Improving intestinal flora and immune function enhancing composition comprising the extract of Cinnamomum cassia bark

本発明は、桂皮抽出物を有効成分とする腸内菌叢改善及び免疫増進用組成物に関するもので、より詳細には腸内有益菌であるビフィドバックテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｏｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）とラクトバチルスアシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生育を促進して一般免疫系リンパ球のような免疫細胞を増殖させる機能とともに腸管免疫系の免疫細胞活性機能を有する桂皮抽出物を有効成分として含む薬学的組成物に関するものである。

ヒトは生まれると同時に、微生物が腸内に棲息し始めてその集団が平衡に到達すると安定した腸内菌叢を形成する。 腸内菌叢は、宿主の生理的条件、飲食物、薬物及びストレスなどのさまざまな要因によって変わる。

正常菌叢を構成する微生物の数と活動は、外来性因子（ａｌｏｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）と内因性因子（ａｕｔｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）によって調節される（ＹａｚａｗａＴ．，Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０年，第１０巻，２２９−２３２頁）、前者は宿主の環境や食餌などから誘発され、後者は菌叢内の微生物間で主に起きるようになる。

すなわち、正常菌叢の均衡は腸内の強い嫌気的条件、腸の連動運動、連続的な排泄下で腸管内の棲息場所と栄養源に対して競争する過程で成立し、一部はｐＨ、酸化還元電位、胆汁酸、生産されるバクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）、脂肪酸、硫化水素などによって正常菌叢の均衡が成立することが報告されている（Ｙａｚａｗａ Ｋ．ａｎｄＴａｍｕｒａ Ｚ．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，１９８２年，第１（１）巻，３９−４４頁）。

腸内菌叢を構成する個々の微生物は、物質生産または分解能によって宿主に被害または利益を与えたりする。 腸内菌叢を全体的にみると、ビタミン供給、感染防止及び腸機能（連動運動及び吸収）を助けることに関与していて、それにより菌叢の組成は便秘、腸関連疾患発生などと密接な関係があることが知られている（ＭｉｓｔｕｏｋａＴ．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，１９８２年，第１（１）巻，３頁）。

お年寄りや腸が良くない人々は、腸内に非正常な菌叢（ＭｉｔｓｕｏｋａＴ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０年，第６巻，２６３頁）が形成されている。 普通小腸での菌数が顕著に増加したり有益菌であるビフィドバックテリウムＳＰＰ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）が減ったりなくなったりする一方、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）などのｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ． は顕著に増加した状態の場合が多い。 したがって、元気に長生きするためにビフィドバックテリウムｓｐｐなどの有用細菌は多く、そしてｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓなどの有害細菌は少ない状態で維持させる理想的な腸内菌叢を維持することが提案されている（ＭｉｔｕｓｏｋａＴ．，Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｌｏｒａ．，Ｊａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，１９８９年，１頁）。

一方、桂皮（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ ｂａｒｋ）は、クスノキ科の常緑喬木の皮で、中国の南部やベトナム等に自生する。 桂皮は喬木の皮、桂枝はその枝、肉桂は厚い皮を意味し、桂心は古い木の厚い皮を伸ばして乾かしたものを意味する。 桂皮には、精油（桂皮アルデヒド７５〜９０％、シンナミルアルデヒドなど）１〜３．４％、タンニン質２〜３％、粘液、炭水化物などが含まれている。 ５〜６年経った木で精油含量が多いという。 桂皮は昔から発汗剤、解熱剤、鎮痛剤のみならず食料品の香料など多様に使用されてきた。 また、腸連動運動を促進して腸内の異常醗酵を抑制する防腐効果があることが知られているが、具体的な機序は知られていない。

また、桂皮は昔から体質が虚弱で気血が虚弱な人のための漢方薬剤に使用され、免疫能力を促進する効果があることが予想されてきたが、その正確な機序も報告されたことがない。 したがって、免疫反応に関与する器官である白血球系細胞（リンパ球、血漿細胞、食細胞、顆粒球）またはリンパ器官（リンパ節、脾臓、胸腺、腸）に桂皮がどのような影響を及ぼすのか観察すると、その機序を知ることができるだろう。 特に、腸管免疫体系は、外部から入ってくる多くの飲食物抗原と正常菌叢が一緒に共存する所で免疫寛容が起きていることを示した端的な例である。 腸管免疫体系は、飲食物や正常細菌叢のような無害な抗原に対しては反応しないながらも、有害菌やウイルスのような有害な抗原に対しては選択的に反応する体系（免疫学的恒常性）を維持している。 腸内恒常性は、正常の場合、無害な抗原等に対する口腔免疫寛容と有害な抗原等に対する免疫作用によって維持されるが、腸内でなんらかの機序によって口腔免疫寛容が壊れるようになると、飲食物に混じった抗原に対する反応や正常細菌叢及び腸壁自体に対する免疫反応が発生する炎症性腸炎が誘発されて、腸の消化機能及び排泄機能に大きな障害を受けるようになる。 腸管免疫は、１次と２次に分けられるリンパ組織系の中で２次リンパ組織系に分類される生体リンパ組織の１／３以上を占める粘膜リンパ器官の３種の中で腸管関連リンパ組織に属しながら、腸管の粘膜部位に存在して腸管免疫系内免疫グロブリンＡ反応（ＩｇＡ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を始めとする生体防御に非常に重要な役割を担当する（Ｂｉｅｎｅｓｔｏｃｋ，Ｊ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８０年，第４１巻，２４９〜２７０頁）。 腸管免疫の主要役割は、可溶性抗原、細菌、ウイルスなどを細胞吸収作用（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）や食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって接種して、リンパ細胞に移動させることで細胞の活性化に寄与する（Ｔｒｉｅｒ，Ｊ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．，１９９１年，第２０巻，５３１〜５４７頁。

