[0001] 本发明涉及水产养殖技术领域，尤其涉及缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响的添加剂。

[0002] 海洋酸化已被广泛确认是CO2上升导致的又一重大环境问题。化石燃料的使用等人类活动导致大气中CO2浓度不断升高，可能已经导致全球变暖和气候异常等，海洋不断从大气中吸收CO2，对缓解全球变暖起着重要的作用。然而，自工业革命以来，海洋大量吸收人类排放的CO2，已导致上层海水pH值下降了0.1。根据联合国政府间气候变化专门委员会(IPCC)预测模型(A1F1)的推测，至2100年大气CO2浓度会升至800-1000μL/L，表层海水pH值将下降0.3-0.4，这种酸化速度在过去3亿年间的任何一个时期都未有过。海洋酸化引起的海洋化学变化(碳酸盐系统及物质形态)，正在改变海洋生物赖以生存的化学环境，海洋生物的代谢过程会受到影响，海洋生态的稳定性会发生变化。海洋酸化引起的海水pH值的降低会改变海洋生物的多项生理功能，使海洋生物抵抗不良环境胁迫与疾病等能力降低，致使胁迫或疾病对海洋生物造成的损伤更严重，甚至在较低胁迫强度下造成生物个体死亡。

[0003] 近江牡蛎(Crassostrea rivularis)，又名大蚝、生蚝，是广西钦州四大名贵海产之一，肉可鲜食，亦可加工成蚝豉、蚝油。大蚝蚝肉是高蛋白、低脂肪、味道鲜美的具有很高营养和保健功能的水产品，蚝肉蛋白质含量超过40％，营养丰富，味道鲜美，素有“海中牛奶”之称，同时还可入药。大蚝肉富含牛磺酸，能促进人脑发育。近江牡蛎是我国主要牡蛎养殖种类之一，属于半咸水种类，主要分布在华南沿海众多河口地带。近江牡蛎营养丰富，其人工养殖主要集中在广东、广西和福建一带。牡蛎属于天然海产品，主要靠滤食海水中的藻类营生，养殖风险较低、生产易于管理、技术易于掌握。近年来，生蚝养殖由滩涂往浅海发展，由插养往吊养模式发展，成品蚝亩产量不断地上升，成为了我国沿海地区的支柱产业，有力地带动了沿海渔民增收致富。

[0004] 溶菌酶(lysozyme)别称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种小分子量的碱性蛋白水解酶，参与机体内多种免疫反应，在机体正常防御和非特异免疫中具有重要作用，是生物体内重要的非特异性免疫因子，常作为评价机体免疫水平的重要指标之一。McHenery等以30种贝类为研究对象，在其消化腺、外套膜、鳃、肌肉中均能检测到溶菌酶活性。现有研究发现，近江牡蛎鳃中能检测到较高含量的溶菌酶，而溶菌酶是生物体内重要的非特异免疫因子之一，在机体免疫过程中不仅能催化水解细菌细胞壁而导致细菌溶解死亡，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。可见，包括近江牡蛎在内，贝类的鳃在防止病原微生物入侵方面起着重要作用。近江牡蛎受到pH值降低和铅等重金属胁迫后，鳃组织溶菌酶含量呈先下降、后上升、再下降的趋势。近江牡蛎在遭遇外界胁迫时，代谢受到抑制，溶菌酶含量降低；而后由于适应性代谢加强，溶菌酶含量逐渐上升，甚至超过原有水平；随着时间的延长，胁迫依然没有解除，长时间的环境刺激超出近江牡蛎的适应范围，导致溶菌酶含量逐渐降低，免疫力下降。在养殖生产过程中，应尽量避免养殖水体pH值过低、铅含量过高，一旦发现应及时调整，以保证近江牡蛎的免疫力维持在正常水平，减少病害的发生。

[0005] 本发明提供了缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响的添加剂，添加到近江牡蛎(大蚝)的生长环境中，可以有效缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响。

[0006] 缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响的添加剂，该添加剂由以下重量比例成分制成：

[0007]

[0008] 所述微量金属离子为氯化钠、氯化钙、钼酸钠的一种；

[0009] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.0-8.2；

[0010] 所述促进剂采用以下方法制备：

[0011] 1)原料处理：将积雪草和穿心莲按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

[0012] 2)蒸汽爆破处理：将步骤1)得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；

[0013] 3)蒸馏处理：将步骤2)得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；

[0014] 4)高剪切均质机处理：将步骤3)得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。

[0015] 本发明所述用水符合制药行业标准。

[0016] 本发明所述积雪草和穿心莲的使用量，优选粉碎后的体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3。

[0017] 进一步优选的，该添加剂由以下重量比例成分制成：

[0018]

