【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】 本発明は脂質主体コクリエート（渦巻形）送達システムの新規な調製方法、脂質主体コクリエート送達システムから誘導される薬学的製剤、および生物学的関連分子の有効な全身および粘膜投与を達成するためのこれらの薬学的製剤の使用に関する。 【０００２】 【従来の技術】 経口経路にて投与される生物学的関連分子の性能は、いくつかの要因に依存する。 生物学的関連分子は、該生物学的関連分子が活性輸送機構のための生物学的膜を通って移送されるためには、消化液中に溶解しなければならないか、あるいは小腸のパイエル板を通り、かつ、リンパ系を通って吸収され得る適当に小さな粒子サイズでなければならない。 粒子サイズは経口投与が達成されるべき場合には重要なパラメーターである（Couvreur P. et al, Adv. Drug Delivery Review
s 10:141-162, 1993) 。 【０００３】 薬剤を経口にて投与する性能における第１の問題は、タンパク分解酵素から薬剤を保護することである。 理想的な手法とは、薬剤を疎水性物質中に組み入れて 、水溶性液体がこのシステムを通過できないようにすることである。 脂質主体コクリエートは、この目的を達成できる理想的なシステムである。 【０００４】 コクリエートの利点は数多い。 コクリエートは非水溶性構造を有し、したがって、それらは： ａ）脂質が酸化されないから、より安定である； ｂ）凍結乾燥して貯蔵され得る；それは室温で長期間、貯蔵される潜在性をもたらし、全世界への輸送や投与に先立つ貯蔵において長所となるであろう； ｃ）凍結乾燥後ですら、その構造を維持する；一方、リポソーム構造は凍結乾燥によって破壊される； ｄ）コクリエート構造の脂質２相中への生物学的関連分子の有効な組み入れを示す； ｅ）コクリエートが解離するにつれて、インビボにて生物学的関連分子を低放出する潜在性を有する； ｆ）担体として作用する脂質２相を有し、かつ動物および植物細胞膜に見られる単純脂質から構成される；それため脂質は非毒性である； ｇ）容易に、かつ安全に製造される； ｈ）所定量および割合の薬剤または抗原から構成される一定の製剤として製造され得る。 【０００５】 コクリエート構造は大型単層小胞の調製における中間物質として、D. Papahad
jopoulosによって最初に調製されている（米国特許第4,078,052 号参照) 。 ワクチンとしてタンパクまたはペプチド分子を送達するコクリエートの使用は、米国特許第5,840,707 号に記載されている。 しかし、これらの特許のいずれにも粒子の大きさの重要性または小さなサイズのコクリエートによって仲介される生物学的関連分子の有効な経口投与については言及していない。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】 したがって、本発明の目的は１ミクロンより小さい粒子サイズを有するヒドロゲル単離コクリエートを得る方法を提供することにある。 さらに、該方法は治療に有効な量のヒドロゲル単離コクリエート中で少なくとも１つの生物学的関連分子を渦巻形とすることを必要とする工程を含む。 【０００７】 「生物学的関連分子」とは、生物の生命過程において役割を果たすものである。 この分子は有機物または無機物、モノマーまたはポリマー、宿主生物にとって内因性またはそうでないもの、天然に産生またはインビトロ合成のものなどであってもよい。 すなわち、その例としては、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、毒素、殺菌剤、静菌剤、補因子、酵素、ポリペプチド、ポリペプチド凝集体、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、澱粉、顔料、脂肪酸、ホルモン、
サイトカイン、ウイルス、オルガネラ、ステロイドおよび他の多環状構造物、糖類、金属、代謝毒物、薬剤などが挙げられる。 【０００８】 これらおよび他の目的は、渦巻形の生物学的関連分子を提供することによって達成される。 その際、生物学的関連分子・コクリエートは下記成分を含む。 ａ）生物学的関連分子 ｂ）負に荷電した脂質、および ｃ）カチオン成分 その際、渦巻形の生物学的関連分子の粒子サイズは、１ミクロンより小さく、さらに生物学的関連分子は、好ましくは薬剤である。 【０００９】 本発明は、さらに、生物学的に有効な量の上記したコクリエートを宿主に経口投与する方法を提供する。 好ましい態様では、生物学的関連分子・コクリエートは経口から投与される。 【００１０】 【課題を解決するための手段】 本発明は新規な方法を使用して小型コクリエートを生産して、薬剤の有効な経口投与を達成する方法を提供する。 この新規な方法は、ともに水溶性である２種のポリマー溶液間の非相溶性に基づく。 ポリマーの水溶性２相系は、有機溶媒の必要性がないこと、マイルドな表面張力、および水溶性ポリマーの生体適合性などの多くの利点を有することから、タンパク精製においてよく使用されている（
PA Albertsson in "Partition of cell particles and macromolecules", 3rd
edition, Wiley NY 1986;および"Separation using aqueous Phase System" D.
