Bioassay method of yokukansan

本発明は、抑肝散のアッセイ方法に関し、更に詳細には、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）１Ａ（以下、「５ＨＴ１Ａ」という）受容体に対する作用を用い、漢方製剤である抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を定量的に評価しうるアッセイ方法に関する。

漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。 また、単一の活性成分のみで効果を発揮するとは限らず、複合的に作用する場合もあるため、その品質を保証するには、漢方薬全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている（特許文献１、特許文献２）。

この測定方法中には、個別の成分を測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。 そしてバイオアッセイには、生体内（in vivo）試験と、試験管内（in vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。

一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められており、実際ミオスタチンについては、バイオアッセイ法が報告されている（特許文献３）。 しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬については、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、それらの確立が待たれている。

例えば、漢方製剤である抑肝散は、一般的には下の組成の生薬混合物あるいはその抽出物であり、さらに必要に応じて、賦形剤等の医薬用担体や、その他の製剤上使用しうる成分を含有したものであるが、このものについても適切なバイオアッセイ系は見出されておらず、より高い品質保証を行うためには、その開発が求められている。

特表２０００−５１２６２１

特表２００１−５２１８７６

特表２００５−５２０４８６

従って、抑肝散について、より高い品質保証を可能とする試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことが本発明の課題である。

本発明者らは、抑肝散の作用に関し鋭意検討を行っていたところ、このものは５ＨＴ１Ａ受容体と結合活性を有し、しかもその結合活性は抑肝散の用量に依存することを知った。 そして、この知見を応用すれば、抑肝散のバイオアッセイ方法が構築できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと抑肝散とを競合的に作用させ、結合標識リガンド量から抑肝散の結合活性を測定することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。

また本発明は、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞膜に対して、標識ＧＴＰと抑肝散とを作用させ、結合標識ＧＴＰ量から抑肝散を測定することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。

さらに、本発明者らは、抑肝散の構成生薬の一つであるチョウトウコウについても５ＨＴ１Ａ受容体と結合活性を有し、しかもその結合活性はチョウトウコウの用量に依存することを知った。 そして、この知見を応用すれば、チョウトウコウあるいはチョウトウコウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法が構築できることを見出し、本発明を完成した。

ここで、チョウトウコウを含有する被検試料としては、チョウトウコウを含有する七物降下湯、釣藤散、抑肝散、抑肝散加陳皮半夏等の漢方処方やチョウトウコウを含有する植物エキス製剤等があげられる。

本発明のバイオアッセイ方法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、試験管内試験により、簡便かつ安定に抑肝散、チョウトウコウ又はチョウトウコウを含有する被検試料の生理活性値（薬理活性価）を求めることが可能である。

本発明の抑肝散のバイオアッセイ方法は、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞または細胞膜を用い、この受容体と抑肝散の結合活性を測定することにより、抑肝散の薬理活性値を評価するというものである。

より具体的には、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと抑肝散とを競合的に作用させ、結合標識リガンド量から抑肝散の結合活性を測定する方法（以下、「第一態様発明」ということがある）と、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞膜に対して、標識ＧＴＰと抑肝散とを作用させ、結合標識ＧＴＰ量から抑肝散の受容体結合によるアゴニスト活性を測定する方法（以下、「第二態様発明」ということがある）の何れかが利用できる。

上記２つの態様の発明のうち、第一態様発明は、細胞または細胞膜に発現している５ＨＴ１Ａ受容体で、標識リガンドと抑肝散を競合的に反応させ、標識リガンドのみの特異的結合量と競合後の標識リガンド結合量の差から抑肝散の結合活性値を測定するものである。

