시아나이드에 의해 글루타치오닐코발라민의 글루타치온 리간드 치환반응을 이용한 시아나이드의 검출방법

시아나이드에 의해 글루타치오닐코발라민의 글루타치온 리간드 치환반응을 이용한 시아나이드의 검출방법{Methods for the detection of cyanide based on displacement of the glutathione ligand of glutathionylcobalamin by cyanide}

본 발명은 시아나이드에 의해 글루타치오닐코발라민의 글루타치온 리간드 치환반응을 이용한 시아나이드의 검출방법에 관한 것이다.

최근에 화학적으로나 생물학적으로 음이온이 매우 중요한 역할을 한다는 인식을 하게 되면서 초분자 화학분야에서는 음이온을 인식하는 시스템을 개발하는데 많은 관심을 가지고 있다. 다양한 음이온 중에서도 시아나이드 음이온은 매우 독성이 강하고, 구토와 의식 상실을 유발하고 사망에 이르기까지는 하는 음이온이기 때문에 시아나이드 음이온을 검출하는 시스템을 개발하는 것은 특히 중요하다고 할 수 있다.

시아나이드 음이온은 금 채굴, 전기도금, 야금술을 포함하여 다양한 산업적인 공정과정에서 사용되는 중요한 화합물이지만 갑작스런 시아나이드 음이온의 방출은 매우 심각한 문제를 야기할 수 있다. 이러한 측면에서 시아나이드 음이온을 검출할 수 있는 다양한 시스템들이 계속해서 연구되어 오고 있다.

형광 공명 에너지 전이, 친핵체 첨가 반응, 금속킬레이트의 탈금속화와 같은 다양한 메커니즘을 사용한 많은 시아나이드 감별 시스템들이 발표되었다. 하지만, 이러한 많은 시스템들은 다른 음이온들의 간섭으로 시아나이드 감별에 있어 여전히 선택성과 감도가 좋지가 않다.

따라서, 다른 음이온들에 의해 간섭을 받지 않는 특이성, 높은 민감성, 그리고 단순한 방법으로 시아나이드 음이온을 검출하는 방법이 필요한 실정이다.

글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 유도체의 하나이다.

본 발명자들은 글루타치오닐코발라민의 중심 금속 코발트에 리간드 결합되어 있는 글루타치온(GSH)이 시아나이드 음이온에만 특이적으로 친핵성 치환반응함을 알아내어, 이를 시아나이드 음이온 검출에 응용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명에 따른 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl) 및 버퍼를 포함하는 시아나이드(CN ^- ) 검출용 조성물은, GSCbl이 다른 음이온들과는 친핵성 치환반응을 일으키지 않고 CN ^- 음이온에만 선택적으로 치환반응을 일으키는 특이성이 있고, 또한 코발라민(Cbl)에 리간드 결합되어 있는 글루타치온(GSH)이 CN ^- 음이온과 높은 효율로 친핵성 치환반응을 하여 민감성이 향상되는 효과가 있으며, 이러한 CN ^- 의 친핵성 치환반응에 의해 생성되는 부생성물인 시안화코발라민(CNCbl), 이시안화코발라민(diCNCbl) 및 글루타치온(GSH)을 각각 분광, 육안 및 형광 분석을 통해 정성/정량 검출할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl) 및 버퍼를 포함하는 시아나이드(CN ^- ) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 시아나이드의 분광 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 시아나이드의 육안 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 혈액 또는 음식물 시료 중 시아나이드(CN ^- ) 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 시아나이드의 형광 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl) 및 버퍼를 포함하는 시아나이드(CN ^- ) 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시아나이드(CN ^- ) 함유 시료를 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)이 포함되어 있는 버퍼에 첨가하는 단계(단계 1);

상기 GSCbl은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 단계 1에서 첨가된 시아나이드(CN ^- )가 친핵성 공격을 통해 글루타치온(GSH)과 치환반응하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 생성된 시안화코발라민(CNCbl)을 UV-Vis 분광기로 정성 또는 정량 검출하는 단계(단계 3);

를 포함하는 시아나이드의 분광 검출방법을 제공한다.

상기 분광 검출방법에서 단계 1의 버퍼는 pH 9 미만인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 시아나이드(CN ^- ) 함유 시료를 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)이 포함되어 있는 버퍼에 첨가하는 단계(단계 1);

상기 GSCbl은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 단계 1에서 첨가된 시아나이드(CN ^- )가 친핵성 공격을 통해 글루타치온(GSH)과 치환반응하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 생성된 이시안화코발라민(diCNCbl)을 색상의 변화로 육안 검출하는 단계(단계 3);

를 포함하는 시아나이드의 육안 검출방법을 제공한다.

상기 육안 검출방법에서 단계 1의 버퍼는 pH 9 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 혈액 또는 음식물 시료 중 시아나이드(CN ^- ) 검출용 키트를 제공한다.

나아가, 본 발명은 시아나이드(CN ^- ) 함유 시료를 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)이 포함되어 있는 버퍼에 첨가하는 단계(단계 1);

상기 GSCbl은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 단계 1에서 첨가된 시아나이드(CN ^- )가 친핵성 공격을 통해 글루타치온(GSH)과 치환반응하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 생성된 글루타치온(GSH)을 형광 검출기로 정성 또는 정량 검출하는 단계(단계 3);

