유체중 칼륨이온의 측정

[발명의 명칭]

유체중 칼륨이온의 측정

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 생물학적 및 비생물학적 유체중에서, 이하에서 검체라고도 불리는, 이온을 측정하기 위한 약제 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 민감한 효소의 활성을 자극하거나 또는 억제하기 위한 여러검체의 능력에 근거하고 있다. 이 검체는 양이온 또는 음이온, 금속성 또는 비금속성, 단순물 또는 혼합물일 수 있다. 실제로 적절한 분석지시효소의 감도범위 밖의 농도로, 또는 효소가 또한 그에 대해 민감한 다른 이온의 존재에 의해 방해가 유발되는 농도로 검체가 시료중에 존재한다는 것이 종종 발견된다. 본 발명은 이들 문제를 여러가지로 해결하기 위한 것이다.

임상 생화학에 있어서 혈청전해질의 측정은 병원에서 수행되는 가장 통상적인 분석시험이다. 이런 측정들은 일상적인 조사 뿐만아니라 분석속도가 필수적으로 요구되는 생명이 위급한 상황 및 비상시에도 자주 요청된다. 병원에서 주요 지연원인중의 하나는 병실에서 진단실험실로 표본을 운반하는 것이기 때문에, 침대-근처에서 용이하게 수행되는 방법이 위급한 상황시에 특히 가치를 발휘하게 될 것이다.

임상 생화학 실시에서 칼륨과 나트륨을 분석하는 통상적인 방법은 염광 광도법(flame photometry)이다. 이 방법은, 원자가 열에 의해 여기되었을때 흥분되어 바닥상태로 돌아올때에는 특색파장의 광을 방출한다는 원리에 따르는 것이다. 원자에 의해 유발되는 방사에너지의 특성파장의 세기는 불꽃중에서 흥분된 원자의 수에 비례하는데, 이는 시료중의 관심물질의 농도에 비례한다. 여기에서 요구되는 장치는 복잡하며 상대적으로 값이 비싸고 연소성 기체를 사용하여야 한다.

특히 나트륨, 칼륨 및 염화물에 대한 다른 방법은 이온-선택성 전극을 사용하는 것이다. 이상적으로 각 전극은, 전극이 단지 하나의 이온에 대해서만 반응하는 독특한 이온-선택성을 가지게 된다. 실제로 이것은 가능하지 못하며, 모든 이온-선택성 전극에 방해하는 이온이 존재한다. 더우기, 이온-특유전극은 일반적으로 보정은 가능하지만 절대적으로 특유한 것은 아니다. 전극은 특유 이온의 존재시에 생긴 전위차를 측정한다. 이 기구는 상대적으로 값이 비싸다. 이 방법은 분광적으로 수행될 수 없을 뿐만아니라 그럼으로써 이온측정을 위한 임상적 필요성은, 일차적으로 분광적 검정을 위해 고안된 상업적으로 입수가능한 임상분석기의 복잡성을 실제로 증가시키게 된다. 두가지 방법의 성공적인 수행에는 상당한 정도의 기술과 지식이 요구된다.

유사하게, 전기량법(coulometric method)에 의한 염화물의 일반적인 측정은 특별한 기계사용을 필요로 한다. 이 적정 과정의 종말점은 불용성 염화은 생성물 형성의 전기흐름증가의 완료에 의해서 탐지된다. 그렇지 않다면, 전위차 측정을 사용할 수 있는데 이것도 매우 시간을 필요로하며 부가적인 기계사용을 요구한다.

더우기 염화물의 경우에, 예를들면 다음과 같은 광도측정 및 적정방법이 있다 :

-디페닐카바존 착물을 통한 유리 Hg ²⁺ 이온의 적정측정

-HgCl ₂ 의 침전 다음 수은 착물의 분해시에 형성된, 철의 로단화 착물의 비색측정(Skeggs, Clin.Chem. 10, 1964, 918f. ; Schmidt, Zentralblatt Pharm. 124(9), 1985, 527f).

-각각의 수은염으로부터 클로랄산(Chloranilic acid)의 비색측정(Renschler).

-무색의 수은염으로부터 디에틸-디티오카밤산의 착색된 Cu ²⁺ 착물의 측정(독일공개공보 2137146).

-수은착물의 분해시에 착색된 금속착물의 형성에 유사하게 근거한 보다 통상적인 TRTZ-방법(tripyridile-s-triazine)(R.Fried, Zeitschr. Klin. Chem., Klin. Bioch.10, 1972, 280f ; DOS 215 3387).