[0019] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.0。

[0020] 本发明添加剂的使用量，优选0.03-0.10％(w/w海水)。

[0021] 与现有技术相比，本发明的优点：

[0022] 1、现有研究表明，在酸化海水中，酸化海水对近江牡蛎溶菌酶活性的诱导效应显现得缓慢而持久，近江牡蛎鳃中能检测到较高含量的溶菌酶，而溶菌酶是生物体内重要的非特异免疫因子之一，在机体免疫过程中不仅能催化水解细菌细胞壁而导致细菌溶解死亡，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。近江牡蛎长期处于酸化海水中，代谢受到抑制，溶菌酶含量降低，长时间的环境刺激超出近江牡蛎的适应范围，导致溶菌酶含量逐渐降低，免疫力下降。而本发明得到近江牡蛎，通过对溶菌酶活性的检测，证明缓解了酸化海水对近江牡蛎溶菌酶活性影响。

[0023] 2、溶菌酶含量降低，在近江牡蛎的外观表现上是近江牡蛎的软体部分颜色发黄、黑色部分或者黑点增加，从而影响近江牡蛎的销售；而从口感的角度，比如清蒸后，肉质变老，顺滑度变差。而采用本发明的添加剂，得到的近江牡蛎，软体部分颜色洁白、黑色部分或者黑点少；而从口感的角度，比如清蒸后，肉质细嫩，顺滑。

[0024] 下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

[0025] 实施例1：

[0026] 缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响的添加剂，该添加剂由以下重量比例成分制成：

[0027]

[0028] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.0；

[0029] 所述促进剂采用以下方法制备：

[0030] 1)原料处理：将积雪草和穿心莲按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

[0031] 2)蒸汽爆破处理：将步骤1)得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；

[0032] 3)蒸馏处理：将步骤2)得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；

[0033] 4)高剪切均质机处理：将步骤3)得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。

[0034] 实施例2：

[0035] 缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响的添加剂，该添加剂由以下重量比例成分制成：

[0036]

[0037] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.2；

[0038] 所述促进剂采用以下方法制备：

[0039] 1)原料处理：将积雪草和穿心莲按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

[0040] 2)蒸汽爆破处理：将步骤1)得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；

[0041] 3)蒸馏处理：将步骤2)得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；

[0042] 4)高剪切均质机处理：将步骤3)得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。

[0043] 实施例3：

[0044] 缓解酸化海水对大蚝溶菌酶活性影响的添加剂，该添加剂由以下重量比例成分制成：

[0045]

[0046]

[0047] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.0；

[0048] 所述促进剂采用以下方法制备：

[0049] 1)原料处理：将积雪草和穿心莲按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

[0050] 2)蒸汽爆破处理：将步骤1)得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；

[0051] 3)蒸馏处理：将步骤2)得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；

[0052] 4)高剪切均质机处理：将步骤3)得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。

[0053] 空白例：

[0054] 大蚝基地的海水，不使用添加剂。

[0055] 对比例1：

[0056] 添加剂由以下重量比例成分制成：

[0057]

[0058] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.0。

[0059] 对比例2：

[0060] 添加剂由以下重量比例成分制成：

[0061]

[0062] 用磷酸盐缓冲液调pH为8.0；

[0063] 所述促进剂采用以下方法制备：

[0064] 1)原料处理：将积雪草和穿心莲按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

[0065] 2)水提处理：将步骤1)得到的物料加入10倍纯净水，加热沸腾提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩至1.05-1.1mg/mL(25℃)。

[0066] 实验例：

[0067] 本试验所用近江牡蛎于2017年4月购自钦州，立即送到试验场地，洗刷干净后置于5mx5mx1.8m的室内水泥池内暂养7d，经测定，近江牡蛎采集地和试验地海水中铅含量均低于0.01m//L，无显著性差异。暂养期间采用静态换水法，每天换水1次，养殖用水为过滤海水，主要水环境因子按采样地调控，水温(27±1)℃，pH值8.0，盐度3％，以金藻、青岛大扁藻作为饵料，24h连续充氧。暂养结束后，死亡率<1％，符合试验要求，挑选大小均匀[(11.12±
1.35)g/只]的近江牡蛎个体作为受试生物。

[0068] 1、处理

[0069] 试验前使用乙酸调配试验所需酸化海水(pH值7.6)，为防止调配好的海水在使用过程中pH值升高，采用输液管匀速缓慢向试验容器中滴加乙酸的方法稳定水体pH值。试验以正常海水作为对照(pH值8.0)。

[0070] 2、样品制备

[0071] 试验开始的当天记为0d，试验开始后的5、10、15、20d，从各桶随机取3只近江牡蛎，每组9只，取鳃组织，称质量，按1∶9(质量体积比)的比例添加预冷的生理盐水，冰上匀浆，4℃、5000r/min离心10min，取上清液，置于-80℃超低温冰箱内保存备用。

[0072] 3、溶菌酶活性测定

[0073] 溶菌酶活性测定使用南京建成生物工程研究所研制的溶菌酶检测试剂盒(A050型)，按照试剂盒使用说明操作，每个待测样品测试3次。

[0074] 4、添加剂的使用量：0.05％(w/w海水)

[0075] 5、结果：

[0076] 不同pH对近江牡蛎溶菌酶活性的影响    溶菌酶活性(U/mg)[0077]

[0078] 结论：实施例3的样品结果优于对比例。