一种高折射水凝胶型纳米复合材料的制备方法及应用 |
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| 申请号 | CN201511003965.7 | 申请日 | 2016-02-24 | 公开(公告)号 | CN105504151A | 公开(公告)日 | 2016-04-20 |
| 申请人 | 湖北大学; | 发明人 | 张全元; 曾有兰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种高折射 水 凝胶型纳米 复合材料 的制备方法及应用，通过紫外光引发自由基共聚合的方法成功合成了含有ZnS纳米颗粒的高折射率的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶型纳米复合材料。通过本发明制备方法制得的纳米复合材料清澈而透明，测得其折射率在干燥状态下高达1.58-1.70，在水合状态下高达1.38-1.46，而且其折射率随着ZnS纳米颗粒量的变化而变化，ZnS纳米颗粒含量高达60wt％的时候也能很好的分散并稳定于纳米复合材料中。另外，ZnS纳米颗粒的引入并没有增加纳米复合材料对细胞的毒性，对一般的细胞表现出最小的细胞毒性。将纳米复合材料植入到兔的眼睛里，能很好地维持透明状3周。本发明方法所制备的纳米复合材料来作为软质隐形眼镜材料和人工眼 角 膜 植入材料具有很大的潜在可能性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高折射水凝胶型纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种高折射水凝胶型纳米复合材料的制备方法及应用技术领域[0001] 本发明涉及一种高折射水凝胶型纳米复合材料的制备及应用。 背景技术[0002] 隐形眼镜(contact lens，简称CL)，也叫角膜接触镜，是一种戴在眼球角膜上，用以矫正视力或保护眼睛的镜片。根据材料的软硬它包括硬性、半硬性、软性三种，隐形眼镜不仅从外观上和方便性方面给近视、远视、散光等屈光不正患者带来了很大的改善，而且视野宽阔、视物逼真，此外在控制青少年近视、散光发展、治疗特殊的眼病等方面也发挥了特殊的功效。全球近视患者已超过10亿。中国是全球近视患者最多的国家，约有33％的人口患有近视，为世界平均水准22％的1.5倍。2013年，国内眼镜零售市场总额近300亿元，其中隐形眼镜(包括护理产品)占到30％，即90亿元。这意味着，隐形眼镜市场规模近三年来一直在以约30％的速度增长。而且由于需求庞大，而且眼镜产品更加丰富，这个数据将在未来几年内增长明显，到2015年，国内隐形眼镜市场规模预计将达到150亿元左右。另一个数据是，2013年隐形眼镜用户数量新增约20％，与前几年的新增速度大致持平。 [0003] 然而，中国隐形眼镜市场仍处于发展初期，据Euromonitor的估计，中国隐形眼镜市场(不包括护理产品)在2013年零售额为34亿元人民币，仅占全球隐形眼镜市场的4％。目前中国约有3000万人配戴隐形眼镜，按消费者平均每年配戴隐形眼镜2-3副测算，我国隐形眼镜的年需求量为7500万副左右。但中国隐形眼镜市场品牌较为集中，在2013年强生、视康、博士伦等主要国外隐形眼镜品牌已占了85％的市场份额。若有30％的隐形眼镜佩戴着选择国产品牌，按半年抛型每副100元计算，其年销售额将超过20亿元人民币。据研究显示，未来三年中国隐形眼镜市场将维持每年约20％的成长，占全球隐形眼镜市场的比重将逐步提升至7％。可以预见隐形眼镜的市场具有十足的成长潜力。 [0004] 此外，无论是近视眼还是远视眼，使用一种生物相容性材料做成可折射的移植物来处理一系列长期的角膜折射的改变很明显是一种更好的方法。明确指出精确的折射率改变的这种能力将会提高，更为重要的是这个步骤是addit ive和可逆的，而不是移除组织[1.2]。 [0005] 近些年，很多的研究机构试图研发各种各样的材料来作为眼角膜的替代品[3-11]。水凝胶是第一种应用于人的身体以及在生物领域有着广泛应用生物材料，例如药物释放、软接触镜、组织工程支架、生物传感器、软组织替代[12-16]。