Fischer Eds, Plenum, NY, 1989参照）。 例えば、タンパクなどの大きな極性分子は、ＰＥＧのそれに似た物理的特性をもつポリマー相中よりも、デキストランのそれに似た物理的特性をもつポリマー相中でより高い濃度に分配することが公知である（D. Forciniti, CK Hall, MR Kula, Biotechnol. Bioeng. 38,
986, 1991 ）。 【００１１】 本発明では、小型脂質主体コクリエート粒子およびこれらから誘導した該粒子中に組み込まれた生物学的関連分子を含む製剤の調製方法を提供する。 コクリエート粒子は脂質２相／カチオンの交互配列から形成されている。 生物学的関連分子は脂質２相または脂質２相間の空間のいずれかに組み込まれている。 小型コクリエートの調製方法の１つは、１）小型単層リポソームまたは生物学的関連分子負荷リポソームの懸濁液を調製し、２）該リポソーム懸濁液をポリマーＡと混合し、３）ポリマーＡが非相溶性であって、ポリマーの水溶性２相系となる他のポリマーＢ中へ、好ましくは注入によってリポソーム／ポリマーＡ懸濁液を添加し、４）工程３の２相系へカチオン塩溶液を添加して、カチオンがポリマーＢ中へ、次いで、リポソーム／ポリマーＡからなる粒子中へ拡散し、小型コクリエートを形成し、５）ポリマーを洗い出し、生理的緩衝液または適当な薬学的ビヒクル中へ空または薬剤負荷コクリエートを再懸濁することを含む。 【００１２】 小型コクリエートを調製する第２の方法は、界面活性剤と生物学的関連分子とカチオンを含む。 この方法は下記工程を含む。 ａ）界面活性剤・脂質混合物を含む水溶性懸濁液を準備し、 ｂ）該界面活性剤・脂質懸濁液をポリマーＡと混合し、 ｃ）ポリマーＢを含む溶液中に該界面活性剤・脂質／ポリマーＡ懸濁液を添加し、その際、ポリマーＡとポリマーＢは非相溶性であり、それによって２相ポリマー系を形成し、 ｄ）該２相ポリマー系へカチオン成分の溶液を添加し、かつ、 ｅ）該２相ポリマー系を洗浄して、ポリマーを除去する。 【００１３】 凍結乾燥手法が適用されて、凍結乾燥した生物学的関連分子・コクリエート複合体は、全身、皮膚または粘膜からの投与のために、柔らかいあるいは固いゼラチンカプセル、タブレットまたは他の用量形態中に充填され得る。 【００１４】 この方法は、生物学的関連分子の有効な経口投与を可能とする狭いサイズ範囲をもつ小型粒子となる。 生物学的関連分子は脂質２相およびその中間のいずれか、あるいは双方へ分配し、生物学的関連分子はインビボで粒子の解離によってコクリエート粒子から放出される。 投与の別な経路は、筋肉内、皮下または静脈内などの全身性、または鼻内、眼内、膣内、肛門内、非経口または肺内などの粘膜からであってもよい。 適当な用量は、例えば、実験室動物または臨床試験での用量反応実験から、および患者の体重、吸収率、半減期、疾患の重症度などを考慮して決定され得る。 用量回数、日々の用量および治療過程は個々人により異なるであろう。 他の投与経路は皮膚、経皮膚、また皮膚内である。 【００１５】 本発明の新規な方法の第１工程は、小さなリポソームの調製であり、超音波または微細流動化、または他の関連方法（例えば、Liposome Technology, Liposom
e Preparation and Related Techniques, Edited by Gregory Gregoriadis,Vol.
I, 2nd Edition, CRC Press, 1993) によって達成され得る。 【００１６】 好ましくは注入によるポリマーＢ中へのポリマーＡ／リポソーム懸濁液の添加は、適当な制御速度、例えば、０．１ｍｌ／分〜５０ｍｌ／分、好ましくは１〜
１０ｍｌ／分の速度でシリンジポンプを使用して機械的に行い得る。 【００１７】 本発明の脂質は非毒性脂質であり、動物および植物細胞膜に見出される単純脂質が挙げられるが、これらに限定されない。 好ましくは、脂質は負に荷電した脂質、より好ましくは、負に荷電したホスホリピド、およびさらに好ましくは、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロールの群からの脂質である。 この脂質もまた、少量の両性イオン性脂質、カチオン性脂質、またはＰＥＧ化した脂質などの生物学的関連分子と水素結合を形成することが可能な中性脂質を含む。 【００１８】 本発明のポリマーＡおよびＢは、水溶性２相系を形成することができる全ての生物学的適合性ポリマーの群からなる。 例えば、ポリマーＡはデキストラン２０
０，０００〜５００，０００、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３，４００〜
８，０００で挙げられるが、これらに限定されない。 ポリマーＢはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、フィコール３０，００
０〜５０，０００、ポリビニルメチルエーテル（ＰＶＭＢ）６０，０００〜１６
０，０００、ＰＥＧ３，４００〜８，０００が挙げられるが、これらに限定されない。 ポリマーＡの濃度は、ポリマーの性質に依存して最終濃度２〜２０ｗ／ｗ
％の範囲である。 ポリマーＢにおいても同じ濃度が適用され得る。 適当な２相系の例としては、４〜１０ｗ／ｗ％ＰＥＧ３，４００〜８，０００中、５〜２０ｗ
／ｗ％デキストラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／ＰＥ
Ｇ、１０〜２０ｗ／ｗ％ＰＶＰ１０，４００〜２０，０００中、１０〜２０ｗ／
ｗ％デキストラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／ＰＶＰ
、３〜１５ｗ／ｗ％ＰＶＡ１０，０００〜６０，０００中、３〜１５ｗ／ｗ％デキストラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／ＰＶＡ、１０
〜２０ｗ／ｗ％フィコール３０，４００〜５０，０００中、１０〜２０ｗ／ｗ％
デキストラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／フィコール、６〜１５ｗ／ｗ％ＰＶＭＥ６０，０００〜１６０，０００中、２〜１０ｗ／ｗ
％ＰＥＧ３，５００〜３５，０００であるＰＥＧ／ＰＶＭＥがある。 【００１９】 生物学的関連分子は水溶性媒体において疎水性である有機分子であってもよい。 この生物学的関連分子は薬剤であってもよく、薬剤は抗ウイルス剤、麻酔薬、
抗炎症剤、抗菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、精神安定剤、または血管拡張剤であってもよい。 その例としては、アンホテリシンＢ、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン、テストステロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタミン、カナビノイド、ラパマイシン、プロパニジッド、プロポフォール、アルファジオン、エチノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキソールおよびタキソテレが挙げられる。 【００２０】 生物学的関連分子はシクロスポリン、アンジオテンシンＩ、IIおよびIII 、エンケファリンおよびその類似体、ＡＣＴＨ、抗炎症性ペプチドＩ、II、III 、ブラジキニン、カルシトニン、ｂ−エンドルフィン、ジノルフィン、ロイコキニン、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インシュリン、ニューロキニン、
ソマトスタチン、サブスタンスＰ、チロイド分泌ホルモン（ＴＲＨ）およびバソプレシンなどのペプチドであってもよい。 【００２１】 生物学的関連分子は抗原であってもよいが、該抗原はタンパク抗原に限定されない。 抗原はまた炭水化物またはＤＮＡなどのポリヌクレオチドであってもよい。 抗原性タンパクの例としては、インフルエンザまたはセンダイウイルスからの外皮糖タンパク、動物細胞膜タンパク、植物細胞膜タンパク、細菌性膜タンパクおよび寄生虫膜タンパクが挙げられる。 【００２２】 生物学的関連分子は公知方法によって起源である粒子、細胞、組織または生体から抽出される。 生物学的関連分子の生物活性は維持される必要はない。 しかし、いくつかの例（例えば、タンパクが膜溶融またはリガンド結合活性または免疫系によって認識される複合構成を有する場合）では、生物活性を維持することが望ましい。 これらの例では、膜タンパクの生物活性を破壊しない界面活性剤を含む抽出緩衝液が使用される。 適当な界面活性剤としては、コール酸塩、デオキシコール酸塩などのイオン性界面活性剤、またはツイーン(Tween) 、ＢＲＩＧまたはトリトン(Triton)などの異種ポリオキシエチレン界面活性剤が挙げられる。 【００２３】 この方法を使用すると、生物活性を保持して抗原、より具体的にはタンパクのリポソーム中への再構築、および終局的にはコクリエートとの有効な解離を可能とする。 これは、生物学的活性形において抗原の有効な再構成に悪影響を与える有機溶媒、超音波、または極端なｐＨ、温度、または圧力を避けることができる。 【００２４】 ヒドロゲル単離コクリエートは種々の生物学的関連分子の組み合わせを適当に含んでいてもよい。 小型コクリエートの生成（生物学的関連分子とともに、あるいは該分子なしで）はリポソームを含む水溶性２相ポリマー溶液へ正に荷電した分子を添加して達成される。 コクリエートを製造する上記手法では、正に荷電した分子は、多価カチオンであり、より具体的にはコクリエート生成を誘導することができる２価カチオンである。 好ましい態様では、２価カチオンとしては、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋
、Ｂａ＋＋およびＭｇ＋＋あるいは２価イオンを生成可能な他の要素または負に荷電した脂質とキレートおよび架橋できる多数の正電荷を有する他の構造物が挙げられる。 リポソーム含有溶液への正に荷電した分子の添加もまた、水溶液からコクリエートを沈殿させるために使用される。 【００２５】 コクリエート構造物を単離し、ポリマー溶液を除去するために、コクリエート沈殿物は正に荷電した分子、より具体的には２価カチオンを含む緩衝液で繰返して洗浄される。 洗浄緩衝液への正に荷電した分子の添加は、コクリエート構造が洗浄工程を通じて維持され、これらが沈殿物のままであることを確証する。 【００２６】 コクリエートが懸濁される媒体は、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウムおよび炭酸ナトリウムなどの塩を含むことができる。 この媒体はツイーン８０またはＢＲＩＧまたはトリトンなどのポリマーを含むことができる。 生物学的関連分子・コクリエートは生物学的に許容される適当なビヒクル（例、２