桂皮抽出物を含む組成物関連特許では、桂皮抽出物を含む動脈硬化症予防及び治療用組成物（大韓民国特許第１０−１９９８−００２１４７４号）、肉桂皮抽出物を含む化粧料組成物（大韓民国特許第１０−１９９９−００３４７０７号）及びナノ粒子化された桂皮抽出物を含む口腔衛生増進用組成物（大韓民国特許第１０−２００２−００７４２１０号）が挙げられるが、前記特許のいずれにも桂皮の腸内菌叢改善と免疫増進活性に対しては記述していない。

それで、本発明者等は、本発明の桂皮抽出物を有効成分とする組成物が腸内有益菌であるビフィドバックテリウムロンガム、ラクトバチルス属とラクトバチルスアシドフィラスに対して生育促進効果を示し、脾臓と腸管内のリンパ球のような免疫細胞を増殖させる機能があって、便秘、腸関連疾患治療剤及び免疫増進剤、特に腸管系免疫増進剤として使用することができることを確認して本発明を完成した。

本発明の目的は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸内菌叢改善用組成物を提供することである。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む免疫増進用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸管系免疫増進用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む免疫増進用健康食品を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸内菌叢改善用組成物を提供する。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む免疫増進用組成物を提供する。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸管系免疫増進用組成物を提供する。

また、本発明は、腸内菌叢を改善することができる量の桂皮抽出物を対象に投与する工程を含む腸内菌叢改善方法を提供する。

また、本発明は、免疫増進が求まられる患者に免疫増進に適合した量の桂皮抽出物を投与する工程を含む免疫増進方法を提供する。

また、本発明は、薬理学的有効用量の桂皮抽出物を対象に投与する工程を含む治療を要する患者の腸関連疾患の治療方法を提供する。

同時に、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む免疫増進用健康食品を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸内菌叢改善用組成物を提供する。

桂皮（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ ｂａｒｋ）は、クスノキ科の常緑喬木の皮で、中国の南部やベトナム等に自生する。 昔から発汗剤、解熱剤、鎮痛剤のみならず食料品の香料など多様に使用されてきて、腸連動運動を促進して腸内の異常醗酵を抑制する防腐効果があることが知られているが、具体的な機序は知られていない。

一方、微生物が腸器官内に棲息し始めて集団が平衡に到達することにより、腸内菌叢を形成する。 腸内菌叢を構成する個々の微生物は、ビタミン供給、感染防止及び腸機能などに関与し、それにより菌叢の組成は、便秘、腸関連疾患発生などと深い関係があることが知られている（ＭｉｓｔｕｏｋａＴ． Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，１９８２年，第１（１）巻，３頁）。

本発明者等は、腸機能改善効果があることが知られた桂皮抽出物が、腸内有益菌にいかなる活性を示すのか調べた。 まず、乾燥した状態の桂皮（ファジン流通）を収得して、それを熱湯抽出器で３時間抽出した後、前記抽出液をろ紙でろ過して減圧蒸留装置で濃縮し、凍結乾燥してそれを粉末にした。 前記抽出粉末試料を実験ごとに必要な濃度になるように滅菌蒸留水に懸濁させた後、ろ過して使用した。

本発明の桂皮抽出物は、水、単一または混合エーテル、エチルアルコール、メタノール及びエチルアセテートからなる群から選択された一つ以上の溶媒で抽出して減圧濃縮することによって製造され、前記溶媒は水を使用するのが好ましく、前記抽出は熱湯、冷浸、還流または超音波などの方法によることができるが、熱湯抽出であることが好ましい。

一方、多様な腸内菌叢の中で腸内有益菌の指標にビフィドバックテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ１５７０７）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＣＴＣ ３９３０）、ラクトバチルスアシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ４３５６）を使用するが、前記菌株等は、ＲＣＭ（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｍｅｄｉａ）培地で３７℃ＢＢＬ ＧａｓＰａｋ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に入れた嫌気的条件で培養して使用した。