水凝胶的交联网络结构能吸取大量的水分显著溶胀，并在溶胀之后仍保持其交联结构的一种聚合物。由于水凝胶生物材料与软组织有着相似的物理性能，使得水凝胶材料与细胞和组织有着相似的流体动力学性能，同时，材料表面的亲水性和聚合物链高的内在流动性也可以改善它的生物相容性[17.18]。然而，由于水的折射率只有1.33，较低，而水凝胶生物材料的含水量高，所以其折射率也不是很高。而对于同一视力矫正度来说，折射率越低，其光学中心就需要做得越厚，从而影响了其佩戴的舒适性。 [0006] 参考文献： [0007] [1]Khan B，Dudenhoefer EJ，Dohlman CH.Keratoprosthesis:an update.Curr Opin Ophthalmol 2001；12:282–7. 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1.2)在充氮和温度为160℃的条件下不断搅拌回流10h； [0046] 需要说明的是，步骤S2中，ME-ZnS纳米颗粒按DMAA、单体NVP和ME-ZnS的质量之和的30％-60％加入。ME-ZnS的含量过低折射率的提高不明显，过高时材料韧性不够，30％-60％的比例能较好地兼顾折射率和材料韧性。 [0047] 需要说明的是，步骤S2中，得到的含ME-ZnS纳米颗粒、DMF、DMAA和单体NVP的混合物中，DMAA、NVP、DMF的重量比为2:2:1。 [0048] 需要说明的是，所述光引发剂采用Darocur 1173，为单体NVP的1vol％。 [0049] 需要说明的是，所述交联剂采用TEGDMA，为单体NVP的量的1vol％。 [0050] 需要说明的是，步骤S3中，超声处理时间为30s。 [0051] 需要说明的是，步骤S3和S4中的玻璃板厚度为1.0mm。 [0052] 需要说明的是，步骤S3和S4中垫片具有10mm的厚度，内径为20mm。 [0054] 本发明的有益效果在于： [0055] 1、通过采用简单的紫外光共混方法将纳米颗粒掺杂入聚合物体系中，掺杂的纳米颗粒含量可以根据需要任意随意调节，从而可根据需要选择不同的纳米颗粒含量以制备具备不同的折射率的高折射率水凝胶纳米复合材料，以满足不同视力矫正的要求； [0056] 2、通过本发明制备方法制得的纳米复合材料清澈而透明，测得其折射率在干燥状态下高达1.58-1.70，在水合状态下高达1.38-1.46，而且其折射率随着ZnS纳米颗粒量的变化而变化，ZnS纳米颗粒含量高达60wt％的时候也能很好的分散并稳定于纳米复合材料中； [0057] 3、ZnS纳米颗粒的引入并没有增加纳米复合材料对细胞的毒性，对一般的细胞表现出最小的细胞毒性； [0058] 4、将纳米复合材料植入到兔的眼睛里，能很好地维持透明状3周，因此本发明方法所制备的纳米复合材料来作为软质隐形眼镜材料和的一种候选材料具有很大的潜在可能性； [0060] 图1为ME-ZnS纳米颗粒、PVP/PDMAA水凝胶、不同ZnS含量(30-60wt％)的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的TGA曲线； [0061] 图2为在干燥状态下(RI(D))和水合状态下(RI(H))，不同ME-ZnS含量的水凝胶纳米复合材料的折射率和平衡含水量(WC)的变化示意图； [0062] 图3为猪的软骨细胞在含有不同ZnS纳米颗粒含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的培养皿上培养7天期间的WST活动能力测试结果图； [0063] 图4为hFOB、hHepG2和pSMSCs细胞培养7天后的WST活性测试； [0065] 图6为被染色细胞的“LIVE/DEAD”测试结果图； [0066] 图7为LESCs在培养1-5天中的MTS测试结果谱图； [0068] 图9为对水凝胶纳米复合材料的细胞粘附性能进行的研究结果示意图； [0069] 图10将不同ZnS纳米颗粒含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料在体外移植到兔的眼睛； 具体实施方式[0071] 以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。 [0072] 一种高折射水凝胶型纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤： [0073] S1合成干燥的ME(巯基乙醇)-ZnS纳米颗粒； [0074] S2将步骤S1得到的干燥的ME-ZnS纳米颗粒分散在DMF和DMAA组成的混合物中，常温下搅拌，然后加入单体NVP，搅拌使其混合均匀，形成ME-ZnS纳米颗粒、DMF、DMAA和单体NVP的混合物；将NVP和DMAA分两步与ME-ZnS混合，能够提升ME-ZnS的分散效果； [0075] S3在步骤S2得到的含ME-ZnS纳米颗粒、DMF、DMAA和单体NVP的混合物中加入光引发剂和交联剂后，用超声处理，使之成为透明的前驱体溶液，再将其转入到一块放置在玻璃板上的聚四氟乙烯的垫片上； [0076] S4将另一块放置在玻璃板上的聚四氟乙烯的垫片放在步骤S3中的垫片的顶部，再将溶液暴露在波长为200-2500mm的紫外光下10min，引发自由基聚合使其凝胶化，不溶于DMF的透明水凝胶形成，即为ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料； [0077] S5将步骤S4制得的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料放到大量的水中清洗，使水凝胶中未反应的溶解性物质交换出，之后用去离子水至少浸泡3天，以除去未反应的组分以及使其充分吸收水分，获得溶胀状态下的平衡水含量。 [0078] 需要说明的是，步骤S1的具体方法为： [0079] 1.1)在500ml的三颈烧瓶中加入22.0g、0.1mol的Zn(Ac)2.2H2O，11.6g、0.148mol的ME，5.5g、0.072mol的硫代尿素、300ml DMF，然后放到磁力搅拌器上，并装上冷凝装置，充氮； [0080] 1.2)在充氮和温度为160℃的条件下不断搅拌回流10h； [0081] 1.3)放到旋转蒸发仪中将浓度浓缩到80ml，再加入过量的乙醇将固体沉淀，把固体沉淀收集起来，用甲醇进行彻底的清洗，再将其放到真空干燥箱里进行干燥，得到干燥的ME-ZnS纳米颗粒。 [0082] 需要说明的是，步骤S2中，ME-ZnS纳米颗粒按DMAA、单体NVP和ME-ZnS的质量之和的30％-60％加入。ME-ZnS的含量过低折射率的提高不明显，过高时材料韧性不够，30％-60％的比例能较好地兼顾折射率和材料韧性。 [0083] 需要说明的是，步骤S2中，得到的含ME-ZnS纳米颗粒、DMF、DMAA和单体NVP的混合物中，DMAA、NVP、DMF的重量比为2:2:1。 [0084] 需要说明的是，所述光引发剂采用Darocur 1173，为单体NVP的1vol％。 [0085] 需要说明的是，所述交联剂采用TEGDMA，为单体NVP的量的1vol％。 [0086] 需要说明的是，步骤S3中，超声处理时间为30s。 [0087] 需要说明的是，步骤S3和S4中的玻璃板厚度为1.0mm。 [0088] 需要说明的是，步骤S3和S4中垫片具有10mm的厚度，内径为20mm。 [0089] 如上述任一权利要求制备方法所制得的高折射水凝胶型纳米复合材料在软质隐形眼镜材料、人工眼角膜植入材料的应用。 [0090] 上述制备方法所制得的高折射水凝胶型纳米复合材料可作为软质隐形眼镜材料、人工眼角膜植入材料。 [0091] 应用于软质隐形眼镜或人工眼角膜植入材料时，根据需要，选择制备相应折射率的纳米复合材料，并按照常规方法制作成软质隐形眼镜或人工眼角膜植入材料。 [0092] 以下将通过实验证明本发明制备方法所制备得到的纳米复合材料的性能。 [0093] 一、材料的表征 [0094] 取2mg左右的纳米复合材料样品和100mg KBr(溴化钾)进行压片，用Bio-Rad digilab FTS 3100分光仪进行傅里叶转换测试。 [0095] 用Perkin Elmer Diamond型热重分析仪对样品进行热重分析，测试条件为在充氮速度为200ml/min和升温速度为10℃/min的条件下将样品从常温加热到700℃。 [0096] ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料折射率的测定条件为：在20℃下，用NAR-4T和NAR-1T型固体阿贝折射仪在波长为589nm的进行测定，测定干燥状态下的折射率用含有硫磺溶液的二碘甲烷作为接触液体，测定水合状态下的折射率用一溴化萘(monobromonaphthalene)作为接触液体。先将纳米复合材料样品切成长20-30nm、宽大约为 8nm、厚度为3-10nm，再对样品进行清洗和表面抛光处理以进行折射率的测量。重复测量3次，以确保数据的准确性。 [0097] 二、溶胀性研究 [0098] ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料平衡含水量的测定是通过对比干燥状态下和水膨胀状态下的含水量。将浸泡在去离子水里的溶胀的纳米复合材料用滤纸将水分吸干，同时定期地测量它的重量，直到恒重。平衡含水量的计算公式如(1)所示： [0099] [0100] Ws：复合材料水合状态下的重量； [0101] Wd：复合材料干燥状态下的重量； [0102] 三、细胞活性/毒性测试 [0103] 对ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的体外细胞活性/毒性研究是采用WST-1测试和LIVE/DEAD测试。WST-1测试采用Transwel l细胞培养系统，这是一种间接的方法，可以显示出水凝胶过滤出的物质对细胞的副影响。将水凝胶纳米复合材料切成小圆片(直径为6mm、厚度为4mm)，在室温下，将其放在乙醇:水为70:30的混合液中在紫外光的照射下进行一天的杀菌处理，之后将其浸泡在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)在紫外光下照射一天，使得PBS上的乙醇完全移位到水凝胶纳米复合材料上。将细胞放到96孔的聚苯乙烯培养皿中(TPS，每孔的细胞5×103个)，在37℃(成骨细胞在33℃)、5％的CO2氛围下培养24h，然后将小块的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料加到培养孔中。将TPS孔用来作一个阳性控制，同时没有ZnS纳米颗粒的水凝胶用来作对照。培养皿每两天更换一次，将细胞染色进行LIVE/DEAD和细胞活性/毒性测定(分子探针)，用钙毒绿素和EthD-1分别对活细胞和死细胞进行鉴别。经过细胞生长的1-7天这个特定的时间段后(After a certain period of cell seeding time ranging from 1to 7days)，再将培养皿卸掉，用PBS清洗培养皿。然后，用含有2μm钙黄绿素和4mMEthD-1的“LIVE/DEAD”溶液在37℃下培养30min。采用荧光显微镜(Olympus IX71显微系统)对染色过的培养皿进行活细胞和死细胞的数量测定。 [0104] WST-1测试是用来检测线粒体RNA的功能和细胞增殖的。WST工作液是通过细胞培养皿中之分之一的溶液混合制备而成(WST working solution was prepared by mixing a tenth of WST regent with the cell media)。当在培养皿中培养了1-7天这个特定的时期后，再将培养皿卸掉，然后将220μl的WTS的测定液加入到96孔的水凝胶纳米复合材料板中，在37℃(成骨细胞为33℃)的条件下，在振动筛里培养1.5h使得颜色柱形成，之后，将WST测定液放到一个新的96孔测顶板(每孔100μl)上，放在波长为490nm的热质谱中进行吸光度的测定，每个样品测定4次。 [0105] 通过MTS测试来检测水凝胶纳米复合材料对角膜缘上皮干细胞的繁殖能力的影响。将细胞放在24孔(每孔1.0×104cm-2)在1ml的无血清培养基中进行培养，一晚上之后细胞可以吸附上，再用药品进行处理(Cells were allowed to attach overnight and then treated with the samples.)。在之后的1-5天对每一个样品用200μlMTS溶液进行处理(For each sample，200μl of MTS solution was added at 1and 5days after treatment)，之后在37℃、5％CO2的氛围下培养3h，再用490nm的酶标测定光吸收度。