수성 환경에서의 분석물 검출

수성 환경에서의 분석물 검출{DETECTION OF ANALTES IN AQUEOUS ENVIRONMENTS}

매체에서 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 지시제 분자는 알려져 있다.

불행하게도, 많은 그러한 지시제들은 물에 불용성이거나 제한적으로 수용성이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,503,770호(James,등)는 글루코오스를 사카라이드류에 결합시 고강도의 형광을 방사하는 형광성 보론산 함유 화합물을 기술하고 있다. 이 형광성 화합물은 적어도 하나의 페닐보론산 분자(moiety) 및 적어도 하나의 아민제공 질소원자인 플루오로포어(fluorophore)를 포함하는 분자구조를 갖는데 이질소원자는 보론산과 상호 분자적으로 상호작용하도록 페닐보론산 분자의 근처에 배치된다. 그러한 상호작용은 화합물이 사카라이드 결합시에 형광을 방사하도록 한다. T. James등의 J. Am. Chem. Soc.117 (35) : 8982-87 (1995)참조. 그러나. 미국특허 제 5, 503, 770호의 실시예 2에 기술된 화합물 (식(6)을 갖는)은 물에 불용성이고 실질적으로 수성환경에서 작업하기 위해서는 메탄올과 같은 유기용매의 존재를 필요로 한다.

충분한 수성 용해성이 없으면 수성환경에서의 적용, 예를 들면 생체내 적용시에 심각한 문제가 있다. 따라서, 수성환경에서 사용하기 위해 불용성 또는 제한적 용해성 지시제를 적합화시키기 위한 많은 필요성이 남아 있다.

발명의 요약

하나의 양태로서, 본 발명은 수성환경에서 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 지시제 고분자에 관한 것으로서 상기 고분자는,

a) 상기 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 수성환경에서 사용될 수 있도록 개별적으로 충분한 수용성이 아닌 하나이상의 지시제 성분 모노머; 및

b) 하나 이상의 친수성 모노머

로 이루어져서 고분자가 수성환경에서 상기 분석물의 존재 또는 농도를 검출할 수 있도록 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 수성환경에서 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 지시제 고분자의 제조방법에 관한것으로서, 이 방법은

a) 상기 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 수성환경에서 사용될 수있도록 개별적으로 충분한 수용성이 아닌 하나이상의 지시제 성분 모노머; 및

b) 하나 이상의 친수성 모노머

를 공중합하는 것을 포함하므로서 결과적인 고분자가 수성환경에서 상기 분석물의 존재 또는 농도를 검출할 수 있도록 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 수성환경을 갖는 샘플에서 분석물의 존재 및 농도를 검출하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은,

a) 결과적인 고분자가 수성환경에서 분석물의 존재 또는 농도를 검출할 수 있도록,

ⅰ) 상기 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 수성환경에서 사용될 수 있도록 개별적으로 충분한 수용성이 아닌 하나이상의 지시제 성분 모노머; 및

ⅱ) 하나 이상의 친수성 모노머

로 이루어진 코폴리머를 포함하며, 고분자가 분석물에 노출될 때 농도의존방법으로 변화하는 검출가능한 품질을 갖는 지시제 고분자에 샘플을 노출시키는 단계; 및

b) 상기 샘플에 있는 분석물의 존재 또는 농도를 측정하도록 상기 검출가능한 품질의 변화를 측정하는 단계

를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 엑시머(excimer)효과를 나타낼 수 있는 고분자를 제공하는데, 이 고분자는,

a) 분자성분이 서로에 대하여 적절히 배향될 때 엑시머 효과를 나타낼 수있는 하나이상의 엑시머 형성 모노머; 및

b) 하나 이상의 다른 모노머

로 이루어져서 최종 고분자가 상기 엑시머 효과를 나타내도록 하는 코폴리머를 포함한다

또 다른 양태로서, 본 발명은 엑시머 효과를 나타낼 수 있는 고분자를 제조하는 방법을 제공하는데, 이방법은,

a) 분자성분들이 서로에 대하여 적절히 배향될 때 엑시머 효과를 나타낼 수 있는 하나 이상의 엑시머 형성 모노머; 및

b) 하나이상의 다른 모노머

를 공중합하여 최종 고분자가 상기 엑시머 효과를 나타내도록 하는 것을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 샘플에서 분석물의 존재 및 농도를 검출하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은

a) 최종 고분자가 엑시머 효과를 나타내도록,

ⅰ) 분자들이 서로에 대하여 적절히 배향될 때 엑시머효과를 나타낼 수 있으며, 분석물의 존재 또는 농도를 검출할 수 있는 하나이상의 지시제 성분 모노머; 및

ⅱ) 하나이상의 다른 모노머

로 이루어진 코폴리머를 포함하며, 고분자가 상기 분석물에 노출될 때 농도 의존 방식으로 변화하는 검출가능한 품질을 갖는 지시제 고분자에 샘플을 노출시키는 단계; 및

b) 상기 검출가능한 품질의 어떤 변화를 측정하여 샘플에 있는 분석물의 존재 또는 농도를 측정하는 단계

를 포함한다.

[도면의 간단한 설명]

도 1-2는 실시예 2에 기술된 본 발명의 몇 개의 지시제 고분자의 방사 스펙트럼을 도시한 것이다.

도 3은 실시예 3에서 지시제 성분 모노머의 합성을 도시한 것이다.

도 4는 실시예 5에 기술된 지시제의 표준화된 형광방사( I/Io@427nm )를 도시한 것이다.

도 5는 실시예 6에 기술된 지시제의 표준화된 형광방사( I/Io@428nm )를 도시한 것이다

도 6은 실시예 6에 기술된 지시제의 표준화된 형광방사( I/Io@427nm )를 도시한 것이다

도 7은 실시예 7 에 기술된 지시제의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다

도 8-9는 실시예 7에 기술된 지시제의 흡수율(450nm/530nm)을 도시한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

하나의 양태로서, 본 발명은 스스로가 수성환경에서 불용성이거나 제한적으로 용해성인 지시제 성분을 수성환경에서 사용하는 방법을 제공한다. 그러한 지시제들은 유효하게, 충분히 친수성인 하나 이상의 모노머와 공중합되어 최종 지시제 고분자가 지시제 성분 모노머의 소수성 기여를 극복하기 위해 전체적으로 충분히 친수성이 되도록 한다.

적절한 지시제 성분으로는 물에 불용성이거나 제한적으로 용해성이며 그 분석물이 적어도 제한적으로 수용성인 지시제 분자를 포함한다. 적절한 분석물로는 글루코오스, 플럭토오스 및 다른 비시날 디올(vicinal diol); α- 하이드록시 산류, β-케토산류; 산소 ; 이산화탄소 ; 아연, 포타슘, 수소(pH측정), 카보네이트, 독소, 미네랄, 호르몬, 등과 같은 다양한 이온들을 포함한다. 여기서 사용된 지시제 성분 모노머의 범위내에는 본 발명의 고분자에 도입될 때 지시제로서 작용하는 둘이상의 모노머 (적어도 하나는 수성환경에서 적절하게 작용하도록 충분히 용해성이 아니다) 의 혼합물이 포함된다는 것을 알 것이다.

많은 그러한 지시제 성분들이 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허 제 5,503,770호에 기술된 화합물들이 글루코오스와 같은 사카라이드류를 검출하는데 유용하지만 물에 제한적으로 용해성이거나 불용성이다. 다른 등급의 지시제로는 여기에 참고로 도입되는, 1999년 3월11일에 출원된 미국출원 제09/265/979호(및 1999년 9월 16일에 PCT 국제출원 WO 99/46600 으로서 공개된)에 기술된 란타나이드 킬레이트(lanthanide chelates) ; 폴리아로마틱 하이드로카본 및 그들의 유도체 ; 둘 모두 글루코오스와 인터페링 α- 하이드록시산 또는 β- 디케톤류 사이르 식별할 수 있는 두개의 인식요소를 갖는 지시제를 기술하고 있는, 2001년 1월 5일에 출원된 미국 특허출원 제09/754,217호 및 2001년 2월 21일에 출원된 미국특허제60/269,887호에 기술된 지시제, 등을 포함한다.

