的方法を介して容易に分離することができる。

アルカリ除外を伴う構造の変換に関する発明内容（即ち、生物変換性木材又はその関連品のような最初の材料）及びカリ、ナトリウムイオン（水微細構造状態に関する）によって及ぼされる極めて変化に富んだ影響。 カリイオンは、水の両極に対し、環境中構造破壊的効果を及ぼし、同じ条件下で、ナトリウムイオンは、構造形成効果を及ぼす。 これはアルカリ性フラグメンテーション生成系の活性物質ユニット間の分子の相互作用関係が、
各イオンの極性エネルギーの小さな問題ではないことを意味している。

本発明中で特定した構造分裂因子と形成因子の混合物を用いることは、その最終生成物の構造輪郭の変換の別の物的可能性である（構造分裂・形成因子の分裂した混合を介した構造の変換）。

免疫・生化学的及び他の試験結果に基づいて、あるものは製造プロセスの他の方法論的詳細を変更することなしに、他の構造変換を行なう単純な方法をもっている。
それが多様な生物的研究の明白な大要を得ることを容易にすることは当然である。

実施例９ 実施例８に記載され“１または２以上のイオン原則”
に従って、限外ろ過により数回既に沈澱粒子を除去している生成物をマイクロ波加熱で手近かに46℃として、又室温へ再び冷却する。

水は疑似コロイド構造を有する。 15〜30℃、30〜45
℃、及び45〜60℃の温度域では種々の構造組成物間に異なる関係があり、例えば60℃では水は真に流体の水から成り、他方30〜45℃では、水の半分は猶、疑似結晶組成物（Ｃ組成物）（柔らかい氷）から構成される。 水の双極は、動きとともに熱エネルギーを付与し液相の性質をも与えるけれども水素結合によってＣ変形にいっしょに保持される。

一定温度で始まる真の液体型（Ｌ組成物）へ変化するＣ組成物。

それ故、もし一定量の水が、構造的変化の領域内で、
マイクロ波によって、熱せられたならば、他の顕著な処理が始まる。 水はマイクロ波エネルギーを高頻度循環運動を通して、直ちに熱へ、変換する為マイクロ波エネルギーは水層の厚さに依存する方法で、遮断される。 乱流等の為、異種の常時変化する温度勾配が形成される。 そしてこれは再び水組成物の分散及び温度の不連続性に関する無秩序な体系の発達を起こす上記のコロイド状の水構造に影響を及ぼす。

もし異なる極性エネルギーをもったイオンが、特に影響される有機的単位のパートナーとして、我々の場合の様に次にこの無秩序体系は、当然予期出来ず、本発明に特定されるフラグメンテーション過程の影響は技術的方法を用いて経験的に研究されなければならない。 構造的輪郭は、フラグメンテーション過程における反復した物的に誘導された変化を介してフラグメンテーションに特異な影響を及ぼす事によって、変更される事が研究されている。 超遠心分離（より詳細は実施例８を参照）による最終の超微細精製の後でアルカリ性混合物（有機的単位）が実施例８に従ってその精製物が得られたと同じ方法で更に処理される。

このフラグメンテーション過程に於ける反復した物的に誘導された変化を通して構造的輪郭が変更される。

実施例10 反応光度的研究は、本発明にかかる実施例８に従って、製造された活性物質は380−378nmでのフォトン活性化によって大きく変更する事が出来る。 活性物質のフォトン需要単位の領域に於けるこの物質変換と共に、色彩的処理が生じる。 物質Ａが他の形（構造）又は化合物Ｂ
に変換する可逆的な光化学反応があり、この化学反応は紫外線又は可視光線の吸収によって引き起こされる方向へ進むことができる。 本発明の活性物質は、終息のモニタリングが例えば90分後に終息最大が起こった事を示すまで波長388nmによって影響される。 ある物は、同時に二重ビーム光度計（図６）（例、5nmの周波体）内の光線を測定する様に単色388nmの光線を使用し記録する。

終息最大測定（図６参照）に加えて構造変換は、又蛍光測定を通しても見い出せる（感応スペクトラムの記録）活性物質内のフォトン需要単位に対する色彩的影響を介して曲線が最初のサンプルのものからは大きく異なるすべての感応分光蛍光分析領域に於て得られる。 それ故結合した発色団の分子内の体系が拡大されたプッシュ−プル体系を発展させる。 （構造的原理；電子供与体／
活性物質／結合系／電子需要体＝助色団／色原性／発色団）。 これらのUV誘導系は特異的方法で所望の多変形の活性物質を増加し原位置又は生体内の化学療法と効果に影響する。 臨床実験は、このUV活性化、活性物質溶液が
AIDSに影響を及ぼす為だけではなくＴ細胞リンパ腫と共にＴリンパ球を影響するのに適している。 この種の白色病細胞は免疫反応の整合に於て中心的役割を果たす。 それらは又HIV感染（CD−４レセプターを持つＴヘルパー細胞）及びCTCL（皮膚Ｔ細胞リンパ腫）の両方と重要な役割を成している。 フラン環とクマリンから成る８−MO
AのUV活性化を通してCTCLに影響を及ぼすことが知られている。 しかしながらこの方法は非常に入念であり（ロイコフェレシス）、他方本発明に従って製造されたUV活性化化合物によって通常の注射薬療法の実施が必要である。