이들 방법의 주요결점은 독성이 강한 물질을 함유하는 용액을 사용해야 한다는 것이다. 몇몇 방법은 복잡하며 조정커브(calibration curve)는 직선이 아니며(예를들면 로단화물 방법), 더우기 이들 방법중 몇몇은 시료의 단백질 함유에 의해 유발되는 방해를 제거하기위해 사전처리를 필요로 한다.

개선된 TPTZ-방법이 Wo. 83/002670에 개시되어 있지만, 독성의 수은 화합물을 사용해야 한다는 단점은 여전히 가지고 있다. 수은이온을 사용하지 않는 비색방법은 과염소산용액중에서 Fe(Ⅲ)의 헥사클로로 착물을 측정하는 것이다(F.Hoppe., Ther.Ggw.110(4), 1971, 554f ; H.Mahner, Zeitschr. Klin. Chem., Klin. Biochem. 11(11), 1973, 45f ; WT Law, Clin. Chem.26(13) 1980, 1874f. ; US-4278440). 이 방법에 대한 강한 제한은 부식성의 강한 산성약제를 사용하는 것이며 그러므로 기계적인 피펫계와 함께 사용될 수 없다는 것이다. 또다른 단점은 시료중에 있는 빌리루분에 의한 방해이다.

칼슘은 임상실험실에서 통상적으로 측정되는 전해질의 또다른 예이다. 체액중에서의 이 금속이온의 농도는 좁은 범위내에서 조절된다. 병적으로 높거나 낮은 농도는 신장부전, 췌장염, 테타니 및 울형성심장마비와 같은 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있다.

칼슘을 측정하기위한 최초의 방법중 하나는 Tisdall에 의해 설명된 것(J.Biol.Chem 63, 461-465, 1925)으로 여기에서 칼슘은 옥살산에 의해 침전되고 그 다음에 비색측정에 의해 평가된다. 이 방법은 원심분리단계를 포함하며 그러므로 매우 시간이 소비된다 ; 이것은 칼슘에 대해서 특유한 것이 아니며 시료의 조작에 주의가 요망되기 때문이다. 이 방법은 적정 및 직접적인 비색방법으로 여러 실험실에서 사용되고 있으나 전자는 복잡하고 귀찮은 과정을 포함하는 단점을 가지며 많은 부피의 시료를 필요로 한다. 후자의 방법에서 칼슘은, 예를들면 광도측정계에서 측정될 수 있는 오르토크레졸프텔레인 콜플렉손(orthocresolphthalein complexone)과 같은 염료의 색깔에 영향을 끼친다. 이 방법의 단순함은 임상실험실에서의 자동화를 제공해준다. 하지만 이 방법도, 강한 알칼리용액 및 독성물질을 사용하는 것을 포함하고 있다. 특히 이것은 지질, 단백질, 인산염 및 빌리루빈과 같은 다수의 혈청 성분에 의해 방해를 받는 경향이 있으며 그결과 원자흡수 및 염광광도 측정의 표준방법과 잘 맞지 않는다. 비색방법의 또다른 단점은 보정커브가 직선이 아니며 색깔이 온도에 의해 좌우된다는 것이다.

(WH Outlaw and OHLowry, Analytical Biochemistry 92, 370-374(1979)에는 조직중에서 칼륨이온을 측정하기위한 효소-조정분석방법이 설명되어 있다. 이 방법은 토끼근육으로부터 나오는 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 사용하여, 이것은 칼륨이온 및 나트륨이온에 의해 활성화되는데, 전자가 약 5배 정도 더 영향력이 강하다. 이 비-특이성 때문에 이 방법은 칼륨이온이 우세한 양이온인 식물질에는 적절할 수 있지만, 30배 초과되는 나트륨이온을 포함하는 혈청과 같은 체액에서의 측정에 부적합하다. 그러므로 나트륨이온을 플라즈마 또는 혈청중의 칼륨을 측정하기 위해 Lowry등에 의해 설명된 효소적 광도측정기법을 사용할때 수용하지 못할 방해를 유발한다. 또다른 문제는 암모늄이온이 칼륨이온에 유사한 활성을 제공한다는 것이다. 상기한 출판물의 방법은 혈청과 같은 생체액중에 있는 칼륨이온의 분석과 관련된 이들의 중요한 문제를 해결해 주지도 못하며, 나트륨이온을 측정하기 위한 어떤 방법도 제시하지 못하고 있다.

그러므로 본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결할 수 있는 방법과 시약을 제공하는 것이다. 본 발명은 이 문제들을 효소활성에 대한 이온의 영향을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 유체중의 이온(검체)를 측정함으로써 해결한다.