본 발명의 지시제 성분은 일반적으로 고분자가 측정될 분석물에 노출되었을때 농도 의존 방식으로 변화하는 검출가능 품질을 갖는다. 많은 그러한 품질들이 알려져 있는데 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, 지시제가 루미네센트(형광성 또는 인광성) 또는 케미루미네센트 분자, 흡수계 분자, 등을 포함할 수 있다. 지시제는 에너지 공여분자 및 에너지 수용분자를 포함할 수 있는데 이들은 각각 고분자가 분석물과 상호작용할 때 검출가능한 변화가 있도록 공간져 있다. 지시제는 분석물이 없을 때 플루오로포어가 퀀처(qnencher)에 의해 퀀칭되도록 플루오로포어와 퀀처를 포함할 수 있다. 이 상황에서, 분석물이 존재할 때 지시제는 퀀처가 플루오로포어로 부터 충분한 거리를 이동하여 형광이 방사되도록 하는 배치적인 변화를 겪는다. 역으로, 플루오로포어와 퀀처는 분석물의 부재시에 충분히 격리되어 플루오로포어가 야기하도록 충분히 근접하게 이동하도록 배치되어 있다. 배치변화의 개념은 여기에 참고로 도입되는, 2001년 1월 5일에 출원된 미국출원 제 09/754, 219호 "분석물의 검출" 에 보다 상세히 기술되어 있다

다른 검출가능한 분자들로는 그 형광이 광유도된 전자 전달 또는 유도효과를 통하여 분석물 상호작용에 의해 영향을 받는 것들을 포함할 수 있다. 이러한 것들로는 1999년 3월11일에 출원된 미국출원 제 09/265,979호(및 1999년 9월 16일에 PCT 국제출원 WO 99/46600 으로서 공개된)에 기술된 란타나이드 킬레이트 ; 폴리아로마틱 하이드로카본 및 이들의 유도체 ; 쿠마린 ; BODIPY (Molecuar Probes, Eugen, OR) ; 단실(dansyl) ; 카테콜 ; 등을 포함한다.

또 다른 종류의 분자들로는 Alizarin Red , 등을 포함하는, 분석물과 지시제 화합물의 상호작용시에 그 흡수 스펙트럼이 변화하는 것들을 포함한다. 또 다른 종류의 분자들로는 그 형광이 근접효과에 의해 조절되는 것들, 예를 들면 단실/댑실(dabsyl)과 같은 에너지 공여/수용 쌍, 등을 포함한다.

바람직하게는, 검출가능한 품질은 흡수특성(예를 들면, 흡수도 및/또는 스펙트럼 이동), 형광 쇠퇴시간(시간 도메인 또는 주파수 도메인 측정으로 측정됨), 형광 강도, 형광 비등방성(anisotropy)또는 편광화의 변화 ; 방사 스펙트럼의 스펙트럼 이동; 시간 해결 비등방성 쇠퇴 (시간 도메인 또는 주파수 도메인 측정으로 측정됨)의 변화, 등과 같은 검출가능한 광학 또는 스펙트럼 변화이다.

적절한 친수성 모노머는 소수성 지시제 성분 모노머의 합을 극복하기 위해서 충분히 친수성이어서 최종 지시제 고분자가 수성환경에서 기능할 수 있도록 해야 한다. 매우 다양한 친수성 모노머가 본 발명에 사용하기에 적절하다는 것을 쉽게 알 것이다. 예를 들면, 적절한 친수성 모노머로는 메타크릴아미드, 메타크릴레이트, 메탈그릴산, 디메틸아크릴아이드, TMAMA, 비닐류, 폴리사카라이드, 폴리아미드, 폴리아미노산, 친수성 실란 또는 실록산, 등 뿐만 아니라 둘 이상의 다른 모노머의 혼합물을 포함한다.

주어진 적용에 적절한 친수성 모노머는 의도되는 작업온도, 염도, pH, 다른 용질, 이온 강도, 등을 포함하는 여러 요인들에 따라 다양하다. 지시제 고분자의 친수성 정도는 이온(예를 들면, 설포네이트, 사급아민, 아미드, 등), 할로겐, 등과 같은 추가적인 기능성 성분을 첨가하므로서 증가될 수 있다는 것을 쉽게 알것이다.

친수성 모노머 대 지시제 성분 모노머의 몰비는 원하는 특정 용도에 매우 좌우된다. 친수성 모노머 ; 지시제 성분 모노머의 바람직한 비율은 약 2:1 - 약 1000:1, 보다 바람직하게는 약 5:1 - 약 50:1의 범위이다.

본 발명의 지시제 고분자는 일반적으로 적어도 하나의 지시제 성분 모노머와 적어도 하나의 친수성 모노머를 단순히 공중합시키므로서 합성될 수 있다. 최적 중합조건 (시간, 온도, 촉매, 등)은 특정 반응물 및 최종산물의 용도에 따라 다양하다.

본 발명의 지시제 고분자는 어떤 소정 정도의 수 용해도를 가질 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 1과 2의 지시제 고분자는 매우 용해성 이어서 수성 용액에 쉽게 분해한다. 한편, 예를 들면 친수성 모노머 HEMA(하이드록시에틸 메타크릴레이트)또는 다른 일반적인 하이드로겔 성분을 함유하는 지시제 고분자는 비용해성 이지만 친수성이다.

용해성 지시제 고분자는 원할 경우 용액에 직접 사용될 수 있다. 한편, 원하는 용도가 요구할 경우, 지시제 고분자는 유리, 플라스틱, 폴리머성 물질, 등과 같은 불용성 표면 또는 매트릭스 상에 또는 내에 고정 (기계적인 포획, 공유 또는 이온 결합 또는 다른 수단으로) 될 수 있다. 지시제 고분자가 예를 들면 또 다른 폴리머내에 포획될 때 포획물질은 분석물이 고분자에 있는 지시제 성분과 분석물 사이의 적절한 상호작용을 허용하도록 충분히 투과성이어야 한다

본 발명의 지시제 고분자는 에너지, 의료 및 농업 분야에서 지시제로서의 용도를 포함하는 많은 용도가 존재한다. 예를 들면, 지시제 고분자는 혈액, 조직 소변에 있는 글루코오스의 서브레벨 또는 서프라레벨을 검출하여 당뇨병 및 신장 부전증과 같은 질병을 진단 또는 모니터 하기 위한 가치 있는 정보를 제공하는 지시제 분자로서 사용될 수 있다. 인간치료용을 위한 글루코오스의 의료/제약학적 제조는 모니터링 및 제어를 요구한다.

농업에서 본 발명의 용도는 콩 및 다른 농업 산물에서 글루코오스와 같은 분석물의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 글루코오스는 와인 포도와 같은 고부가 가치산물을 위해 중요한 수확시기 결정에서 신중하게 모니터 되어야 한다. 글루코오스는 발효공정에서 가장 고가의 탈소원 및 원료이기 때문에 최적 반응기 이송 속도 제어를 위한 글루코오스 모니터링이 파워 알콜제조에서 중요하다. 또한, 반응기 혼합 및 글루코오스 농도의 제어는 국제적으로 가장 많은 량의 글루코오스와 발효가능 설탕을 소비하는, 청량음료 및 발효음료의 제조시에 품질관리를 위해 중요하다.

지시제 고분자가 형광지시제 성분을 도입할 때 본 발명의 고분자를 사용할 수 있는 다양한 검출방법이 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 본 발명의 고분자는 형광 감지장치(예를 들면, 미국 특허 제5, 517,313호)에 사용될 수 있거나 폴리머성 물질 또는 가시적인 검사를 위한 시험지와 같은 다른 기재에 결합될 수 있다. 후자의 기술로서 예를 들면 리트머스 시험지의 스트립으로 pH 를 측정하는 것과 동일한 방법으로 글루코오스 측정을 이룰 수 있다. 여기서 기술된 고분자는 또한 스펙트로플루오로미터 또는 시마주(Shimadzu), 히다치(Hitachi), 재스코 (Jasco),벡맨(Beckman)등에 의해 제조된 임상분석기와 같은 표준 벤치탑(benchtop) 분석기구에서 간단한 시제로 사용될 수 있다. 이들 분자들은 또한 오션옵틱스(Ocean Optics(Dunedin, Florida), 또는 오리엘 옵틱스(Oriel Optics)에 의해 제조된 섬유광학계 센서 및 분석 플루오로미터를 위한 분석물 특이적 화학/광학 신호 변환을 제공한다.

