Antiviral drugs

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物種子から抽出される血球凝集素すなわちレクチン類を有効成分とする抗レトロウイルス剤に関する。

近年、Ｂ型肝炎、成人Ｔ細胞白血病さらにはAIDS（Ac
quired Immunodeficiency Syndrome）と、次々にウイルス病が話題の焦点となっている。 ウイルス病に対してはこれまでワクチンによる予防接種で対応し、天然痘根絶をはじめ、黄熱病、ポリオウイルスの制圧がなされてきた。 しかしAIDSなどのような持続感染や潜伏感染が問題となる病気に対してはワクチンだけでは対応出来ず、安全ですぐれた効果を示す抗ウイルス剤の開発が期待されているのが現状である。 そこで、本発明者らは各種の薬剤を鋭意検討したところ、驚くべきことに本発明のレクチン類が抗レトロウイルス作用の薬理効果を有していることを見出して本発明に至ったものである。

ここでレクチン類とは、細胞凝集、分裂誘発機能活性化、細胞障害などの効果を及ぼす物質を言う。 植物種子から抽出される血球凝集素すなわちレクチン類（以下本物質と略称する。）が、HIVの吸着阻害活性、RTase阻害活性を有することを見出した。 本発明でレクチン類が得られる双子葉植物網はＭkelaの分類（O.Mkela,Ann.
Med.Exp.Biol.,FENN 35 Supl.II（1957）；森良一、大沢利昭共著「レクチン」講談社昭和51年６月10日発行）によって分けられる２群、３群に属するものの内、２群からは、Abrus precatorius,Calpuria aeggptiana,Fomes
formentarius（ツリガネタケ）,Maackia amurensis（イヌエンジュ）,Phaseolus lunatas（リママメ）,Phaseol
us vulgaris（インゲンマメ）からなるものが選ばれ、
３群からは、Canavalia ensiformis（タチナタマメ）,J
ack bean（ナタマメ）,Cerastrium fomentosusからなるものが選ばれる。

特に、イヌエンジュ、ナタマメに属する属のものが好ましい。

抽出に際して用いる水系溶媒とは水又は水に可溶な有機溶媒、酸、塩基又は塩のいずれかを少量、例えば10％
程度以下含有する水溶液から選択される１種又は２種以上の組合せよりなるものである。 有機溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが主として用いられる。 酸としては、塩酸、硫酸、酢酸などである。 塩基としてはアンモニヤ、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソーダなどである。

抽出は原料（乾燥基準）に対して５倍乃至200倍量の抽出液を使用し、通常は４℃乃至150℃で20分乃至20時間処理するものである。

精製処理工程とは、塩析、アフィニティクロマトグラフィー、透析、限外濾過、逆滲透処理、ゲル濾過、有機溶媒による沈澱処理などの１種又は２種以上の方法の適用により低分子物を除去することを意味するものである。 工学的には加圧による膜分離法である限外濾過法、
逆滲透処理法の単独又は組合せが特に好ましい。 又場合により塩析工程後これらの処理を行ってもよい。

塩析工程に用いる塩析剤は硫安、食塩、塩化カリ、炭酸バリウム等であるが、硫安の使用が最も好ましい。 又塩析工程の後処理として透析、限外濾過、ゲル濾過、逆滲透処理等のいずれか１つ又はこれらの２以上の工程の組合せが必要である。

アフィニティクロマトグラフィーは、担体にデキストラン、アガロース、ポリアクリルアミドゲル等を用い、
それ単独か或いはそれらの担体に化学的手法で精製されるレクチンに特異性の高い糖鎖構造を有する物質を固定化したカラムが通常用いられる。

透析は通常セロファン膜、コロジオン膜などの半透膜を用いて実施されるものである。 ゲル濾過はデキストラン又はポリアクリルアミドゲルなどを充填したカラムを用いて実施する。 セファデックス、バイオゲルの名称で販売せられている充填剤が通常用いられる。

