瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物抗腫瘍の薬物用途

本発明は、瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物の新用途に関連し、具体的にいうと、該当化合物は、抗腫瘍薬物製薬の用途を言及され、医薬領域に属する。

悪性腫瘍は従来から医学業界において征服が期待される疾病であり、当面の抗腫瘍薬物及び不良反応がますます重視されている。副作用が少なく、抗腫瘍作用の強い薬物を求めるのは昔から腫瘍研究のホットスポット・重点になっている。植物由来の薬物は当面において相変わらず最も理想的な抗腫瘍薬物選別の宝庫であり、例えばパクリタキセル、カンプトテシン、人参サポニン等沢山の強い抗腫瘍活性を備える天然化合物が選び出されて、良好的な応用前景を持っている。わが国は植物由来薬物の使用大国であり、悠久的な応用の歴史があり、疾病と戦う中で段々と独特な漢方薬理論体系が形成されている。漢方薬理論より指導の中に数多くの植物薬が応用され、腫瘍等を含む難病の治療過程に重要な作用が働いている。この他、わが国において自然薬草の資源は豊かで、民族、民間薬草の薬用は幅広く、抗腫瘍薬物の選別に手がかりを提供し、上述の有利な条件は、民族民間薬用から副作用が少なく、抗腫瘍作用の強い薬物の選別に良好的な基礎を打ち立てている。本研究チームは、抗腫瘍薬物の選別過程中に、初めてミャオ族薬物瓦草の中に含まれている5環性トリテルペンサポニン類化合物が強い抗腫瘍活性を持つことを発見し、それは特に離体培養の人源腫瘍細胞及び実体腫瘍(ヌードマウス)に対しても強い抑制および消滅作用を持っている。

瓦草とはセキチク科(Caryophyllaceae)マンテマ属の植物シレネ(Silene viscidula Franch.)の乾燥根である。鎮痛、止血、解熱、利尿の効果があり、主に打撲傷、リウマチや骨痛、気管支炎、尿路感染等の治療に使用されている。当面、瓦草の研究は主に化学成分研究の方面に集中しており、薬理方面の研究報告は少なくなっている。瓦草の主要な化学成分は、サポニン類、蛋白質類、有機酸類、多糖類、環状ペプチド類、エクジステロン類等であり、出願人は瓦草の中より分離、鈍化し、且つ複数の5環性トリテルペンサポニン類化合物を確定しており、抗腫瘍活性成分の選別及び評価に基礎を置いている。

本発明の目的は、式Iの化合物若しくはその塩又は式Iの化合物若しくはその塩を含む組成物を抗腫瘍薬物の調製において提供する用途にある。

また本発明の他の目的は、腫瘍を治療する薬物組成物及び治療腫瘍薬物調製において提供する用途にある。

更に本発明の他の目的は、瓦草抽出物を抗腫瘍薬物の調製において提供する用途にある。

本発明の目的は、下記技術方案を通して実現する。

式Iの化合物若しくはその塩又は式Iの化合物若しくはその塩が含まれる組成物の抗腫瘍薬物の調製における用途において、

上記式において、 R₁はH、Ac、Glc(glucose、ブドウ糖基)のうちの一種、 R₂は(E)−MC、(Z)−MC、Acのうちの一種、 R₃はH、Xyl(Xylose、キシロース基)のうちの一種、 R₄はH、CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃のうちの一種である。

上述のAcの構造式は以下の通りである。

上述の(E)−MCの構造式は以下の通りである。

上述の(Z)−MCの構造式は以下の通りである。

。

更に、上述の塩とは、式Iの化合物及びアルカリ又はソロネッツ金属により形成される塩を指し、更に、上述のアルカリは、水酸化ナトリウム、水素カリウム、水素酸化カルシウム、水素酸化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム又はアンモニアを含んでいる。上述のソロネッツ金属は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミ、銅、亜鉛又はマグネシウムを含んでいる。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

更に、上述の化合物の構造式は、以下の通りである。

本発明は更に、上述の式I及び化合物1−8が肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍を治療する薬物の調製における用途を提供する。

また、上述の式I及び化合物1−8の用量範囲は、0.1〜10mg/kg動物体重であり、常識によりヒトへの用量に換算できる。

更に、上述の式I及び化合物1−8は、補助料と併せて臨床上使用される注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、気剤、食品又は飲料に調製され得る。

更に一歩進んで、上述の注射剤は、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射及び腔内注射等の多種類の注射方法を含んでいる。

また本発明は、腫瘍を治療する医薬組成物の一種を提供し、該医薬組成物中の活性成分は、式Iの化合物又はその塩及び通常の抗がん剤の何れかの一種により構成される。

上述の通常の抗がん剤は、シクロホスファミド、5−フルオロウラシル、パクリタキセル、アドリアマイシン、エトポシド、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン又はゲムシタビン等、臨床的によく使われる一線、二線抗腫瘍薬物である。

本発明は、瓦草抽出物が肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍を治療する薬物の調製の用途を提供する。上記の瓦草抽出物は、瓦草からメタノール、エタノール又は他の通常の有機溶剤によって取得された式Iの化合物を含む抽出物である。

更に、上記の瓦草抽出物は、瓦草を有機溶剤によって抽出後、次に精製、鈍化工程の調製を通して取得した有効成分の瓦草総サポニンであり、上記の精製、鈍化工程は抜粋、シリカゲルカラム、マクロ多孔性樹脂柱、ゲル柱、反相柱等通常柱のクロマトグラフィー工程を含んでいる。

更に、上記の瓦草抽出物中の瓦草総合サポニンの含有量は、50%以上である。更に一歩進んで、上記の瓦草抽出物中の瓦草総サポニンの含有量は、60%以上である。

更に、上記の瓦草抽出物は、以下の方法に基づき調製される。瓦草を50−95%のエタノール溶液で抽出し、抽出液の濃縮後にマクロ多孔性樹脂柱を通して70%−90エタノールで溶離すると取得できる。

本発明はまた、組成物の腫瘍治療調製における用途の一種を提供し、該組成物は式Iの化合物及び他の抗がん剤又は補助抗がん剤より構成される。

本発明に記述される式Iの構造の化合物は主に植物瓦草より抽出されるが、他の植物からの抽出、化学合成、半合成又は生物転換の方法を通して取得される該構造を有する化合物及びその類似体も、本発明の保護範囲内に含まれる。

本発明の研究によると、瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物がヒト肝臓癌細胞株、ヒト胃癌細胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト乳腺癌細胞及び黒色素腫瘍細胞株の増長に対して全て強い抑制効果があり、この中でも肝臓癌細胞に対して最も鋭敏であり、同様の投与濃度の下での肝臓癌細胞に対する抑制効果は、陽性対照薬であるシスプラチンおよびシクロホスファミドより優れていることが分かる。且つ本発明の研究によると、瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物は、ヌードマウスの腫瘍に対する成長状態、体重の影響が有効的に改善でき、西洋薬化学療法薬物と比べると副作用が少なくなっていることが分かる。