여기에 참고로 도입된 미국 특허 제 5, 517,313호는 형광 감지 장치를 기술하고 있는데 이 장치에는 본 발명의 고분자가 액체 매체에서 클루코오스 또는 다른 시스-디올 화합물과 같은 분석물의 존재 또는 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 이 감지장치는 형광 지시제 분자 함유 매트릭스(이하 "형광 매트릭스" 라 함), 하이 패스 필터 및 광 검출기의 적층 배열을 포함한다. 이 장치에서, 광원, 바람직하게는 발광 다이오드("LED") 는 지시제 물질 내에 적어도 부분적으로 또는 지시제 매트릭스가 상부에 배치되는 도파관에 위치되어 광원으로 부터의 입사광이 지시제 분자가 발광하도록 한다. 하이패스 필터는 발광된 광이 광검출기에 도달하도록 하는 반면에 광원으로 부터의 산란된 입사광을 필터링한다.

미국특허 제 5,517,313호에 기술된 장치에 사용된 지시제 분자의 형광은 글루코오스 또는 다른 시스-디옥 화합물과 같은 분석물의 국소적 존재에 의해 조절, 예를 들면 감쇠 또는 강화

미국특허 제5,517,313호에 기술된 센서에서 지시제 분자를 함유하는 물질은 분석물에 투과성이다. 따라서, 분석물은 주변 테스트 매체로 부터 물질로 확산하여 지시제에 의해 방사된 형광에 영향을 미치다. 광원, 지시제 분자함유 물질, 하이패스 필터 및 광검출기는 지시제 분자에 의해 방사된 형광의 적어도 일부분이 광검출기에 충돌하여 주변 매체에 있는 분석물(예를 들면, 글루코오스의 농도를 표시하는전기적 신호를 발생하도록 구성된다.

본 발명의 지시제 분자를 사용하는 다른 가능한 실시예에 따른 감지장치는 모두 여기에 참고로 도입된 미국 특허 제5,910,661, 5,917,605및 5,894,351호에 기술되어 있다.

본 발명의 고분자는 예를 들면 생체내에 있는 분석물 (혈액 또는 조직 글루코오스 수준)을 연속적으로 모니터하기 위해 이식가능한 장치에 사용될 수 있다. 적절한 장치들이 1999년 8월 26일에 출원된 미국특허 제09/383,148호 및 미국특허 제5,833,603호, 6,002,954호 및 6,011,984호에 기술되어 있는데 이들 모두 여기에 참고로 도입되었다.

본 발명의 고분자는 독특한 잇점을 갖는다. 예를 들면, 샘플의 흡수는 흡수제의 농도 및 샘플 경로 길이 모두에 직접적으로 비례적이다. 따라서, 흡수계 평가에서 주어진 흡수 수준에 있어서의 샘플 경로길이는 흡수제 농도가 매우 증가될 경우 매우 감소될 수 있다. 농도에 있어서의 바람직한 증가는 친수성 모노머 : 지시제 성분 모노머의 비율은 감소시키므로서 달성될 수 있다.

실제로, 본 발명은 제한된 공간에 훨씬 많은 흡수제 성분의 국소화된 농도를 허용하므로서 유니트 두께 당 흡수를 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 흡수계 평가시에 훨씬 작은 장치를 사용할 수 있게 한다. 형광계 평가를 포함하는 어떤 광학계 평가에 있어서, 지시제 성분의 국소적 농도를 매우 증가시키는 능력은 몇 가지 잇점을 제공한다. 예를 들면, 지시제 성분의 보다 높은 국소적 농도는 지시제 고분자의 보다 얇은 층을 이용할 수 있고 이것은 분석물의 존재 또는 농도에 대한 고분자의 반응시간을 매우 감소시킬 수 있다. 또한, 이것은 여기광의 보다 높은 여기를 가져오고 이것은 조직계통 또는 생리용액에서 작업할 때 자기형광의 입사를 현저히 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 형광계 고분자로 작업할 때 비흡수 여기광이 예를 들면, NADH, 트립토판, 티로신, 등과 상호작용 할 수 있는데 이들은 그들 분자로 부터의 바람직하지 않은 간섭형광방사를 가져오는 조직 또는 생리용액에 존재할 수 있다. 고흡수와 지시제 성분의 높은 국소적 농도를 갖는 것도 바람직하지 않은 간섭 방사를 감소시킬 수 있다. 또한, 조직 또는 생리용액에서 흡수계 고분자를 사용할 때는 빌리루빈과 같은 주변조직 또는 유체에 있는 성분에 의해 잠재적으로 변화하는 양에서 반영되는 광원방사의 양을 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 고흡수와 지시제 성분의 높은 국소적 농도를 갖는 것은 바람직하지 않는 영향을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 추가 양태로서 특정 고분자가 엑시머 효과를 나타내는 것으로 발견되었다. 배경으로서, 방향족 구조를 갖는 두개의 평면 분자(플루오로포어와 공유인것과 같은)는 그들의 파이 전자 궤도 로우브(lobes)가 중첩할 수 있는 지점에 농축될 때 중첩으로 부터의 공명이 에너지적으로 유리하고 안정한 하이브리드(커플릿, couplet)구조를 가져오는 경우 어떤 종에 대하여 공명 상태가 발생할 수 있다. 이 두개의 평면 분자들은 사이에 중첩하는 전자 구룹을 갖는, 샌드위치상의 두조각의 빵처럼 공유평면 구조로 배향된다. 형광평면 종에 있어서 특징적인 다운필드(doumfield) 방사가 모 종보다는 실질적으로 낮은 에너지의 파장에서 결합되지 않은 종과 관련하여 발생한다. 그러한 공명구조를 형성할 수 있는 분자는 엑시머로서 알려져 있다. 여기에 사용된 엑시며 효과는 엑시머로 부터의 최종 특징적인 보다 긴 파장 방사를 말한다.

전형적인 엑시머 형성 폴리아로마틱 하이드로카본의 예로는 안트라센과 파이렌을 포함한다. 다른 것들도 많이 있다. 예는 본 발명의 실시예 1과 2에 사용된 지시제 성분인 안트라센 유도체(보로네이트 포함)이다. 안트라센이 용액에서 엑시머를 형성하는 것으로 알려져 있지만 어떤 엑시머 특성 관찰하기 위해 충분히 높은 수준으로 분자를 농축시킬 수 있어야 한다. 본 발명의 실시예에서, 안드라센 유도체 모노머의 상대적인 농도는 500:1 에서 400:1, 200:1, 100:1, 50:1, 25:1, 15:1, 그리고 5:1로 코롤리머에 있는 친수성 모노머에 비례하여 증가되었다. 모두 녹색방사가 갑자기 나타나는 5:1 비에서를 제외하고 안트라센 유도체의 417nm에서 청색 방사를 갖는다. 이 녹색 방사는 엑시드 하이브리드의 것이고 방사는 약 100+나노미터(~515-570nm,녹색)까지 다운필드를 이동시켰다. 전체 용액의 농도는 높을 필요가 없는데 이는 평면 종들 사이의 거리가 3-D 공간에서의 용해성 농도라기 보다는 폴리머 백본에 따른 변위에 의해 조절되기 때문이다.

놀랍게도, 엑시머 방사영역은 분석물 농도의 변화에 응답하는 것이 아니라 여기 강도, 온도 및 pH 와 같은, 분석된 시스템의 다른 모든 양태에 응답하는 것으로 발견되었다. 그 결과, 본 발명의 지시제 고분자는 지시제 및 내부 기준 모두로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 이상적인 기준구성은 지시제 파장 (즉, 분석물에 의해 영향 받은 파장)에서의 방사강도가 엑시머 파장에서의 방사강도에 의해 선택 대역 여파기를 사용하여 광학적으로 분할되는 곳이다. 결과값은 예를 들면, 산소,pH 의 흐름 및 에러, LED 강도에 영향을 미치는 파워인자 및 흐름, 상온 이탈, 등에 의한 형광 퀀처와 같은 형광 방사특성에 영향을 미치는 간섭인자를 보정한다.

엑시머 효과를 나타내는 본 발명의 고분자는 수성 및 비수성 환경 모두에 유용하다. 따라서, 이들 고분자 뿐만 아니라 성분 모노머들(엑시머형성 및 다른 모노머)은 소정용도에 따라 친수성에서 소수성까지의 범위일 수 있다.

또한, 본 발명의 엑시며 고분자가 분석물의 존재 또는 농도를 검출하는데 사용될 때 고분자는 용액에 직접 사용되거나 상기한 바와 같이 고정될 수 있다.

본 발명의 고분자는 하기에 기술된 일반적인 과정과 일치하는 반응 메커니즘을 포함하는, 쉽게 알려진 반응 메커니즘과 시제를 사용하여 과도한 양의 실험없이도 당업자에의해 제조될 수 있다.

본 출원은 2000년 8월 4일 출원된 미국 특허출원 제 09/632,624호의 일부계속출원이다.