限外濾過、逆滲透圧法はいずれも加圧下で膜を用いて分画する方法である。 前者は0.5〜5Kg/cm ² 、後者は20〜
35Kg/cm ²で行うのが通常である。

有機溶媒による沈澱法はメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどを用いるのが一般的である。 又、上記操作に加えて必要に応じイオン交換処理を行っても良い。

上記精製操作が終った後は噴霧乾燥、凍結乾燥などで水分を除去した後製品化するものである。

尚本物質を、アルカリ性水溶液で処理すると、驚くべきことには抗レトロウイルス効果が増強されるので更に好ましい。

本物質を５倍乃至200倍量の0.01N乃至5Nの好ましくは
0.1乃至2Nのアルカリ性水溶液で、40℃乃至250℃、好ましくは60℃乃至200℃最も好ましくは100℃乃至150℃で５分乃至２時間、好ましくは10分乃至１時間処理する。
次に該処理液を中和し、精製処理工程を行なう。 精製処理工程は、前記の塩析透析、限外濾過、逆滲透処理、ゲル濾過、有機溶媒による沈澱処理などの１種又は２種以上の方法の適用により行なうことが出来る。 条件は前記と同じである。

上記精製操作が終った後は、噴霧乾燥、凍結乾燥などで水分を除去した後製品化する。

また、本物質をジエチルアミノエチル（DEAE）−セルロース等のイオン交換セルロース等を用いたクロマトグラフィーで更に精製を行うと、その吸着物質中塩、アルカリ等で溶出される画分は抗レトロウイルス効果が強いものが得られるのでより好ましい。

本物質はα−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応及び又はローリィーフォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒドリン反応で陽性を示す。 元素分析の結果、炭素20〜55％、
水素３〜９％、窒素0.1〜16.0％を主成分として含有する。

pHは6.0〜7.5である。

本物質の糖成分は少なくともグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンを含み、蛋白成分としては少なくともグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンを含有する。

赤外線吸収スペクトルを測定すると、3600〜3200cm ^-1
付近に水酸基の吸収及び又は1700〜1600cm ^-1付近にアミド基に由来する吸収を認めることが出来た。

本物質は水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶である。
水系溶媒は水又は水を主体として水に可溶のアルコール、酸、塩基等を含むものであり、有機溶媒はクロロホルム、ベンゼン、エーテル等を言う。

本物質は白色又は褐色で分子量はゲル濾過クロマトグラフィーにより10 ³ 〜３×10 ⁶である。

ラット（呑竜系）４〜５週令、体重100〜150gのものを用い、本物質を1000mg/Kg経口投与し、７日間観察を行ったが全匹生存していた。

本物質はその毒性が極めて低く且つ副作用も殆んど生起しないなど安全な物質である。

一般にウイルスは、標的細胞に吸着し、ウイルスの核酸が細胞内に注入され、さらに細胞のゲノムにインテグレートされる過程を経てウイルスが複製されることが知られている。 また、特にレトロウイルスについては、細胞のゲノムにインテグレートされる前に、ウイルス由来の核酸であるRNAから、逆転写酵素の作用によってDNAに転写される過程が必要である。 本発明者等は、本物質が
HIV（Human Immunodeficiency virus）のヒト由来リンパ系細胞への吸着および、それに引き続く感染を阻害すること、および、逆転写酵素活性を阻害することを見出した。 すなわち、HIVを50〜1000μg/mlの濃度の本物質で０℃にて２時間処理した後HIVを洗浄し、MT−４細胞に加えて感染させ、３日間培養後のHIV抗原陽性細胞を測定する方法にて、本物質の効果を検討したところ、本物質による前処理により、HIV抗原陽性細胞がほとんど消失し、HIVのヒト由来リンパ系細胞に対する強い吸着阻害効果が認められた。 一方、本物質の逆転写酵素活性に及ぼす影響をラット肝臓全メッセンジャーRNAを鋳型として測定したところ、本物質500μg/mlの添加により強い逆転写酵素活性の阻害がみられた。

これらのことは、本物質がウイルスの感染を阻害する作用をもつこと、特に逆転写酵素をもつレトロウイルスの感染を阻害すること、就中、HIV感染によって引き起こされるAIDSに有効であることを示すものである。