(実験例1)異なる瓦草サポニン化合物の体外培養される腫瘍細胞に対する抑制作用

1 実験方法

1.1 腫瘍細胞株及びその培養 ヒト肝臓癌細胞株(HepG2)、ヒト胃癌細胞(BGC823)、ヒト大腸癌細胞(HT29)、ヒト乳腺癌細胞(MCF−7)、黒色素腫瘍細胞株(A875)は全て、中国医学科学院腫瘍病院より提供される。10%(V/V)ウシ胎児血清(FBS)及び1%(V/V)双抗(100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシン)を含むRPMI−1640培地に、37℃、5% CO₂の飽和湿度の培養箱の中で培養し、2−3日に1回別の培地に接種してから培養し、対数成長期の細胞を取って実験研究に使用する。

1.2実験設計 HepG2、BGC823、MCF−7、HT29、A875細胞株を37℃、5%CO₂の培養箱の中で培養し、2〜3日に溶液を交換し、1回別の培地に接種してから培養する。成長状態の良い細胞を収集し、細胞濃度を2×10⁴個/mLに調整し、96孔プレート毎に細胞懸濁液100μL(孔毎に2000個細胞ぐらい)を加えて、CO₂培養箱の中で24時間培養し、空白グループに100μL細胞が含まれていない培地を添加する。

瓦草サポニン化合物1、2、3、4、7、8(実施例2の方法により調製する)の各々をDMSOに溶解し、1640完全培地で希釈し、各化合物の濃度を400μg/mL溶液、DMSOの濃度が0.5%になるようにする。陽性薬のシスプラチンを濃度が400μg/mLの溶液に調製する。実験は空白グループ、モデル対照グループ、化合物1、2、3、4、7、8グループおよび陽性薬シスプラチングループとして分けて、グループ毎に六つの孔がある。

投与前に細胞培養プレートの上にある清澄液を除去し、新鮮な完全1640培地を180μL/孔で添加し、各薬物サンプルは以下の通りである。瓦草サポニン化合物グループに瓦草サポニンの各化合物を添加し、孔毎に20μL(最終濃度は40μg/mLになる)を添加する。陽性対照グループにシスプラチン溶液20μL(最終濃度は40μg/mLになる)を添加する。空白グループ、モデル対照グループの孔毎にDMSO濃度が0.5%である培地20μLを添加する。薬物の加入後にCO₂培養箱の中で48時間培養する。培養の終了後に孔毎にMTT溶液20μLを添加し、継続的に4時間発育してから培養を終了し、注意深く上清を吸い捨て、孔毎に150μLのDMSOを加入し、10分間振とうして、490nm波長で各孔の吸光度を測定し、且つ抑制率を計算する。

1.3 抑制率計算 抑制率=[(モデルグループOD−空白グループOD)−(実験グループOD−空白グループOD)]/(モデルグループOD−空白グループOD)×100%。 上述MTT試験に計3ロットの実験を繰り返す。

2 データ集計 SPSS 10.0ソフトウェアを採用して、データ処理分析を行い、全ての指標を均数±標準差(±s)で表示し、グループ間の比較に分散分析を採用する。

3 結果 MTT試験結果によると、異なる瓦草サポニン化合物1、2、3、4、7、8は全て、それぞれ40μg/mLの投与濃度によって、腫瘍細胞HepG2、MCF−7、BGC823、HT29、A875に対して良好な抑制効果が現れることが分かる。形態学的な観察において、正常の腫瘍細胞と比べると投与グループでは明らかな細胞の縮小、破砕、壁に付かない現象が発見されている。この中で、瓦草サポニン化合物1、化合物2のヒト肝臓癌HepG2、ヒト胃癌BGC823、ヒト大腸癌HT29細胞に対する抑制率は全て90%を超えており、この中でも肝臓癌細胞に対して最も鋭敏であり、抑制率は99%に達している。化合物3、4は、5種の腫瘍細胞に対しても強い抑制効果がある。それに対して化合物7、8は、腫瘍細胞に対する抑制作用は弱くなっている。結果は表1に示される。

本実験の結果によると瓦草サポニン化合物1、2は全て、腫瘍細胞の増長に対して強い抑制効果があり、このうち化合物2の抑制効果が一番強く、薬物効果が最も良好であることが分かる。5種の被験腫瘍細胞株の中でも肝臓癌細胞に対して最も鋭敏であり、肝臓癌細胞に対する抑制効果は同様の投与濃度の下での陽性対照薬シスプラチンより優れており、本試験は後述する動物実験全てに対して実験根拠及び参考を提供する。

(実験例2)異なる干渉時間における瓦草サポニン化合物2のヒト肝臓癌細胞HepG2に対する抑制率及びIC₅₀の影響

1 実験方法

1.1 ヒト肝臓癌細胞HepG2の培養 HepG2は、中国医学科学院腫瘍病院より提供される。10%(V/V)ウシ胎児血清(FBS)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI−1640培地において、37℃、5% CO₂の培養箱の中で培養し、2−3日に1回別の培地に接種してから培養し、対数成長期の細胞を取り実験研究に使用する。

1.2 実験設計 成長状態が良好なHepG2細胞を収集し、細胞濃度を2×10⁴個/mLとなるように調製し、96孔プレートの孔毎に細胞懸濁液100μL(孔毎に2000個細胞程度)を添加し、CO₂培養箱の中で24時間培養し、空白グループに100μLの細胞を含まない培地を添加する。

瓦草サポニン化合物2(実施例2の方法により調製する)をDMSOで溶解し、1640完全培地により異なる濃度勾配の化合物2溶液に希釈し、DMSOの濃度を0.5%とした。実験では、空白グループ、モデル対照グループ、化合物2の異なる濃度(最終濃度は80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mLである)グループ及び陽性薬シスプラチングループとして分けられ、グループ毎に六つの複合孔があり、それぞれ六つの平行プレートが設けられ、異なる時間での培養に使用される。

投与前に細胞培養プレートの上にある清澄液を除去し、新鮮な完全1640培地180μL/孔を添加し、薬物サンプルを以下の通り用いる。瓦草サポニン化合物2グループに異なる濃度勾配の化合物2溶液を添加し、孔毎に20μLとし、最終濃度をそれぞれ80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL及び5μg/mLになるようする。陽性対照グループに、シスプラチン溶液20μL(最終濃度は40μg/mLである)を添加する。空白グループ、モデル対照グループの孔毎にDMSO濃度が0.5%である培地20μLを添加する。添加後にCO₂培養箱の中においてそれぞれ24時間、48時間培養する。