本発明者等は、桂皮抽出物がビフィドバックテリウムロンガム、ラクトバチルス属及びラックトバシロスアシドフィラス菌株の生育活性に及ぼす影響を調べることにした。 そのために粉末試料に製作した桂皮抽出物を様々な濃度で添加した培地を作って、ビフィドバックテリウムロンガム、ラクトバチルス属及びラックトバシロスアシドフィラスの全培養液を培地に接種して培養した後、Ｏ． Ｄ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して菌の生育状態を調査した。 その結果、桂皮抽出物の量を増やすほど菌株の生育が増加してＯ． Ｄ． 値が高くなって、生育活性比（実験群のＯ．Ｄ値／対照群のＯ．Ｄ．値）も増加することを観察した（図１参照）。

また、直径６ｍｍディスクペーパーに多様な濃度で桂皮抽出物を滴下した後、ディスクペーパーを固めた培地上に一定間隔をおいて配置して、前記菌株を培養した後、生育活性環の大きさを観察した。 その結果、表１に示したように、桂皮抽出物１０ｍｇ／ｄｉｓｃを配置した固体培地でビフィドバックテリウムロンガム、ラクトバチルス属及びラックトバシロスアシドフィラス菌株は、すべて広い生育活性環を示し、本発明の桂皮抽出物が腸内有益菌に生育活性効能を有することを確認した（表１参照）。

また、桂皮抽出物をマウスに経口投与してマウスの血液構成成分がどのように変化するかも観察することにし、そのために、１５日間５００ｍｇ／ｋｇ／日の量で桂皮抽出物を経口投与してその結果を観察した。 １５日後、血液構成成分は対照群と比較して有意な差を示さなかった（表２参照）。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む免疫増進用組成物を提供する。

本発明者等は、気血補充のための漢方薬に使用されてきた桂皮抽出物が実際に生育活性効能のみならず免疫細胞増殖能を有するのかどうか観察することにした。 そのために、桂皮抽出物を投与したマウスの脾臓からＴ細胞を分離して分裂能力を測定した結果、高い分裂能力を示した（図９）。

また、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸管系免疫増進用組成物を提供する。 腸管系免疫は、一般体液性免疫とその作用領域及び機序において大きな差が存在するので、特定物質が体液性免疫増進作用があるといっても、当該物質が直ちに腸管系免疫増進作用があるとすることはできない。 本発明者等は、桂皮抽出物をマウスに経口投与して腸管免疫系と一般免疫系に及ぼす影響を観察するために、マウスに桂皮抽出物を経口投与した後、腸内免疫反応の指標になる腸免疫細胞（腸リンパ節Ｔ細胞とＢ細胞、ラミナプロプリア単一核細胞）のサイトカイン発現量を観察した。 その結果、驚くべきことに桂皮抽出物を投与時、対照群に比較して免疫反応を促進及び制御するサイトカインの分泌制御を通じて腸内免疫活性が調節され得ることを確認した（図２ないし図８及び図１０参照）。

本発明の腸内菌叢改善及び免疫機能増進用薬学組成物は、前記桂皮抽出物を有効成分として含み、前記桂皮抽出物は臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。 好ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤などの経口投与用製剤があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、加溶化剤、懸濁化剤、保存剤または増量剤などを使用して調剤することができる。

本発明の腸内菌叢改善及び免疫機能増進用薬学組成物で、桂皮抽出物の投与用量は、患者の状態、年齢、性別及び合併症などの多様な要因によって専門家が決定することができるが、一般的には成人１ｋｇ当たり０．１ｍｇないし１０ｇ、好ましくは１０ｍｇないし１ｇの用量で投与することができる。 また、単位剤形当たり前記桂皮抽出物の１日用量またはその１／２、１／３または１／４の用量が含有されるようにして、一日に１ないし６回投与することができる。 しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期間摂取の場合には、前記量は前記範囲以下であリ得、有効成分は安全性面で何らの問題がないので、前記範囲以上の量でも使用することができることは確かである。

本発明の桂皮抽出物の原料である桂皮は、天然薬剤として安全性が確保されていて、特に本発明の桂皮抽出物をラットに経口投与して毒性実験を遂行した結果、毒性試験による５０％致死量（ＬＤ _５０ ）は、少なくとも桂皮抽出物１０ｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判明した。

同時に、本発明は、桂皮抽出物を有効成分として含む腸内菌叢改善及び免疫機能増進用健康食品を提供する。

本発明の桂皮抽出物を食品に使用する場合、前記抽出物をそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりして、通常的な方法によって適切に使用することができる。 有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康または治療的処置）により適合して決定することができる。 一般的に、本発明の桂皮抽出物を食品または飲料の製造時に原料に対して４０ないし７０重量％、好ましくは５０ないし６０重量％の量で添加することができる。 健康食品の桂皮抽出物の有効用量は、前記薬学的組成物の有効用量に準じて使用することができるが、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下があり得、有効成分は安全性面で何らの問題がないので前記範囲以上の量でも使用することができることは確かである。

前記食品の種類には特別な制限がない。 前記桂皮抽出物を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などを挙げることができる。