価カチオン含有緩衝液）中に希釈して製造される。 【００２７】 コクリエート粒子は腸溶性である。 コクリエート粒子はゼラチンカプセル内に配置することができ、このカプセルは腸溶性被覆され得る。 【００２８】 本発明の調製法では、ある種の疎水性物質が生物学的関連分子の経口投与における増大した吸収性能をもたらすために添加され得る。 これらの物質は好ましくは長鎖カルボン酸、長鎖カルボン酸エステル、長鎖カルボン酸アルコールおよびこれらの混合物からなる群から選択される。 疎水性物質はリポソーム生成前に、
最初に、あるいは乳化液などの脂肪性ビヒクルの形態として、後の工程で脂質に添加することができる。 【００２９】 当業者は、本発明を実施して治療をなし遂げるために、最も有効な治療手段を決定することができる。 多くの権威ある文書や参考文献の全て、例えば、"Goodm
an & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics", (6th Ed., Go
odman et al., eds., MacMillan Publ. Co., New York, 1980)を参照することができる。 【００３０】 ここに実施例でもって本発明が説明されるが、これらは本発明を限定するように考慮されるべきものではない。 実施例中、断りのないかぎり、全ての割合、パーセントおよび量は重量によるものである。 【００３１】 【実施例】 実施例１． カルシウムにより沈殿したジオレオイルホスファチジルセリンから空ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA)のクロロホルム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を丸底フラスコに入れ、ブチ(B
uchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃で乾燥して薄膜とした。 この回転式蒸発器は０．２μｍのフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封して、次いで冷却され、浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com., Inc.) 中で超音波処理した。 超音波処置は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から平均直径が３５．７±４９．７ｎｍであることを示す。 【００３２】 工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で、４０ｗ／ｗ％デキストラン５００，０００（Sigma)と混合した。 この混合物を次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００（Sigma ）〔ＰＥＧ
８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁性攪拌しつつ、シリンジで注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００
ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００３３】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 この懸濁液に渦巻きを作り(vortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から、コクリエートの平均直径が４０７．２±８５ｎｍであることを示す（図２ｂ）。 【００３４】 実施例２. カルシウムにより沈殿したジオレオイルホスファチジルセリンと１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−
ｎ−（ポリ（エチレングリコール）−５０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の混合物からの空ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）と１，２−ジステアロイル−ｓ
ｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−ｎ−（ポリ（エチレングリコール）−５０００）、（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA)のクロロホルム溶液（重量比、ＤＯＰＳ：ＤＳＰＳ−ＰＥＧ＝１００：
１）を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／
ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き 、窒素で封して、次いで冷却された浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com., Inc.) 中で超音波処理した。 超音波処置は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１００
０の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００３５】 工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ
）〕中へシリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０
００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００３６】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用して再構築した。 位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示す。 【００３７】 実施例３． カルシウムにより沈殿したジオレオイルホスファチジルセリンとｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコ−ピラノシドの混合物からの空ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜をｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ−ピラノシド（ＯＣＧ）溶液１ｍｇ／ｍｌで、ＤＯＰＳ：ＯＣＧの重量比、１
０：１にて水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で簡単に超音波処理した。 【００３８】 工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得た懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜
１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００３９】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示す。 【００４０】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用して再構築した。 位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示す。 【００４１】 実施例４． カルシウムにより沈殿したアンホテリシンＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからのＡｍＢ負荷小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＡｍＢメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）をモル比、１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、４０℃で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が明るい黄色になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで続けた。 【００４２】 工程２：ＡｍＢ−負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００４３】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）からＡｍＢ・コクリエートの平均直径は４０７．３±２３３．８ｎｍであったことを示す（図２ａ）。 【００４４】 実施例５． カルシウムにより沈殿したドキソルビシン（ＤＸＲ）負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＤＸＲ負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）と（ＤＸＲ）のメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を２５ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が明るいピンクになり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００４５】 工程２：ＤＸＲ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液５ｍｌは２／１ｖ／ｖデキストラン／
リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００（Sigma）
と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８
０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１