培養の終了後に孔毎にMTT溶液20μLを加入し、継続的に4時間培養した後、培養を終了させ、注意深く上清を吸い捨て、孔毎に150μLのDMSOを添加し、10分間振とうして、490nm波長で各孔の吸光度を測定し、且つ抑制率及びIC₅₀を計算する。 抑制率=[(モデルグループOD−空白グループOD)−(実験グループOD−空白グループOD)]/(モデルグループOD−空白グループOD)×100%。 IC₅₀をBliss法で計算する。 本実験を3回繰り返す。

2 データ集計S SPSS 10.0ソフトウェアデータを採用して処理分析を行い、全ての指標も均数±標準差(

(以下、x(エックスバー)と記載する場合あり)±s)で表示とし、グループ間の比較に分散分析を採用する。

3 結果 表2データによると、瓦草サポニン化合物2は濃度20〜80μg/mL間において、ヒト肝臓癌細胞HepG2に対して明らかな抑制効果があり、抑制率が最大時に99%以上に達していることが示される。形態上では投与細胞が正常腫瘍細胞に比べて、明らかな細胞縮小、破砕、壁に付かない現象が現れることが発見された。薬物濃度が10μg/mLである場合のヒト肝臓癌細胞HepG2への処理後24時間、48時間では、その腫瘍細胞抑制率は全て80%を超えている。

計算を通して、瓦草サポニン化合物2のヒト肝臓癌細胞HepG2に対する24時間、48時間でのIC₅₀はそれぞれ、5.25nmol/mL、4.56nmol/mLであり、一定の時間関連性が現れている。

(実験例3)瓦草サポニンのヒト肝臓癌細胞のアポトーシスに対する誘導作用及びその作用機序の研究

1 実験方法

1.1ヒト肝臓癌細胞HepG2の培養 HepG2は中国医学科学院の腫瘍病院より提供される。10%(V/V)ウシ胎児血清(FBS)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI−1640培地において37℃、5% CO₂の培養箱の中で培養し、2−3日に1回別の培地に接種してから培養し、対数成長期の細胞を取り実験研究に使用する。

1.2 実験設計

1.2.1 細胞アポトーシス実験 対数成長期の細胞を培養瓶に培養し、壁に付けて24時間培養後に細胞分を三つのグループに分けて、それぞれモデル対照グループ、瓦草サポニン化合物2グループ(最終濃度は80μg/mLである)及び陽性対照薬シスプラチングループ(最終濃度は40μg/mLである)とし、グループ毎に3瓶とし、薬物での24時間処理後に収集し、その後、測定待ちの細胞濃度を5×10⁵−1×10⁶個/mLになるように調整し、1mL細胞を取り、1000rpm、4℃で10分間遠心し、上清を除去してから1mLの冷PBSを添加し、軽く振とうしながら細胞を懸濁させ、1000rpm、10分間遠心し、上清を除去してから、細胞を200μlのBinding Buffer中に再懸濁させ、その後、10μlのAnnexin V−FITC及び5μlのPIを添加し、軽く混合させ、避光して室温で15分間反応させ、300μlのBinding Bufferを添加し、流式細胞計で即時に検出する。

1.2.2 細胞周期の検出 対数成長期の細胞を培養瓶の中で培養し、細胞を四つのグループに分けて、それぞれ、モデル対照グループ及び瓦草サポニン化合物2の異なる濃度(最終濃度は20μg/mL、40μg/mL、80μg/mLである)グループとし、グループ毎に3瓶とし、薬物で24時間処理後に、測定待ちの細胞を単細胞懸濁液に調製し、PBSで2回洗い、ペプシンで消化する。培地を加えて消化を終了させ、均一に攪拌し、1000rpmで、5分間遠心し、上清を除去し、4℃のPBS(1−2mL)で細胞を2回洗い、1000rpm、5分間遠心し、上清を除去し、−20℃の70%アルコール(1−2mL)を加えて、均一に攪拌し、30分間以上固定する。1000rpmで、5分間遠心し、アルコールを除去し、4℃のPBS(1−2 mL)で洗い、1000rpmで、5分間遠心し、上清を除去する。4℃のPBS(1−2 mL)で洗い、細胞を均一化し、100目ガーゼで流式検出管にてろ過し、1000rpmで5分間遠心し、上清を除去し、PI染液染色(濃度は50μg/mLである)を添加して振とう器で均一に振とうさせ、避光して染色を最低30分間行った後、流式細胞計で検出する。

2 データ集計 SPSS 10.0ソフトウェアを採用してデータ処理分析を行い、全ての指標も均数±標準差(x(エックスバー)±s)で表示し、グループ間の比較に分散分析を採用する。

3 結果

3.1 細胞アポトーシス早期信号の検出結果 検出結果によると、対照グループと比べると瓦草サポニンの作用後に早期アポトーシス信号細胞数が1.5%から8.5%へと明らかに上昇し、差異に顕著性(p<0.01)があることが分かる。壊死細胞数は対照グループと比べて明らかに増加し、2.0%から6.6%に上昇している。薬物の腫瘍細胞への作用に異なるルートが存在することが説明され、一方で細胞アポトーシスが促進できるが、もう一方で他のルートが存在して細胞壊死を起こしている。

3.2 細胞周期の検出結果 空白対照グループ及び薬物グループの細胞は殆どG0/G1期にある。瓦草サポニン化合物2(40μg/mL)で48時間処理すると、G0/G期細胞の比率は対照グループの(56.39±0.69)%より(55.08±5.75)%に下降する。瓦草サポニン化合物2(80μg/mL)で48時間処理後では、G0/G期細胞の比率は対照グループの(56.39±0.69)%より(47.28±13.07%)に下降し、且つ50%以上の細胞がS期及びG2/M期に入る。この中でも瓦草サポニン化合物2の濃度上昇、作用時間の延長に従ってG0/G1期に位置する細胞は段々と減少し、特にS期にある細胞は段々と増加し、例えば瓦草サポニン化合物2(80μg/mL)の処理後24時間、48時間、72時間では、S期細胞の比率は同時期対照グループの(16.63±1.32)%、(23.68±1.6)%、(26.09±0.26)%よりそれぞれ(20.39±2.56)%、(30.95±5.84)%、(40.34±12.32)%に増加する。瓦草サポニン化合物2が主に腫瘍細胞をS期にブロックし、抑制細胞がG0/G1期への進入によって腫瘍細胞の増長を抑制し、且つ明らかな用量効果関係が現れたことが説明される。結果は表3に示される。

(実験例4)瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物の抗ヒトHepG2肝臓癌薬効学の研究 抗癌効果の最も強い化合物1、化合物2を代表として、瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物の抗肝臓癌効果を考察する。

1 実験方法

1.1 動物及び飼育管理 清潔なヌードマウス70匹(オス、体重18−20g)は、中国食品薬品検定研究所より提供され、合格証明番号はSCXK(京)2009−0017である。適応飼育1週間後に薬効学実験を実施する。 実験動物の飼育条件は以下の通りである。