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
下記の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞実験材料＜１−１＞桂皮抽出物の製造ファジン流通から購入した乾燥桂皮を粉砕した後、熱水抽出器で３時間抽出した。 桂皮熱水抽出物は、ろ過紙でろ過して上澄み液は回転式真空濃縮蒸発機で濃縮した後、凍結乾燥機（イルシン）を使用して凍結乾燥して抽出粉末試料を作った。 前記抽出粉末試料を必要な濃度になるように滅菌蒸留水に懸濁させた後、ろ過して使用した。

＜１−２＞腸内細菌準備腸内有益菌の指標にビフィドバックテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ１５７０７）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＣＴＣ３９３０）、ラクトバチルスアシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ４３５６）を使用した。 菌株等は、ＲＣＭ（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｍｅｄｉａ、Ｄｉｆｃｏ、米国）培地で３７℃ＢＢＬ ＧａｓＰａｋ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）に入れた嫌気的条件で培養して使用した。

＜実施例２＞桂皮抽出物が腸内有益菌の生育活性に及ぼす影響確認本発明の桂皮抽出物が腸内有益菌の中でビフィドバックテリウムロンガム、ラクトバチルス属及びラクトバチルスアシドフィラス菌株の生育活性に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を遂行した。 桂皮抽出物が腸内有益菌の生育活性に及ぼす影響に対する実験は、３回繰り返して実施し、実験結果は水で処理した対照群に対する桂皮抽出物を処理した実験群のＯ． Ｄ． 値の比で示した。

＜２−１＞液体培養による生育活性実験桂皮抽出物が腸内細菌の生育に及ぼす影響を調査するために、桂皮抽出物を凍結乾燥させて作ったエキス基質を、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ／ｍｌ濃度で添加した変形されたＥＧ（Ｅｇｇｅｒｔｈ Ｇａｇｎｏｎ）培地（ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ２ｇ、ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｎｏ．３ １０ｇ、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ、Ｎａ _２ ＨＰＯ _４ ４ｇ、ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ０．５ｇ、ｇｌｕｃｏｓｅ １．５ｇ、Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ０．４ｇ、ｓｉｌｉｃｏｎ ａｎｔｉｆｏａｍｅｒ ０．２５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５ｇ、Ｄ．Ｗ １，０００ｍｌ）を作った。 ここに実施例＜１−２＞のように嫌気的条件で活性化させたビフィドバックテリウムロンガム、ラクトバチルス属及びラクトバチルスアシドフィラスの全培養液を接種して嫌気的に３７℃で１８時間培養した後、６００ｎｍでＯ． Ｄ． を測定することにより菌の生育状態を調査した。

実験結果は、水で処理した対照群のＯ． Ｄ． 値に対する桂皮抽出物を処理した実験群のＯ． Ｄ． 値の比で示した。 桂皮抽出物を含んだ液体培地で腸内有益菌の生育活性位を測定した結果、図１に示したように桂皮抽出物の量を増やすほど菌株の生育が増加してＯ． Ｄ． 値が高くなったが、桂皮抽出物１０ｍｇ／ｍｌで添加した時、対照群と比較して最大２．４倍ラクトバチルス属の生育を促進し、ビフィドバックテリウムロンガムとラクトバチルスアシドフィラス菌株も桂皮抽出物の濃度の増加につれて菌株の生育活性比も増加することを観察した。

＜２−２＞アガー分散法（Ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）による生育活性実験ＥＧ寒天培地を滅菌した後、５０℃に冷やして３種の菌株が各々２〜３％含まれるように菌主を接種したプレート３個を作った後、常温で培地を固めた。 直径６ｍｍディスクペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ Ｎｏ．４１）に、０．１ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ濃度になるように桂皮抽出物を滴下した後、これを固めた培地上に一定間隔をおいて配置した。 前記培地を嫌気的条件で３７℃で４８時間培養した後、生育活性環の大きさを観察した。 その結果、表１に示したように、桂皮抽出物１０ｍｇ／ｄｉｓｃを配置した固体培地でビフィドバックテリウムロンガム菌株は＋程度の生育活性環を示し、ラクトバチルス属菌株は＋程度の生育活性環を示し、ラクトバチルスアシドフィラス菌株は＋＋＋程度の広い生育活性環を示して本発明の桂皮抽出物が高い生育活性効能を有することを確認した。
表１：桂皮に対する腸内菌叢改善活性結果

ｎ：無効果、＋：直径１０〜１４ｍｍ
＋＋：直径１５〜１９ｍｍ、＋＋＋：直径２０〜２４ｍｍ
−：抑制ゾーンの直径１０〜１４ｍｍ
＜実施例３＞マウス経口投与時の桂皮抽出物が血液に及ぼす影響確認本発明者等は、桂皮抽出物をマウスに経口投与した時の血液構成成分の変化を観察することにした。 そのために、６週齢の雄マウスを対照群、桂皮抽出物経口投与群（各群当り３匹ずつ）に分けて１５日間５００ｍｇ／ｋｇ／日の量で桂皮抽出物を経口投与した。 血液組成の分析は、クルトカウンター（ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ，ＣＯＬＵＴＥＲ ＪＴ）を使用し、結果は表２に示した。