细胞活性能力的计算用了水凝胶样品处理的活细胞与没有用水凝胶样品处理的活细胞数量的比值，一式三份的进行重复试验以确保数据的准确性。 [0106] 四、蛋白质的吸附 [0107] 将直径大约为0.5cm、厚度大约为0.2cm的圆形水凝胶样品，BSA的量为0.2ml、样品溶液的量为0.1ml放在48孔的TCPS中进行蛋白质吸附测试。取一定量的BSA(牛血清白蛋白)溶解到PBS溶液中来制备浓度为3mg/m-1的BSC溶液，将BCA和硫酸铜溶液以50:1的体积比混合以制备检测液。将水凝胶纳米复合材料切成小圆块，再将其浸泡在PBS溶液中1h。PBS里溶解好了的样品浸入在BSA溶液里，再将其放在37℃的振动筛里培养4h。先确定溶液里BSA的浓度，再用BCA检测试剂盒测定它的吸附值。简要地说，就是将0.1ml的样品溶液加到1ml的检测液中，再将其放在30℃的水浴锅中培养15min，其颜色由绿色变为紫色。培养后的溶液，用紫外光谱(UV-2450，Shimadzu)进行分析，观察560nm处的吸收强度可用来评估蛋白质的浓度，重复测量3次，取平均值。 [0108] 五、细胞粘附 [0109] 细胞的培养和处理ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的步骤和之前描述的一样，将水凝胶纳米复合材料放在96孔的TCPS上，并用PBS洗涤3次、一次用来作为细胞的传递的媒介(one time with the cell media.)。PCCs细胞(猪卵丘颗粒细胞)已接种好了的孔在37℃下培养24h，细胞的播种密度为：1.0×105/孔。培养好之后，将表面的细胞用细胞培养液(cell media)清洗3次，再用显微镜(奥林巴斯1X71显微系统)来对每一个阶段的相对细胞粘附进行评估(cell adhesion was assessed in a phase contrast microscopy(Olympus IX71 microscope system)。 [0110] 六、移植学研究 [0111] 准备12只2-3kg的新西兰白兔，根据ARVO协会对使用动物眼科和视觉研究的要求对兔子进行眼科实验。实验的操作规范经过了动物关怀协会、生物资源中心委员会及Jilin大学的同意。(The experimental protocol was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Biological Resource Centre,Jilin University.)。用40mg/kg的克他命(New South Wales，Australia)和8mg/kg的甲苯噻嗪(New South Wales，Australia)注射到12只兔子的肌肉，使兔子处于麻醉状态。制得直径为4mm、厚度大约为1mm的钻孔水凝胶，用LKP技术将其植入，再用丝线进行缝合。The hydrogel samples were obtained using a 4mm diameter punch from the sheet of hydrogel(大约1mm thick)and the samples were implanted by lamellar keratoplasty(LKP)； silk sutures were used)为了评估植入材料(scaffold)的生物相容性，将薄膜形式的水凝胶样品植入到兔右眼的眼角膜处，在兔子的右眼角膜中心开一个薄膜基质大的口子(5× 4mm)，然后将样品薄膜植入到中心的口子处。将ZnS纳米颗粒的含量分别为：1wt％、40wt％、 60wt％的三种水凝胶样品的植入到兔的右眼，每种样品分别都植入到4只兔的眼睛里。移植了3个星期(1and 3weeks)后，将兔安乐死后将眼角膜的样品取出，取出来的角膜样品用苏木精和曙红对样品染色进行考察。用裂隙灯考察眼角膜的光学透明度和neo-vascularization(与没有植入样品的左眼进行对比)。 [0112] 七、数据分析 [0113] 对于以上的每一项实验，每个样品测4次，使其在考虑了统计学误差后，将误差控制在小于0.05，再取平均值。 [0114] 八、结果与讨论 [0115] 8.1、ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的性能 [0116] 将已经分散DMF中的ME-ZnS纳米粉末来获得不同浓度下稳定而透明的溶液，以制备不同ZnS含量的水凝胶纳米复合材料。尽管最小的平均直径为3.0nm左右，但是立方相的ZnS纳米颗粒仍有一个很好的结晶度[19]。与DMF相比(besides)，据报道它是极性有机分子，例如DMFF，由于与ZnS纳米颗粒表面的协同反应，使其可以有效地稳定和分散ZnS纳米颗粒[20-23]。NVP和DMF、DMAA有着相似的分子结构，由于离子络合作用，他们在反应中所起的作用也是一样的，然而，NVP和DMAA都是形成水凝胶网络结构的前驱单体。通过一个简单的紫外光引发自由基共聚合，用紫外光照射ME-ZnS纳米颗粒、DMF、NVP和DMAA单体的混合溶液，成功合成不同ZnS含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料，所制备的纳米复合材料中ME-ZnS纳米颗粒的含量可为30-60wt％。由于ZnS纳米颗粒表面的相互作用：(1)Zn2+的络合作用；(2)ZnS纳米颗粒表面ME分子中羟基形成的氢键的分子作用，使得ME-ZnS纳米颗粒能很好的稳定和分散在PVP和PDMAA的聚合物基体中。 [0117] ME-ZnS纳米颗粒、PVP/PDMAA水凝胶和ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的热稳定性研究，如图1为它们的TGA曲线。由于巯基乙醇分子表面的不稳定性，ZnS纳米颗粒在200℃左右时开始失重，其有机结构在300℃左右开始分解，根据图1的失重数据估计，ME：Zn2+的重量下降比例高达1:1.45，数据表明，大量的ME分子修饰到ZnS纳米颗粒的表面可以提高ZnS纳米颗粒在聚合物基体中的相容性，可以避免相分离以制得均匀且透明的纳米复合材料。PVP/PDMAA聚合物基体的分解温度在330-450℃。当把ZnS纳米颗粒整入到PVP/PDMAA聚合物基体后，所制得的纳米复合材料出现两个不同阶段的失重，一个是ME分子的分解；一个是聚合物基体的分解，他们之间是各自分解的。从图1曲线的走势可知，第一个阶段的失重开始于220℃左右，第二个阶段在300℃左右，是所有纳米复合材料样品的分解。随着ZnS纳米颗粒量的增加，TGA曲线中残留重量的百分比也有19.6％增加到39.1％。ME-ZnS的残留重量为64.8％，这个数据和有ME-ZnS(30％-60wt％)在水凝胶纳米复合材料中的理论组成相一致。 [0118] 所制得的水凝胶纳米复合材料在干燥状态下和水合状态下都是清澈而透明的，即使在ZnS纳米颗粒在含量为60％的时候也一样。由于溶胀，样品尺寸大小的变化是比较明显的。当ZnS纳米颗粒的含量从30wt％变化到60wt％的时候，ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的平衡含水量相应地从82.0％变化到66.8％。高的含水量使得水凝胶复合材料对水溶性的代谢物，如葡萄糖、氧和其他营养素，具有高的渗透性[24.25]。所制得的水凝胶纳米复合材料在干燥状态下的折射率为1.58-1.70，在水合状态下的折射率为1.38-1.46，比PVP/PDMAA水凝胶复合材料的折射率1.35-1.48要高。 [0119] 图2为不同含量的ME-ZnS所制得的水凝胶纳米复合材料的折射率和平衡含水量的变化谱图。随着ZnS纳米颗粒在聚合物基体中含量的增加，所制得的材料的折射率在干燥和水合状态下几乎都是线性增加，表明本发明制备方法是提高和调节水凝胶纳米复合材料折射率的一种很有效的方法。另外，还研究了将水凝胶样品在去离子水中浸泡了一个月后的折射率，发现其折射率并没有改变，表明水凝胶纳米复合材料是稳定的，同时ZnS纳米颗粒并没有被浸出。此外，所制得的水凝胶纳米复合材料的折射率均比人的角膜的折射率[26](1.373-1.380 )要高。尤其是当ZnS纳米颗粒的含量为40wt％的时候，所制备出的水凝胶纳米复合材料的折射率为1.41，与人类角膜的折射率(1.373-1.380)最为适宜，只是此时的平衡水含量为75.2％，比人类角膜的含水量稍低。