００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００４６】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、
Coulter N4 Plus）から小型ＤＸＲ・コクリエートの生成を確認した。 【００４７】 実施例６． カルシムにより沈殿したシクロスポリンＡ（ＣＳＰＡ）負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＣＳＰＡ負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＣＳＰＡのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００４８】 工程２：ＣＳＰＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００（Sigma ）〔ＰＥＧ８０００
／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍ
Ｍ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００４９】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別な洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小型ＣＳＰＡ−コクリエートの生成を確認した。 【００５０】 実施例７． カルシウムにより沈殿したネルフィナビール（ＮＶＩＲ）負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＮＶＩＲ負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＮＶＩＲのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００５１】 工程２：ＮＶＩＲ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００５２】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別な洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小型ＮＶＩＲ−コクリエートの生成を確認した。 【００５３】 実施例８． カルシムにより沈殿したリファミピン（ＲＩＦ）負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＲＩＦ負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＲＩＦのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１
０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き 、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００５４】 工程２：ＲＩＦ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム（Sigma ）懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／
（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ
）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００５５】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小型ＲＩＶ−コクリエートの生成を確認した。 【００５６】 実施例９． カルシムにより沈殿したビタミンＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ビタミンＡ負荷小胞の調製 ビタミンＡ（レチノール）は空気酸化に対して感受性を有し、紫外線によって不活性化される。 ビタミンＡは脂質２相内に包埋されると保護される。 この組み込みは下記のようにして達成される。 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とビタミンＡのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００５７】 工程２：ビタミンＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液５ｍｌは２／１ｖ／ｖデキストラン／
リポソーム（Sigma ）懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０
００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００
ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００５８】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から、小型ＲＩＶ−コクリエートの生成を確認した。 【００５９】 実施例１０． カルシムにより沈殿した多価不飽和脂肪酸（ＰＦＡ）負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 ＰＦＡは血中のコレステロール濃度制御に関与する生物学的関連分子であり、
プログラスタンジンの前駆体である。 ＰＦＡは酸化に対して感受性を有し、食品への導入が制限される。 ＰＦＡは酸素存在下に自動酸化と呼ばれる一連の反応を受け、アルデヒドとなり、次いで魚のような不愉快な臭味や風味を有するケトンとなる。 固く包まれた脂質２相にＰＦＡを包埋すると、自動酸化のカスケードを阻止することを助ける。 ＰＦＡ・コクリエートを調製する一般的な方法は下記の通りである。 【００６０】 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＰＦＡ負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＰＦＡのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１
０：１にて丸底フラスコに入れ、回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００６１】 工程２：ＰＦＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ
）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００６２】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 【００６３】 実施例１１． カルシムにより沈殿したシナモンオイル（ＣｉｎＯ）負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＣｉｎＯ−負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＣｉｎＯのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、４０
℃で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００６４】 工程２：ＣｉｎＯ−負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ
）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００６５】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 【００６６】 実施例１２． カルシムにより沈殿したＤＮＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＤＮＡ−負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリンのクロロホルム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi) 回転式蒸発器を使用して、４０℃で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜をｐＣＭＶ−β−ｇａｌ
−ＤＮＡのＴＥ緩衝液の溶液（１ｍｇ／ｍｌ）で水和して、ＤＯＰＳ：ＤＮＡが１０：１であり、１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度に達した。 水和懸濁液を取り除き、
窒素で封し、次いで数分間、渦巻きを作った(vortex)。 【００６７】 工程２：ＤＮＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、ＤＮＡ／リポソーム混合物は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕
中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８０
０〜１，０００ｒｐｍであった。 ＣａＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００６８】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。 【００６９】 実施例１３． カルシウムにより沈殿した空ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃
で乾燥して薄膜とした。 この回転式蒸発器は０．２μｍのフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０
ｍｇ脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き 、窒素で封して、次いで冷却された浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com.