본 발명은 액체와 같은 매체에 있는 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 지시제 분자(indicator molecules) 및 그러한 검출을 이루기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 고분자(macromolecule)가 수성환경에서 사용될 수 있도록 상대적으로 소수성인 지시제 성분 모노머 및 친수성 모노머를 함유하는 코폴리머 고분자에 관한 것이다.

실시예1

a) 9-[(메타크릴로일아미노프로필아미노) 메틸] 안트라센의 제조

(A) 일단계

얼음물 조에서 교반하는 클로로포름(250mL)에 있는N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드(Polysciences, #21200)(11.82g, 0.066몰, 300eg)및 미량의 억제제 DBMP(2,6-디-t-부틸-4-메틸페놀)(10mg)의 현택액에 디이소프로필에틸아민(25mL,18.55g, 0.144몰, 6.5eg)을 20분에 적하 첨가 했다. 이 혼합물을 실온으로 올리고 얼음물조에서 다시 냉각시켰다. 클로로포름(100mL)에 깨끗한 9-클로로메틸안트라센(5.0g, 0,022몰)의 용액을 1시간 이상 적하첨가했다. 이것을 1시간동안 25℃ 에서, 12시간 동안 50℃ 에서 그리고 2시간동안 70℃ 에서 주행시켰다.

이 혼합물을 물(60mL x 4)로 세척하고 수성층을 메틸렌클로라이드로 추출했다. 유기층을 조합하고, Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시킨 다음 분리하고, 용매를 40℃ 로 강압하에서 제거했다. 조(crude) 물질을 메틸렌 클로라이드에 있는 2-5% 메탄올로 실리카 겔상에서 크로마트그래피하여 고형물로서 2.44g(33.4%)의 산물을 제공했다.

(B) 이단계

얼음물 조에서 교반하는, 물(30mL)과 테트라하이드로퓨란(30mL)의 혼합물에 있는N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드(788mg,4.41mmole,10eq) 및 미량의 억제제 MEMQ(메틸에테르 하이드로퀴논) (2mg)의 깨끗한 용액에 Na ₂ CO ₃ / NaHCO ₃ 완충액 166mL, 0.2M, pH10)을 1시간에 첨가하고 클로로포름(100mL)에 있는 9-클로로메틸안트라센(100mg, 0.441mmole)의 용액을 3시간에 첨가했다. 이것을 7시간동안 25℃ 에서 그리고 12시간 동안 55℃ 에서 주행시켰다.

유기층을 분리하고 물(50mL x 4)로 세척한 다음 수성층을 메틸렌클로라이드로 추출했다. 유기층들을 조합하고 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고 분리한 다음 용매를 45℃ 에서 감압하에 제거했다. 조 물질(270mg)을 메틸렌클로라이드에 있는 10-20%메탄올로 실리카 겔상에서 크로마토그래피하여 고형물TLC(실리카 겔) : R _f 0.77 MeOH/CH ₂ Cl ₂ (19.6%)의 산물을 제공했다.

b) 9-[[N-메타크릴로일아미노프로필-N-(O-보로노벤질)아미노]메틸}안트라센의 제조

얼음물 조에서 교반하면서 클로로포름(250ml)에 있는 상기 단계 a)에서 얻어진 산물(2.440g, 0.00734mole)과 미량의 억제제 DBMP(10mg)의 용액에 DIEA(디이소프로필에틸아민)(2.846g, 3.84mL, 0.022 mole, 3.0eg)를 10분에 부로(by portion)첨가하고 클로로포름(15ml)에 있는 2,2-디메틸프로판-1,3-디일[0-(브로모메틸)페닐] 브로네이드(2.492g, 0.00881mole, 1.2eg)의 용액을 30분에 첨가했다. 실온에서 20시간동안 반응시켰다.

이 혼합물을 물로 세척하고 분리한 다음 수성층을 메틸렌 클로라이드로 추출했다. 유기층을 조합하고, Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시킨 다음 분리하고 용매를 25℃에서 감압하에 제거했다. 반고형물(4.75g)을 메틸렌클로라이드에 있는 2-5%메탄올로 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 약간 노란 결정성 고형물, mp 72-73℃, TLC(실리카 겔) : R _f 0.36(MeOH/CH ₂ Cl ₂ =1/9)로서 2.50g(76.3%)의 산물을 제공했다. H ₂ O 와 에테르에서 제한된 용해도였다.

c) MAPTAC 및 9-{[N-메타크릴로일아미노프로필-N-(0-보로노벤질)아미노]메틸}안트라센의 수용성-코폴리머성 용액의 제조

(50:1)용액 : 에탄올(100%,1.5ml)에 있는 모노모(42.3mg, 0.0908mmole)의 용액에 MAPTAC[3-(메타크릴로일아미노)프로필]트리메틸알모늄클로라이드(2.0mL,1.0g, 4.54mmole, 50eq)및 라디칼 지시제로서 AIBN (아조비시소부틸 니트릴)에탄올성 용액(0.183M, 0.2mL)를 첨가하여 깨끗한 용액을 얻었다. 이것을 질소로 포화시키고 1시간에 70℃ 로 가열시킨 다음, 70℃ 에서 80분 동안 유지시켜 비스코스액을 얻었다.

얻어진 액체를 물(26mL)로 처리하고 마이크로필터(0.45㎛)를 통해 여과시켜 깨끗한 용액을 제공했다. 물(5L x 4)로 셀룰로오스 아세테이트 막(MWCO 3500)을 통하여 투석한 후 그것을 폴리에틸렌 글리콜(MW 24K)로서 깨끗한 용액(34.54g)으로 농축시켰다. 농축 : 1.0g용액에 24.0mg 고형물, 총고형물 829 mg, 수율 79.5%

소수성 모노머 : 지시제의 몰비가 500:1, 400:1, 200:1, 100:1, 50:1, 25:1 인 코폴리머 용액들을 제조하는데에 유사한 과정을 적용했다.

50:1 및 25:1 코-폴리머의 글루코오스 조절

다양한 농도를 갖는 글루코오스용액에 의한 50:1 및 25:1 지시제 고분자의 형광조절을 표 1 및 2에 도시하였다. 표1 은 4개의 다른 글루코오스 농도와 이 실시예의 25:1 지시제 고분자의 두개의 다른 농도(15mg/ml 및 25mg/ml)를 사용한 결과이다. 표2 는 4개의 다른 글루코오스 농도와 이 실시예의 50:1 지시제 고분자의 두개의 다른 농도(10mg/ml 및 20mg/ml)를 사용한 결과이다. 두 표에서 I/Io 는 글루코오스에 노출(365nm 여기)전후에 420nm 에서의 방사된 강도의 비이다.

실시예 2

본 실시예는 실시예 1에서 제조된 5:1 지시제 고분자와 관련하여 존재하는 놀랍고도 유용한 엑시머 효과를 입증한다.

도1은 365mm에서 광에 의한 자극(excitement)후에 세 농도의 글루코오스 (OmM, 30mM 및 60mM)에 노출되었을 때 5:1 지시제 고분자의 방사 스펙트럼을 도시한 것이다. 도1 에서 검게 도시된 것은 실시예 1 로 부터의 비엑시머 25:1 지시제 고분자의 방사이다. 엑시머 방사 영역은 등흡광점(isosbestic point) 이라기 보다는 등흡광 영역을 도시한 것이다. 엑시머 방사영역(OmM, 30mM 및 60mM 글루코오스 라인이 중첩되는 영역)은 글루코오스 농도의 변화(등흡광점과 같은)에 응답적이지 않다는 것을 도1 로 부터 알 수 있다. 엑시머 방사영역은 안트라센 유도체 조절의 피크 반응성 파장으로 부터 약 100mm 다운필드를 시작한다. 글루코오스를 제외하고, 엑시머는 여기 강도, 온도 및 PH와 같은 다른 모든 양태의 시스템에 반응성이다. 따라서, 이상적인 기준 구성은 415mm에서 진폭 또는 신호값이 515nm 또는 또 다른 파장의 진폭 또는 신호값 또는 엑시머 방사영역 내의 파장 범위에 의해 전기적으로 분할되어 결과값이 LED 강도, 상온이탈, 등에 영향을 미치는 pH, 파워인자 및 드리프트의 에러에 대해 보정된다. 이것은 하기에서 입증된다.

여기강도, 온도 및 PH 보정의 입증

5:1 지시제 고분자의 글루코오스 조절을 세개의 다른 글루코오스 용액(OmM, 100mM 및 200mM)으로 측정했다. 광원 및 방사광을 위한 세개의 다른 분광광도계 슬릿 구성(1.5 는 좋아지고 3 은 넓어진다)에서 글루코오스 용액 각각에 대하여 방사스펙트럼을 측정했다. 데이터를 표3 에 eh시하였다.