를 포함하는 시아나이드의 형광 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl) 및 버퍼를 포함하는 시아나이드(CN ^- ) 검출용 조성물은, GSCbl이 다른 음이온들과는 친핵성 치환반응을 일으키지 않고 CN ^- 음이온에만 선택적으로 치환반응을 일으키는 특이성이 있고, 또한 코발라민(Cbl)에 리간드 결합되어 있는 글루타치온(GSH)이 CN ^- 음이온과 높은 효율로 친핵성 치환반응을 하여 민감성이 향상되는 효과가 있으며, 이러한 CN ^- 의 친핵성 치환반응에 의해 생성되는 부생성물인 시안화코발라민(CNCbl), 이시안화코발라민(diCNCbl) 및 글루타치온(GSH)을 각각 분광, 육안 및 형광 분석을 통해 정성/정량 검출할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 20 μM GSCbl와 1 mM KCN의 반응 흡광 스펙트럼이다. 과량의 시아나이드와 GSCbl의 반응에서 diCNCbl 중간체를 통해 CNCbl이 형성된다.
도 1(A)는 GSCbl(점선) 및 반응 개시 직후 반응(실선)의 흡광 스펙트럼이다.
도 1(B)는 (A) 이후 반응 5분마다 측정한 흡광 스펙트럼이다. 화살표는 반응에 따른 흡광의 증가 및 감소를 표시한 것이다.
도 1(C)는 반응 시간에 따라 표기된 파장에서 흡광의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 1(D)는 표기된 코발라민들 또는 반응혼합물의 흡광 스펙트럼을 비교하여 나타낸 그래프이다. 여기서, 'I'는 반응 개시 직후를 의미하고, 'C'는 반응 2시간 후를 의미한다. diCNCbl의 흡광 스펙트럼은 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 20 μM CNCbl와 10 mM KCN의 반응으로부터 얻었다.
도 2는 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 20 μM GSCbl와 10 μM KCN의 반응 흡광 스펙트럼이다. GSCbl와 저농도의 시아나이드의 반응에서 CNCbl 및 diCNCbl이 형성된다.
도 2(A)는 0 min (GSCbl), 5 min and 10 min 반응시간에서 측정한 흡광 스펙트럼이다. 삽화는 다른 스펙트럼으로부터 GSCbl의 스펙트럼을 공제(subtraction)하여 얻은 흡광 스펙트럼이다.
도 2(B)는 (A) 이후 반응 5분마다 측정한 흡광 스펙트럼이다. 삽화는 다른 스펙트럼으로부터 diCNCbl의 첫 번째 스펙트럼을 공제하여 얻은 흡광 스펙트럼이다. 화살표는 반응에 따른 흡광의 증가 및 감소를 표시한 것이다.
도 2(C)는 반응 시간에 따라 표기된 파장에서 흡광의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3(A)는 pH = 4.0-12.0의 버퍼에서 50 μM GSCbl와 40 μM KCN의 반응으로부터 diCNCbl 형성에 따른 580 nm에서의 흡광이다. 화살표는 반응 버퍼의 pH가 증가함에 의해 반응 10 min에서 A580 nm의 증가를 나타낸다. (50 mM NaCitrate pH 4.0-5.0; 50 mM MES pH 5.5-6.5; 50 mM Tris/HCl pH 7.0-8.5; 50 mM CHES 9.0-10.0; 50 mM NaHCO ₃ pH 10.5-11.0; 50 mM Na ₂ HPO ₄ pH 11.5-12.0)
도 3(B)는 pH = 4.0-12.0의 버퍼에서 50 μM GSCbl와 40 μM KCN의 반응으로부터 CNCbl 형성에 따른 361 nm에서의 흡광이다. 화살표는 반응 버퍼의 pH가 증가함에 의해 반응 120 min에서 A361 nm의 증가를 나타낸다. (50 mM NaCitrate pH 4.0-5.0; 50 mM MES pH 5.5-6.5; 50 mM Tris/HCl pH 7.0-8.5; 50 mM CHES 9.0-10.0; 50 mM NaHCO ₃ pH 10.5-11.0; 50 mM Na ₂ HPO ₄ pH 11.5-12.0)
도 3(C)는 pH 변화에 따른 최대 △A580 nm(A580 nm at 10 min - A580 nm at 0 min) plots을 나타낸 그래프이다. (△A = A580 nm at 10 min or A361 nm at 80 min - corresponding absorption at 0 min)
도 3(D)는 pH 변화에 따른 최대 △A361 nm(A361 nm at 120 min - A361 nm at 0 min) plots을 나타낸 그래프이다. (△A = A580 nm at 10 min or A361 nm at 80 min - corresponding absorption at 0 min)
도 4(A) 및 (B)는 50 μM GSCbl와 200 μM KCN의 반응 생성물 CNCbl 및 GSH를 HPLC 분석으로 확인한 결과이다. 도 4(A)에서 코발라민 생성물의 머무른 시간 20.9 min은 진품인 CNCbl와 동일하였다. 도 4(B)에서 글루타치온 생성물의 모무른 시간 17.5 min은 진품인 GSH와 동일하였다.
도 4(C)는 50 μM GSCbl와 0-200 μM KCN의 반응 생성물 GSH를 HPLC 분석으로 확인한 결과이다. 도 4(C)의 plot은 GSH 및 KCN 사이에서 선형 비례 관계를 나타낸다. 점(plots)의 회귀분석(실선)으로 얻은 기울기 0.76±0.04 (n ≥ 3, r ² = 0.9954)는 [GSH]:[CN ^- ] = 약 1.0:1.3의 몰 비율에 대응한다.
도 5는 GSCbl으로부터 형성되는 diCNCbl의 음이온 특이성 및 시아나이드의 육안 검출결과이다.
도 5(A)는 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 50 μM GSCbl와 5 mM CN ^- 또는 5 mM의 다른 표기된 음이온의 흡광 스펙트럼이다.
도 5(B)는 50 μM GSCbl와 5 mM CN ^- 또는 5 mM의 다른 표기된 음이온의 용액 색상을 확인한 사진이다.
도 5(C)는 500 mM의 표기된 첨가 음이온 존재하에 50 μM GSCbl와 5 mM CN ^- 의 용액 색상을 확인한 사진이다.
도 5(D)는 50 mM CHES (pH 10.0)에서 50 μM GSCbl와 표기된 CN ^- μM 농도를 10분간 반응 후 확인한 용액 색상의 사진이다.
도 6은 시아나이드 정량을 위한 CNCbl의 분광계 적정이다.
도 6(A)는 50 mM Tris/HCl (pH 9.0)에서 50 μM GSCbl와 0-200 μM KCN의 반응 2시간 후에 얻은 흡광 스펙트럼이다. 여기서, 화살표는 KCN의 농도가 증가함에 의해 A361 nm에서 흡광이 증가하는 것을 나타낸다.
도 6(B)는 KCN의 농도 변화에 따른 △A361 nm을 점으로 나타낸 그래프로서, CNCbl (De361 nm = 14.2 mM ^-1 cm ^-1 , 삽화) 및 CN ^- 사이에서 선형 비례 관계를 나타낸다. 삽화에서 점(plots)의 회귀분석(삽화에서의 실선)으로 얻은 기울기 0.83±0.09 (n ≥ 6, r ² = 0.9922)는 [CNCbl]:[CN ^- ] = 약 1.0:1.2의 몰 비율에 대응한다.
도 7은 GSH의 형광 검출을 통한 시아나이드의 정량 결과이다. 50 mM Tris/HCl (pH 9.0)에서 20 μM GSCbl와 0-50 μM KCN의 반응 2시간 후, GSCbl로부터 나오는 GSH을 형광 시약 (MCB)을 이용하여 검출하였다. 삽화에서 KCN 농도에 따른 형광 강도의 점(plot)은 GSH 및 CN ^- 사이에 선현 비례 관계를 나타낸다. 삽화에서 회귀분석(실선)으로 얻은 기울기 0.66 ± 0.05 (n ≥ 6, r ² = 0.9941)는 [GSH]:[CN ^- ] = 약 1.0:1.5의 몰 비율에 대응한다.
도 8은 물 시료에서 육안으로 시아나이드를 검출한 사진이다.
도 8(A)는 시아나이드의 표기된 농도(μM)를 수돗물(tap water)에 첨가하여 얻은 사진이다.
도 8(B)는 시아나이드의 표기된 농도(μM)를 연못수(pond water)에 첨가하여 얻은 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