本発明方法において使用される５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞としては、例えば、Ｎｅｗｍａｎ-Ｔａｎｃｒｅｄｉらの手段（Newman-Tancredi, A. et al., 1992, High-level stable expression of recombinant 5-HT1A 5-hydroxytryptamine receptors in Chinese hamster ovary cells, Biochem.J. 285, 933-938）により、ヒト組換５−ＨＴ１Ａ受容体発現遺伝子を導入した細胞が挙げられる。 その例として、５−ＨＴ１Ａ受容体を発現したＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞等が挙げられる。 また、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞膜として、上記の５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞をホモジネート等の手段により破壊し、高速遠心分離等の手段により細胞膜分画を分離したものが挙げられる。 または、入手可能な５−ＨＴ１Ａ受容体発現細胞膜分画を得るなどが挙げられる。

また、５ＨＴ１Ａ受容体に対する標識リガンドとして、ラジオアイソトープ、蛍光、酵素等で標識したものが挙げられ、その例としては、［ ^３ Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、［ ^３ Ｈ］−５ＨＴ等が挙げられる。

第一態様発明の実施は、具体的には、５ＨＴ１Ａ受容体を発現しているＣＨＯ細胞膜を用い、［ ^３ Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴと抑肝散との競合反応から結合活性を求めることが好ましい。 この場合の反応系は、２５〜３７℃程度とすることが好ましく、抑肝散の結合活性の測定は、細胞または細胞膜に標識リガンドと抑肝散を加えた後、反応時間を１５〜６０分程度とすればよい。 また、標識リガンドのみの特異的結合量と競合反応後のリガンド結合量の差から抑肝散の結合活性を測定することが好ましい。

一方、第二態様発明は、細胞膜に発現している５ＨＴ１Ａ受容体にアゴニストが結合すると、細胞膜のＧ蛋白質αサブユニット（以下、「Ｇα」と略称する）に結合されていたＧＤＰが解離され、ＧＴＰに置き換わる作用を利用するものである。 本試験では、アゴニスト作用を持つ抑肝散が受容体に結合した際のＧαに捕捉された標識ＧＴＰ量から、抑肝散の５ＨＴ１Ａ受容体結合によるアゴニスト活性を測定するものである。

この第二態様発明で用いられる標識ＧＴＰとしては、ＧＴＰにラジオアイソトープ、蛍光、酵素等で標識したものが挙げられ、その例としては、［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ―ＧＴＰ等が挙げられる。

この第二態様発明を実施するには、具体的には、５ＨＴ１Ａ受容体を発現しているＣＨＯ細胞膜を用い、抑肝散の受容体結合によるアゴニスト活性シグナルにより増加する［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳの結合量を測定することが好ましい。 この第二態様発明では、標識ＧＴＰが細胞膜の内側にあるＧαと結合する必要があるため、５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞膜を用いることが必要である。 ５ＨＴ１Ａ受容体を発現している細胞を利用した場合では、標識ＧＴＰが細胞中に入ることができず、抑肝散の測定をすることができない。 また、第二態様発明の反応は、２２〜３０℃程度の温度とすることが好ましく、また、反応時間は２０〜６０分程度とすれば良い。 また、抑肝散の標識ＧＴＰ結合量と５ＨＴによる標識ＧＴＰ結合量との相対値から、抑肝散の受容体アゴニスト活性を測定することが好ましい。

上記両方法において、一般的には既知濃度の抑肝散を含む試料を同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性（結合活性あるいは受容体アゴニスト活性）価を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、既知濃度の抑肝散を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。

以上のようにして、被検試料中の抑肝散の薬理活性価を評価することができるが、この作用機序は、次のように考えられている。 すなわち、抑肝散またはチョウトウコウは５ＨＴ１Ａ受容体に結合するが、第一態様発明では当該成分と標識した５ＨＴ１Ａリガンドを競合反応させることにより、前記成分量に応じて５ＨＴ１Ａ受容体に結合する標識リガンドが減少する。 この減少した標識リガンド量を測定することにより、抑肝散またはチョウトウコウの結合活性評価が可能となるというものである。 また、第二態様発明では、アゴニストが細胞膜の５ＨＴ１Ａ受容体に結合すると、細胞膜のＧαに結合しているＧＤＰがＧＴＰと交換されるという性質を利用するものである。 すなわち、細胞膜の５ＨＴ１Ａ受容体に抑肝散を作用させ、細胞膜Ｇαに結合した標識ＧＴＰの量から、抑肝散の受容体アゴニスト活性を測定、評価するというものである。