, Inc.) 中で超音波処理した。 超音波処置は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、
倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。 【００７０】 工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで、工程１で得たリポソームは２／１ｖ／ｖデキシトラン／リポソームの懸濁液中で、４０ｗ／ｗ％デキストラン５００，０００と混合した。 この混合物を次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕
中へ磁性攪拌しつつ、シリンジで注入して懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜
１，０００ｒｐｍであった。 ＺｎＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００７１】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＺｎＣｌ２および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(vortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。
レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小型コクリエートの生成を確認した。 【００７２】 実施例１４． カルシウムにより沈殿したアンホテオリシンＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ＡｍＢ負荷小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＡｍＢのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１
０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、４０℃
で乾燥して薄膜を得た。 回転式蒸発器 は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。 次工程は無菌箱内で実施した。 乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。 水和懸濁液を取り除き、窒素で封して、次いで冷却された浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com., Inc.
) 中で超音波処理した。 超音波処理は懸濁液が澄んだ黄色となり（懸濁液Ａ）、
倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）、続けた。 【００７３】 工程２：ＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製 次いで工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４０ｗ／ｗ％デキストラン５００，０００と混合した。 この混合物は次いで、１５ｗ／ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）
〕中へシリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。 攪拌速度は８００〜１，００
０ｒｐｍであった。 ＺｎＣｌ２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。 【００７４】 攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭ ＺｎＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。 懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。 上清を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した。 コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載される。 得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用して再構築した。 レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）からＡｍＢ−Ｚｎ−コクリエートの生成を確認した。 【００７５】 実施例１５． ヒドロゲル単離コクリエートの顕微鏡による観察 光学的顕微鏡の研究を、ヒドロゲル単離コクリエート生成の機械的作用の詳細を得るために、調製手法を使用して段階的に実施した。 図３ａ、ｂおよび４ａ〜ｆに見られる顕微鏡による像は、Ｃａ２＋イオンにより沈殿したＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの各調製段階における形態上の変化を示す。 ＡｍＢ／リポソーム−デキストラン混合物がＰＥＧ溶液に分散されると、相分離が図３ａによって示されるように生じた。 リポソームの分配はＡ
ｍＢの黄色によって示されるように、分散デキストラン相を好んだ。 この分配は各デキストラン粒子にリポソームが単離されることを確証する。 連続相（ＰＥＧ
）中へのカルシウムイオンの添加は、分散相の沈殿生成となった。 最終産物として、小さな針状コクリエートが形成され、顕微鏡下に観察され、これらのコクリエートはＥＤＴＡの添加およびカルシウムのキレートによって単層小胞中へ開いた（図４ａ、ｂ）。 針状形態は、凍結破砕後、走査電子顕微鏡によって確認されさた（図５）。 空およびＡｍＢ−Ｚｎ−沈殿ヒドロゲル単離コクリエート（図４
ｃ、ｄ）および空Ｚｎ−沈殿ヒドロゲル単離コクリエート（図４ｅ、ｆ）において同様な顕微鏡像を得た。 【００７６】 実施例１６． アンホテリシンＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートのインビトロ抗菌活性 カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の成長阻害 酵母のインビトロ感受性分析を行なったて、ＡｍＢ−コクリエート、ＡｍＢアイソマー（ＡｍＢのリポソーム生成）およびＡｍＢ／ＤＭＳＯの阻害および致死効果を比較した。 新しく成長するカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の５つのコロニーをＹＰＤ寒天プレートから（４８時間培養物から）選択し、２ｍ