본 발명의 주요한 일면은, 특히, 체액의 희석이 불가능할때 분석효소에 대한 최적범위내에서 검체의 자유농도를 유발하는 선택성 결합제를 사용하는 것이다. 본 발명의 부가적인 요소는 검체에 대한 효소의 감도를 감소시키기 위하여 해당분석효소에 대해 경쟁적인 억제제를 사용하는 것인데, 이에 의해 더 높은 농도에서 검체의 측정이 가능해진다. 이는 특히 예를들어 선택성 결합제가 용이하게 입수될 수 없거나 또는 비쌀 경우에 특히 유용하다.

본 발명의 또다른 일면은 방해가 무시될 정도의 수준으로 방해이온의 자유농도를 감소시키기 위하여 선택성 결합제를 사용한다는 것이다. 또 억제제는 검체보다 더욱 효과적으로 방해이온과 경쟁하며, 이에 의해 방해이온과 비교하여 검체에 대한 효소의 감도를 증가시키기 위해 사용된다.

중요한 것은 검체의 효소의 활성에 대한 작용이 방해이온의 그것보다 더 크도록 적당한 이소엔자임(isoenzyme)의 선택을 포함하며, 적당한 반응조건을 선택하는 것이다. 더우기, 분석효소의 활성에 대한 검체 및 방해이온의 작용은 합으로 나타나므로 만약 방해이온의 농도가 알려진다면, 검체의 농도가 용이하게 구별에 의해 측정될 수 있다. 방해이온의 방해가 분석중인 체액에서 상대적으로 일정한 농도에서 일어나는 경우에, 적당한 농도의 방해이온을 표준(보정)용액에 포함시킬 수 있다. 이런 검체를 분석하기 위한 또다른 방법은 검체가 결합제로부터 다른 이온을 교체시키게 되고, 결합제로부터 분리된 이 이탈된 이온의 적당한 효소의 활성에 대한 효과를 측정하는 간접적인 분석방법을 사용하는 것이다.

이들 일반원칙은 플라즈마 또는 혈청중의 칼륨, 나트륨, 칼슘, 염소 및 중탄산 이온을 측정하는데에 이들을 적용하는 방법을 나타냄으로써 상세히 매우 잘 예시되어 있다. 하지만, 이들은 넓은 이온영역, 예를들면 마그네슘, 리튬, 납, 아연, 구리, 철, 또는 기타 중금속과 같은 양이온에 적용될 수 있다. 특정될 수 있는 비-금속이온의 예는 수소이온 또는 암모늄이다. 암모늄을 발생시키는 우레아와 같은 물질도 또한 측정될 수 있다.

[적합한 효소]

사용될 수 있는 적합한 효소는 예컨대 다음과 같다(HJEvans등, Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47, 1966) ;

인을 함유하는 그룹을 전이하는 트랜스퍼라아제와 같은 트랜스퍼라이제(Transferase). 이런 트랜스퍼라이제는 피루베이트 키나아제일 수 있다. 피루베이트 키나아제 대신에 마그네슘이온 또는 망간이온에 민감한 아데닐레이트 키나아제(adenylate kinase) 또는 헥소키나아제(hexominase)와 같은 다른 키나아제가 사용될 수 있다. 다른 트랜스퍼라아제는 아세테이트 키나아제(acetate kinase)(E.coil로부터)이다. 다른 예는 아연이온에 민감한 뇌에서 유발되는 피리독살 키나아제(pyridoxal kinase)이다.

글리코시다아제(glycosidase)와 같은 하이드롤라아제(Hydrolases), 예를들면 α-또는 β-D-갈락토시다아제(E.coil로부터), 카복시펩티다아제 A(소 췌장으로부터), 콜라게나아제(클로스트리듐 히스톨리쿰으로부터), 아밀라아제(타액 또는 췌장으로부터) 또는 포스포글리콜레이트 포스파타아제.

또한 시스테인 또는 티올 의존성 프로테인아제와 같은 펩타이드 하이드롤라이제로서, 이들의 특이 예는(J.Biol.Chem.259, 12489-12494. (1984))에서 Sasaki등에 의해 설명된 칼파인(Calpain) Ⅰ 및 Ⅱ(또한 칼슘 활성화된 중성 프로테아제라고 불림)이다. 후자의 효소는 쥐의 간 및 신장, 인간 및 돼지의 적혈구, 소의 뇌, 그리고 토끼의 골근으로부터, (J.Biochem, 95, 1759-1766(1984))에 A.Kitahara등의 방법에 따라 분리 및 정제될 수 있다. 또다른 예는 디펩티닐 아미노펩티다아제 Ⅰ(EC3.4.14.1. 카텝신 C), (J.Ken Mc Donald, Bioch.Biopys.Res.Communication 24(5), 66, 77f). 또다른 효소원으로 유전자 재조합 기법에 의해 얻어지는 단백질이 있다.