動物をパットのあるIVCプラスチック飼育箱の中で飼育し、清潔なヌードマウス専用の維持飼料(北京科澳協力飼料有限会社)で飼育し、自由に水を飲ませる。

1.2 HepG2肝臓癌細胞の培養 HepG2細胞を通常培養し、10%(V/V)ウシ胎児血清(FBS)及び1%(V/V)(100U/mLペニシリンと100μg/mLストレプトマイシン)を含むRPMI−1640培地に37℃、5%CO₂の飽和湿度培養箱の中に培養し、2−3日に1回別の培地に接種してから培養し、対数成長期の細胞を実験対象とする。

1.3 実験設計 70匹のヌードマウスを適応性飼育1週間後、体外培養成長が良好なHepG₂細胞の懸濁液をヌードマウスの背部皮下に1×10⁷個細胞/匹で接種する。接種終了後、体重によりランダムに7グループに分けて、それぞれはモデル対照グループ、瓦草総サポニングループ(実施例1の方法により調製される)、化合物1グループ、化合物2グループ、化合物1+シクロホスファミド(CY)グループ、化合物2+CYグループ及び陽性薬CYグループであり、グループ毎に10匹とする。3日間接種後に投与を開始し、連続3週間とする。

毎週1回、体重及び腫瘍の大きさを測定し、且つ腫瘍体積を計算し、計算式は以下の通りである。 腫瘍体積:V=π/6×a×b²(a、bは腫瘍の横軸、縦軸の長さ)

最終投与終了後に、ヌードマウスを8時間禁食してから、空腹の体重を測定し、眼球を外して血を取り、血清を遠心分離し、腫瘍組織を分離し、体重を量り、且つ腫瘍指数及び腫瘍抑制率を計算し、計算式は以下の通りである。 腫瘍指数=腫瘍重量(mg)/動物体重(g) 腫瘍抑制率(%)=(対照グループの平均腫瘍重量−投与グループの平均腫瘍重量)/対照グループの平均腫瘍重量×100%

1.3.1 組分け状況は以下の通りである。

1.3.2 投与方法 瓦草総サポニン、化合物1、化合物2、CYをそれぞれ無菌注射用水の中に溶解し、ろ過除菌する。化合物1+CY、化合物2+CYをそれぞれ1:39の比率で混合液を調製し、ろ過除菌する。各投与グループにそれぞれ対応薬物を皮下注射し(10ml/kg BW)、モデル対照グループに同容量の注射用水のみを皮下注射する(10ml/kg BW)。毎日午前9時に投与し、計3週間継続する。

1.3.3 実験方案 体重の測定:毎週1回ヌードマウス体重を測定する。 腫瘍の測定:毎週1回ヌードマウス横直径及び縦直径を含む腫瘍の大きさを測定する。 実験の終了:投与3週間(21日)後に該当実験研究を終了する。

2 データ集計:SPSS 10.0ソフトウェアでデータ処理分析を行い、全ての値を均数±標準差(x(エックスバー)±s)で表示し、グループ間の比較に分散分析を採用する。

3 結果

3.1 異なる瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のHepG2腫瘍負荷ヌードマウスの体重への影響 投与前に各グループの動物体重は同じであり、グループ間に統計学的差異が無い。腫瘍接種後、モデルグループ、化合物1、2グループの体重は毎週増加し、この中でも化合物2グループの増加は速く、モデルグループの増加は遅くなっている。陽性薬グループ動物の体重は投与開始後増加しておらず、反対に下降傾向(モデルグループと比べると全てp<0.01である)を示している。

この結果は瓦草総サポニン、瓦草5環性トリテルペンサポニン化合物1、2が腫瘍ヌードマウスの成長状態−体重に対して有効な改善の影響をもたらし得、化学療法薬物であるCY等による抗癌作用における体重の急激な減少の副作用を回避したことを示している。化合物1、2とCYを併用すると明らかにCYによる動物の体重への影響を弱めることができ、データによると、薬を併用しているヌードマウスの体重の緩やかな増加が現れており、化合物1、2によって明らかにCYの副作用が減らせることが示されている。表6に示される。

3.2 瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のHepG2腫瘍負荷ヌードマウスの腫瘍体積への影響 実験期間中、各グループの動物の腫瘍体積は経時的に増加しており、この内、モデルグループの腫瘍体積は顕著にに増加し、被験薬及びCYグループの腫瘍体積は緩やかに増加している。

異なる時間に投与すると、各薬物グループの動物の腫瘍は全て、モデルグループの腫瘍と比べて明らかに減少(全てはp<0.01になる)し、各薬物を単独で使用する場合、化合物2グループの腫瘍は最も小さく、その次に化合物1であり、2グループの腫瘍体積も明らかに陽性薬CYグループより小さく、瓦草類サポニン化合物1、2が腫瘍増長抑制において陽性対照薬CYより優れていることを説明する。瓦草総サポニンの腫瘍抑制効果も著しいが、CYと比べると効果はやや弱くなっている。

化合物1、2とCYを併用すると、腫瘍成長はより明らかに抑制され、各単独投与グループと比較すると、併用グループの腫瘍体積は明らかに減少し、化合物1、2とCYを併用すると、より良い協同効果があることが示される。表7に示される。

3.3 異なる瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のHepG2腫瘍負荷ヌードマウスの腫瘍重量、腫瘍指数及び腫瘍抑制率への影響 瓦草総サポニン、化合物1、2グループ動物の腫瘍重量、腫瘍指数はモデルグループと比べて明らかに減少(モデルグループと比較すると、全てp<0.01である)し、単独使用の場合、化合物2の腫瘍成長抑制効果が最も著しく、化合物1、2グループの腫瘍重量、腫瘍指数は全て陽性薬CYグループより低くなっている。瓦草総サポニンは以上の指標の改善に対して効果が著しいが、効果はCYより弱くなっている。腫瘍抑制率から見ると、化合物1、2皮下注射投与の腫瘍抑制率はそれぞれ80.05%と87.42%であり、陽性薬CY抑制率(70.46%)より高くなっており、良好な抗腫瘍効果を示し、且つ抗腫瘍作用強度はCYより優れている。

化合物1、2をそれぞれCYと併用する場合、腫瘍重量は各薬物の単独使用より明らかに低減し、腫瘍指数は明らかに減少し、腫瘍抑制率も増加し、化合物1、2がCYと抗腫瘍治療において併用すると良好的な協同効果があることを表明している。表8に示される。

4 結論 瓦草総サポニン、化合物1及び化合物2は明らかにヒト肝臓癌HepG2腫瘍負荷ヌードマウスの体重を増加させ、腫瘍体積を減少させ、腫瘍重量及び腫瘍指数を低減させることが可能で、この中でも化合物1、化合物2は陽性薬CYより優れる腫瘍抑制率を示し、瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物が強い抗腫瘍活性を有することが示される。同時に化合物1及び化合物2は、腫瘍負荷ヌードマウスの体重(モデルグループ、CYグループと比較するとp<0.01或いはp<0.01である)を明らかに増加させることが可能で、その副作用はCYより低いことが示され、効果が高く、低毒性の抗腫瘍活性成分の一種である。化合物1、2をそれぞれCYと併用する場合、マウスの体重は増加し、腫瘍抑制率も向上しており、化合物1、2は陽性薬CYと併用すると良好に副作用が低減され、効果が増強されることが示される。