표에서, 420nm 에서의 방사강도에 550nm 에서의 방사강도의 비는 슬릿트 구성에 상대적으로 독립적이다.

5:1 엑시머 지시제 고분자의 온도 안정성을 측정했다. 200mM 글루코오스 (pH 7.5)에 노출된 5:1 엑시머 지시제 고분자의 1mg/ml에 대하여 420nm 및 550nm에서의 방사비는 실온에서 7.57 이었고 약 60℃ 에서 7.53 이었다.

5:1 엑시머 지시제 고분자의 pH 안정성도 측정했다. 세개의 다른 pH 수준(6.5, 7.0 및 7.5)에서 5:1 엑시머 지시제 고분자의 1mg/ml에 대하여 420nm 및 550nm 에서의 방사비를 측정하여 (370nm, 슬릿 1.5, 3 에서의 여기광) 표4 에 도시했다. 전 방사 스펙트럼을 도 2 에 도시하였다. 시험된 범위를 넘어서는 변화는 통계적으로 중요하지 않았다.

엑시머 복합체의 안정성(파이 클라우드를 통한다고 가정하여)은 비엑시머 안트라센 유도체를 초과하고, 비엑시머의 특성을 혼란에 빠트릴 수 있으며 우수한 지시제를 만드는 보로네이트 인식 특성은 보다 안정한 엑시머 복합체를 혼란에 빠트릴 수 없어서 엑시머가 매우 우수한 기준 지시제를 만든다. 기준 분자는 판독 채널 지시제로 부터 구조적으로 변하지 않는다. 폴리머 매트릭스는 같을 수 있으며 이 실시예에서는 실제로 같은 고분자이다. 인식요소는 오픈되어 있으며 완전하지만 인식요소와 플루오로포어 중심사이의 유도에너지 영향이 없어졌다.

상기한 사항은 매우 중요한데 이는 지시제와 기준 분자 사이의 개별적인 물리적 및/또는 화학적 환경의 필요성을 제거할 수 있기 때문이다.

실시예 3

적절한 란타나이드 길레이트 지시제 성분 모노머의 합성을 도 3 에 도시하였다. 화합물(1) 및 (2)는 텍사스, 리차드슨에 소재하는 매크로사이클릭스 (Macrocyclics)로 부터 상업적으로 입수가능하다. (화합물(2)는 p-NH ₂ -Bz-DOTA로 알려져 있다.) 최종산물(9)는 지시제 고분자를 형성하도록 하나 이상의 다른 모노머와 공중합될 수 있다.

실시예 4

비스-보로네이트-안트라센의 단일-메타크릴아미드 모노머

A. 9-클로로메틸-10-[{2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노}-메틸]안트라센 하이드로클로라이드 염

200mL의 NMP에 있는 9,10-비스(클로로메틸)안트라센 (5.18g, 18.8mmole, 3.99당량)의 현탁액에 2-(2-아미노에톡시)에탄올(0.495g, 0.475mL, 4.71mmole)을 첨가했다. 이 혼합물을 17시간 동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 반응혼합물을 50°C에서 ~ 50mL 로 진공하에서 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (150g 그래비티 등급 실리카 겔, 0-10% CH ₃ OH/CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 0.425g(24%)의 노란색/오렌지 고형물을 수득했다.

TLC:Merck 실리카 겔 60 플레이트, 70/30 CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH를 갖는 R _f 0.72 UV (254/366)로 봄, 닌하이드린 스테인.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10*250mm 컬럼, 0.100mL 주입, 2mL/분, 370nm 검출, A= 물 (0.1% HFBA) 및 B= MeCN (0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-80% B, 2분 이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간16.1분.

B. 9-[{2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노}메틸]-10-[{(3-메타크릴아미도)프로필아미노}메틸]안트라센

23°C에서 125mL CHCl ₃ 에 있는 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드록사이드 염(3.08g, 17.2mmloe, 4.2당량), DIEA (5.19g, 7.00mL, 40.1mmole, 9.8당량) 및 ~3mg의 BHT의 현탁액에 25mL의 CHCl ₃ 에 있는 9-클로로메틸-10-[{2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노}-메틸]안트라센 하이드로클로라이드 염(1.56g, 4.10mmole)의 용액을 적하 첨가했다. 이 혼합물을 92시간 동안 어둠에서 순차적으로 교반했다. 이 시점에서, 반응혼합물을 여과하고 2 x 40mL의 NaHCO ₃ (포화된 수성용액)으로 세척했다. 유기 추출물을 무수 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고 여과한 다음 농축시켜 끈적한 오렌지색 고형물을 수득하고 이것을 알루미나 크로마토그래피 (50g 활성화 중성 알루미나, 0-5% CH ₃ OH / CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 0.364g (20%)의 오렌지색 고형물을 수득했다.

TLC : Merck 실리카 겔 60 플레이트, 70/30 CH ₂ Cl ₂ / CH ₃ OH, UV (254/366)로봄, 닌하이드린 스테인.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201 TP 10*250nm 컬럼, 0.100mL 주입, 2mL/분, 370nm검출, A=물 (0.1% HFBA)및 B=MeCN (0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-80% B, 2분 이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 16.85분

C. 9-[N-{2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질}-N-{3-(메타크릴아미도)프로필아미노}메틸]-10-[N-{2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질}-N-{2-(2-하이드록시에톡시)-에틸아미노}메틸]안트라센. (단일-메탈크릴아미드 모노머).

23°C에서 20Ml CHCl ₃ 에 있는 9-[{2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노} -메틸]-10-[{(3-메타크리아미도)프로필아미노}메틸]-안트라센(0.343g, 0.763mmole), DIEA (0.965g, 1.30mL, 9.8당량) 및 (2-브로모메틸페닐) 보론산 네오펜틸 에스테르 (1.09g, 3.85mmole, 5.0당량)의 용액을 25시간동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 이 반응 혼합물을 초기에 회전 증발로, 이후에 진공 펌프를 사용하여 농축시켜서 DIEA를 제거했다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(40g활성화 중성 알루미나, 0-10% CH ₃ OH / CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 0.2999g (46%)의 노란 오렌지색 고형물을 수득했다. 이 산물은 하나 이상의 다른 보노머와 공중합되어 지시제 고분자를 형성할 수 있다. 보로네이트기는 사용 전에 보호해제 되어야 한다.

FAB MS : C ₅₁ H ₆₅ B ₂ N ₃ O ₇ [M] ⁺ 854에 대해 계산됨 ; [M+1] ⁺ 855발견됨.

TLC : Merck 베이직 알루미나 플레이트, 95/5 CH ₂ Cl ₂ / CH ₃ OH로 Rf 0.35, UV (254/366)로 봄.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 20/TP 10 x 250nm 컬럼, 0.100mL 주입, 2mL/분, 370nm 검출, A= 물 (0.1% HFBA) 및 B= MeCN (0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-80%, 2분 이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 19.7분.

실시예 5

비스-보로네이트-안트라센의 이중-메타크릴아미드 모노머

A. 9,10-비스[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]메틸-안트라센

23°C에서 200mL CHCl ₃ 에 있는 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(1.5g,5.45mmole), DIEA (28.17g, 38.00mmole, 218mmole, 40당량), N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드 염 (9.76g, 54.5mmole, 10당량) 및 ~5mg의 BHT의 현탁액에 40°C에서 4일동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 온도를 45℃ 로 증가시키고 이 혼합물을 3일 더 길게 교반했다. 이 시점에서, 침전물이 형성되었다. 이 혼합물을 여과하고 고형산물을 최소량의 CH ₂ Cl ₂ 에 용해시켰다. 노란색의 결정성 고형물인 비스 하이드로클로라이드 염의 소정 산물을 밤새 형성했다. (3.15g, 정량적).

TLC : Merck 베이직 알루미나 플레이트, 90/10 CH ₂ Cl ₂ / CH ₃ OH 로 R _f 0.31, UV (254/366)으로 봄.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5*100mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100mL 주입, 0.75mL/분, 360nm 검출, A= 물 (0.1% HFBA) 및 B= MeCN (0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-80%, 2분 이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 15.0분.