글리세롤 디하이드로게나아제(효모로부터) 또는 티로시나아제(카테콜 옥시다아제)와 같은 옥시도리덕타아제(Oxidoreductatse).

알돌라아제(효모로부터) 또는 카본산 안하이드라아제(소의 적혈구로부터)와 같은 리아제(Lyase).

다른 적절한 효소는 친할로겐 미생물에서 나온 여러 효소이다. 다른 효소원으로는 유전자 재조합 기법에 의해 얻어지는 단백질이 있다.

선택성 결합제 : 여러가지 결합제들이 검체 또는 방해이온의 결합을 위해 유용하다. 이런 결합 또는 차폐물질은 크립탄드(cryptand), 코로난드(coronand), 크라운 에테르(crown ether), 포단드(podand), 스페란드(spherand), 헤미스페란드(hemispherand), 칼릭사렌(calixaren) 및 이들의 조합물, 천연에 존재하는 이오노포어(inonophore), 예를들면 항생제, 발리노마이신(valinomycin)과 같은 시클릭 펩타이드, 콜플렉손(complexone) 및 킬레이팅제, 예를들면 이미노디아세트산, EDTA, 니트로트리아세트산 및 이들의 유도체이다. 이런 화합물들은 (Kontakte(Merck), 1977, No. 1, p. 11. ff) and p,29 ff ; Kontakte(Merck), 1977, No.2, p. 16 ff ; ) ; (Konakte(Merck), 1977, No. 3, p. 36 ff) ; (Phase Transfer Catalysts, Properties and Applications(Merck-Schuchardt)1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction) ; (RMIzatt등, Chemical Reviews 85, 271-339(1985)) ; (Data for Biochemical Research, 1986, RMC Dawson등, Eds., 제3판, 399-415(Clarendon Prss)옥스포드) ; (F.Vogtle 등, Chem.Macrocycles, Springer Verlag, 뉴욕, 1985) ; (GWGokel등, Eds., Macrocycles Polyether Synthesis, Springer Verlag, 뉴욕, 1982) ; (JMLehn등, J.Am.Chem, Soc.97, 6700-6707(1975) ; (G.Schwarzenbach등, Helv.Chim.Acta 28, 828(1945)) ; (SFAKettle, Koordinationsverbindungen, Taschentext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr.1972) ; (AEMartell등, Die Chemie der Metallcheatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr.1958) ; (M.Becke-Geohring등, Komplexchemie, Springer Verlag, 1970) ; (F.Kober, Grundlager der Komplexchemie, Otto Salle Verlag, Frankfurt/Main 1979) ; (G.Schwarzenbach등, Helv.Chem.Acta 31, 1029(1949)) ; (RGPearson등, Science 151, 172(1966))에 기술되어 있다.

다가이온, 특히 이가 양이온을 결합할 수 있는 킬레이트제의 예는 에틸렌글리콜-비스-(2-아미노에틸에테르)-N,N,N′,N′-테트라아세트산(EGTA로 불림) 및 (에틸렌디니트릴로) 테트라아세트산(EDTA)이다.

예컨대 EDTA 및 이들의 유도체와 같은 다가이온을 결합할 수 있는 결합제는 많이 존재하는 반면에, 일가이온을 결합할 수 있는 시약은 덜 일반적이다. 테트라페닐보론은 칼륨이온을 결합한다. 하지만 더 광범위한 가능성을 가지는 한 그룹의 화합물은 크립탄드로서 이것은 수용액중에서 일가 양이온을 선택적으로 결합할 수 있는 시약의 예이다(RMIzatt등 Chem.Reviews 85, 271-339). 크립탄드에 대한 특별한 예는 Merck-Schuchardt의 Kryptofix ^R 화합물이다. 예컨대 : 4,7,13,16,21-펜타옥시-1, 10-디아자비시클로(8,8,5-트리코산, Kryptofix ^R 221, 페이지 438, Merck-Schchardt 카탈로그, 1987/88, 번호 810646(K 221. 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1, 10-디아자비시클로(8.8.8)헥사코산, Kryptofix ^R 221, 페이지 438, Merck-Schuchardt 카탈로그, 1987/88, 번호 810647(K 221). 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로(8.8.8)헥사코산, Kryptofix ^R 222, 페이지 438, Merck-Schuchardt 카탈로그, 1987/1988, 번호 810647(K 222)가 있다.