(実験例5)瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物の抗ヒトBGC823胃腺癌薬効学の研究

1 実験方法

1.1 動物及び飼養管理 清潔なヌードマウス70匹(オス、体重19−22g)は、中国食品薬品検定研究所より提供され、合格証明番号:SCXK(京)2009−0017である。適応性飼育1週間後に薬効学実験を実施する。 実験動物飼育条件は実験例4と同様である。

1.2 BGC823胃癌細胞の培養 BGC823細胞の体外培養方法は実験例4と同様である。

1.3 実験設計 70匹のヌードマウスを適応性飼育1週間後、体外培養成長が良好なBGC823細胞の懸濁液をヌードマウスの背部皮下に1.2×10⁷個細胞/匹で接種する。接種終了後、体重に基づきランダムに七つのグループに分け、それぞれはモデル対照グループ、瓦草総サポニングループ(実施例1方法に基づき調製される)、化合物1グループ、化合物2グループ、化合物1+5−FU、化合物2+5−FUグループ及び陽性薬5−フルオロウラシル(5−FU)グループであり、グループ毎に10匹とする。3日接種後に投与を開始し、3週間継続する。

毎週1回、体重及び腫瘍の大きさを測定し、且つ腫瘍の体積を計算し、計算式は以下の通りである。 腫瘍体積:V=π/6×a×b²(a、bは腫瘍の横軸、縦軸の長さである)

最終投与終了後に、ヌードマウスを8時間禁食し、空腹の体重を測定し、眼球を外し血を取り、血清を遠心分離し、腫瘍組織を分離し、重量を量り、且つ腫瘍指数及び腫瘍抑制率を計算し、計算式は以下の通りである。 腫瘍指数=腫瘍重量(mg)/動物体重(g) 腫瘍抑制率(%)=(対照グループ平均腫瘍重量−投与グループ平均腫瘍重量)/対照グループ平均腫瘍重量×100%

1.3.1 組分け状況は以下の通りである。

1.3.2 投与方法 瓦草総サポニン、化合物1、化合物2、5−FUをそれぞれ無菌注射用水の中に溶解させ、ろ過除菌する。化合物1+5−FU、化合物2+5−FUをそれぞれ1:19の比率で混合液を調製し、ろ過除菌する。各投与グループにそれぞれ対応薬物を皮下注射し(10ml/kg BW)、モデル対照グループに同じ容量の注射用水のみを皮下注射し(10ml/kg BW)、毎日午前9時に投与し、計3週間継続する。

1.3.3 実験方案 体重の測定:毎週1回、ヌードマウスの体重を測定する。 腫瘍の測定:毎週1回、ヌードマウスの横直径及び縦直径を含む腫瘍の大きさを測定する。 実験終了:投与3週間(21日)後に該当実験研究を終了する。 データ集計:SPSS 10.0ソフトウェアでデータ処理分析を行い、すべての指標は均数±標準差(x(エックスバー)±s)で表示し、グループ間の比較に分散分析を採用する。

2 結果

2.1 異なる瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のBGC823腫瘍負荷ヌードマウス体重への影響 投与前に各グループの動物の体重は同じであり、グループ間に統計学的差異は無い。腫瘍接種後に、モデルグループ動物の体重は緩やかに増加し、接種して三週目より体重は明らかに減少する。瓦草総サポニン、化合物1、2グループの動物の体重は毎週増加しており、三者間で体重増加に明らかな差異はない。陽性薬グループの動物の体重は投与開始から増加していないにも関わらず、反対に明らかに減少(モデルグループと比較すると全てはp<0.01である)する。化合物1、2を5−FUと併用すると、5−FUによって動物の体重は明らか低減し得、データによると、薬併用グループのマウスの体重は毎週増加し、化合物1、2により明らかに5−FUの副作用が低減できることが示される。表10に示される。

2.2 瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のBGC823腫瘍負荷ヌードマウスの腫瘍体積への影響 1週間投与時、各薬物干渉グループの動物の腫瘍は明らかにモデルグループ腫瘍より縮小している(全てp<0.01である)。2、3週間投与時、化合物1、2グループの腫瘍はモデルグループの腫瘍に比してより明らかに縮小し(全てp<0.01)、且つ陽性薬5−FUグループの腫瘍体積はより明らかに縮小している。瓦草総サポニンも明らかな抗BGC823腫瘍効果を有するが、効果は5−FUより少し弱くなっている。

化合物1、2を5−FUと併用すると、腫瘍成長はより明らかに抑制され、各単独投与グループと比較すると、薬併用グループでは腫瘍体積が明らかに減少し、良好な協同効果が示される。表11に示される。

2.3 異なる瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のBGC823腫瘍負荷ヌードマウスの腫瘍重量、腫瘍指数及び腫瘍抑制率への影響 瓦草総サポニン、化合物1、2グループの動物の腫瘍重量、腫瘍指数は明らかにモデルグループ(モデルグループと比較すると、全てp<0.01である)より小さく、このうち、化合物2の腫瘍成長抑制効果は化合物1、瓦草総サポニンより強く、化合物1、2の皮下注射投与の腫瘍抑制率はそれぞれ64.54%と79.63%であり、陽性薬5−FUの腫瘍成長抑制効果より強く、三種の薬物も良好な抗胃癌活性を示している。

化合物1、2をそれぞれ5−FUと併用する場合、腫瘍重量は上述の三種の薬物の単独使用グループより明らかに低減され、腫瘍指数は明らかに減少し、腫瘍抑制率も向上しており、化合物1、2を5−FUと抗腫瘍治療において併用すると、良好な協同効果があることが示される。表12に示される。

3 結論 瓦草総サポニン、化合物1、化合物2は明らかにヒト胃癌BGC823腫瘍負荷ヌードマウスの体重を増加させ、腫瘍体積を低減させ、腫瘍重量及び腫瘍指数を低減させることが可能で、瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物が強い抗胃癌活性を有することを示している。同時に化合物1と化合物2は明らかに腫瘍負荷ヌードマウスの体重を増加させる(投与モデルグループ、5−FUグループと比較すると、p<0.01又はp<0.01である)ため、その薬効は5−FUより優れており、副作用は5−FUより低いことが証明され、効果が高く、低毒性である抗腫瘍活性成分の一種である。化合物1、2をそれぞれ5−FUと併用する場合、マウスの体重は増加し、腫瘍指数は明らかに下降し、腫瘍抑制率も向上しており、化合物1、2と5−FU併用すると良好に副作用減少、効果増強作用がもたらされることが示される。