시아나이드( CN ^- ) 검출용 조성물

본 발명은 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl) 및 버퍼를 포함하는 시아나이드(CN ^- ) 검출용 조성물을 제공한다.

글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 유도체의 하나이다.

본 발명에 따른 조성물은 GSCbl이 다른 음이온들과는 친핵성 치환반응을 일으키지 않고 CN ^- 음이온에만 선택적으로 치환반응을 일으키는 특이성이 있고(실험예 1의 '음이온 특이성 평가' 및 실험예 4 참조), 또한 코발라민(Cbl)에 리간드 결합되어 있는 글루타치온(GSH)이 CN ^- 음이온과 높은 효율로 친핵성 치환반응을 하여 민감성이 향상되는 효과가 있으며, 이러한 CN ^- 의 친핵성 치환반응에 의해 생성되는 부생성물인 시안화코발라민(CNCbl), 이시안화코발라민(diCNCbl) 및 글루타치온(GSH)을 각각 분광, 육안 및 형광 분석을 통해 정성/정량 검출할 수 있다.

본 발명의 발명자는 코발라민에 리간드 결합된 글루타치온을 다른 치환기로 대체하여 보았으나, 시아나이드 음이온과의 친핵성 치환반응 효율 면에서 글루타치온 치환기가 다른 치환기들에 비해 현저히 우수한 것을 확인하고, 글루타치온코발라민을 시아나이드 음이온 검출에 사용하였다.

여기서, 시안화코발라민(CNCbl)은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 축방향으로 리간드 결합되어 있는 글루타치온(GSH)과 시아나이드 음이온이 친핵성 치환반응으로 형성된 부생성물 중의 하나로서, 이를 UV-Vis 분광광도계를 이용하여 정성 및/또는 정량 검출할 수 있다.

또한, 이시안화코발라민(diCNCbl)은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 아래 및 위의 축방향 모두에 시아나이드 음이온이 리간드 결합되어 형성된 부생성물 중의 하나로서, 안정성이 낮아 곧 시안화코발라민(CNCbl)으로 전환되는 특징이 있으나, pH 9 이상에서는 diCNCbl의 안정성이 향상되어 구조가 유지되는 시간이 길어지는 경향을 갖는다(실험예 1의 pH 값의 영향 평가 참조). GSCbl은 적색을 나타내고, 상기 diCNCbl은 보라색을 나타내므로, 육안 검출에 이용할 수 있다.

나아가, 글루타치온(GSH)은 시아나이드 음이온과 친핵성 치환반응에 의해 코발라민으로부터 떨어져 나오는 부생성물로서, GSH가 GST(glutathione S -transferase)의 촉매작용에 의해 형광시약(monochlorobimane, MCB)과 결합하여, 이를 형광 검출에 이용할 수 있다.

분광 검출방법

본 발명은 시아나이드(CN ^- ) 함유 시료를 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)이 포함되어 있는 버퍼에 첨가하는 단계(단계 1);

상기 GSCbl은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 단계 1에서 첨가된 시아나이드(CN ^- )가 친핵성 공격을 통해 글루타치온(GSH)과 치환반응하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 생성된 시안화코발라민(CNCbl)을 UV-Vis 분광기로 정성 또는 정량 검출하는 단계(단계 3);

를 포함하는 시아나이드의 분광 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 분광 검출방법에서, 상기 버퍼는 pH 9 미만인 것이 바람직하다. 이는 pH 9 이상에서는 diCNCbl의 안정성이 향상되어 정량 검출에 오차를 줄 가능성이 있기 때문이다(실험예 1의 'pH 값의 영향 평가' 참조).