방해하는 음이온을 제거하기 위한 차폐화합물로서 다음과 같은 부류의 물질들이 사용될 수 있다 : 음이온크립탄드, 헤테로시클로판(heterocyclophanes), 카타피난드(catapinands) 및 무기금속착물 또는 불용성염. 이온 착물형성 화합물의 특별한 예는 문헌에 설명되어 있는데, 예를들면 아자모노-또는 아자폴리사이클, 마크로시클릭 4차 테트라헤드론 화합물, 마크로시클릭 비스-금속-착물, 공유결합된 루이스산 센터를 가지는 마크로사이클, 양성화-또는 알킬화된 4차 크립탄드 또는 카타피난드(FP Schmidtchen, Nachrihten Chem. Techn. lab. 36(1), 1988, S. 8f ; E.Grag, J.Amer. Chem. Soc.98(20), 1976, 6403f ; CHPark, J.Amer. Chem. Soc. 90(9), 1986, 243f) 및 예컨대 철의 헥사클로로 착물 또는 질산은이다.

결합제의 기능 : 이들 결합제는 다음과 같은 목적을 위해 사용된다;

1. 방해이온의 선택적 결합.

2. 시료의 희석이 불가능할때 검체의 농도를 최적의 측정수준으로 감소시키는 것.

3. 본 발명의 구현예로, 결합제가 ＂지시＂ 이온과 착물을 형성하며, 이 착물로 부터 지시이온은 검체이온에 의해 정량적으로 교체되고, 효소의 활성에 대한 교체지시이온의 작용을 분석하여, 이에 의해 검체이온의 농도를 간접 측정하는 방법이 있다. 예컨대 이런 방법에서 효소는 피루베이트 키나아제이고, 지시이온은 칼륨이고, 결합제는 Kryptofix ^R 221이며 측정될 이온은 나트륨이거나 ; 또는 효소는 키나아제이고, 지시이온은 Mg ²⁺ 이고, 결합제는 킬레이트제, 예컨대 EDTA이며, 이온은 금속이거나 ; 또는 효소는 피리독살 키나아제이고, 지시이온은 Zn ²⁺ 이고, 결합제는 Kryptofix ^R 221이며, 이온은 중금속이거나 ; 또는 효소는 α-아밀라아제이고, 결합제는 Ag 또는 Hg이며 측정될 이온은 염소이거나 ; 또는 효소는 콜라게나아제이고, 결합제는 EDTA와 같은 킬레이트제이며 측정될 이온은 칼슘이다.

분석용 유체 : 검체의 측정을 실행하는 생물유체는 혈액, 혈청, 플라즈마, 땀, 추출물 또는 뇨이다. 다른 유체의 예는 수도물 또는 음식물의 추출물 또는 과일 또는 포도주와 같은 발효액이다.

칼륨 및 나트륨이온의 측정에 대한 일반원칙의 적용

칼륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 감도에 근거하여, 혈청 또는 플라즈마에 있는 칼륨이온의 측정을 위한 만족스런 방법에 대한 필수요건은 나트륨 또는 암모늄이온에 의해 유발되는 방해를 극복하는 것이다. 본 발명에서 구현된 일반원칙에 따라 이는 하나 이상의 다음 과정에 의해서 성취될 수 있다.

1. 적절한 결합제, 예를들면 Kryptofix ^R 221로 나트륨이온을 선택적으로 결합함.

2. 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearthermophilus) 효소가 근육효소 보다 두배나 큰 나트륨이온에 비해 칼륨이온에 대한 선택성을 가지기 때문에 토끼근육 보다 이 미생물효소를 피루베이트 키나아제로서 선택하는 것.

3. 분석에서 선택적 지시효소의 경쟁적 억제제인 이온의 선택, 예를들면 나트륨 이온 및 칼륨이온과 경쟁시키기 위해 리튬이온을 사용하는 것.

4. 암모늄이온의 효소적 제거.

리튬이온은 칼륨이온에 대해 경쟁제로서 덜 효과적이기 때문에, 전체적인 효과는 나트륨이온과 비교하여 50% 더 칼륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 상대적인 선택성을 증가시키는 것이다. 더우기, 리튬이온의 존재하에서 피루베이트 키나아제의 활성에 대한 칼륨 및 나트륨이온의 효과는 상호-작용적이라기 보다는 합산되어 나타난다. 이것은, 만약 다른 한 이온의 농도가 알려져 있다면 칼륨이나 또는 나트륨이온의 측정이 가능하다는 것이다.