一般に木材抽出条件は可溶性多糖リグニン単位の分子構造に大きな影響を持つと言われる。 ここでマトリックスの分子構造は多くの場合最初の材料に依存し、それ故そこには木の心材ワラ又は草が使われる。 微量の除草剤を避ける為古い木が使用される。 木の種類（針葉樹、広葉樹）及び最初の材料（ナッツの殻、ももの種、軟木）
として使われる植物の一部は重要である。 例えばナッツ殻のピートＬの間の結合は軟木よりもかなり強い。

更にLD−PLPポリマー抽出の方法は精製物にとって不可欠である。 ここで特に適する物はアルカリ抽出、圧力下（オートクレーブ）熱水又はスチーム処理、又は電解質としての食塩による電気分解である。

本発明活性物質によって芳香族、コア構造周辺付近に炭水化物が配置される。 これら炭水化物（セルロース、
リグナイトからのグルコース）は芳香化合物との間に結合を作らない。 その代わりそれらは、周辺に結合を作る。

リグナイト−セルロース、フラグメントは、それ故に
ZNの塩酸により容易に加水分解されグルコース残基中の主要な水酸基は酸化されセルロース鎖がグルクロン酸単位（オキシセルロース）によって壊される為である。

無結合セルロース、結合セルロース及びグルコシド結合単サッカライド（主たるモノサッカライド；グリコース）が本発明体系の周辺に見い出される。 コア構造は単素化の少ない反応性コア周辺部と同様により強く単素化された芳香性単位（ドメイン）から由来した遅い反応の中心である。

最も簡単な形では活性物質はそれ自身がコア単位の単素化の度合に依存して周囲及び中央領域からなる芳香性／フェノール性、コア状の多糖体鎖から構成される。

本発明の活性物質はそれ故天然物質界及び炭水化物からの構造単位を供えている。

次の説に於て異なる細胞形に於ける実施例１からの物質効果について行なわれた研究について記載する。

HIV−感染ヒトリンパ球に対する実施例１の活性物質の試験 試験系として新生児の、へその緒の血液からのリンパ球でフィトへマグルチニン（PHA）10μg/mlで２間前活性化したものを用いた。 この培養細胞系はHIV研究用の非常に敏感な細胞系である。 1mlの培養中におよそ20万のPHA活性化、へその緒、リンパ球がHIV−２株、HIV−2
ROD（最終濃度がおよそ200シンシチア、形成単位/ml）
によって試験基質の存在下、感染されている。 感染３日後に感染を受けた培養の光学顕微鏡による評価が行なわれた。

活性物質は連続的減菌フィルターなしに培養基中に溶解した。 濃度が200μg/ml,100μg/ml,50μg/ml,20μg/m
l,2μg/ml,及び0.2μg/ml,が試験された。 ２バッチ（A8
8−１及びA88−４）が検討された。

本物質系の抗HIV活性（実験室II）本発明に従った活性物質が2mg/mlと16mg/mlの２濃度で実験室で検討した。 この関連に於て、実験室１からのHIVコア蛋白、P2
4、がH9細胞に感染後、抗体捕獲技術を用いて試験した。

ホスホノホルミン酸が正の制御物質として使われ異なるAZT及びddCも又試験された。 この実験に於て両サンプルとも抗ウィルス活性を証明した。

実験室には終点としてMT−２細胞の主感染の後でシンシチア形成を用いた。

試験結果：

Vウィルスの攻撃を抑制している。

治癒的薬量（人間の体重1Kg当りおよそ0.1mg）に於て活性物質は長期投薬による感作性を生ぜず無毒であり、
副作用もない。 本発明の活性物質は親水性の領域を有し、良好な水溶解性を持つ。 もちろん専門家に公知の本発明の原理に関連する他の変形や尺度、例えばマトリックス表面に他のモノマーを用いる様な内容とすることが可能である。

従って、本発明の物質系は長期の投薬に適し、薬効の消失もなく疑わしい場合の危険なしに使用する事が出来る。 上記実験は、本発明記載の活性物質がそれ故優れた抗ウィルス特性を有する事を示している。

試験１（隣接細胞ストレスなしの生存効果の立証） 本発明の活性物質は、又以下に示す様な反進行性（回復性）を持っている中枢神経系の急性の障害が起った時には、例えば外傷、脳の障害、イシェミア（ischaemi
a）等が殆んど中枢神経の退化、又は死に供なって起こる。 同様に多数の神経学的及び神経退化的な中枢神経的な疾患が特定のニューロン中断の死によって明瞭になる。 この理由の為細胞死または中枢ニューロンの生存の研究は非常に重要である。 近年向神経性要因及びニューロン−グリア相互作用に関する研究が生体内及び生体外に於けるニューロンの生存に関する新たな知識をもたらしている。 又神経細胞の活性はガングリオミッド及びリン脂質を含む膜脂質の重要性に関する知識が含まれている神経細胞に関する実験は、膜に対する作用によって脂質ペルオキシド又は酸素ラジカルが生存又は細胞死に於て役割を果たしている事が示している。