본 발명에 따른 분광 검출방법은, CNCbl의 특징인 361 nm 흡광 피크의 세기를 측정하여 정량할 수 있고, 이를 이용하여 시아나이드 음이온의 정량을 계산할 수 있다.

본 발명에 따른 분광 검출방법의 검출한계는 1.0 μM으로서, 민감성이 매우 높다(실험예 1의 'CNCbl의 분광 검출로 시아나이드의 정량' 참조).

육안 검출방법

본 발명은 시아나이드(CN ^- ) 함유 시료를 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)이 포함되어 있는 버퍼에 첨가하는 단계(단계 1);

상기 GSCbl은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 단계 1에서 첨가된 시아나이드(CN ^- )가 친핵성 공격을 통해 글루타치온(GSH)과 치환반응하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 생성된 이시안화코발라민(diCNCbl)을 색상의 변화로 육안 검출하는 단계(단계 3);

를 포함하는 시아나이드의 육안 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 육안 검출방법에 있어서, 상기 버퍼는 pH 9 이상인 것이 바람직하다. 이는 pH 9 미만에서는 diCNCbl의 안정성이 낮아져 육안 검출이 어렵기 때문이다(실험예 1의 'pH 값의 영향 평가' 참조).

본 발명에 따른 육안 검출방법은 GSCbl(적색)에 시아나이드 함유 시료를 첨가함에 따라 형성되는 diCNCbl(보라색)에 의한 색변화를 육안으로 구별 가능하므로(실험예 4 참조), 이를 신속검사 키트에 응용할 수 있다.

시아나이드( CN ^- ) 검출용 키트

본 발명은 상기 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl) 및 버퍼를 포함하는 시아나이드(CN ^- ) 검출용 조성물을 포함하는 혈액 또는 음식물 시료 중 시아나이드(CN ^- ) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트는 상기 시아나이드의 육안 검출방법 원리를 이용하는 것으로, 일반적인 키트의 제조방법으로 제조할 수 있다.

형광 검출방법

본 발명은 시아나이드(CN ^- ) 함유 시료를 글루타치오닐코발라민 (Glutathionylcobalamin, GSCbl)이 포함되어 있는 버퍼에 첨가하는 단계(단계 1);

상기 GSCbl은 평면구조의 코발라민(Cbl)의 중심 금속인 코발트(Co)에 글루타치온(GSH)이 축방향으로 리간드 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 단계 1에서 첨가된 시아나이드(CN ^- )가 친핵성 공격을 통해 글루타치온(GSH)과 치환반응하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 생성된 글루타치온(GSH)을 형광 검출기로 정성 또는 정량 검출하는 단계(단계 3);

를 포함하는 시아나이드의 형광 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형광 검출방법에 있어서, 상기 단계 1의 버퍼에는 글루타치온(GSH)과 결합하는 형광시약(예를 들어, monochlorobimane (MCB) 등)을 포함하는 것을 특징으로 하고, 추가로 GSH가 형광시약과 결합하는 것을 도와주는 GST(glutathione S -transferase)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 검출방법은 글루타치온(GSH)의 형광 강도를 측정하여 정량할 수 있고, 이를 이용하여 시아나이드 음이온의 정량을 계산할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 검출방법의 검출한계는 1.2 μM으로서, 민감성이 매우 높다(실험예 5 참조).

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재료

화합물은 대부분 Sigma로부터 구입하였다. 글루타치오닐코발라민 (GSCbl)은 기존에 알려진 아쿠오코발라민(OH ₂ Cbl)과 글루타치온 (GSH)의 반응 방법에 따라 합성하였으며 잔량의 GSH를 제거하기 위하여 충분한 세척을 수행하였다. 합성한 GSCbl의 농도는 e534 nm = 7.97 mM ^-1 cm ^-1 을 기준으로 측정하였다. 시안화칼륨 (KCN) 수용액은 20 mM 수산화나트륨 수용액에 용해시켜 사용 전에 준비하였으며, Sigma로부터 구입한 표준 시안화물은 측정 방법의 quality control로 사용하였다. CDNB (Chloro-2,4-dinitrobenzene)과 MCB (monochlorobimane)는 메탄올에 용해시켜 사용하였다.

< 실험예 1> GSCbl ( Glutathionylcobalamin )과 시안의 반응 그리고 시안의 분광광도계(spectrophotometric)를 이용한 검출

반응 혼합물은 50 mM Tris/HCl pH 7.5에 50 μM GSCbl가 포함되었으며 표기된 농도의 KCN를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 혼합물은 실온, 암 조건에서 배양하였고 반응 시간에 따라 흡광도를 측정하였다 (Cary 100 UV-Vis 분광광도계 (Varion)). 최종 반응 산물 CNCbl은 50 mM Tris/HCl pH 9.0에 50 μM GSCbl과 KCN (0-200 μM)를 첨가하고 2시간 배양 후 흡광도를 측정을 통하여 적정하였다 (△ε361 nm = 14.2 mM ^-1 cm ^-1 ). CNCbl과 CN의 분자비는 △A361 nm와 KCN 농도 그래프를 단순 선형 분석을 통하여 계산하였다. 시안 검출 한계는 IUPAC 권고에 따라 계산되었다: 검출의 최저 한계 = 3SD _b / s , SD _b 는 블랭크 측정치 (n ≥ 7)의 표준편차이고, s 는 적정곡선의 기울기이다.

도 1은 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 20 μM GSCbl와 1 mM KCN의 반응 흡광 스펙트럼이다. 과량의 시아나이드와 GSCbl의 반응에서 diCNCbl 중간체를 통해 CNCbl이 형성된다.

도 1(A)는 GSCbl(점선) 및 반응 개시 직후 반응(실선)의 흡광 스펙트럼이다.