B. 9,10-비스[N-{2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질}-N-{3-(메타크릴아미도)-프로필아미노}메틸안트라센

23°C에서 20mL CHCl ₃ 에 있는 9,10-비스[3-(메타크릴아미도)-프로필아미노]메틸안트라센(0.650g, 1.34mmole의 유리아민), DIEA (0.612g, 0.825mL, 4.74mmole, 3.55당량) 및 BHT (억제제로서 5mg)의 용액을 5일동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 반응 혼합물을 진공속에서 농축시키고 잔류물을 알루미나 크로마토그래피 (200g 활성화 중성 알루미나, 0-2% CH ₃ OH/ CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 0.465g(39%)의 매우 점성인 노란색 오일을 수득했다.

TLC : Merck 베이직 알루미나 플레이트, 90/10 CH ₂ Cl ₂ / CH ₃ OH로 Rf 0.59, UV (254/366)로 봄.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5*100mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050mL 주입, 0.75mL/분, 360nm 검출, A= 물 (0.1% HFBA) 및 B= MeCN (0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-80% B, 2분 이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 16.9분.

C. 글루코오스 지시제로 N,N-디메틸아크릴아미드 하이드로겔의 제조 :

에틸렌 글루콜에 있는 N,N-디메틸아크릴아미드 (40% wt.) 및 N,N ¹ -메틸렌비스아크릴아미드 (0.8% wt.)의 용액을 제조했다. 9,10-비스[N-{2-(5,5-디메틸보리난 -2-일)-벤질}-N-{3-(메타크릴아미도) 프로필아미노 }메틸 안트라센 (17.8mg, 2x10 ^-5 mole) 및 40uL 의 수성 암모늄 퍼설페이트(5% wt.)를 1mL의 에틸렌 글리콜 모노머 용액과 조합했다. 결과 용액을 질소로 퍼지된 글러브 박스에 위치시켰다. N,N,N ¹ ,N ¹ -테트라메틸에틸렌디아민 (80uL, 5% wt.)의 수성 용액을 모노머 제형 (formulation)에 첨가하여 중합을 가속화했다. 결과 제형을 현미경 슬라이드 및 100 마이크론 스테인레스 스틸 스페이서로 부터 구성된 몰드에 부었다. 질소 분위기에서 8시간동안 유지시킨 후 몰드를 포스페이트 완충염(PBS) (10mM PBS, pH = 7.4)에 위치시키고 현미경 슬라이드를 분리한 다음 하이드로겔을 제거했다. 하이드로겔을 3일동안 1mM 라우릴 설페이트 소듐 염 및 1mM EDTA 소듐 염을 함유하는 100mL의 PBS로 세척했는데 용액을 매일 바꿨으며, 이어서 DMF/PBS (10/90 부피, 3 x 100mL) 및 마지막으로 PBS (Ph = 7.4, 3 x 100mL)로 세척했다. 결과적인 하이드로겔 폴리머를 0.2% wt. 소듐 아지드 및 1mM EDTA 소듐 염 함유 PBS (10mM PBS, pH = 7.4)에 저장했다.

D. 글루코오그, 락테이트 및 아세토아세테이트로의 형광조절

본 실시예에 의해 제조도니 지시제 고분자 (두개의 인식요소)의 글루코오스,락테이트 및 아세토아세테이트로의 형광조절을 측정했다. 도 4 는 다양한 양의 소듐-L-락테이트, 리튬 아세토아세테이트 또는 α-D-글루코오스를 함유하는 1mM EDTA 및 0.2% NaN ₃ 를 함유하는 10mM PBS ,pH 7.4에 있는 본 실시예 하이드로겔의 정상 형광방사 ( I/Io@427nm )를 도시한 것이다. 온도 조절 샘플 홀더를 사용하여 37℃, 저감도로 427nm(슬림=3nm)에서의 방사 및 여기 365nm(슬릿=3nm)를 갖는 Shimadzu RF-5301 스펙트로플루오로메터를 사용하여 데이터를 기록했다. 3mL 의 소정 용액을 함유하는 큐벳(cuvettes)를 측정전에 15분 동안 37℃ 에서 평형화시켰다. 각 하이드로겔 샘플을 네개의 독립된 샘플로 측정했다. 에러바는 각 데이터점에 대하여 네배값을 갖는 표준편차이다. 글루코오스 인식 분자를 함유하는 하이드로겔을 상기한 바와 같이 제조했다. 하이드로겔을 유리 슬라이드상에 놓고 45℃ 입사광으로 PMMA cuvettes 에 있는 플리에스터 메쉬로 덮었다. 1, 5, 10및 20mM 소듐 L-락테이트[Aldrich], 5, 10 및 20mM 리튬 아세토아세테이트[Aldrich] 및, 1,2,4,5,10및 20mM aD-글루코오스의 용액을 0.2% NaN 및 1mM EDTA를 함유하는 10mM PBS, pH 7.4 에서 제조했다. 코폴리머의 형광은 락테이트 또는 아세트아세테이트의 존재가 아니라 글루코오스의 존재에 의해 영향을 받았다

실시예 6

비스-보로네이트-안트라센의 단일-및 이중-메타크릴레이드 모노머

A. 9,10-비스[{2-(2-하이드록시에특시)에틸아미노}메틸]-안트라센

23℃ 에서 40mL CHCl ₃ 에 있는 2-(2-아미노에톡시)에탄올(31.4g, 30.0mL, 299mmole, 20.9 당량)의 용액에 9,10-비스(클로로메틸)안트라센(3.94g, 14.3mmole)을 첨가했다. 용액을 67시간 동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 100mL CH ₂ Cl ₂ 를 첨가하고 용액을 1 x 50mL 및 2 x 100mL 부의 NaHCO ₃ (포화수용액)으로 세척했다. 유기추출물을 무수 Na ₂ SO4 상에서 건조시키고 여과한 다음 농축시켜 4.67g(79%)의 노란색 분말을 수득했다. 산물(RP-HPLC에 의한 ~ 85% 습도)을 그대로 진행시켰다.

HPLC 조건 : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250mm 컬럼, 0.100mL 주입, 2mL/분, 370nm 검출, A=물(0.1% HFBA)및 B=MeCN(0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-8% B, 2분 이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 15.6분.

B. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2(2-하이드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센.

23℃에서 125mL CHCl ₃ 에 있는 9,10-비스[[2-하이드록시에톡시]에틸아미노]-메틸]안트라센(4.02g, 9.75mmole), DIEA (12.6g, 17.0mL,97.5mmole, 10.0당량)및 [2-브로모메틸-페닐]보론산 네오펜틸 에스테르(13.7g, 48mmole, 4.9당량)을 46시간동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 반응혼합물을 초기에는 회전증발시키고 이후 진공펌프를 사용하여 농축시켜서 DIEA를 제거했다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(150g 활성화 중성알루미나, 0.3% CH ₃ OH/CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 방치시에 고형화되는, 5.67g(70%)의 점성 오일을 수득했다. 산물(RP-HPLC에 의한 ~ 85% 순도)을 그대로 진행시켰다.

TLC : Merck 베이직 알루미나 플레이트, 95/5 CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH 로 Rf 0.33, UV(254/366)으로 봄.

HPLC 조건 : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250mm 컬럼, 0.100mL 주입, 2mL/분, 370nm 검출, A=물(0.1% HFBA) 및 B=MeCN(0.1% HFBA), 그라디엔트 100% B 2분, 유지시간 18.8분.

C. 9-[N-2(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[메타크로일톡시에톡시)메틸]-10-[N-2-(2-하이드록시에톡시)-에틸아미노]메틸]안트라센(단일-메탈크릴레이트모노머)

23℃ 에서 15mL CH ₂ Cl ₂ 에 있는 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노]메틸]-안트라센(0.298g, 0.359mmole), 메타크릴산(0.304g,0.300mL, 3.53mmole, 9.84당량) DCC(0.965g,4.68mmole, 13.0당량)및 N,N-디메틸아미노피리딘(0.020g, 0.16mmole, 0.46당량)의 용액을 4시간동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 반응혼합물을 여과하고 회전증발로 농축시켰다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피 (50g 활성화 중성 알루미나, 0.4% CH ₃ OH/ CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 0.150g(47%)의 노란색 고형물을 수득했다.

FAB MS : CHBNO [M] 885에 대해 계산된 ; [M+1] ⁺ 886 발견

TLC : Merck 베이직 알루마나 플레이트, 95/5 CH ₂ Cl ₂ CH ₃ OH 로 Rf0.45,UV (254/366)으로 봄.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250mm 컬럼, 0.100mL 주입, 2mL/분, 370nm 검출, A=물(0.1% HFBA) 및 B=MeCN(0.1%HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분이상10-80% B, 2분이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 21분.