결합제가 없는 상태에서 과정 2와 3을 사용함으로써 칼륨이온 대 나트륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 상대적인 선택성을 100 : 1로 얻는 것이 가능하다. 이것은 110 또는 170밀리올/ℓ의 상당히 비정상적인 나트륨이온 농도에서 조차, 측정된 칼륨이온 농도에서의 오차는 140밀리몰/ℓ(실시예 A)의 정상적인 플라즈마 나트륨이온 농도에 대해서 0.3밀리몰/ℓ를 초과하지 않을 것이라는 것을 의미하는 것이다. 이는 대부분의 임상목적을 위하여 충분히 정확한 것으로 간주되지는 않는다. 하지만, 플라즈마 나트륨이온의 진정한 농도가 알려져 있다면, 칼륨이온의 측정오차를 ±0.05밀리몰/ℓ로 낮추어 정확히 측정하는 것이 가능하다(실시예 B). 만약 과정 1-3이 합쳐지고 결합제, 예를들면 Kryptofix ^R 221이 포함된다면, 나트륨이온과 비교하여 칼륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 상대적인 감도는 ＞500 : 1로 증가될 수 있다. 이러한 상황하에서 플라즈마 칼륨이온 농도를 0.05밀리몰/ℓ이하까지(실시예 C) 측정하기 위하여 나트륨이온 농도를 아는 것은 불필요한 것이다.

칼륨이온 측정을 위한 이들 방법은 방해를 감소시키는 것과 관련한 본 발명에서 구현된 일반원칙을 적용하는 것이 가능하다는 것을 보여주는 것이다. 다른 한편으로 혈청 또는 혈장에서의 나트륨이온의 측정은 효과적인 검체농도를 규정하는데 이들 원칙을 적용하는 것을 가장 잘 예시하고 있다. 본 발명에서 구현된 바와 같은 나트륨이온 측정의 한가지 수단은 나트륨이온에 대해 활성이 높은 효소를 사용하는 것이다. 이런 효소의 예는 β-갈락토시다아제이다(Kudy등, J.Am. Chem. Soc. 75, 890, 1953). 하지만, 이 효소가 가장 감도가 높은 나트륨이온 농도의 범위는 희석단계없이 혈장시료에서 용이하게 얻어질 수 있는것 보다 훨씬 낮다.

시료의 희석이 가능하지 않을 경우에 효과적인 나트륨 이온농도를 최적수준으로 낮추기 위해 본 발명에서 구현된 원칙들을 지키는데에 다음 과정들이 사용된다.

1. Kryptofix ^R 221과 같은 나트륨이온 결합제의 사용.

2. β-갈락토시다아제의 경쟁적 억제제로서 리튬이온을 사용하여, 나트륨이온에 대한 효소의 감도를 감소시킴.

과정 1과 2를 조합하면, β-갈락토시다아제를 사용하여 혈장 또는 혈청중의 나트륨이온의 측정을 용이하게 해주며, 결합제의 양은 110밀리몰/ℓ이하의 나트륨이온 농도에 대한 감응을 최소화하는 반면 통상의 분석범위(110-170밀리몰/ℓ)의 감응을 향상시키기 위해 조절될 수 있다.

칼륨이온에 의한 효소활성의 자극이 감소되고, 칼륨이온-결합제, 예컨대 Kryptofix ^R 222가 반응혼합물에 포함된다면, 피루베이트 키나아제의 의해 나트륨이온도 측정될 수 있다.

혈장나트륨 이온농도를 측정하는 다른 방법으로, 나트륨이온이 Kryptofix ^R 221에서 나오는 칼륨이온을 교체하여 방출된 칼륨이온이 혈정나트륨 이온농도에 비례하여 피루베이트 키나아제의 활성을 자극하는 방법도 있다.

본 발명의 다른 구현은 생물학적 및 비-생물학 체액중의 이온측정을 위한 조성물 및 시약이다.

본 발명에 의한 시약은 용해 또는 건조형일 수 있다. 이것은 적당한 담체상에 주입될 수도 있다. 시험편형의 진단용약제는, 아세톤과 같은 휘발성 용매중의 시험편의 생산에 편리하게 사용되는 필요한 시약 용액으로 담체물질, 바람직하게는 여과지, 셀룰로오스 또는 합성섬유양모에 주입시킴으로써 생산될 수 있다. 이것은 한번 이상의 주입단계로 제조될 수 있다. 완성된 시험종이는 그 자체로서 또는 알려진 방법으로 처리되어 바람직하게는 합성수지와 미세한 메쉬 사이에 봉인되어 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명의 실시예를 보다 상세히 설명하겠다. 그러나 설명된 세부항목의 하나 또는 조합에 본 발명이 국한되지는 않는다는 것을 알 수 있을 것이며, 특히, 이 실시예에서 설명된 것들 외에 기계적인 또는 화학적인 변형이 있을 수 있다.