도 1(B)는 (A) 이후 반응 5분마다 측정한 흡광 스펙트럼이다. 화살표는 반응에 따른 흡광의 증가 및 감소를 표시한 것이다.

도 1(C)는 반응 시간에 따라 표기된 파장에서 흡광의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 1(D)는 표기된 코발라민들 또는 반응혼합물의 흡광 스펙트럼을 비교하여 나타낸 그래프이다. 여기서, 'I'는 반응 개시 직후를 의미하고, 'C'는 반응 2시간 후를 의미한다. diCNCbl의 흡광 스펙트럼은 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 20 μM CNCbl와 10 mM KCN의 반응으로부터 얻었다.

도 1에 나타난 바와 같이, GSCbl에 과량의 시아나이드를 첨가하면, diCNCbl (dicyanocobalamin)의 특징인(도 1(D)) 368 nm, 541 nm 및 580 nm 흡광 피크(도 1(A) 및 (C))의 전개를 보이는 것과 같이, 흡광 스펙트럼에 즉각적이고 확연한 변화가 일어난다. 반응을 좀 더 하면, diCNCbl의 흡광 스펙트럼에서 368 nm, 541 nm 및 580 nm에서 흡광의 감소와 361 nm, 518 nm 및 550 nm에서 수반되는 흡광이 증가하는 추가의 느린 변화를 나타낸다.

또한, 느린 반응 상태에서, 등흡광점(isosbestic points)이 364 nm, 399 nm 및 560 nm에서 관찰되었다(도 1(B) 및 (C)).

형성된 흡광 스펙트럼은 CNCbl (cyanocoblalamin)의 특징이다(도 1(D)).

도 2는 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 20 μM GSCbl와 10 μM KCN의 반응 흡광 스펙트럼이다. GSCbl와 저농도의 시아나이드의 반응에서 CNCbl 및 diCNCbl이 형성된다.

도 2(A)는 0 min (GSCbl), 5 min and 10 min 반응시간에서 측정한 흡광 스펙트럼이다. 삽화는 다른 스펙트럼으로부터 GSCbl의 스펙트럼을 공제(subtraction)하여 얻은 흡광 스펙트럼이다.

도 2(B)는 (A) 이후 반응 5분마다 측정한 흡광 스펙트럼이다. 삽화는 다른 스펙트럼으로부터 diCNCbl의 첫 번째 스펙트럼을 공제하여 얻은 흡광 스펙트럼이다. 화살표는 반응에 따른 흡광의 증가 및 감소를 표시한 것이다.

도 2(C)는 반응 시간에 따라 표기된 파장에서 흡광의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2에 나타난 바와 같이, [GSCbl]/[cyanide] = 2.0의 비율에서 GSCbl와 저농도의 시아나이드 반응을 나타내는 유사한 흡광 스펙트럼 변화가 관찰되었다(도 2). 빠른 반응 상태에서, 비록 과량의 시아나이드에서 얻어진 결과에 비해 낮은 규모이지만, diCNCbl의 형성 특징인 368 nm 및 580 nm에서 흡광 피크가 전개되었다(도 2(A)). 더 느린 반응 상태에서, diCNCbl가 CNCbl로 전환될 때 나타나는 특징인 368 nm 및 580 nm에서 흡광 피크의 감소가 361 nm 및 550 nm에서 수반되는 흡광 증가와 함께 관찰되었다(도 2(C)). 이러한 결과는 시아나이드가 GSCbl과 반응하여, 글루타치온(GSH) 리간드를 치환하여, diCNCbl 중간체를 통해 CNCbl을 형성하는 것을 나타낸다.

pH 값의 영향 평가

시아나이드 음이온의 친핵성 공격에 의한 반응의 유도

[GSCbl]/[cyanide] = 0.8의 비율에서 GSCbl 및 시아나이드의 농도를 고정하고, pH = 4.0-12.0 범위에서 GSCbl와 시아나이드의 반응에서 pH의 영향에 대하여 알아보았다.

도 3(A)는 pH = 4.0-12.0의 버퍼에서 50 μM GSCbl와 40 μM KCN의 반응으로부터 diCNCbl 형성에 따른 580 nm에서의 흡광이다. 화살표는 반응 버퍼의 pH가 증가함에 의해 반응 10 min에서 A580 nm의 증가를 나타낸다. (50 mM NaCitrate pH 4.0-5.0; 50 mM MES pH 5.5-6.5; 50 mM Tris/HCl pH 7.0-8.5; 50 mM CHES 9.0-10.0; 50 mM NaHCO ₃ pH 10.5-11.0; 50 mM Na ₂ HPO ₄ pH 11.5-12.0)

도 3(B)는 pH = 4.0-12.0의 버퍼에서 50 μM GSCbl와 40 μM KCN의 반응으로부터 CNCbl 형성에 따른 361 nm에서의 흡광이다. 화살표는 반응 버퍼의 pH가 증가함에 의해 반응 120 min에서 A361 nm의 증가를 나타낸다. (50 mM NaCitrate pH 4.0-5.0; 50 mM MES pH 5.5-6.5; 50 mM Tris/HCl pH 7.0-8.5; 50 mM CHES 9.0-10.0; 50 mM NaHCO ₃ pH 10.5-11.0; 50 mM Na ₂ HPO ₄ pH 11.5-12.0)

도 3(C)는 pH 변화에 따른 최대 △A580 nm(A580 nm at 10 min - A580 nm at 0 min) plots을 나타낸 그래프이다. (△A = A580 nm at 10 min or A361 nm at 80 min - corresponding absorption at 0 min)

도 3(D)는 pH 변화에 따른 최대 △A361 nm(A361 nm at 120 min - A361 nm at 0 min) plots을 나타낸 그래프이다. (△A = A580 nm at 10 min or A361 nm at 80 min - corresponding absorption at 0 min)

도 3에 나타난 바와 같이, 반응 중간체 diCNCbl의 형성 및 반응 생성물 CNCbl은 각각 A580 nm 및 A361 nm에서 측정하였다(도 3(A) 및 (B)). 580 nm에서 흡광은 10분에서 증가한 다음, 추가 반응시간에서는 감소하였다(도 3(A)). 이 결과는 diCNCbl의 급격한 형성과 이의 사라짐을 의미한다.