表２に示したように、マウスに桂皮抽出物を経口投与した時、投与群と対照群は有意的な差を示さなかった。

＜実施例４＞マウスの腸管系免疫増進効能確認＜４−１＞マウス腸免疫細胞分離桂皮抽出物の口腔投与時のホストの免疫体系に及ぼす影響を調べるためにマウス脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、リンパ節（ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）、腸リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）、ラミナプロプリア（Ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を各々分離した。

具体的に、桂皮抽出物の口腔投与を終えた後、実験用マウスを犠牲して脾臓、腸リンパ節そして腸を摘出した後、脾臓と腸リンパ節からＴ細胞とＢ細胞の分離のために「磁気的方法」を使用した。 磁気的方法というのは、Ｔ細胞とＢ細胞に特異的な磁気ビードを使用して、Ｔ、Ｂ細胞に結合させた後、それを強い磁場の上に位置するようにして、磁気ビードが付いたＴ、Ｂ細胞が磁場に固定されるようにして、非特異的細胞等を除去後に磁場を除去することで所望するＴ細胞とＢ細胞を獲得する方法である。

腸からラミナプロプリア単一核細胞を分離するために一旦腸を摘出した後、それをコラゲナーゼ酵素（Ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，Ｓｉｇｍａ，米国）を使用して腸の筋肉組織を一次的に除去した後（３時間、１％コラゲナーゼ処理）筋肉組織の下に位置しているラミナプロプリア層で細胞を単一細胞化させた後、最後にフェルコル（ｆｅｒｃｏｌｌ）濃度勾配方法を使用して生きているラミナプロプリア単一核細胞を獲得した。

＜４−２＞マウス腸リンパ節のＴ免疫細胞が分泌するサイトカイン発現量測定ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、米国）とイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、Ｋａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して細胞に刺激を与え、生体内条件と近くするために生体内Ｔ細胞を対象に行なう実験で使用されるＣＤ３とＣＤ２８抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）を使用して一定時間（４８時間）刺激を加えた後、腸リンパ節に位置するＴ細胞で現れる変化様相を確認してみた。

その結果、腸リンパ節にＴ細胞で有意に現れたタンパク質（免疫誘導物質）の変化は、２種程度を確認することができたが、まず、腸リンパ節Ｂ細胞で現れたＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の場合、Ｂ細胞の結果と同じに刺激にかかわらず対照群細胞に比較してｍＲＮＡ発現量が多いことを確認することができた。 しかし、現在桂皮抽出物によって誘導されると報告されていたインターフェロンガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ）の場合は、細胞が受ける刺激によって異なるパターンを示し、桂皮抽出物によっては増加する傾向を確認することができた（図２及び図３）。

＜４−３＞マウス腸リンパ節のＢ免疫細胞が分泌するサイトカイン発現量測定マウスに１０日間桂皮抽出物を５００ｍｇ／ｋｇ／日、５０００ｍｇ／ｋｇ／日を口腔投与した後、マウスを犠牲にして磁気的方法によって腸リンパ節からＴ細胞とＢ細胞を分離した。 前記ＰＭＡとイオノマイシンを使用して分離した細胞に刺激を与え、さらに動物の実際状況に近づけるためにｉｎ ｖｉｖｏＢ細胞を刺激するために使用されるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓｓｃａｒｉｄｅ）を使用して、同様にＢ細胞に４時間刺激を加えた後、各グループのＢ細胞が示す変化を確認した。

その結果、対照群に比較して実験を通じて確認した分子物質の中で、実験群で有意な変化があることが確認されたが、まず、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の場合、対照群では発現量がほとんど確認できないほどに微々だったが、５００ｍｇ／ｋｇ／日、５０００ｍｇ／ｋｇ／日経口投与した二つのグループは、すべて対照群と比較して刺激にかかわらず特異的な過発現パターンを確認した（図４）。 インターロイキン−４の場合も、先のＴＮＦ−αタンパク質の場合と同じ発現様相を示し（図５）、インターロイキン−１０の場合は、刺激がない時とＰＭＡ／イオノマイシン刺激が加えられた時は、対照群に比較して小幅の増加を示したが、ＬＰＳを使用して刺激を与えた時は、対照群と比較して約１００倍以上発現量が増加することが確認された（図６）。 そればかりではなく、インターフェロンガンマの発現量も濃度に依存的な傾向を示し、刺激の種類にかかわらず顕著に増加することを確認することができた（図７）。