材料及び方法 I.海馬ニューロン培養の製造、17日生のラット胚の海馬をトラプシン−EDTAの処理及び機械的鋏によって分離し、次にポリリジン被覆のカバースリップ状においた。
10％血清中の付着層の後、細胞は特定された無血清の培養基中で生長する。

II.螢光試験 ２つの螢光系統が生細胞と死細胞を色で区別する様に組み合わせて用いた。 フルオレシェンジオステート（FD
A）が最初に生細胞へ非螢光系で取り込まれ加水分解で分裂し螢光化合物に変換される。 臭化エチジウム（EtB
r）が生細胞から排除されその核を赤く螢光する死細胞中のみ侵入する。

培養基 DMEM（ドルベッコス改良イーグルズ培養基）セロメッド、ミュンヘン FKS（子牛血清）セロメッド、ミュンヘン 10％ DMEM
（56℃ 30分 不活化） HM（ホルモン混合） インシュリン 8.8×10 ^-7 M トランスフェリン 1.1×10 ^-8 M トリヨードチロニン ３×10 ^-10 M ヒドロコルチゾン ２×10 ^-8 M DMEM中 活性物質濃度 アンプルは2mg/ml溶液を含有する。

DMEMにより希釈 培養基中の最終濃度 （100μl/2ml） 1:10 200μg/ml 10μg/ml(1) 1:100 20μg/ml 1μg/ml(2) 1:1000 2μg/ml 100 ng/ml(3) 1:10,000 200 ng/ml 10 ng/ml(4) 1:100,000 20 ng/ml 1 ng/ml(5) 付着相の後、その溶液は濃度（１−５）の付着細胞の周囲の培養基へ加えられた。 条件当たり３培養の各々から１視野当たりおよそ50ニューロンで15視野がカウントされた。

結果 活性試験はコントロールに比較した培養基中のニューロンの生存に対する100ng/ml付近の濃度液での生の影響を示す10μg/mlでおだやかな有害効果が起こった。

細胞が最適条件で生長している生存効果を評価する時つまり生存における実質的改善が期待出来ない事を、考慮すべきである。 それ故最適条件以下（試験II）で実験するのが妥当な様である。

48時間後の海馬ニューロンによる生体外活性試験 生死細胞比率 試験II 後のニューロンの生存に対する影響。

映画方法を用いて顕微鏡視野中の長時間ハロゲンランプの光にさらされた視野外の物よりも早く死亡する事が観察された。

この効果の原因を捜索中に我々はいわゆる日光ランプからの光にさらされた細胞培養基中に（高率の単波光と共に）致死的な光分解物が生成する事を見い出した。 トリプトファン又はトリプトファン／リボフラビン含有培養基の近UV（365nm）による照射によって有害量のH202
が生成される。 （マコーミック,JPフィシャー,JRパクラトコ,JP及びアイゼンスターク，サイエンス191,4
68−469（1976）；及びワン,RJニクソン,BPインビトロ14,No8 19−22（1978））。

過酸化基及び酸素基は、今日、細胞の連続処理及び有害な影響（例えばヒポキシアの結果として）を介した細胞障害に関して特別な興味を有するものである。

以下の研究は、ハロゲンランプからの照射への露出後の細胞障害効果に対する本活性物質の影響を検討したものである。

細胞の生存の明らかな現象を導くが未だ完全に致死的でない露出期間が最初に予備実験で決定された。

方法 ラット胚（17日）の海馬からのニューロンを前記のごとく準備した。 インキュペーター中での３〜４時間の生長後、培養皿を取り出し光に露光した。 ３濃度段階で新たな培養基をその培養へ加えた後でさらに20時間培養した。 それら培養の生存を前記螢光試験によって測定した。 対照区は、照射区及び無照射区の両方を取り、新しく、同時に活性物質なしの培養基を与えた細胞である。

露出−反射鏡を持つ500wのハロゲンランプ、距離40cm
（ペトリ皿のレベルで測定した光価:18.5）、露光期間2
0分。 露出期間中温度調節可能な水浴中に培養皿を置いた。 培養基中で直接測定した温度は34℃を越えなかった。

結果 結果は培養基中に於ける24時間後の生細胞の生存率で図４中に示した。

１） 24時間後露出なしの生存率 ２） 活性物質なしの露出後。

３） 露出後及び活性物質 １μg/ml添加後。

４） 〃 0.1μg/ml添加後。

５） 〃 0.01μg/ml添加後。

培養基中のニューロンの生存に対する明瞭な効果が前記条件下で認められる。 濃度（１μg/ml）有効で最適条件下（レポートＩを参照）48時間後の生の生存効果を示さなかった事に注目し得る。 正常な条件のもとで、若干の有害効果が、光が障害を起こす条件下で前支配的である保護効果の上に位置づけることが可能である。 スペクトラムのどの部分がその致死的効果に最も影響するかの問題は検討されていない。 しかしながら培養基が光中の効率な長波照射を通して加温され細胞がこの理由ゆえに障害を受けた可能性は除外された。