(実験例6)瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物の抗ヒトHT29大腸癌薬効学の研究

1 実験方法

1.1動物及び飼養管理 清潔なヌードマウス70匹(オス、体重19−22g)は中国食品薬品検定研究所より提供され、合格証明番号:SCXK(京)2009−0017である。適応性飼育1週間後に薬効学実験を実施する。 実験動物の飼育条件は実験例4と同様である。

1.2 HT29大腸癌細胞の培養 HT29細胞の体外培養方法は実験例4と同様である。

1.3 実験設計 70匹のヌードマウスを適応性飼育1週間後に、体外培養成長が良好なHepG₂細胞懸濁液をヌードマウス背部皮下に接種する。1×10⁷個細胞/匹とする。接種終了後、体重に基づきランダムに七つのグループに分け、それぞれ、モデル対照グループ、瓦草総サポニングループ(実施例1方法に基づき調製される)、化合物1グループ、化合物2グループ、化合物1+パクリタキセルグループ(PTX)、化合物2+PTXグループ及び陽性薬PTXグループであり、グループ毎に10匹とする。3日接種後に投与を開始し、3週間継続する。

毎週1回、体重及び腫瘍の大きさを測定し、且つ腫瘍体積を計算し、計算式は以下の通りである。 腫瘍体積:V=π/6×a×b²(a、bは腫瘍の横軸、縦軸の長さである)

最終投与後に、ヌードマウスを8時間禁食し、空腹の体重を測定し、眼球を外し血を取り、血清を遠心分離し、腫瘍組織を分離し、重量を量り、且つ腫瘍指数及び腫瘍抑制率を計算し、計算式は以下の通りである。 腫瘍指数=腫瘍重量(mg)/動物体重(g) 腫瘍抑制率(%)=(対照グループ平均腫瘍重量−投与グループ平均腫瘍重量)/対照グループ平均腫瘍重量×100%

1.3.1 組分け状況は以下の通りである。

1.3.2 投与方法 瓦草総サポニン、化合物1、化合物2、PTXをそれぞれ無菌注射用水の中に溶解し、ろ過除菌する。化合物1+PTX、化合物2+PTXをそれぞれ1:19の比率で混合液を調製し、ろ過除菌する。各投与グループにそれぞれ対応薬物を皮下注射し(10ml/kg BW)、モデル対照グループに同じ容量の注射用水のみを皮下注射し(10ml/kg BW)、毎日午前9時に投与し、計3週間継続する。

1.3.3 実験方案 体重の測定:毎週1回、ヌードマウスの体重を測定する。 腫瘍の測定:毎週1回、ヌードマウス横直径及び縦直径を含む腫瘍の大きさを測定する。 実験終了:投与3週間(21日)後に該当実験研究を終了する。 データ集計:SPSS 10.0ソフトウェアでデータ処理分析を行い、全ての指標は均数±標準偏差(x(エックスバー)±s)で表示し、グループ間の比較に分散分析を採用する。

2 結果

2.1 異なる瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のHT29腫瘍負荷ヌードマウス体重への影響 投与前、各グループの動物の体重は同じであり、グループ間に統計学的差異が無い。腫瘍接種1週間時、PTXグループ以外の動物の体重はやや下降しているほか、他の各グループの動物の体重は全て増加している。2週間接種時、瓦草総サポニン、化合物1、2グループの動物の体重はまだ増加しており、それに対してモデルグループ、PTXグループの体重は下降を始める。3週間接種時、化合物1グループの動物の体重はまだ増加している一方で、他の各グループの体重は下降しており、このうち、モデルグループ、PTXグループの体重下降は著しくなっている。

化合物1、2をPTXと併用すると、明らかにPTXによって動物の体重への影響が低減され得、データから見ると、薬併用グループのマウスの体重は毎週増加しており、化合物1、2がPTXの副作用を有効に低減できることを示している。表14に示される。

2.2 瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のHT29腫瘍負荷ヌードマウスの腫瘍体積への影響 1週間投与時、各薬物干渉グループの動物の腫瘍はモデルグループの腫瘍より小さいが、瓦草総サポニン、化合物1グループの腫瘍は緩やかな増長の傾向を示しており、モデルグループと比較すると、統計学的差異が現れていない。2、3週間投与時、化合物2、PTXグループの腫瘍体積は先に上昇してから後に下降し、それに対して化合物1グループの腫瘍は継続して下降傾向を示しているが、増長速度は明らかにモデルグループ(p<0.05或いはp<0.01)より低くなっている。

化合物1、2をPTXと併用すると腫瘍の成長はより明らかに抑制され、各単独投与グループと比較すると薬併用グループの腫瘍体積は明らかに減少し、良好な協同効果を示している。表15に示される。

2.3 異なる瓦草5環性トリテルペンサポニン類化合物のHT29腫瘍負荷ヌードマウスの腫瘍重量、腫瘍指数及び腫瘍抑制率への影響 瓦草総サポニン、化合物1、2グループの動物の腫瘍重量、腫瘍指数は明らかにモデルグループより低く(モデルグループと比較すると、均有p<0.01)、このうち、化合物1、2のHT29腫瘍成長抑制強度はPTXと近似しており、腫瘍抑制率はそれぞれ50.44%と54.87%になっている。瓦草総サポニンの腫瘍抑制率は化合物1、2より低く、46.76%であり、三種の薬物も良好な抗大腸癌効果を示している。

化合物1、2をそれぞれPTXと併用した場合、腫瘍重量は上述の三種の薬物単独使用グループより明らかに低減され、腫瘍指数は明らかに減少し、腫瘍抑制率は増加しており、化合物1、2とPTXを抗腫瘍治療に併用する場合、良好な協同効果を有することを示している。表16に示される。

3 結論 瓦草総サポニン、化合物1及び化合物2は明らかにヒト大腸癌HT29腫瘍負荷ヌードマウスの体重を増加させ、腫瘍体積を低減させ、腫瘍重量及び腫瘍指数を減少させることが可能で、良好な抗大腸癌薬効学活性を示している。同時に化合物1、2をそれぞれPTXと併用した場合、明らかにマウス体重が増加し、腫瘍指数が低減され、且つ腫瘍抑制率を増加させることが可能で、PTXと併用した場合に、良好な効果増強、副作用低減作用が示される。

具体的な実施例は以下の通りである。

以下は本発明の原理及び特徴に対して説明され、列挙された実施例は本説明の解釈のみに扱うものとし、本発明の範囲を限定するものではない。

(実施例1)瓦草総サポニンの調製 瓦草21kgを取り、粉砕後に170Lの95%エタノールと70%エタノールで別々に3回抽出し、濃縮してからエキス7kgを取得し、エキスを水で希釈後にD101マクロ多孔性樹脂を通してそれぞれ水、10%エタノール、70%エタノール、90%エタノール勾配で溶離、この中に90%溶離部分から直接的に瓦草総サポニンが調製され、該当総サポニンの含有量は分光光度法で測定され、総サポニンの含有量は61.2%に達する。