＜４−４＞マウスラミナプロプリア（Ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｍｏｎｏ−ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）に位置する免疫細胞が分泌するサイトカイン発現量測定 一般的に腸管免疫系に対する研究をする時、最も重要視される細胞がラミナプロプリア単一核細胞である。 この細胞は、腸の外被細胞の真下に位置する免疫細胞で、腸管免疫を調節する最大の細胞であると認識されている。 しかし、多くの研究者等がその細胞の獲得が難しいためにそれを使用した実験ができないでいる実情である。 しかし、本実験に先立って実験方法で言及したような方法でラミナプロプリア単一核細胞を獲得する方法を確立し、それによってその細胞を使用して先で進行した実験と同一な方法で刺激を与えて（ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ，ＬＰＳ，抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８）桂皮抽出物に対するｍＲＮＡ発現量の変化を確認した。 ラミナプロプリア単一核細胞に対する桂皮抽出物に対する反応物質分析結果は、特異的にインターフェロンガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）が対照群に比較して大きな変化を示すことを確認することができた。 （図８）。

＜実施例５＞マウス脾臓と腸リンパ節免疫増進効能確認＜５−１＞マウス脾臓Ｔヘルパー細胞分離マウス脾臓からＣＤ ^４＋ Ｔヘルパー細胞を分離するために実験用マウスを犠牲にした後、脾臓を摘出した。 脾臓の摘出後、脾臓の組織を物理的力で破壊して単一細胞が通過することができる程度のフィルター（４０μｍ ｎｙｒｏｎ ｍｅｓｈ；Ｆａｌｃｏｎ）に流してやって単一細胞化した。 脾臓細胞の単一化後、ＣＤ ^４＋ Ｔ細胞の分離を磁気的方法を通じて分離した後、ＣＤ４に特異的に結合することができる金属性ビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，米国）を添加して、まずＣＤ ^４＋ Ｔ細胞表面に付くようにした。 その後、細胞を強い磁場上に位置させて金属性ビードが付いていない細胞等を除去して、その後、磁場を除去する方法によってＣＤ ^４＋ Ｔ細胞をマウス脾臓から獲得することができた。

＜５−２＞桂皮抽出物の口腔投与時のマウス脾臓と腸リンパ節Ｔ細胞に分裂能力に及ぼす影響の評価漢方でよく知られた事実を基にして本実験者は、桂皮抽出物の口腔投与がホストＴ細胞に分裂能力に及ぼす影響を評価してみた。 実験に先立って、８週間２０回にわたって実験用マウスに桂皮抽出物を（５００ｍｇ／ｋｇ／１回）を口腔投与し、口腔投与が終わった後、マウスを犠牲にして脾臓と腸リンパ節を摘出した。 摘出された二つの組織で先で言及した方法と同じ方法でＣＤ ^４＋ Ｔヘルパー細胞を分離した。 分離したＴ細胞の分裂能力測定のために一旦同一数の細胞に抗−ＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍｌ）及び抗−ＣＤ２８抗体（１ｕｇ／ｍｌ）で刺激後、約３日間細胞培養を通じて細胞が刺激に対して充分に反応及び分裂することができる時間を与えた。 その後、放射線同位元素（［ ^３ Ｈ］−チミジン）を一定量添加してそれが細胞内ＤＮＡに結合するようにして、増加した細胞の数を放射性同位元素の放射能を測定することで細胞の分裂程度を比較した。 その結果、ＰＢＳを口腔投与したＴ細胞に比較して桂皮抽出物を投与したＴ細胞が脾臓と腸リンパ節のすべてで刺激に対してさらに高い分裂能力を有していることを確認することができた（図９）。

＜５−３＞桂皮抽出物の口腔投与時のマウス脾臓と腸リンパ節Ｔ細胞にインターフェロン−ガンマとＴＮＦーαの発現能力測定先行実験を通じて桂皮の口腔投与がＴ細胞で免疫増強作用をして、免疫に代表的なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＮＦγとＴＮＦαの発現量を刺激に反応して無投与グループのＴ細胞に比較してｍＲＮＡレベルを増加させることを確認することができた。 このような実験結果を基にしてタンパク質水準で上の二つのサイトカインの発現を評価してみた。 そのために前記実験と同じ方法で桂皮を口腔投与した実験マウスとＰＢＳを口腔投与した実験マウスの脾臓と腸リンパ節の各々からＴ細胞とＢ細胞を分離した。 このように分離したＴ細胞とＢ細胞がサイトカインを生産できるように一定時間ＰＭＡとイオノマイシンを使用して刺激を与えた後、その刺激によって生産されたサイトカインの細胞外部への放出を防ぐために Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｂｉｏｃｏｍｐａｎｙ；Ｂ９０１ＭＧ、米国）を刺激を受けた細胞に処理してＥＲでの生成タンパク質の移動を防ぐ作業をした。 このように一定時間ＥＲ内でのタンパク質の移動を防止した後、細胞に透過緩衝溶液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ；０．５％ ｓａｐｏｎｉｎ，１％ ＢＳＡ ｉｎ Ｄ．Ｗ）を使用して細胞膜に穴を作って、そのように穴が作られた細胞に特定蛍光物質（抗−ＩＦＮ−ＰＥ、抗−ＴＮＦａ−ＰＥ）で標識されているＩＮＦγとＴＮＦαを添加して細胞内部で作られたサイトカインの量を流細胞測定機を使用して測定した。