10분에서 pH 증가에 의해 diCNCbl 최고 수치는 향상되었다(도 3(C)). 이는 diCNCbl 형성을 위한 pH 최적 범위는 pH > 9.0이라는 증거이다. 이러한 결과는 GSCbl와 시아나이드의 결합은 시아나이드 음이온의 친핵성 공격에 의해 유도되는 것을 나타낸다. 반응한 다음 361 nm에서 흡광의 증가는 증가한 다음 천천히 평형에 도달하였는데, 이 결과는 CNCbl 형성의 포화를 의미한다.

pH 증가에 따라 2시간에서 CNCbl의 수치는 향상된다(도 3(D)). CNCbl의 형성은 pH ≥ 8.0 범위에서 최적화되는 것으로 나타난다. 그러나, pH = 8.5 위에서, 361 nm에서 흡광에 적은 간섭을 일으켰는데, 이는 높은 pH 환경에서 diCNCbl의 안정성이 향상되어 CNCbl로의 불완전한 전환에 의한 결과이다.

GSCbl의 글루타치온 리간드 치환용 음이온 특이성 평가

GSCbl와 CN ^- 의 반응을 위한 음이온 특이성을 실험하기 위하여, 다양한 음이온(Cl ^- , F ^- , Br ^- , I ^- , SCN ^- , NO ₃ ^- , HCO ₃ ^- , PO ₄ ^3- , 또는 SO ₄ ^2- )을 GSCbl와 함께 반응하고 흡광 스펙트럼을 측정했다.

도 5는 GSCbl으로부터 형성되는 diCNCbl의 음이온 특이성 및 시아나이드의 육안 검출결과이다.

도 5(A)는 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)에서 50 μM GSCbl와 5 mM CN ^- 또는 5 mM의 다른 표기된 음이온의 흡광 스펙트럼이다.

도 5(A)에 나타난 바와 같이, GSCbl 특유의 흡수 밴드(λmax = 288 nm, 334 nm, 428 nm 및 534 nm)는 영향을 받지 않고 유지되었는데, 이 결과는 글루타치온 리간드 치환이 발생하지 않았음을 의미한다(도 5(A)). 그러나, 과량의 시아나이드(CN ^- ) 첨가는 diCNCbl의 특징인 368 nm, 541 nm 및 580 nm의 흡광 피크에서 보여지는 흡광 스펙트럼의 즉각적인 변화를 유도하였다. 게다가, CN ^- 에 비해 100배 과량의 다른 음이온 존재하에서 GSCbl에 CN ^- 의 첨가는 동일한 diCNCbl 형성의 흡광 스펙트럼 변화를 나타냈다. 이러한 결과는 GSCbl의 글루타치온 리간드 치환은 테스트한 다른 음이온들과 경쟁하지 않고, 시아나이드 음이온에만 특이적으로 반응하는 것을 의미한다.

CNCbl의 분광 검출로 시아나이드의 정량

GSCbl을 시아나이드 농도를 증가하며 반응할 때 형성되는 CNCbl의 양을 UV-Vis 분광기로 측정하였다.

도 6은 시아나이드 정량을 위한 CNCbl의 분광계 적정이다.

도 6(A)는 50 mM Tris/HCl (pH 9.0)에서 50 μM GSCbl와 0-200 μM KCN의 반응 2시간 후에 얻은 흡광 스펙트럼이다. 여기서, 화살표는 KCN의 농도가 증가함에 의해 A361 nm에서 흡광이 증가하는 것을 나타낸다.

도 6(B)는 KCN의 농도 변화에 따른 △A361 nm을 점으로 나타낸 그래프로서, CNCbl (De361 nm = 14.2 mM ^-1 cm ^-1 , 삽화) 및 CN ^- 사이에서 선형 비례 관계를 나타낸다. 삽화에서 점(plots)의 회귀분석(삽화에서의 실선)으로 얻은 기울기 0.83±0.09 (n ≥ 6, r ² = 0.9922)는 [CNCbl]:[CN ^- ] = 약 1.0:1.2의 몰 비율에 대응한다.

도 6에 나타난 바와 같이, 반응생성물의 흡광 스펙트럼은 시아나이드 농도가 증가할수록 CNCbl의 증가를 나타냈다(도 6(A)). 시아나이드 농도와 대조적으로 A361 nm의 점(plot)은 0-50 μM 시아나이드 농도 범위에서 CNCbl 및 CN ^- 사이에 선형 비례 관계를 나타났고(도 6(B)), [CNCbl]:[CN ^- ] 몰 비율은 약 1.0:1.2인 것으로 예측된다(도 6(B)의 삽화). 이러한 분광계 적정은 1.0 μM 시아나이드 농도 검출한계로 시아나이드의 정량에 응용할 수 있다.

< 실험예 2> HPLC 분석

코발라민 생성물은 알려진 방법에 따라 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 반응 혼합물은 50 mM Tris/HCl pH 7.5에 50 μM GSCbl과 200 μM KCN을 혼합하였고 실온, 암 조건에서 2시간 동안 배양 후, Inertsil ODS-3V C ₁₈ 역상 컬럼 (250×4.6 mm, 5 ㎛, GL Sciences)을 사용하여 분리하였다. 컬럼은 1 ml min ^-1 의 속도로 40분동안 0.1% TFA 수용액에 0%-40% acetonitrile 농도 구배를 형성하여 용출시키며 254 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이러한 조건에서 표준 코발라민 OH ₂ Cbl, CNCbl과 GSCbl은 각각 17.6분, 20.9분, 22.6분에 용출되었다. GSCbl과 KCN의 반응의 코발라민 산물은 표준 코발라민의 용출 시간과 비교하여 동정하였다.