[칼륨이온의 분석방법에 대한 상세한 설명]

이 부분은 본 발명에서 설명된 원리들을 구현하여 칼륨이온측정에 대한 더욱 상세한 방법을 설명하는 것이다. 칼륨이온을 측정하기 위하여, 체액, 예를들면 혈장을, 아데노신 디포스페이드(ADP), 포스포에톨피루베이트(PEP), 감소된 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드(NADH), 피루베이트 키나아제(PK) 및 락테이트 디하이드로 게나아제(LDH)를 포함하는 완충된 혼합물에서 배양한다. PK 및 LDH에 의해 촉매화된 반응중에, 이 혼합물에서의 피루베이트, 그 다음에 락테이트의 형성은 전적으로 적당한 양이온의 존재에 의해 좌우되는데, 이것이 없는 상태에서 PK는 실제로 불활성이다. NADH는 340nm에서 강하게 흡수하지만, NAD는 그러하지 아니하다.

미생물 PK에 필요한 망간이온을 포함하는 분석을 위해 선택된 조건하에서, NADH 산화물은 칼륨이온의 농도에 비례한다(실시예 AC 참조).

이들 조건하에서 다음 반응이 발생한다 :

(1) PEP + ADP + H ⁺

(2) 피루베이트 + NADH + H ⁺

⁺

반응(1)의 반응율은 계에 존재하는 칼륨이온의 농도에 의해서 결정되며, 이것은 거꾸로 반응(2)의 반응율을 제한한다. 이들 반응율을 측정할 수 있는 몇가지 방법이 있다. 일반적인 방법은 반응(2)에서 NADH의 소실율을 분광 광도적으로 측정하는 것이다. NADH는 340nm에서 강하게 흡수하는 반면에, NAD는 그러하지 아니하다. 따라서, 340nm에서(또는 대체파장에서)반응혼합물의 흡수가 강하다는 것은 반응율을 직접 측정하는 것이되며 이로부터 혼합물중에 존재하는 칼륨이온의 농도가 유출될 수 있다. 그렇지 않으면, 반응(1)과 (2)가 H ⁺ 를 소비하여, 반응혼합물의 양성자 농도를 감소시킨다는 사실을 이용할 수 있다. 양성자 농도의 강하율을 pH 미터, 또는 적정방법에 의해 측정될 수 있다. 후자의 경우에 있어서 사용되는 완충액의 농도는 분광광도기법에서 보다 훨씬 적을 것이다. 피루베이트 키나아제의 활성을 조정하기 위하여 형광미터 또는 발광미터와 같은 다른 장비가 사용될 수 있다.

PK 활성과 관련된 피루베이트의 축적을 찾아내는 많은 다른 방법이 있다. 여기에 소비된 산소 또는 무기 인산염 또는 과산화수소 ; 피루베이트 옥시다아제의 효소적작용에 의해 발생된 이산화탄소 또는 아세틸포스페이트 ; 2,4-디니트로페닐 히드라진과 함께 히드라존의 형성 ; 피루베이트 디카복실라제 또는 피루베이트 디하이드로 게나아제 ; 피루베이트 카복실라아제의 효소적작용의 반응물 또는 생성물의 측정 ; 플라빈 결합된 계의 사용 ; 그리고 기질의 미소농도를 측정하기 위한 동위원소방법(MN Berry등, Analytical Biochem. 118i, 334-352(1981))이 있다.

200개의 혈청시료를 조사함에 있어서 염광광도측정 또는 이온-선택성 전극측정과 다른 방법과의 우수한 일치가 얻어졌다. 이 방법에 있어서의 중요한 방해는 혈청에 일반적으로 존재하는 암모늄이온이다. 암모늄이온 방해의 가능성은 반응혼합물에 α-케토글루타레이트(KG) 및 글루타메이트 디하이드로 게나아제(GDh)를 포함시킴으로써 완전히 피할 수 있다. 암모늄이온은 다음 반응에 따라 사전배양에서 제거된다 :

NH ₄ ⁺ + KG + NADH → 글루타메이트 + NAD ⁺

뇨와 같은 암모늄이온 함량이 높을 수 있는 용액에서는 결합된 반응이 사용될 수 있다 :

NH ₇ KG + NADPH → 글루타메이트 + NADP

글루코스-6-P +NADP → 6-포스포글루코네이트 + NADPH

이 결합된 방법은 글루코스-6-포스페이트 디하이드로 게나아제를 사용한다. 가해진 글루코스-6-P- 및 -KG가 존재하는 어떤 암모늄이온보다 초과된다면, 시약에 NADH를 보존하는중에 모든 암모늄이온이 제거될 것이다.