その結果、桂皮を口腔投与した場合、対照群（ＰＢＳ投与実験マウス）に比較して脾臓のＴ細胞ではＴＮＦαの発現が軽微に増加することが分かり、腸リンパ節Ｔ細胞ではその発現量の増加が非常に大きくなることを確認することができた。 しかし、ＩＮＦγの発現増加はほとんど確認することができず、Ｂ細胞では二つのサイトカインすべてが対照群と実験群で差を確認することができなかった（図１０）。

＜実施例６＞ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイシステムで免疫増進効能確認＜６−１＞桂皮抽出物がサイトカインの発現に及ぼす影響に対するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングｉｎ ｖｉｖｏ実験に先立って桂皮抽出物がホストの免疫体系にどんな影響を及ぼすかに対する間接的実験として、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（ＴａＫａＲａ，日本）を使用して、桂皮抽出物が免疫細胞のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の発現に及ぼす影響をスクリーニングした。 まず、ルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター（ｐＸＰＧ ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ，２０００年，第４４巻，１７３−１８２頁）前方にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２４、ＴＮＦ−αサイトカインのプロモーター地域をクローニング方法を通じて挿入して、ルシフェラーゼの活性がアップストリームのサイトカインプロモーターの発現程度によって調節されるように組換えベクターを作った。

前記製造過程は、具体的に、ＸｈｏＩそしてＫｐｎＩ制限酵素を使用してルシフェラーゼが発現し始める部位の前部分を切ってベクターを準備し、インサートの場合はマウスからＴ細胞を分離した後、ゲノムＤＮＡを抜き出した後、それで各プローモーター特異的で両方の端にＸｈｏＩとＫｐｎＩ制限酵素位置をそして、前方に開始コドンを有するプライマーを使用してＰＣＲ方法を使用してプロモーター部位を増幅後、増幅されたプロモーターを二つの制限酵素を使用して切った後、それをまた精製して準備した後、このように準備したベクターとインサートをリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して連結させた。

前記のように作られた組換えベクターでマウスＴ細胞株の一種であるＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ−３９）をｌｉｐｏｐｌｅｘ方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）を使用して形質感染させた後、桂皮抽出物だけでまたは、桂皮抽出物とＰＭＡ＋イオノマイシンでＴ細胞株に刺激を一定時間与えた後、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ分析用キット（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して測定した。 実験に使用した遺伝子プロモーターは、先で言及したしたのと同じくＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２４、ＴＮＦ−αの五種を測定したが、数回の繰り返し実験を通じて桂皮抽出物の刺激によって活性が増加するサイトカインがＴＮＦαであることを確認することができた。 すなわち、桂皮抽出物で細胞株に刺激を与えた場合、刺激を与えなかった場合と比較して濃度別にその活性が増加して、１％の桂皮抽出物で刺激を与えた場合約５〜６倍のルシフェラーゼ活性を示すことを確認することができ、桂皮抽出物とＰＭＡ＋イオノマイシンを一緒に刺激を与えた場合には０．１％と０．３％濃度で一緒に刺激を与えた時、単にＰＭＡ＋イオノマイシンで刺激を与えた時よりその活性が増加することを確認することができた（図１１）。

＜実施例７＞ラットに対する経口投与急性毒性実験６週齢の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ，ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して急性毒性実験を実施した。 群当り５匹ずつの動物に実施例１によって調剤された桂皮抽出物を０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して、１ｇ／ｋｇ、５ｇ／ｋｇ及び１０ｇ／ｋｇの用量で１回単回経口投与した。 試験物質投与後、動物の斃死の有無、臨床症状、体重変化を観察して血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、部検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常有無を観察した。

その結果、試験物質を投与したすべての動物で特記に値する臨床症状や斃死した動物はなく、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などでも毒性変化は観察されなかった。 以上の結果、本発明の桂皮抽出物は、ラットで１０ｇ／ｋｇまで毒性変化を示さない。 したがって、経口投与中間致死量（ＬＤ _５０ ）は、実施例１によって調剤された桂皮抽出物１０ｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。

＜製剤例１＞軟質カプセル剤の製造実施例１によって調剤された桂皮抽出物１００．０ｍｇ、豆油１７５．０ｍｇ、黄蝋４５．０ｍｇ、椰子硬化油１２７．５ｍｇ、大豆リン脂質２１．０ｍｇ、ゼラチン２１２．０ｍｇ、グリセリン（比重１．２４）５０．０ｍｇ、ジ−ソルビトール７６．０ｍｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．５４ｍｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０．９０ｍｇ、メチルバニリン０．５６ｍｇ、黄色２０３号適量の成分が、１カプセル中に含有されるように薬典製剤総則中の軟質カプセルの製法によって製造した。