以上説明した本発明のバイオアッセイ法によれば、抑肝散として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性価を評価し、基準製剤と被検製剤を比較することにより、製剤の品質同等性を評価することができる。

さらに、以上説明したバイオアッセイ法において、抑肝散ではなくチョウトウコウ又はチョウトウコウを含有する被検試料をもちいても、抑肝散と同様に品質の同等性を評価することが出来る。

また、複数の製剤ロットについて本発明のバイオアッセイ法で薬理活性価の評価を行いその平均等から導き出される上下限の範囲に対し、被検試料の薬理活性価がその範囲に該当するかどうかにより品質同等性を評価することもできる。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

実 施 例 １
セロトニン１Ａ受容体結合阻害試験：
（ 各実験条件 ）
使用細胞膜：ＣＨＯ細胞膜（ヒト組換５−ＨＴ１Ａ受容体を発現）（パーキンエルマー）
培養緩衝液：アスコルビン酸０.１％、ＥＤＴＡ０.５ｍＭおよびＭｇＳＯ _４ １０ｍＭを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）
培養時間および温度：６０分、２５℃
リガンド：１.５ｎＭの［ ^３ Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（ＮＥＴ−９２９、１７０.２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、パーキンエルマー）
非特異的リガンド： １０μＭのメテルゴリン（Metergoline；シグマ）
Ｋｄ： ２ｎＭ
Ｂｍａｘ：１.３ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン 特異的結合：７５％

（ 被験薬物溶液の調製 ）
約２０ｍｇの被験薬物（ＴＪ−５４または構成生薬エキス）を秤量し、１００μＬ（ＴＪ−５４では１２５μＬ）の蒸留水を加え、さらに同量のＤＭＳＯを加えて５０％ＤＭＳＯ溶液とした。 この溶液を用いて各濃度に希釈した。

（ 被験薬物の結合試験 ）
１ｍＬのチューブに、３２−４６μｇプロテイン/５００μＬのＣＨＯ細胞膜溶液、２０μＬの［ ^３ Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（最終濃度：１.５ｎＭ）および各濃度の被験薬物溶液（ｖｅｈｉｃｌｅでは最終濃度０．５％ＤＭＳＯ）５.２５μＬを加えて、インキュベーションした（６０分、２５℃）。 インキュベーション終了後、セルハーベスター（ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ−９６，パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ １８２１−９１５ ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、５０ｍＭトリス緩衝液で４回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［ ^３ Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴの放射活性を液体シンチレーションカウンター（Top Count NXT、パーキンエルマー）で測定した。 非特異的結合は、リガンド非標識の１０μＭメテルゴリン存在下、総結合は被験薬物非存在下（ｖｅｈｉｃｌｅ）での［ ^３ Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴの放射活性から算出した。

（ 被験薬物の結合活性は、以下の結合阻害率（％）から算出した。）
阻害率（％） ＝ ［１−（ｃ−ａ）／（ｂ−ａ）］×１００
ａ ； 非特異結合の平均ｃｐｍ
ｂ ； 総結合の平均ｃｐｍ
ｃ ； 試験化合物存在下でのｃｐｍ

（ 結 果 ）
抑肝散（ＴＪ−５４；（株）ツムラ製）２００μｇ/ｍＬおよび各構成生薬の７エキス（５０μｇ/ｍＬ）の結合活性（％）を上記方法で求めた結果を図１に示す。 この結果から、抑肝散およびチョウトウコウに高い結合活性が認められた。 さらに図２に示すように両エキスには、用量依存性が認められた。