ｌの２ｘＹＰＤブロス、ｐＨ５．７へ添加した。 この保存溶液のＯＤ５９０を測定し、酵母密度をＯＤ５９０＝０．１に調節し、この懸濁液０．１ｍｌを９６ウェルプレートのそれぞれのウェルへ添加した。 【００７７】 ＡｍＢ／コクリエート、ＡｍＢ／ＤＭＳＯおよびＡｍＢアイソマーを９６ウェルプレートへ添加して、ＡｍＢ最終濃度を０．０７８、０．１５６、０．３１２
５、０．６２５、１．２５および２．５μｇ／ｍｌとした。 ９６ウェルプレートを緩やかに攪拌しながら、３７℃に加熱し、細胞密度を０、２、４、６、２４および３０時間に、９６ウェルプレートリーダー（Molecular Devices Spectramax
340）上で測定した。 図６はＡｍＢ・コクリエートがＡｍＢアイソマー（ＡｍＢ
のリポソーム生成）よりも大きな成長阻害効果を有することを示す。 【００７８】 アンホテリシンＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートの抗菌効果 酵母細胞の部分標本（５０μｌ）を９６ウェルプレートから取り出し、連続的に希釈し（寒天培地上に置くために１：１００００まで）、かつ、血算機(hemoc
ytometer) を使用して計数した。 希釈酵母細胞５０μｌをＹＰＤ寒天プレート上に置き、３７℃で２４時間、加熱した。 黄色のコロニーはQuanitity One TMソフトウェアを装備したBioRad Fluor-S A Multi-Imager を使用して計数した。 【００７９】 ＡｍＢアイソマー、ＡｍＢ／ＤＭＳＯおよびＡｍＢ／コクリエート（０．６２
５μｇＡｍＢ／ｍｌ）で処理した酵母細胞について、加熱３０時間後に全細胞数に対するコロニー形成単位の割合をテストした。 その結果はＡｍＢ／コクリエートがテストした他の抗菌剤に比べて、酵母細胞に対して最も大きな致死効果を有することを示す。 ＡｍＢ・コクリエートによる処理後、酵母生存率はほぼ０％であり、ＡｍＢ／ＤＭＳＯによる処理後、酵母生存率は１２％であった。 ＡｍＢアイソマーは効果的ではなく、酵母生存率５２％であった（図７）。 【００８０】 ＡｍＢコクリエートによるマクロファージ保護 マクロファージなどの粒子補足細胞は、多くの微生物感染に対する防御の第１
線である。 しかしながら、重度のヒトへの臨床的感染を誘導する多くの微生物はマクロファージに感染し、破壊を避けることが示されている。 【００８１】 インビボにてマクロファージは細胞内取り込み機構によって、コクリエートの摂取において重要な役割を果たすことが可能である。 マクロファージはまた宿主防御および真菌類および寄生虫のクリアランスにおいて重要な役割を果たすから、マクロファージとコクリエート間の相互作用を検討することが重要である。 【００８２】 下記実施例はコクリエートがマクロファージによって摂取されることを示す。
マクロファージへ送達された大量のＡｍＢは非毒性であると判断され、生物学的活性形態にてマクロファージ内に残された。 ＡｍＢコクリエートは真菌感染前または後に投与された場合、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)による感染に対してマクロファージに保護をもたらした。 【００８３】 予防的用量摂取：Ｊ７７４Ａ． １マクロファージ（Ｍ）を９６ウェルプレートにて、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１×１０５細胞／ｍｌの濃度で継代培養した。 ＡｍＢコクリエート１００μｌ（ＡｍＢｃ０．２、０．６、１．２５、および２．５μｇＡｍＢ／ｍｌ）、フンギゾーン（Fungizone ）、または空コクリエート（２、６、１２．５、および２５μｇ脂質／ｍｌのＥＣ）を特定濃度で添加した。 プレートを３７℃で一夜、５％ＣＯ２中でインキュベートした。 ２４時間後、培地を取り換えた。 この工程を２回行なった。 カンジダ・アルビカンス（ＣＡ
）を濃度２．５×１０３細胞／ｍｌ、マクロファージに比べて１：２００の割合でプレートに添加した。 プレートを上記した条件下に一夜インキュベートした。 【００８４】 ２４時間インキュベートした後、プレートを取り出し、観察した。 培地を勢いよくピペットで取り出し、細胞を破砕し、この懸濁的２５μｌをサブロー・デキストロース寒天プレート上に置き、次いで、３７℃で一夜、ドライインキュベーター中に置いた。 Ｃ． アルビカンスＣＦＵを翌日、計数した。 図８のデータはマクロファージを負荷したＡｍＢコクリエートが真菌細胞の殺傷に非常に効果的であることを示唆した。 【００８５】 感染後用量摂取：Ｊ７７４Ａ． １マクロファージ（Ｍ）を９６ウェルプレートで継代培養し、次いで一夜、インキュベートした。 インキュベート後、マクロファージにＣＡを２００：１の割合で感染させ、次いで、ＡｍＢｃ、フンギゾン（
Fungizone）またはＥＣを続いて特定濃度で添加した。 ２４時間後、細胞培養物を上記したように観察し、ＣＦＵを測定した。 【００８６】 ＭにＣＡを感染させ、続いてＡｍＢコクリエートを投与したとき、ＣＦＵ数は再びほぼ零であった。 これらの結果は、ＡｍＢコクリエートが洗い出された後、
マクロファージがＣ． アルビカンス感染に対して保護されたように、マクロファージがＡｍＢコクリエートを巻き込み、かつ集中化することを示す（図８）。 【００８７】 反対に、フンギゾーン（デオキシコール酸中のＡｍＢ）、ＡｍＢの最も一般的な臨床形状は、インビトロでマクロファージに対して極めて毒性および致死性を示した。 投与後、５時間以内にペトリ皿に大量の細胞性残骸が見られ、生きたマクロファージの徴候は見られなかった。 【００８８】 顕微鏡観察では、ＡｍＢコクリエートは検討した最高用量でもマクロファージに対して毒性を有しないことを明らかにする。 ＡｍＢコクリエートは高濃度で集積して、大きな膨張小胞となる。 マクロファージを洗浄し、再び２４時間インキュベートした後、大抵の小胞は正常な形態および大きさにもどり、なお、わずかなものは著しく大きくなっていた。 わずかなマクロファージですら、拡大した小胞とともに「移動」していることが認められたた。 ＡｍＢコクリエートは小胞内に集中化し、おそらくＡｍＢは時間とともに徐々に放出される。 【００８９】 実施例１７． アンホテリシンＢヒドロゲル単離コクリエートの静脈投与後のＡ
ｍＢの組織透過評価 アンホテリシンＢの組織透過性は静脈投与後に評価した。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２０〜２３ｇ）群（ｎ＝５）にＡｍＢコクリエート（０．０５ｍｇ／２０ｍ
ｌ）を１８ｇ１／２針サイズを有する１／２ｃｃＵ１００インシュリンシリンジで静脈から（０．６２５ｍｇｑ／ｋｇ）与えた。 予定された屠殺時間（２、５、