＜製剤例２＞錠剤の製造実施例１によって調剤された桂皮抽出物１００．０ｍｇ、とうもろこし澱粉９０．０ｍｇ、乳糖１７５．０ｍｇ、エル−ヒドロキシプロピルセルロース１５．０ｍｇ、ポリビニルピロリドン９０ ５．０ｍｇ及びエチルアルコール適量の原料を均質に混合して湿式顆粒法で顆粒化してステアリン酸マグネシウム１．８ｍｇを加えて混合した後、１錠が４００ｍｇになるように打錠した。

＜製剤例３＞カプセル剤の製造実施例１によって調剤された桂皮抽出物１００．０ｍｇ、とうもろこし澱粉８３．２ｍｇ、乳糖１７５．０ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム１．８ｍｇの原料を均質に混合して、１カプセルに３６０ｍｇが含有されるように充填した。

＜製剤例４＞散剤の製造桂皮抽出物 ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。

＜製剤例５＞チューインガムの製造実施例１によって製造された桂皮抽出物０．２４〜０．６４％、ゴムベース２０％、砂糖７６．３６〜７６．７６％、フルーツ香料１％及び水２％の組成及び含量にして、通常的方法を使用してチューインガムを製造した。

＜製剤例６＞飲料の製造実施例１によって製造された桂皮抽出物０．４８〜１．２８ｍｇ、蜂蜜５２２ｍｇ、チオクト酸アミド５ｍｇ、ニコチン酸アミド１０ｍｇ、塩酸リボフラビンナトリウム３ｍｇ、塩酸ピリドキシン２ｍｇ、イノシトール３０ｍｇ、オルト酸５０ｍｇ及び水２００ｍｌの組成及び含量にして、通常的な方法を使用して飲料を製造した。

＜製剤例７＞ソーセージの製造実施例１によって製造された桂皮抽出物０．２４〜０．６４％、豚肉６３．６％、鶏肉２７．５％、澱粉３．５％、大豆蛋白１．７％、食塩１．６２％、ブドウ糖０．５％及びその他添加物（グリセリン）０．９４〜１．３４％の組成及び含量にして通常的な方法でソーセージを製造した。

本発明の桂皮抽出物を有効成分として含む組成物は、腸内菌叢改善及び免疫機能増進用組成物は腸内有益菌であるビフィドバックテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｏｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）とラクトバチルスアシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）に対して生育活性効果を示して、一般免疫系及び腸管系免疫系リンパ球のような免疫細胞増殖能を高める機能があるので、桂皮抽出物を添加したヨーグルト製品、桂皮抽出物を添加した乳製品、消化能力が劣ったお年寄りや病床の患者の消化能力を向上させることができる桂皮飲料、漢方消化剤、便秘、宿便治療剤などの腸関連疾患治療剤及び免疫増進剤に使用することができる。

桂皮抽出物を含んだ液体培地で腸内有益菌の生育活性程度を測定した結果を示したグラフである。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウス腸リンパ節から分離したＴ免疫細胞によるＴＮＦαの発現量を測定した結果を示したグラフである。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウス腸リンパ節から分離したＴ免疫細胞によるＩＦＮ−ｇａｍｍａの発現量を測定した結果を示したグラフである。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウス腸リンパ節から分離したＢ免疫細胞による各種サイトカインの発現量を測定した結果を示したグラフで、ＩＬ−４の発現量を測定した結果を示す。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウス腸リンパ節から分離したＢ免疫細胞による各種サイトカインの発現量を測定した結果を示したグラフで、ＩＬ−１０の発現量を測定した結果を示す。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウス腸リンパ節から分離したＢ免疫細胞による各種サイトカインの発現量を測定した結果を示したグラフで、ＩＦＮ−ｇａｍｍａの発現量を測定した結果を示す。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウス腸リンパ節から分離したＢ免疫細胞による各種サイトカインの発現量を測定した結果を示したグラフで、ＴＮＦ−αの発現量を測定した結果を示す。

桂皮抽出物を経口投与した時、マウスラミナプロプリナから分離した単一核細胞によるＩＦＮ−ｇａｍｍａ発現量を測定した結果を示したグラフである。

桂皮抽出物を経口投与した後、脾臓と腸リンパ節からＣＤ

^４＋ Ｔ−細胞分離後、抗−ＣＤ３抗体及び抗−ＣＤ２８抗体で刺激を与えた後、Ｔ−細胞増殖力を測定したグラフである。

マウスに桂皮抽出物を経口投与した後、脾臓と腸リンパ節からＣＤ

^４＋ Ｔ−細胞とＢ−細胞分離後、ＰＭＡとイオノマイシンで６時間刺激後、ＴＮＦαとＩＦＮ−ｇａｍｍａの細胞内生成量を流細胞分析機で測定したグラフである。

マウスリンパ腫Ｔ−細胞であるＥＬ４細胞にＴＮＦαｌａｐｈａレポーターベクターを発現させた後、桂皮抽出物処理した時、投与濃度によって変化するレポーター遺伝子の発現程度を測定したグラフと、ＰＭＡ及びイオノマイシンと桂皮抽出物を一緒に処理した後、変化するレポーター遺伝子の発現程度を測定したグラフである。