上記の結果から、抑肝散の用量と結合活性の間に高い相関関係があること、また、抑肝散の構成生薬のうち、チョウトウコウの量と結合活性の間に高い相関関係があることがわかった。 この結果から、実施例１の方法で抑肝散の薬理活性値を測定することができることおよびこの５ＨＴ１Ａ受容体結合活性は、抑肝散中のチョウトウコウによるものであることが理解できる。

実 施 例 ２
［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ（セロトニン１Ａ受容体）結合試験 （ 各実験条件 ）
使用細胞膜：ＣＨＯ細胞膜（ヒト組換５−ＨＴ１Ａ受容体を発現）（パーキンエルマー）
培養緩衝液：ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＭｇＣｌ _２ １０ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭおよびＥＤＴＡ １ｍＭを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）
培養時間および温度：３０分、３０℃
非特異的リガンド： １００μＭの［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ（ＳＪ−１３０８、１０３３Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム）

（ 被験薬物溶液の調製 ）
約２０ｍｇの被験薬物（ＴＪ−５４または構成生薬エキス）を秤量し、１００μＬ（ＴＪ−５４では１２５μＬ）の蒸留水を加え、さらに同量のＤＭＳＯを加えて５０％ ＤＭＳＯ溶液とした。 この溶液を用いて各濃度に希釈した。

（ ［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合試験 ）
９６ウエルのプレートに５０μＬのＣＨＯ細胞膜溶液（２５−３０μｇプロテイン/ｍL）、各濃度の被験薬物溶液（ｖｅｈｉｃｌｅでは最終濃度０.４％ＤＭＳＯ）、０.４２μＬおよびＧＤＰ（１０μＭ）溶液２５μＬを、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝液中でインキュベーションした（２０分、３０℃）。 次に、ＳＰＡビーズ（Scintillation Proximity Assay beads；ＧＥ アマシャム）溶液２５μＬを加えてさらにインキュベーションした（６０分、３０℃）。 その後、放射活性を測定するため、［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ（０.３ｎＭ）１０μＬを加えてさらにインキュベーションした（３０分、３０℃）。

インキュベーション終了後、放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ、パーキンエルマー）で測定した。 被験薬物の［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合率（％）は、以下の式で算出しアゴニスト活性とした。 非特異的結合は、リガンド非標識の１００μＭＧＴＰγＳと［ ^３ Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴとの活性から算出した。

（ 被験薬物の［ ^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合率の算出 ）
結合率（％） ＝ ［（ｃ−ａ）／（ｂ−ａ）］×１００
ａ ； 非特異結合の平均ｃｐｍ
ｂ ； ３００ｎＭセロトニン存在下での平均ｃｐｍ
ｃ ； 試験化合物存在下でのｃｐｍ

（ 結 果 ）
抑肝散（ＴＪ−５４；（株）ツムラ製）を用い、上記方法で各濃度におけるアゴニスト活性（％）を求めた。 また、抑肝散を構成する７生薬についても、同様にアゴニスト活性（％）を求めた。 これらの結果のうち、抑肝散およびチョウトウコウについてのアゴニスト活性を図３に示す。

この結果から、１２.５〜２００μｇ／ｍｌの範囲で抑肝散の用量とアゴニスト活性の間に高い相関関係があること、また、チョウトウコウの量とアゴニスト活性の間にも相関関係があることがわかった。

本発明によれば、試験管内試験により、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単かつ安定に抑肝散の薬理活性価を求めることが可能である。

従って、従来の含有される一定成分を分析する方法に比べ、抑肝散をより高い程度で品質保証することが可能となる。

抑肝散の５ＨＴ１Ａ受容体結合活性および抑肝散を構成する７生薬の５ＨＴ１Ａ受容体結合活性を示す図面である。

各濃度における抑肝散の５ＨＴ１Ａ受容体結合活性およびチョウトウコウの５ＨＴ１Ａ受容体結合活性を示す図面である。

各濃度における抑肝散の［

^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合活性およびチョウトウコウの［

^３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合活性を示す図面である。