抗ウイルス剤としてすでに使用されている３′−アジド−３′−デオキシチミジン（AZT）の場合、正常細胞に対しても分裂阻害作用を示す副作用がみられるが、本物質は急性毒性も極めて低く、安全な物質であり、ウイルス感染、特にレトロウイルス感染を阻害する作用を示すことにより抗ウイルス剤として有用である。 即ちウイルス感染症、特にレトロウイルス感染症、就中AIDSに有効である。

本物質は、抗レトロウイルス剤として用いる場合、任意の剤型にすることができる。 又、投与も各経路で行なわれる。 更に本発明の薬剤は、抗ウイルス剤として用いられている前記のAZTなどとの併用においても効力を減ずることがなく、これら他の薬剤との併用は有効な手段として使用し得る。

経口投与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などは、それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、潤滑剤、
崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有していてもよく、
又経口用液体製剤として用いる場合は、内用水剤、振盪合剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよく、又使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であってもよい。 さらに、このような液体製剤は普通用いられる添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。 注射用の場合には、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、単位投与量アンプル、又は多投与量容器中で提供される。 なお、上記組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ベヒクル中の乳液のような形態であってもよく、一方活性成分は使用する前に適当なベヒクルたとえば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉末であってもよい。

本発明の抗レトロウイルス剤は人間及び動物に経口的または非経口的に投与される。 経口的投与は舌下投与を包含する。 非経口的投与は注射例えば皮下、筋肉、静脈注射、点滴などを含む。 本発明の抗レトロウイルス剤の投与量は動物か人間により、また年齢、個人差、病状などに影響されるので、場合によっては下記範囲外の量を投与する場合も生ずるが、一般に人間を対象とする場合、本物質の経口投与量は体重1Kg、１日当り0.1〜1000
mg、好ましくは１〜100mgを１回から３回に分けて投与する。

以下、実施例を示す。

実施例 １ よく砕いたイヌエンジュ（Maackia amurensis）種子1
00gを生理食塩水１に懸濁し、１夜４℃で攪拌したのち、遠心分離により沈渣と上澄液に分けた。 上澄液に0.
5飽和となる様に硫安を加え２時間程攪拌し、遠心分離により沈澱と上澄液に分けた。 上澄液には更に0.8飽和となる様に硫酸アンモニウムを加えよく攪拌した。 遠心分離により沈澱を集め、0.15M食塩含有0.001Mリン酸緩衝液（pH7.0）に溶かし、セファロース4B−ブタ甲状腺チログロブリン糖ペプチドのカラムにのせ、上記リン酸緩衝液にて溶出を行った。 初めに不活性のタンパクの大きなピークが溶出されたのちのタンパクピークを集めた。 限外濾過により塩類を除き、凍結乾燥により白色粉末を得た。

実施例 ２ よく砕いて乾燥させたナタマメ（Jack Bean）200gを１の1M NaCl（pH7.0）に溶かし、４℃で10時間抽出した。 抽出液を遠心分離して上澄液と沈渣に分けた。 上澄液を30％硫安飽和（pH7.0）にして、４℃２時間放置後、遠心分離によって沈渣を除去した。 得られた上澄液を80％硫安飽和（pH7.0）として４℃で６時間攪拌し、
この混合物を遠心分離によって分離し、沈渣を集めた。
この沈渣を少量の水に溶かし、水に対して１時間、次いで1M NaCl（pH7.0）に対して10時間透析を行なった。 この透析内液を1M NaCl,pH7.0で平衡化したSephadex G−7
5（４×50cm）にかけ、カラムを同液でよく洗った。

1M NaCl,0.1Mグルコースで溶出すると目的物が得られる。 この溶出液を限外濾過により脱塩し、凍結乾燥することによって白色粉末を得た。

多種豆類より新しく抽出された物質の物理化学的性質を示しているのが表−１である。 本表において、フェノール硫酸呈色反応は糖類の存在を表わし、ローリィーフォーリン法はペプチド結合の存在を示している。 分子量についてはゲル濾過法によって平均的に多く存在する画分を記載した。