글루타치온 생성물은 알려진 방법에 따라 HPLC 분석을 수행하여 동정하였다. 반응 혼합물은 50 mM Tris/HCl pH 7.5에 50 μM GSCbl과 0-200 μM KCN을 혼합하여 실온과 암 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 최종 반응 산물인 글루타치온의 티올을 monoiodoacetic acid와 반응을 통하여 수정, 보호하고 아미노기에 2,3-dinitrofluorobenzene와의 반응 통하여 유도체를 형성하였다. 혼합물을 4:1 (v/v) 메탄올/물 용매 A로 평형화된 Bondclone NH ₂ 컬럼 (300 mm×3.9 mm, 10 ㎛, Phenomenex)에 주입하였다. 컬럼은 용매 B (용매 A의 400 ml와 272 g sodium acetate trihydrate, 122 ml 물과 373 ml 아세트산의 용액 100 ml의 혼합물)을 이용하여 아래 조건에 따라 용출하였다: 0-5분, 30% 용매 B; 5-30 분, 30-100% 용매 B의 농도 구배. GSH의 용출은 355 nm에서 흡광도 측정하여 기록하였다. GSCbl과 KCN의 반응의 최종 산물인 글루타치온의 용출 시간은 표준 GSH와 GSSG의 용출 시간과 비교하여 확인하였다. 최종 반응 생성물 GSH의 농도는 표준 GSH를 위의 HPLC 분석을 통하여 정량 표준 곡선을 작성하고 용출 피크의 면적을 비교하여 측정하였다. GSH와 CN의 반응비는 GSH 농도 대 KCN 농도의 곡선을 단순 선형 회귀 분석을 통하여 계산되었다.

GSCbl와 시아나이드 반응으로부터의 생성물을 HPLC 분석으로 확인하였다.

도 4(A) 및 (B)는 50 μM GSCbl와 200 μM KCN의 반응 생성물 CNCbl 및 GSH를 HPLC 분석으로 확인한 결과이다. 도 4(A)에서 코발라민 생성물의 머무른 시간 20.9 min은 진품인 CNCbl와 동일하였다. 도 4(B)에서 글루타치온 생성물의 모무른 시간 17.5 min은 진품인 GSH와 동일하였다.

도 4(C)는 50 μM GSCbl와 0-200 μM KCN의 반응 생성물 GSH를 HPLC 분석으로 확인한 결과이다. 도 4(C)의 plot은 GSH 및 KCN 사이에서 선형 비례 관계를 나타낸다. 점(plots)의 회귀분석(실선)으로 얻은 기울기 0.76±0.04 (n ≥ 3, r ² = 0.9954)는 [GSH]:[CN ^- ] = 약 1.0:1.3의 몰 비율에 대응한다.

도 4에 나타난 바와 같이, GSCbl와 시아나이드의 반응 흡광 스펙트럼(도 1(C) 및 (D))에서 예상되는 바와 같이, 코발라민 생성물은 CNCbl로서 확인되었다(도 4(A)). 다른 반응 생성물은 시아나이드 치환에 의한 GSCbl로부터 나오는 글루타치온(GSH)인 것으로 추정된다. HPLC 분석결과는 글루타치온 생성물이 글루타치온(GSH)으로부터 환원된 것을 나타낸다(도 4(B)). 추가로, 정량 분석결과 GSH 및 CN ^- 사이에 선형 비례 관계를 나타내고, [GSH]:[CN ^- ]의 몰 비율은 약 1.0:1.3인 것으로 나타났다(도 4(C)).

< 실험예 3> 글루타치온 S - 트랜스퍼레이즈 합성 및 분리

Schistosoma japonicum 의 글루타치온 S -트랜스퍼레이즈 (GST)를 해당 유전자를 발현 벡터 pGEX-4T3 (GE Healthcare)를 사용하여 이종 과발현을 통하여 합성하였다. pGEX-4T3 플라스미드를 가지는 E. coli BL21 (DE3) (Novagen)를 LB medium/ampicillin (100 g/mL)에 접종하여 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 대장균 배양액 10 mL를 1 L LB/ampicillin (100 g/mL)에 접종하고 37℃에서 A600 nm = 약 0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 유전자 발현은 50 mM isopropyl bd-thiogalactopyranoside (IPTG, Qiagen)를 첨가하여 유도하고 37℃에서 5시간 배양 후, 세포를 모아 파괴하여 단백질 분리하였다. GST는 GSH sepharose 4b 친화성 컬럼 (5 mL column volume, GE Healthcare)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리하였다. 분리한 GST는 PBS에서 투석을 통하여 분리 과정에 오염된 GSH를 제거하였다. 단백질 농도는 Bradford assay를 통해 측정하였고 GST 활성은 CDNB (De340 nm = 9.6 mM ^{- 1} cm ^{- 1} )를 사용하여 분광법으로 측정하였다.

< 실험예 4> 시아나이드의 육안 검출

GSCbl와 시아나이드의 반응은 큰 장파장쪽 옮김(bathochromic shift)을 동반하는 diCNCbl 중간체를 형성하는데(도 1(A)), 이는 시아나이드의 육안 검출에 사용될 수 있다.

도 5는 GSCbl으로부터 형성되는 diCNCbl의 음이온 특이성 및 시아나이드의 육안 검출결과이다.

도 5(B)는 50 μM GSCbl와 5 mM CN ^- 또는 5 mM의 다른 표기된 음이온의 용액 색상을 확인한 사진이다.