在这项研究工作中，高折射率的水凝胶纳米复合材料可以促进稀薄的晶状体光学部分在角膜移植上的使用，同时使得在外科手术过程中通过在角膜上开一个小缺口进行植入成为可能。 [0120] 8.2、ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的活性/毒性测试 [0121] 水凝胶纳米复合材料的体外活性/细胞毒性实验是通过WST-1测定和“LIVE/DEAD”测定。ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的毒性测试首先是用PCCs测定ZnS含量的影响，如之前描述的那样，把细胞接种到96孔培养皿上进行细胞培养，再将小块的不同ZnS纳米颗粒含量(30、40、50、60wt％)的水凝胶纳米复合材料放到孔上，将细胞放在没有加入水凝胶复合材料的培养皿中进行培养以进行阳性对照，以及放在没有加入ZnS纳米颗粒的PV/PDMAA水凝胶材料的培养皿中进行培养设置对照。在1、3、5、7天的时间段内检测细胞的活性。如图3为猪的软骨细胞在含有不同ZnS纳米颗粒含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的培养皿上培养7天期间的WST活动能力测试结果谱图，从图中可知，虽然稍低于阳性组，但是在有ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的培养皿中培养的细胞仍能进行繁殖，而且在数量上显示出随培养时间的增加而增加的函数，说明所有的水凝胶纳米复合材料具有一定的生物相容性。当ZnS纳米颗粒以30-60wt％的量加入到PVP/PDMAA水凝胶中的时候，所有制得的水凝胶纳米复合材料的细胞活性只比没有加入ZnS纳米颗粒的水凝胶材料的细胞活性略低。因此，随着ZnS纳米颗粒含量的增加，四种水凝胶纳米复合材料的细胞存活率并无明显差异，表明即使在ZnS纳米颗粒的含量为60wt％的时候，ZnS纳米颗粒对水凝胶纳米复合材料所产生的细胞毒性很小。 [0122] 图5为用钙黄绿素AM和EthD-1染色后ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料和PVP/PDMAA水凝胶在PCCs中的形态谱图。染色了的活细胞和死细胞在荧光显微镜下会分别显示为绿色和红色，在分别含有四种ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的培养皿中培养了7天的PCCs细胞大多数都是活的，死细胞很少，由此证明用这个材料处理的细胞具有高活性。与阳性组对照发现细胞伸展(spread)的很好，并没有观察到形态学的转变。对所有的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料和PVP/PDMAA水凝胶PCCs保持正常的纤维细胞形状。与含有PVP/PDMAA水凝胶的培养皿培养的细胞相比，在含有各种ZnS含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的培养皿中培养的细胞都有钙黄绿素染色(即活细胞)。因此，上面相一致的结果表明将ZnS纳米颗粒引入到PVP/PDMAA水凝胶中对PCCs显示出很小的细胞毒性。 [0123] 另外，还用ZnS纳米颗粒含量为40wt％的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料来考察对hFOB、hHepG2和pSMSCs细胞活性的影响，采用没有水凝胶纳米复合材料的培养皿培养细胞来作为一个阳性对照。如图4为hFOB、hHepG2和pSMSCs细胞培养7天后的WST活性测试谱图，由图可知，细胞活性与软骨细胞相似，在含有水凝胶纳米复合材料的培养皿中培养的这三种类型的细胞的活性都与培养时间成正相关函数。图6为被染色细胞的“LIVE/DEAD”测试结果图，培养7天后，3中细胞大多数都是活的(绿色的荧光)，表明ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料具有很好的生物相容性，除此之外，与阳性对照相比，这三种细胞都保持正常的细胞形状伸展。 [0124] 采用MST-5-2来测试水凝胶纳米复合材料对LESCs活性的影响，图7为LESCs在培养1-5天中的MTS测试结果谱图，如图7可知，LESCs可以在所有含有各种ZnS纳米颗粒含量的水凝胶纳米复合材料的培养皿中繁殖。图8为用钙绿黄素AM和EthD-1处理的LESCs在培养5天后在荧光显微镜下的图谱，从图8的“LIVE/DEAD”测试结果可知，在含有各种ZnS纳米颗粒含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料和PVP/PDMAA水凝胶的培养皿上培养的细胞都伸展的很好，同时，培养了5天后，大部分的细胞都是活的(绿色荧光)，表明ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料对LESCs显示出最小的细胞毒性。根据以上的测定结果，可以得出结论，将ZnS纳米颗粒引入到PVP/PDMAA水凝胶中，对体外的一般细胞都表现出很小的细胞毒性。 [0125] 8.3、蛋白质吸附和细胞粘附 [0126] 对蛋白质吸附研究结果是对四种不同ZnS纳米颗粒含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料和PVP/PDMAA水凝胶都没有检测到蛋白质的吸附。对于所有的有ZnS纳米颗粒和没有ZnS纳米颗粒的水凝胶材料的这种优良的耐蛋白质吸附的性能表明将ZnS纳米颗粒的引入到PVP/PDMAA水凝胶并没有改变水凝胶基体对蛋白质的吸附性能。对水凝胶纳米复合材料的细胞粘附性能进行的研究结果如图9所示，在ZnS纳米颗粒含有40％和60％的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料表面，也仅仅有少数细胞粘附在ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的表面而且并没有发现细胞分布，表明水凝胶纳米复合材料对细胞吸附显示较好的阻隔性。 [0127] 8.4、材料的植入研究 [0128] 将不同ZnS纳米颗粒含量的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料在体外移植到兔的眼睛，如图10所示，研究发现，ZnS纳米颗粒含量为40wt％和60wt％时，水凝胶纳米复合材料植入到兔的眼睛里后能很好的保持透明状3周，没有发现伤口渗漏(wound leakage)、感染、炎症及新生血管。图11为水凝胶眼角膜(不含ZnS纳米颗粒和ZnS纳米颗粒的含量为60wt％)植入物的组织学切片图，表明植入的角膜盘可以在兔角膜基质中移植3周后存活(the transplanted corneal discs could remain in the rabbit cornea stroma after 3weeks of transplantation)，而且并没有发现任何的炎症、水肿和感染。 [0129] 九、结论 [0130] 总的来说，本发明通过简单的紫外光引发自由基聚合已成功合成了一系列含有ZnS纳米颗粒的高折射率的ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料，随着ZnS纳米颗粒的含量由30wt％增加到60wt％，ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料的平衡含水量由82.0％变化到66.8％。水凝胶纳米复合材料的折射率随着ZnS纳米颗粒含量的变化而变化，在干燥状态下水凝胶的折射率为1.58-1.70，在水合状态下的折射率为1.38-1.46。体外细胞活性/细胞毒性的测试、蛋白质的吸附测试、体外细胞粘附测试和体内植入研究都表明ZnS/PVP/PDMAA水凝胶纳米复合材料具有生物相容性。由于本发明制备得到的水凝胶纳米复合材料的折射率具有可调节性，使得它作为人工角膜移植物的中心光学材料具有很大的潜在性。 [0131] 对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。 |
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