１０、２０および４０分、１、２、３、４、６、８、１２、２４、３６および４
８時間）に動物に麻酔薬を与え、心臓穿刺して採血し、次いで安楽死させ、解剖し、目的の組織（脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、脂肪、胃、胃内容物、腸および腸内容物）を取り出し、重量測定した。 ＡｍＢ分析後、試料を抽出溶媒（１
０％メタノール、３５％水、５５％エタノール）と混合し、均質化し、超音波処理して、遠心分離した。 上清の部分標本９０μｌをマイクロバイアル中へ移送し、４０℃に保持したＮｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ−１８カラム（３．９×１５０ｍｍ、
粒子サイズ４μｍ）のＨＰＬＣシステム中へ注入した。 アンホテリシンＢは２９
％メタノール、３０％アセトニトリルおよび４１％２．５ｍＭ ＥＤＴＡでもって流速０．５ｍｌ／分にて溶出し、４０８ｎｍにて検出した。 ＡｍＢ濃度は外部標準曲線により計算した。 【００９０】 図９に、ＡｍＢコクリエート１回静脈投与後の組織露出（exposure）を示す。
肝臓、脾臓および腎臓などの主要組織では大きな透過が見られた。 【００９１】 実施例１８． ＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートによって仲介されたＡｍ
Ｂの経口投与 ＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの経口投与は、一夜絶食したＣ５７Ｂ
Ｌ６マウス（２０〜２３ｇ）へ実施例２の処方剤を胃内投与して試験した。 ９匹のマウスへ用量１０ｍｇ／ｋｇにて処方剤１／１０ｍｌを投与した。 各群から３
匹のマウスを投与後、１、６および２４時間後に屠殺し、続いて器官および組織のＡｍＢ濃度を分析した。 【００９２】 組織および血液試料を以下のように処理した。 組織は抽出溶媒（Ｈ２Ｏ３５％
、メタノール１０％、エタノール５５％、ｗ／ｗ／ｗ ｎｖ／ｖ／ｖ）を添加して１／２０または１／１０倍に希釈し、Ultra-TurrexR装置を使用して均質化した。 部分標本０．５ｍｌを取り出し、１分間超音波処理し、４℃で、１２分間、
７２６０ｒｐｍにて遠心分離した。 上清をＨＰＬＣマイクロバイアルへ移送し、
Ｃ−１８、３．９×１５０ｍｍ、４μｍ粒子サイズの分析カラム上に４０℃で流速０．５ｍｌにて、３０μｌを注入した。 ４０８ｎｍで検出したＡｍＢ濃度は外部標準曲線により計算した。 【００９３】 図１０は組織でのＡｍＢの２４時間、経時プロファイルを示す。 たった３時点がプロットされるにすぎないが、主要組織（肝臓、肺、脾臓および腎臓）での集積が見られる。 【００９４】 多数回用量摂取 マウスの他の２群は１０日間に、１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口から多数回用量摂取を受け、１群は最後の用量後、２４時間で屠殺され、他の群は最後の用量を受けた後２０日に屠殺された。 予定された時点で、マウスに麻酔をかけ、致死させて、組織採取のために解剖した。 組織を１回用量摂取のように処理して、ＡｍＢ
濃度をＨＰＬＣにて測定した。 １０回目の用量後、２４時間で得た結果を図１１
に示し、ヒドロゲル単離コクリエートは治療濃度で胃腸管からＡｍＢの送達を可能とすることを示す。 【００９５】 実施例１９． 健康および感染マウスの生物分布と経口投与後の組織でのカンジダ・アルビカンス濃度の相関関係 図１２はアンホテリシンＢの組織濃度（左スケールのμｇ／ｇ組織）とＡｍＢ
・コクリエートの経口投与後のカンジダ・アルビカンス感染の減少としての効果（右スケールのＣＦＵ／ｇ）との関係を示す（図１２）。 【００９６】 健康なマウスへ１０日間連続して、１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与した後、Ａ
ｍＢが腎臓、続いて肺、脾臓、肝臓および脳で高い濃度を示した。 これは他の組織よりもより低い濃度を示す。 これは疾患状態が異なった濃度で薬剤の薬学動態に影響することを示す。 この現象はグラフから明らかに示される。 組織中のＡｍ
Ｂは５回以上、１５日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日（同じ用量）を経口投与した後のＣ． アルビカンス感染マウスでは健康群よりも低濃度に達する。 これは肺が最低濃度を示す標的組織である場合の分布パターンにおける変化を示す。 【００９７】 ＡｍＢコクリエート処方剤の１５日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日の経口投与は、高い効果をもたらした。 腎臓組織中のＣＦＵ／ｇの減少はコクリエート処方剤において約３．５logである。 肺では、ＡｍＢコクリエート処方剤は完全にＣ． アルビカンスを皆無とし、真菌感染の肺をきれいにする。 コクリエート送達システムは感染動物に高濃度のＡｍＢをもたらし、これはコクリエート処方剤に見られた高効率と関連し、ＡｍＢコクリエートは、全身性カンジダ症の経口治療の適切なビヒクルであることを示す。 【００９８】 さらに、経口投与したＡｍＢコクリエートは最も高用量である５０ｍｇ／ｋｇ
ですら（ＡｍＢコクリエート１０、２０および５０ｍｇ／ｋｇを与えられたマウスの腎臓、ＧＩ管および他の器官で損傷は見られなかった）、非毒性であった。
この高い濃度（５０ｍｇ／ｋｇ）はカンジダ感染マウスモデルにおいて生存率１
００％を示した最低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）の１００倍と均等である。 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１はヒドロゲル単離コクリエートを薬剤とともに、あるいは薬剤なしで得る方法の概念図である。 【図２】 図２ａおよび２ｂは、レーザー光散乱によって測定したアンホテリシンＢ（ＡｍＢ）を負荷した（図２ａ）、あるいは空の（図２ｂ）ヒドロゲル単離コクリエート粒子サイズ分布（重量分析）を示す。 【図３】 図３ａおよび３ｂは、ＰＥＧゲル溶液中に分散させたデキストランのリポソーム混合物の顕微鏡像である。 小さな黒点は、ＰＥＧ相中にデキストラン相を分散させて形成したデキストラン粒子である。 大きなオープン円は小さなデキストラン粒子の溶融によって形成される。 リポソーム分配は、ＡｍＢの黄色によって示されるようにデキストラン相を好む。 ３ｂはＣａＣｌ２溶液によって処理した後の図３ａに示される試料の顕微鏡像である。 矢印で示される円中の黒色物は、Ｃａ２＋イオンの添加によって形成されたコクリエートである。 【図４】 図４ａ〜４ｆは、１ｍＭ ＣａＣｌ２および１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄した後の図３ａおよび３ｂに示される試料の顕微鏡像である。