(実施例2)瓦草5環性トリテルペン類化合物の調製 瓦草21kgを取り、粉砕後に170Lの95%エタノール及び70%エタノール別々に3回抽出し、濃縮してからエキス7kgを取得し、エキスを大量の水で希釈後にD101マクロ多孔性樹脂を通してそれぞれ水、10%エタノール、70%エタノール、90%エタノール勾配で溶離し、この中に90%溶離部分から総重量5kgのエキスが取得される。90%の部分はSephadex LH−20柱を通して分離してからMCIカラムに通して、順番に、水、30%、50%、60%、70%、90%、95%、100%メタノールで溶離し、それからsephadex LH−20を繰り返して、それぞれ大分子化合物1(sinocrassulosideVI)、化合物2(sinocrassuloside VII)、化合物3(sinocrassuloside VIII)、化合物4(sinocrassuloside IX)、化合物7(sinocrassuloside XII)、化合物8(sinocrassuloside XIII)を取得し、この内に、化合物1と化合物2、化合物3と化合物4、化合物7と化合物8は3対のシス型異性体である。 化学構造の鑑定データは以下の通りである。

化合物1と化合物2(sinocrassulosideVIとsinocrassulosideVII):白色粉末、分子式は:C₇₁H₁₀₂O₃₁である。ESI−MS(m/z):1473.2[M+Na]+、1449.7[M−H]⁻。¹H−NMRと¹³C−NMRの具体的なデータは表17を参照のこと。

化合物3と化合物4(sinocrassulosideVIIIとsinocrassuloside IX):白色粉末、分子式は:C₇₂H₁₀₄O₃₁である。ESI−MS(m/z):1487.2[M+Na]⁺、1499.7[M+Cl]⁻、1463.8[M−H]⁻。¹H−NMRと¹³C−NMRの具体的なデータは表17を参照のこと。

化合物7と化合物8(sinocrassulosideとsinocrassulosideXIII):白色粉末、分子式は:C₇₅H₁₁₀O₃₁である。ESI−MS(m/z):1529.3[M+Na]⁺、1541.8[M+Cl]⁻、1505.6[M−H]⁻。¹H−NMRと¹³C−NMRの具体的なデータは表17を参照のこと。

化学構造式の鑑定結果は以下の通りである。

化合物3と化合物4:白色粉末、分子式は:C₇₂H₁₀₄O₃₁である。化学構造式は以下の通りである。

化合物7と化合物8:白色粉末、分子式は:C₇₅H₁₁₀O₃₁である。化学構造式は以下の通りである。

(実施例3)錠剤の調製 化合物1、2をそれぞれ33g取り、加薬用デンプン217gを加えて均一に混合し、適量のデンプンペーストを接着剤制粒とし、乾燥してから顆粒製造機で顆粒を作り、成形し、一錠毎に250mgとし、経口で毎回1錠、毎日2回服用する。 (実施例3)カプセル剤の調製 化合物1、2をそれぞれ33g取り、加薬用デンプン217gを加えて均一に混合して、適量のデンプンペーストを接着剤制粒とし、乾燥してから顆粒製造機で顆粒を作り、カプセルに充填し、1粒毎に250mgとし、経口で毎回1粒、毎日2回服用する。

(実施例4)注射剤の調製 注射用水3000mLで化合物1、2各33gを溶解させ、それぞれ活性炭(105 ℃活化1時間)30gを加えて、それを0.01%になるように調製し、20分間加熱し、pH値を5.5−6.5に調整し、塩化ナトリウムを加えて等浸透溶液に調整し、加熱しながらろ過、封入、殺菌することで取得できる。1本当りに3mLで筋肉に注射し、毎回3mL、一日2回に服用する。

(実施例5)粉末注射剤の調製 化合物1、2それぞれ33gを細かい粉末状に凍結乾燥するか、又は注射液1000mL毎に62.5gマンニトールおよび62.5g麦芽糖を加えて支持剤を作り、溶解後に凍結乾燥し、密封、殺菌すると取得できる。

(実施例6)脂質体の調製 処方量の化合物1、2をそれぞれ3.3g量り、大豆レシチン40g及びコレステロール10gを用いてクロロホルム及びメタノール(2:1)に溶解させ、40℃の恒温水浴中で回転蒸発器の減圧蒸留を通して有機溶剤を除去し、瓶壁に均一な類脂フィルムが形成され、適切な濃度のマンニトール及びブドウ糖の水溶液1000mLを添加して、軽く振とうさせ、フィルムを溶解させて脂質体初懸濁液と水合成し、ディスクター式超音を半透明のコロイド溶液に置き、マイクロ孔ろ過フィルムでろ過し、ろ過液を分けてから凍結乾燥する。

(実施例7)気剤の調製 化合物1、2をそれぞれ16.5g取り、33gのポリグリコール4000を加え、加熱熔化した後に80℃の状態で20滴/分間の速度で液体パラフィン凝縮剤(凝縮剤上部の温度を5〜15℃に管理する)の中に点滴し、成形後に取出して凝縮剤を除去し乾燥すると本品1000錠が取得できる。錠剤の重量が0.0495g/錠剤となるように管理する。

(実施例8)凝結遅緩剤の調製 (1)骨格錠:化合物1、2をそれぞれ66g取り、HPMC K100M40g、乳糖120g、デンプン40gに溶解させる。混合した後に適量の5%PVPの95%エタノール溶液を接着剤制粒とし、乾燥させてから顆粒製造機で顆粒を作り、錠剤を押して、1錠当りに266mgとし、経口で毎回1錠、毎日1回服用する。 (2)マイクロ孔浸透ポンプ、コーディング:1錠当り273mgで経口、毎回に1錠、毎日1回服用する。 錠心:化合物1、2をそれぞれ66g取り、それぞれ糖140g、デンプン50g、塩化ナトリウム3g、タルカムパウダー1gを添加し、適量の5%PVPの95%エタノール溶液を接着剤制粒とし、乾燥させてから顆粒製造機で顆粒を作り、錠剤を押して、1錠当り260mgとする。 コーディング液:酢酸セルロースをアセトン及びイソプロピル・アルコールの混合溶液に溶解させ、濃度を2%(g/100mL)とし、ジブチルフタレート25%を可塑剤として添加し、致孔剤としてPEG400を加え、錠心コーディングとし、コーディングを5%の重量に増加させる。

(実施例9)乳剤の調製 化合物1、2をそれぞれ0.5g、ジメチルスルホキシド14mL、トリエタノールアミン1.6g、グリセリン4.0g、蒸留水54mL、ラノリン2.0g、白ワセリン10g、硬脂酸16gを取り、混合する。

(実施例10)口腔付着錠の調製 化合物1、2をそれぞれ33g取り、それぞれHPMC K4M50g、HPMC K15M25g、乳糖85g、硬脂酸マグネシウム1.5g、アスパルテーム5.5gを添加してから混合し、別々に100目ふるいにて粉枠し、粉末で直接的に錠剤を調製し、1錠あたり200mgとし、経口で毎回1錠、毎日2回服用する。