本物質はすべて凍結乾燥品10mgを滅菌蒸留水10mlに溶解した（濃度:1mg/ml）。

１μの20mM DTT（ジメチルスレイトール：シグマ社製）、５μの５倍濃度酵素反応液（250mM Tris−
HCl（pH8.3）−250mM KCl−40mM MgCl ₂ ）、１μの3d
NTP溶液（1mM dATP−1mM dGTP−1mM dTTP:シグマ社製）、２μの100μg/mlオリゴ（dT） _12〜18 （PL−bio
chemicals社）、１μのメッセンジャーRNA（正常ラット肝臓由来:1μg/μ）、0.5μのRNase Inhibitor
（16unit/μ：宝酒造社製）と１μの［α− ³² P］dC
TP（〜800Ci/mmol,10μCi/μ：アマシャムジャパン社製）を1.5ml容量のエッペンドルフチューブに加え、37
℃ウォーターバス中においた。

５分後、先に調製した1mg/ml濃度の本物質12.5μを反応チューブに添加し、更に、１μの逆転写酵素（７
ユニット／μ：宝酒造社製、Rous associated virus
由来）を加え、最終反応液量を25μとして、37℃で反応させた。

１時間後５μの反応液を2cm×2cmのDEAE紙（東洋濾紙社製）にしみこませ、風乾後、濾紙１枚あたり10mlの
0.5M−Na ₂ HPO ₄水溶液に浸し、振盪しながら濾紙上のDNA
合成に使用されなかった［α− ³² P］dCTPを洗浄した（この操作を５分間おきに５回実施した）。

その後10mlの液体シンチレーションカクテル（アマシャムジャパン社製）の入っているガラスバイヤル瓶に上記DEAE紙を入れ、シンチレーションカウンター（アロカ社製）にて１分間放射活性（cpm）をカウントした。

逆転写酵素活性阻害率（％）は以下の式により求めた。

実施例、４ 本物質によるHIV（AIDSウイルス）のヒトリンパ球への吸着阻害は以下の方法により実施した（尚、すべての操作は無菌条件下で行なった）。

HIV（Human Immunodeficiency Virus）浮遊液1mlと本物質溶液（800μg/ml）1mlを試験管に入れ、氷中に静置した。 ２時間後試験管から1mlのウイルス浮遊液をとり、ヒトリンパ球由来細胞株MT−４［Jpn.J.Cancer Re
s.（Gann）， 28 ,219−229（1982）］に多重感染度（M.
OI）≒２でウイルスを吸着させた。 遠心（毎分2,000
回転,10分間）後、上澄液をすて沈澱したMT−４細胞を2
0％FCSを含むRPMI1640（Gibco Labora tories,NY）中に、細胞濃度２×10 ⁵ /mlになるように浮遊させた。

96穴プレートに上記MT−４細胞浮遊液を100μずつ分注して、空気中５％CO ₂ 、37℃の条件下で培養した。
培養３日目に間接蛍光抗体法によりHIV吸着細胞と非吸着細胞を算出した。

すなわちMT−４細胞をメタノール処理により固定化し、抗HIV感染患者血清と37℃で反応させた。 30分後PBS
で細胞を洗浄し、フルオレッセインイソチオシアネート結合ウサギ抗ヒトIgG（免疫グロブリン）と37℃で反応させた。

蛍光顕微鏡下で500個のMT−４細胞を観察し、蛍光陽性細胞をHIV吸着細胞として算出した。

HIV吸着阻害率（％）は次式により求めた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大原 稔 東京都板橋区富士見町19−25 (72)発明者 武藤 成明 東京都葛飾区東堀切３の23の２ (72)発明者 角地 淳二 東京都世田谷区南烏山６−16−31−406 (72)発明者 古荘 孝雄 東京都町田市旭町１−６−13 (72)発明者 吉汲 親雄 東京都国立市東２−19−46 (72)発明者 高橋 正明 東京都港区高輪１−５−33−314 (56)参考文献 特開 昭61−165334（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−68615（ＪＰ，Ａ)