10Uℓ의 혈장 또는 혈청을 사용하여 37℃에서 칼륨이온을 효소적으로 측정하기위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :

칼륨이온에 대해 감도가 높은 다른 예로는 글리세롤디히드로 게나아제가 있다(ECCLin등, B 235, 1820, 1960). 글리세롤 디하이드로 게나아제를 사용하여 37℃에서 칼륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 농도범위는 다음과 같다 :

칼륨이온에 대해 감도가 높은 또다른 예로는 아세트알데히드 디하이드로 게나아제가 있다(S. Black, Arch. Biochem. Biophys. 34, 86. 1951). 아세트알데히드 디하이드로 게나아제를 사용하여 37℃에서 칼륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :

아세트알데히드(0.02밀리몰/ℓ내지 1밀리몰/ℓ)는 글리콜알데히드로 치환될 수 있다.

아세트알데히드 디하이드로 게나아제는 또는 에스터라아제 활성을 나타내므로 칼륨 이온농도는 4-니트로페닐아세테이트로부터 4-니트로페놀의 이탈을 조사함으로써 측정될 수 있다. 아세트알데히드 디하이드로게나아제의 에스터라아제 활성에 근거하여 37℃에서 칼륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다.

[실시예 A]

나트륨 이온농도는 알려지지 않고, 나트륨이온-결합제 없이 피루베이트 키나아제를 사용하여 칼륨 이온농도의 측정

최종 배양혼합물은 다음을 함유한다 :

칼륨이온표준(보정)용액은 혈장중에 존재하는 나트륨이온의 피루베이트 키나아제에 대한 작용효과를 보상하기 위하여 140밀리몰/ℓ의 나트륨이온을 포함한다.

[실시예 B]

나트륨 이온농도는 알려져 있고, 나트륨이온-결합제 없이 피루베이트 키나아제를 사용하여 칼륨 이온농도의 측정

배양혼합물과 보정용액은 실시예 A와 동일하다.

보정은 나트륨 이온농도가 140밀리몰/ℓ이하(또는 이상)인 매 10밀리몰/ℓ에 0.1밀리몰/ℓ의 칼륨을 가함으로써(또는 뺌으로써) 혼합물의 나트륨 이온농도에 대해 행해질 수 있다. 하지만, 이 보정은 알려진 나트륨 및 칼륨농도를 포함하는 수용액을 분석함으로써 증명되어야 한다.

[실시예 C]

나트륨이온-결합제 존재하에서 피루베이트 키나아제를 사용한 칼륨 이온농도의 측정

인간의 혈청알부민을 생략하고 매질에 부가적으로 분석당 6마이크로몰의 Kryptofix ^R 221을 포함시킨 것을 제외하고는 실시예 B와 같다. 각 표본의 칼륨이온함량을 변경함으로써 기인하는 Kryptofix ^R 221로부터 나트륨이온의 대체시의 변화를 최소화하기 위해 pH 7.8을 선택한다.

[실시예 D]

β-D-갈락토시다아제를 사용한 나트륨 이온농도의 측정

변형 a : 최종 배양혼합물은 다음을 포함한다 :

유리된 2-니트로페놀의 형성율을 측정함으로써 최초의 시료중에 있는 나트륨 이온농도를 결정하기 위하여 이 반응을 420nm(또는 근처)파장에서 관찰했다.

변형 b : 변형 a와 비교되는 다른 접근방법은 사전희석에 의해 시료농도를 10배로 감소하거나 또는 소량의 시료부피를 사용하는 것인데, 이 경우에는 크립탄드를 생략할 수 있다.

변형 c : 낮은 나트륨 이온함량(예컨대 ＜20밀리몰/ℓ)의 유체중에서의 측정으로 이 경우 크립탄드를 생략할 수 있다.

[실시예 E]

동일한 큐벳중의 칼륨이온과 나트륨 이온농도의 측정(트윈-테스트)

분석에서 다음을 함유한 이외에 실시예 D와 같이 나트륨 이온농도를 분석한다 :

반응율에 대한 측정에 의해 나트륨이온의 측정후에, 배양혼합물의 pH를 염산일정량으로 pH 7.4로 낮춘다.

그 다음에 지시된 최종농도를 얻기 위하여 다음 성분을 가한다 :

그 다음에 반응율은 340nm에서 조정할 수 있지만 나트륨이온 지시반응에서 유리된 2-니트로페놀에 의해서 가능한 방해를 최소화하기 위해 약간 더 높은 파장에서 측정될 수도 있다.