凝集体はコクリエート粒子によって形成される。 ４ｂはＥＤＴＡの添加後の図４
ａに示される懸濁液を示す。 直径１〜２ミクロンのリポソームに対して開口し、
コクリエート粒子の固有サイズを示すコクリエート粒子は、ミクロン以下の範囲内にある。 ４ｃは実施例４に記載される方法に従って亜鉛で沈殿させたＡｍＢヒドロゲル単離コクリエートを示す。 ４ｄはＥＤＴＡで処理した後の図４ｃに示すコクリエートを示す。 ４ｅは実施例３に記載される方法に従って亜鉛で沈殿させた空ヒドロゲル単離コクリエートを示す。 ４ｆはＥＤＴＡで処理した後のコクリエートを示す。 【図５】 図５は、凍結破壊後のヒドロゲル単離コクリエートの顕微鏡写真である。 【図６】 図６は、０．６２５μｇＡｍＢ／ｍｌのＡｍＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートによるカンジタ・アルビカンス(Candida albicans)の成長阻害を示す。 ＤＭＳＯ中のＡｍＢおよびＡｍＢアイソマーＲと対比する。 【図７】 図７は、３０時間後のカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の生存可能性へのヒドロゲル単離コクリエートの影響を示す。 【図８】 図８は、アンホテリシンＢ・コクリエートとマクロファージ培養物の効果を示す。 【図９】 図９は、アンホテリシンＢ・コクリエート投与後の組織でのアンホテリシンＢ濃度を示す。 【図１０】 図１０は、ＡｍＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートの１回投与後の組織でのＡｍＢ濃度の時間的経過を示す。 【図１１】 図１１は、１回用量摂取後、２４時間および多数回用量摂取後、２
４時間の組織でのＡｍＢ濃度を示す。 【図１２】 図１２は、アンホテリシンＢコクリエート投与後のアンホテリシンＢ濃度とカンジダ・アルビカンス濃度との間の相関関係を示す。 ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/216 Ａ６１Ｋ 31/216 ４Ｃ０８６ 31/337 31/337 ４Ｃ０９１ 31/405 31/405 ４Ｃ２０４ 31/4174 31/4174 ４Ｃ２０６ 31/436 31/436 31/4422 31/4422 31/48 31/48 31/522 31/522 31/568 31/568 31/704 31/704 31/7042 31/7042 31/7048 31/7048 45/00 45/00 47/02 47/02 47/24 47/24 47/30 47/30 47/34 47/34 47/36 47/36 47/42 47/42 47/44 47/44 Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 23/00 23/00 25/20 25/20 29/00 29/00 31/04 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 35/00 35/00 37/06 37/06 // Ｃ０７Ｄ 209/26 Ｃ０７Ｄ 209/26 211/90 211/90 233/60 １０３ 233/60 １０３ 305/00 305/00 473/18 473/18 519/00 ３１１ 519/00 ３１１ Ｃ０７Ｊ 1/00 Ｃ０７Ｊ 1/00 (72)発明者 ザリフ レイラ アメリカ合衆国 ＮＪ 07103−3000 ニ ューアーク、185 ソー、オレンジアヴェ ニュー、ユーエムディーエヌジェイ ニュ ージャージーメディカルスクール、バイオ デリバリー サイエンス インコーポレー テッド (72)発明者 ジン ツオ アメリカ合衆国 ＮＪ 07103−3000 ニ ューアーク、185 ソー、オレンジアヴェ ニュー、ユーエムディーエヌジェイ ニュ ージャージーメディカルスクール、バイオ デリバリー サイエンス インコーポレー テッド (72)発明者 セガッラ イグナシオ アメリカ合衆国 ＮＪ 07103−3000 ニ ューアーク、185 ソー、オレンジアヴェ ニュー、ユーエムディーエヌジェイ ニュ ージャージーメディカルスクール、バイオ デリバリー サイエンス インコーポレー テッド (72)発明者 マニーノ ラファエル アメリカ合衆国 ＮＪ 07103−3000 ニ ューアーク、ユニバーシティハイツ、30 ベーガンストリート、ユニバーシティ オ ブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャージー Ｆターム(参考） 4C048 TT08 UU01 XX01 4C054 AA07 BB03 CC01 DD04 DD08 EE04 EE33 FF05 FF17 4C072 MM01 UU01 4C076 AA19 AA24 BB01 BB13 BB15 BB16 BB24 BB25 BB27 BB29 BB31 CC01 CC04 CC05 CC07 CC11 CC27 CC32 CC35 DD23 DD63 DD69 EE13 EE23 EE30 EE41 EE51 FF63 FF65 FF68 4C084 AA16 BA44 MA05 MA13 MA24 MA52 MA55 MA56 MA57 MA58 MA59 MA63 MA65 MA66 NA03 NA10 ZA04 ZA05 ZA40 ZB08 ZB11 ZB26 ZB33 ZB35 4C086 AA01 AA02 BC15 BC25 BC38 CB01 CB07 EA04 EA19 MA05 MA13 MA24 MA52 MA55 MA57 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 NA03 NA10 NA11 ZA04 ZA05 ZA40 ZB08 ZB11 ZB26 ZB32 ZB33 ZB35 4C091 AA02 BB02 CC03 DD01 EE04 FF01 GG01 HH01 JJ01 KK01 LL01 MM01 NN01 PA09 QQ01 4C204 BB01 CB03 DB18 EB03 FB21 GB01 4C206 AA01 AA02 CA13 DA21 FA53 GA07 MA05 MA33 MA44 MA72 MA75 MA76 MA77 MA78 MA79 MA80 MA83 MA85 MA86 NA03 NA10 NA11 ZA04 ZA05 ZA40 ZB08 ZB11 ZB26 ZB33 ZB35 |