도 5(C)는 500 mM의 표기된 첨가 음이온 존재하에 50 μM GSCbl와 5 mM CN ^- 의 용액 색상을 확인한 사진이다.

도 5(D)는 50 mM CHES 버퍼 (pH 10.0)에서 50 μM GSCbl와 표기된 CN ^- μM 농도를 10분간 반응 후 확인한 용액 색상의 사진이다.

도 5(B)-(D)에 나타난 바와 같이, GSCbl에 과량의 CN ^- 를 첨가하면 diCNCbl가 형성되고, 이는 곧 즉각적인 색변화(적색에서 보라색)를 일으키는 반면에, 다른 음이온들(5 mM each of Cl ^- , F ^- , Br ^- , I ^- , SCN ^- , NO ₃ ^- , HCO ₃ ^- , PO ₄ ^3- , or SO ₄ ^2- )은 색변화를 일으키지 않는다(도 5(B)). 게다가, GSCbl 용액과 테스트한 다른 음이온들이 담긴 용기에 CN ^- 를 첨가한 후에는 모두 보라색으로 변하였는데(도 5(C)), 이 결과 역시 GSCbl의 글루타치온 리간드 치환은 테스트한 다른 음이온들과 경쟁하지 않고, 시아나이드 음이온에만 특이적으로 반응하는 것을 의미한다. 최적화된 조건하에서(pH = 9.0-12.0 버퍼에서 20μM GSCbl, 10분 배양), GSCbl은 약 20 μM의 검출한계 농도로 시아나이드를 육안 검출에 응용할 수 있다(도 5(D)).

< 실험예 5> GSH 형광 검출을 통한 시아나이드의 정량

반응 혼합물은 50 mM Trix/HCl pH 9.0에 20 μM GSCbl과 0-20 μM KCN를 첨가하여 준비하여 실온, 암 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 반응 혼합물의 pH는 HCl을 첨가하여 7.5로 조정하였고 그 후 형광 시약 monochlorobimane (MCB, 100 μM)과 1U/ml GST가 첨가하였다. 실온에서 20분 배양 후, 형광을 측정하였다; Synergy HT microplate reader (BioTek), 흥분 파장 360±40 nm, 방출 파장 460±40 nm). GSH 농도는 위와 같은 방법으로 20 μM GSCbl과 표준 GSH의 혼합물로부터 얻은 표준 곡선과 비교하여 측정하였다. 검출 한계는 IUPAC 권고에 따라 계산되었다: 검출의 최저 한계 = 3SD _b / s , SD _b 는 블랭크 측정치 (n ≥ 7)의 표준편차이고, s 는 표준 곡선의 기울기이다.

시아나이드 치환에 의해 GSCbl로부터 나오는 GSH는 선형 비례적으로 검출되었으므로, HPLC 분석에 의해 시아나이드 정량에 사용할 수 있다(도 4(B)). 그러나, 높은 민감도와 함께 간단함을 위해, 본 발명에서는 GSH 검출에 티올(thiol) 특이적 형광 시약(monochlorobimane, MCB)을 이용하였다.

구체적으로, GSCbl을 다양한 농도의 시아나이드와 반응시키고 GSCbl로부터 나오는 GSH가 GST(glutathione S -transferase)의 촉매작용에 의해 형광시약(monochlorobimane, MCB)과 결합한다.

도 7은 GSH의 형광 검출을 통한 시아나이드의 정량 결과이다. 50 mM Tris/HCl (pH 9.0)에서 20 μM GSCbl와 0-50 μM KCN의 반응 2시간 후, GSCbl로부터 나오는 GSH을 형광 시약 (MCB)을 이용하여 검출하였다. 삽화에서 KCN 농도에 따른 형광 강도의 점(plot)은 GSH 및 CN ^- 사이에 선형 비례 관계를 나타낸다. 삽화에서 회귀분석(실선)으로 얻은 기울기 0.66 ± 0.05 (n ≥ 6, r ² = 0.9941)는 [GSH]:[CN ^- ] = 약 1.0:1.5의 몰 비율에 대응한다.

도 7에 나타난 바와 같이, GSH 검출을 위해 형광 강도를 측정한 결과, 시아나이드(CN ^- ) 농도 0-20 μM 범위에 선형 비례적으로 나타났고, [GSH]:[CN ^- ]의 몰 비율은 약 1.0:1.5으로 추정된다.

본 실험에 따른 GSH의 형광 검출은 1.2 μM 검출한계 농도로 시아나이드 정량에 적용할 수 있다.

< 실험예 6> 물 시료에서의 응용

실제 시료에서 본 발명에 따른 GSCbl 기반 시아나이드 검출 응용이 가능한지 알아보기 위하여, 수돗물(tap water) 및 연못수(pond water)에 시아나이드를 첨가하여 실험하였다.

도 8은 물 시료에서 육안으로 시아나이드를 검출한 사진이다.

도 8(A)는 시아나이드의 표기된 농도(μM)를 수돗물(tap water)에 첨가하여 얻은 사진이다.

도 8(B)는 시아나이드의 표기된 농도(μM)를 연못수(pond water)에 첨가하여 얻은 사진이다.

도 8에 나타난 바와 같이, 시아나이드 검출한계 농도(20 μM)에서 얻은 육안 검출결과를 나타내었다. 시아나이드를 첨가한 물 시료에서 시아나이드의 양은 분광(spectrophotometric) 및 형광(fluorometric) 평가를 통해 얻은 결과와 일치하였다.

하기 표 1에 분광 및 형광 평가를 통해 물 시료에서 시아나이드 농도를 검출한 결과를 나타내었다.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 분광 검출방법 및 형광 검출방법 모두 높은 민감성으로 시아나이드 음이온을 정량 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.