D. 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-메타크로일록시-에톡시)에틸아미노]메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노]메틸]-안트라센 및 TMAMA 의 수용성 코폴리머(1:50 몰 비).

0.600mL 물에 있는 [2-(메타크릴록시)에틸]트리메틸-암모늄 클로라이드 (TMAMA, 70wt% 수성용액, 0.344g 모노머, 1.66mmole, 50당량)의 용액에 3.00mM MeOH에 있는 9-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2메타크로일록시에톡시)에틸아미노]-메틸]-10-[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(4-시아노발레릭산)(0.0075g, 0.027mmole, 1.6mole%의 총 모노머)를 첨가했다. 0.45u 멤브레인 필터를 통해 이 용액을 여과하고 질소 가스로 퍼지한 다음 16시간동안 55℃ 에서 어둠속에서 가열했다. 이 시점에서 점성용액을 25 ℃ 로 냉각시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 20mL 물로 희석시키고 0.2u 멤브리인 필터를 통하여 여마했다. 폴리머 용액을 2 x 4L의 물에 대하여 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(MWCO 3500)을 통해 투석했다. 그 투석으로부터 38.5mL의 폴리머 용액을 얻었다. 이 용액의 일부를 건성으로의 농축은 1.0mL용액당 0.0075g 폴리머를 나타냈다. 전체 0.289g(77%)수율의 폴리머.

E. 글루코오스, 락테이트 및 아세트아세테이트로의 형광 조절

본 실시예의 단계 D에서 제조된 코폴리머(두개의 인식 요소를 함유하는)의 형광을 그루코오스, 락테이트 및 아세트아세테이트로 조절하는 것을 측정했다. 도 5는 a)0.20mM 글루코오스 ; b) 0-20mM 락테이트 ; c) 0-20mm 리튬아세토아세테이트를 함유하는 PBS에 있는 안트라센 비스 보로네이트-TMAMA(1:50 몰 비) 코폴리머의 1.5mg/mL용액의 정상 형광방사( I/Io@428nm )를 도시한 것이다. 여기 365nm ; 1.5nm의 여기슬릿 ; 1.5nm의 방사슬릿 ; 상온을 갖고 Shimadzn Rf-5301 스펙트라플루오로메터를 사용하여 스펙트럼을 기록했다. 코폴림의 형광을 락테이트 또는 아세테이트의 존재가 아니라 글루코오스의 존재에 의해서 영향을 받았다.

F. 9,10-비스[N-[2-5,5-디메틸보리난-2-일]벤질]-N-[2-(2-메타크로일로일록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(이중-메타크릴레이트 모노머).

5mL CH ₂ Cl ₂ 에 있는 9,10-비스[N[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(2-하이드록시에톡시)에틸아미노]메틸]-안트라센(0.100g, 0.120mmole), 메타크릴산 (0.112g, 0.110mL, 1.30mmole, 10.8당량), DCC(0.316g, 1.53mmole, 12.8당량) 및 N,N-디메틸아미노-피리딘(0.014g, 0.11mmole, 0.92 당량)의 용액을 1시간동안 0℃에서, 이어서 22시간동안 23℃ 에서 교반했다. 이 시점에서, 반응혼합물을 여과하고 회전증발로 농축시켰다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피(30g 활성화 중성 알루미나, 0-2% CH ₃ OH/CH ₂ Cl ₂ )로 정제하여 0.030g(26%)의 노란색 고형물을 수득했다. 이 생성물을 하나이상이 다른 모노머와 공중합하여 지시제 고분자를 형성할 수 있다. 보로네이트기는 사용전에 보호해제 되어야 한다.

FAB MS : C ₅₆ H ₇₀ B ₂ N ₂ O ₁₀ [M] ⁺ 953에 대해 계산됨 ; [M] ⁺ 951 발견(약한 분자이온피크

TLC : Merck 베이직 알루미나 플레이트, 95/5 CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH 로 Rf 0.67, UV(254/366)로 봄.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100mm Novapak HR C18컬럼, 0.100mL 주입, 0.75mL/분, 2mL 주입루프, 370nm 검출, A=물(0.1% HFBA) 및 B= MeCN (0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분이상 10-80% B, 2분이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 19.6분.

G. 글루코오스 지시제로의 HEMA/SPE/MAA 하이드로겔의 제조

0.900mL의 에틸렌글리콜에 있는 하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA, 0.078 mL, 0.084g, 0.64mmole), 메타크릴산(MAA, 0.030mL, 0.020g, 0.035mmole), 폴리에틸렌 글르콜 디메타크릴레이트 1000(PEGDMA, 0.5mg/mL 수성용액, 0.048mL), 및 N,N-디메틸-N-메타크릴록시에틸-N-(3-설포프로필)-암모늄-바타인(SPE, 0.462g, 1.65mmol)의 수용액을 제조했다. 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2일) 벤질] -N-[2-(2-메타크릴록시에톡시)에틸아미노]메틸]안트라센(0.0096g, 0.010mmol)및 0.020mL 의 암모늄퍼셀페이트 5%wt. 수성용액을 0.500mL의 에틸렌글리콜 모노머 용액을 조합했다. 이 용액을 질소로 퍼지된 글러브박스에 위치시켰다. 그 모노머 제형에 N, N, N ¹ , N ¹ -0.040mL, 5% wt.)를 첨가하여 중합을 가속시켰다. 결과적인 제형을 현미경 슬라이드 및 100 마이크론 스테인레스 스틸 스페이서로 부터 구성된 몰드에 부었다. 질소분위기 하에서 8시간 동안 유지시킨 후 몰드를 포스페이트 완충염(PBS, =7.4)에 위치시키고 현미경 슬라이드를 분리시킨 다음 하이드로겔을 제거했다. 하이드로겔을 3일 동안 1mM 라우릴 설페이트 소듐염을 함유하는 100mL의 PBS로 세척했는데 용액을 매일 바꿨으며 이어서 MeOH/PBS(20/80 부피 3 x 100mL) 그리고 마지막으로 PBS(3 x 100ML)로 세척했다. 결과적인 하이드로겔 폴리머를 0.2% wt. 소듐 아지드 및 1mM EDTA 소듐염 함유 PBS(pH=7.4)에 저장했다.

H. 글루코오스로의 형광조절

이 실시예에서 제조된 이중 메타크릴레이트 지시제 화합물의 글루코오스에 의한 형광조절을 측정했다. 도 6은 0-20mM α-D-글루코오스를 함유하는 PBS(7.4, 0.2% NaN ₃ 및 I mM EDTA)에 있는, 본 실시예의 이중 메타크릴레이트 글루코오스 인식분자를 함유하는 HEMA/SPE 하이드로겔(상기한 바와같이 제조된, 10마이크론두께)의 상대적인 형광방사( I/Io@427nm )를 도시한 것이다. 하이드로겔을 유리슬라이드 상에 설치하고 45℃ 입사광의 PMMA 큐벳에서 검은 폴리에스터 메쉬(세파 아메리카 (Sefar America), Depow, NY)로 덮었다. 모든 측정은 온도제어 샘플홀더를 사용하여 고감도로 365nm(슬릿=1.5nm)에서 여기 및 427nm(슬릿=1.5nm)에서 방사를 갖는 Shimadzu RF-5301 로 37℃ 에서 평형화시켰다. 새로운 형광 데이터를 설정하기 위하여 단일 지수 함수를 사용했다.

실시예 7

N-[3-(메타크릴아미도)프로필]-3,4-디하이드록시-9,10-디옥소-2-안트라센설폰아미드(Alizarin Red S 모노머)및 a,a-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미드)프로필아미노]-1,4-크실렌(비스보롤산 모노머)를 함유하는 아크릴아미드 겔에 대한 글루코오스 또는 락테이트의 효과

A. 3,4-디하이드록시-9, 10-디옥소-2-안드라센설포닐 클로라이드 :

3,4-디하이드록시-9,10-디옥소-2-안트라센설폰산 소듐염 (1.4g, 3.9mmoles)을 30mL 의 클로로설폰산과 조합하고 5시간동안 90℃ 로 가열하고, 그 후 용액을 0℃ 로 냉각시킨 다음 100g의 얼음에 부었다. 얼음이 녹은 후 용액을 CH ₂ Cl ₂ (3 x 100ml)로 추출하고 메틸렌 클로라이드 추출물을 Na ₂ SO ₄ 와 조합, 건조시킨 다음 증발시켜 0.87g의 고형물(수율 66%)를 생산했다.