(実施例11)口崩片の調製 化合物1、2をそれぞれ33g取り、ヒドロキシプロピルセルロース146.65g、微結晶セルロース75g、アスパルテーム8.1g、メントール5.4g、乳糖35.5g、硬脂酸マグネシウム1.35gを混合し、経口で毎回1錠、毎日2回服用する。

(実施例12)顆粒剤の調製 化合物1、2をそれぞれ33g取り、乳糖1167g、デキストリン2800gを混合してから、適量の95%エタノールを接着剤制粒として、乾燥後、顆粒製造機で顆粒を作り、包装機で包装し、経口で毎回1袋、毎日2回服用する。

以上は本発明における比較的良い実施例のみであり、本発明に限らないものとし、本発明の精神及び原則内において何れかの修正、同等代替、改善等も全て本発明の保護範囲内に含まれている。

(付記) (付記1) 式Iの化合物

又はその塩の抗腫瘍薬物の調製における使用。 (式中、R₁は、H、Ac及びGlc(ブドウ糖)のうちの一種であり、 R₂は、(E)−MC、(Z)−MC、Acのうちの一種であり、 R₃は、H、Xyl(キシロース)のうちの一種であり、 R₄は、H、CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃のうちの一種であり、 Acの構造式は、以下の通りであり、

(E)−MCの構造式は、以下の通りであり、

(Z)−MCの構造式は、以下の通りである。)

(付記2) 前記化合物は、

、

、

、

、

又は

である、 ことを特徴とする付記1に記載の使用。

(付記3) 前記化合物は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍を治療する薬物の調製において使用される、 ことを特徴とする付記1又は2に記載の使用。

(付記4) 前記塩は、式Iの化合物及びアルカリ又はソロネッツ金属より形成される塩である、 ことを特徴とする付記1に記載の使用。

(付記5) 前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水素カリウム、水素酸化カルシウム、水素酸化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム又はアンモニアを含み、前記ソロネッツ金属は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミ、銅、亜鉛又はマグネシウムを含む、 ことを特徴とする付記4に記載の使用。

(付記6) 式Iの化合物は、化学合成、半合成又は生物転化される、 ことを特徴とする付記1、2、4又は5に記載の使用。

(付記7) 式Iの化合物は、化学合成、半合成又は生物転化される、 ことを特徴とする付記3に記載の使用。

(付記8) 式Iの化合物

又はその塩と、通常の抗がん剤のいずれかの一種と、を活性成分として含む、 ことを特徴とする腫瘍を治療するための医薬組成物。 (式中、R₁は、H、Ac、Glc(ブドウ糖)のうちの一種であり、 R₂は、(E)−MC、(Z)−MC、Acのうちの一種であり、 R₃は、H、Xyl(キシロース)のうちの一種であり、 R₄は、H、CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃のうちの一種であり、 Acの構造式は、以下の通りであり、

(E)−MCの構造式は、以下の通りであり、

(Z)−MCの構造式は、以下の通りである。)

(付記9) 前記通常の抗がん剤は、シクロホスファミド又は5−フルオロウラシルである、 ことを特徴とする付記8に記載の医薬組成物。

(付記10) 腫瘍治療薬物の調製において使用される、 ことを特徴とする付記8又は9の医薬組成物。

(付記11) 前記腫瘍は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍である、 ことを特徴とする付記10に記載の医薬組成物。

(付記12) 式Iの化合物

又はその塩を含む組成物の抗腫瘍薬物の調製における使用。 (式中、R₁は、H、Ac、Glc(ブドウ糖)のうちの一種であり、 R₂は、(E)−MC、(Z)−MC、Acのうちの一種であり、 R₃は、H、Xyl(キシロース)のうちの一種であり、 R₄は、H、CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃のうちの一種であり、 Acの構造式は、以下の通りであり、

(E)−MCの構造式は、以下の通りであり、

(Z)−MCの構造式は、以下の通りである。)

(付記13) 前記化合物は、

、

、

、

、

又は

である、 ことを特徴とする付記12に記載の使用。

(付記14) 前記化合物は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍を治療する薬物の調製において使用される、 ことを特徴とする付記12又は13に記載の使用。

(付記15) 前記塩は、式Iの化合物及びアルカリ又はソロネッツ金属より形成される塩である、 ことを特徴とする付記14に記載の使用。

(付記16) 前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水素カリウム、水素酸化カルシウム、水素酸化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム又はアンモニアを含み、前記ソロネッツ金属は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミ、銅、亜鉛又はマグネシウムを含む、 ことを特徴とする付記14に記載の使用。

(付記17) 前記式Iの化合物は、化学合成、半合成又は生物転化される、 ことを特徴とする付記12、13、15又は16に記載の使用。

(付記18) 前記式Iの化合物は、化学合成、半合成又は生物転化される、 ことを特徴とする付記14に記載の使用。

(付記19) 式Iの化合物

又はその塩と、補助材料と、から作られることを特徴とする製剤の抗腫瘍薬物の調製における使用。 (式中、R₁は、H、Ac、Glc(ブドウ糖)のうちの一種であり、 R₂は、(E)−MC、(Z)−MC、Acのうちの一種であり、 R₃は、H、Xyl(キシロース)のうちの一種であり、 R₄は、H、CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃のうちの一種であり、 Acの構造式は、以下の通りであり、

(E)−MCの構造式は、以下の通りであり、

(Z)−MCの構造式は、以下の通りである。)

(付記20) 前記化合物は、

、

、

、

、

又は

である、 ことを特徴とする付記19に記載の使用。

(付記21) 前記化合物は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍を治療する薬物の調製において使用される、 ことを特徴とする付記19又は20に記載の使用。

(付記22) 前記塩は、式Iの化合物及びアルカリ又はソロネッツ金属より形成される塩である、 ことを特徴とする付記19に記載の使用。

(付記23) 前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水素カリウム、水素酸化カルシウム、水素酸化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム又はアンモニアを含み、前記ソロネッツ金属は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミ、銅、亜鉛又はマグネシウムを含む、 ことを特徴とする付記22に記載の使用。

(付記24) 前記式Iの化合物は、化学合成、半合成又は生物転化される、 ことを特徴とする付記19、20、22又は23に記載の使用。

(付記25) 前記式Iの化合物は、化学合成、半合成又は生物転化される、 ことを特徴とする付記21に記載の使用。

(付記26) 前記製剤は、臨床上で使用される注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は気剤である、 ことを特徴とする付記21に記載の使用。

(付記27) 肝臓癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌又は黒色素腫瘍の治療薬物の調製における瓦草抽出物の使用。

(付記28) 前記瓦草抽出物において、瓦草総サポニンの含有量は、50%以上である、 ことを特徴とする付記27に記載の使用。