B. N-[3-(메타크릴아미드)프로필]-3,4-디하이드록시-9,10-디옥소-2-안트라센설폰아미드 :

3,4-디하이드록시-9,10-디옥소-2-안트라센설포닐 클로라이드(96mg, 0.28 mmoles) 및 N-(3-아미노프로필) 메타크릴아마드 하이드로클로라이드(108mg, 0.6 mmoles)를 20ml의 CH ₂ Cl ₂ 와 조합했다. 이 현탁액에 Et ₃ N(303g, 3mmoles)을 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 여과한 다음 용매를 증발시켰다. 결과적인 고형물을 용출물로서 CH ₂ Cl ₂ /MeOH(90/10)를 갖는 SiO ₂ (10g)상에서 컬럼 크로마토그래피했다. 적색의 고형물(80mg, 64%수율)로서 생성물을 얻었다.

FAB MS : C ₂₁ H ₂₀ N ₂ O ₇ SM ⁺ 445 에 대해 계산됨 ; M ⁺ 445 발견됨.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100mm Novapak HR C18 컬럼, 0.100mL 주입, 0.75mL/분, 2mL 주입 루프, 370nm 검출, A=물(0.1% HFBA) 및 B=MeCN(0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분 이상 10-80% B, 2분이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 17.67분

C. α, α ¹ - 비스[3-(메타크릴아미드)프로필아미노]-1,4-크실렌.

75mL 무수 MeOH 에 있는 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로크로라이드염 (3.00g, 16.8 mmole, 2.21 당량), DIEA(6.5g, 8.8ml, 50mmole, 6.6당량), 테레프탈디카르복스알데하이드(1.20g, 7.60 mmole)및 Na SO (10.7g, 75.3mmole, 9.91당량)의 용액을 25℃ 에서 18시간동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서 Na ₂ SO ₄ (10.7g, 75.3mmole, 9.91당량)를 더 첨가하고 6시간 더 교반을 계속했다. 이 시점에서, 용액을 여과하고, NaBH ₄ (1.73g, 45.7mmole, 6이 당량)을 부로 여과물에 첨가한 다음 21시간 동안 25℃ 에서 교반했다. 현탁액을 Celite 를 통하여 여과하고 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 100mL CH ₂ Cl ₃ 로 용해시키고 1 x 25mL 포화 수성 NaHCO ₃ 로 세척했다. 유기추출물을 무수 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고 여과한 다음 농축시켜 점성 오일을 생산했다. 생성물을 그대로 옮겼다.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250mm컬럼, 0.100ml주입, 2.00ml/분, 260nm 검출, A=물(0.1%HFBA) 및 B=MeCN(0.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분이상 10-80% B, 2분이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 15.8분

D. α, α ¹ -비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미도)프로필아미노]-1,4-크실렌.

25℃ 의 CH ₂ Cl ₂ 에 있는 α, α ¹ -비스[3-(메타크릴아미드)-프로필아미노]-1,4-크실렌 (2.94g, 7.61mmole), DIEA(2.97g, 4.00ml, 23.0mmole, 3.02 당량),(2-브로모메틸-페닐)보론산 네오펜틱 에스테르(6.50g, 23.0mmole, 3.02당량) 및 BHT(억제제로서 5mg)를 28시간동안 어둠에서 교반했다. 이 시점에서, 혼합물을 1 x 25ml 포화 수성 NaHCO ₃ 로 세척했다. 유기추출물을 무수 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고 여과한 다음 농축시켰다. 이 잔류물에 200mL 에테르를 첨가하고 현탁액을 18시간동안 교반했다. 현탁액을 여과하고 잔류물을 CH ₂ Cl ₂ 에 용해한 다음 여과하고 그 여과물을 농축시켰다. 고형 잔류물에 150mL 에테르를 첨가하고 현탁액을 18시간 동안 교반했다. 이 시점에서 현탁액을 여과하여 1.98g(33%)의 플러피 핑크색의 분말을 얻었는데 이것은 최대 PBS(pH7.4)에서 1mmolar의 최대 용해도를 가졌다.

FAB MS : C ₄₆ H ₆₄ B ₂ N ₄ O ₆ [M] ⁺ 790에 대하여 계산됨 ; [M+1] ⁺ 791 발견됨.

HPLC : HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100mm Novapak HR C 18컬럼, 0.050ml주입, 0.75mL/분, 280nm검출, A=물 10.1% HFBA)및 B=MeCN (90.1% HFBA), 그라디엔트 10% B 2분, 18분이상 10-80% B, 2분이상 80-100% B, 100% B 2분, 유지시간 13.4분.

E. N-[3-(메타크릴아미드)프로필]-3,4 디하이드록시-9, 10-디옥소-2-안트라센설폰아미드(Alizarin Red S 모노머)및 α, α ¹ -비스[N-[2-(5.5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[3-(메타크릴아미드)프로필아미노]1, 4-크실렌 :

30% wt. 아크릴아미드 및 0.8% wt. N, N ¹ 메틸렌비스아크릴아미드를 함유하는 에틸렌글리콜 용액을 제조했다. N-[3-(메타크릴아미드)프로필]-3,4-디하이드록시-9,10-디옥소-2-안트라센설폰아미드(1.5mg, 3.38 x 10 ^-6 mole)및 α, α ¹ -비스[N-[2-5.5-디메틸보리난-2-일]벤질]-N-[3-(메타크릴아미드)프로필아미노]-1,4-크실렌(28mg, 3.54 x 10 ^-5 mole)을 800ul의 에틸렌 글리콜 모노머 용액 및 40ul의 5% wt. 수성 암모늄 퍼셀페이트와 조합했다. 이 제형을 유리 현미경 슬라이드 및 100 마이크론 스테인레스 스틸 스페이서로 제작된 몰드와 함께 질소로 퍼지된 글러브 박스에 위치시켰다. 모노머 용액에 N, N, N ¹ , N ¹ 테트라메틸에틸렌디아민 (40ul, 5% wt.)의 수성용액을 첨가하여 중합을 가속시키고 최종제형을 유리몰드에 부었다. 몰드를 16시간 동안 질소분위기하에 방치한 후 PBS(pH=7.4)에 침지시키고 유리 슬라이드를 분리하여 박막형태의 하이드로겔 폴리머를 생산했다. 이 하이드로겔 박막을 1mM 라우릴 셀페이트 소듐염을 함유하는, 100mL 의 포스페이트 완충염으로 세척했는데 용액을 매일 교환했으며, 이어서 MeOH/PBS(20/80 부피, 3 x 100ml), 마지막으로 PBS(pH=7.4, 3 x 100mL)로 세척했다. 하이드로겔 폴리머를 0.2% wt. 소듐 아지드 및 1mM EDTA 소듐염 함유 PBS(10mM PBS, pH = 7.4에 저장했다.

F. 글루코오스 및 락테이트로의 흡수도 조절

글루코오스 및 락테이트에 의한, 본 실시예에서 제조된 지시제 하이드로겔(두개의 인식요소를 함유하는)의 흡수도 조절을 측정했다. 아크릴아미드 겔을 실시예 5에 기술된 바와 같이 PMMA 셀에 설치하였다. 소정량의 글루코오스 또는 소듐락테이트를 함유하는 포스페이트 완충염(PBS), pH=7.4를 수조에서 37℃ 에서 15분동안 평형화시켰다. 각 글루코오스 또는 락테이트 농도에 대한 흡수도 측정을 세번씩 수행했다. 각 측정에서, 650nm에서의 흡수도는 블랭크로서 사용되었고 A(650nm)를 A(450nm)와 A(530nm)의 모든값으로 부터 뺐다.

도 7은 글루코오스가 있거나 없는 상태에서 4mM Alizarin Red S 모노머(1:1000 몰 비의 Alizarin Red : 아크릴아미드)및 44mM 비스 보론산 모노머를 함유하는 아크릴아미드 겔 (30%)에 대한 흡수스펙트럼을 도시한 것이다. 도 8은 4mM Alizarin Red S 모노머와 44mM 비스 보론산 모노머를 함유하는 아크릴아미드 겔(30%)의 흡수도에 대한 글루코오스의 영향을 도시한 것이다. 도 9는 4mM Alizarin Red S 모노머와 44mM 비스 보론산 모노머(1 : 95 몰비의 보론산 모노머 : 아크릴아미드)를 함유하는 아크릴아미드 겔(30%)의 흡수도에 대한 소듐 락테이트의 영향을 도시한 것이다. 지시제의 흡수도는 글루코오스의 존재에 의해 영향을 받지만 락테이트의 존재에 의해서는 실질적으로 영향을 받지 않았다.