카드뮴 나노클러스터 형성에 따른 형광세기를 이용한 카드뮴의 검출방법 및 카드뮴 검출키트

카드뮴 나노클러스터 형성에 따른 형광세기를 이용한 카드뮴의 검출방법 및 카드뮴 검출키트{Method and Kit for detection of cadmium(Cd2+) using Fluorescent cadimium nanoclusters(Cd NCs)}

본 발명은 알부민 및 환원제를 이용하여 카드뮴 이온과 고감도로 결합하여 카드뮴 나노클러스터를 형성함으로써, 다양한 시료로부터 손쉽게 카드뮴을 정량적 및 정성적으로 검출할 수 있는 카드뮴의 검출방법 및 카드뮴 검출키트에 관한 것이다.

일반적으로 카드뮴은 물, 흙 또는 공기와 같은 환경에 노출되면 우리 몸속의 간, 신장, 폐 같은 다양한 기관에 축적되어, 골절, 고혈압, 신장 기능장애, 암과 같은 심각한 병을 유발한다. 이러한 이유로 세계보건기구 (WHO), 미국환경보호청 (US EPA) 에서는 3 ppb ~ 5 ppb 정도를 허용 범위로 제한하고 있다. 이렇게 카드뮴은 적은 양의 농도만 노출되어도 심각한 병을 야기하므로 인간의 건강한 삶을 위해 검출되는 것이 중요하다.

따라서 환경적 및 생물학적으로 적용가능한, 카드뮴의 정량적 검출방법의 개발이 매우 중요하다. 현재까지 카드뮴 검출을 위한 방법으로는 우선 선택성 있는 분석시약을 이용한 금속이온 검출 방법이 사용되어 오다가, 특정 금속이온을 검출하는 광화학적 화학센서의 발명과 합성에 많은 연구 개발이 이루어졌다. 이를 비롯하여 불꽃과 전열에 의한 원자 흡수 분광학(cold vapour atomic absorption spectrometry), 자외선 및 가시광선 분광법(UV-visible spectrophotometry), X-선 흡수 분광법(X-ray absorption spectroscopy) 및 유도적 연결된 플라즈마 방출 분광학 방법 등이 있는데, 이러한 기기 화학적 방법은 고가의 장비를 사용하기 때문에 비용이 많이 들고, 공정이 복잡하고 시간이 오래걸리기 때문에 전문가가 아니면 활용이 용이하지 않다는 단점이 있다.

상기 단점을 해결하기 위한 대안으로 특이성이 높고, 측정비용이 저렴하며, 다루기 쉽고 이동 가능한 검출방법의 개발이 요구되고 있다. 일예로 전기화학, 전기량, 전위차, 형광성, 비색적 방법 등을 이용한 검출 방법(특허문헌 1.)이 발명되었는데, 비교적 빠르고 간단하며 값싸게 검출은 가능하지만, 감도가 낮고, 균질한 상태에서는 측정이 어렵기 때문에, 세척과 같은 추가과정이 요구되므로 여전히 공정이 복잡하고 시간이 오래 걸린다는 한계가 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 다음과 같다.

종래의 값비싸고, 많은 시간이 소모되는 다양한 카드뮴 검출방법 대신 알부민 및 환원제를 포함하는 검출 조성물을 이용하여 쉽고 빠르며, 저렴하면서도, 우수한 감도로 카드뮴을 검출할 수 있도록 하는 것이다.

이를 위해 가격이 저렴한 알부민 및 환원제를 검출 조성물로 하고, 상기 알부민이 카드뮴과 반응하여 형광 특성을 갖는 카드뮴 나노클러스터가 합성되므로, 상기 합성된 카드뮴 나노클러스터의 형광특성을 이용함으로써 시료 내 카드뮴을 정량적 또는 정성적으로 검출할 수 있음을 발견하여 본원을 완성하였다.

본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, Ⅰ) 알부민 및 환원제를 포함하는 검출조성물과 카드뮴이 함유된 시료를 혼합하고, 반응시켜 카드뮴 나노클러스터를 수득하는 단계; 및 Ⅱ) 상기 카드뮴 나노클러스터에 자외선을 조사하고, 형광 스펙트럼을 얻는 단계;를 포함하는 카드뮴의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 알부민 및 환원제를 포함하는 카드뮴 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 상기 카드뮴 검출용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 카드뮴 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 카드뮴 검출방법은 형광 세기 변화를 측정할 수 있는 카드뮴 나노클러스터의 합성을 유도하는 알부민 및 환원제를 시료에 순차적으로 첨가함으로써, 쉽고 빠르며 간단하게 카드뮴을 정량 및 정성적으로 측정할 수 있다.

아울러, 상기 카드뮴 검출방법에 사용되는 알부민과 환원제는 저렴함에도 불구하고 감도가 우수하기 때문에 시료 내에 존재하는 카드뮴의 농도를 직접적으로 측정할 수 있다는 효과를 달성할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 검출조성물을 이용하여 카드뮴을 검출하는 전반적인 과정을 나타낸 개략도로, 도 1A는 본 발명에 따른 검출조성물과 카드뮴을 함유하고 있지 않은 시료를 혼합한 것이고, 도 1B는 본 발명에 따른 검출 조성물과 카드뮴을 함유하고 있는 시료를 혼합한 것이다.
도 2는 실시예 1 내지 6의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 분석한 도표이다.
도 3은 실시예 7 내지 12의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 분석한 도표이다.
도 4는 비교예 1 내지 6의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 분석한 도표이다.
도 5는 카드뮴 이온의 농도별 시료에 대한 사람 혈청 알부민 및 환원제를 이용하여 카드뮴 검출 여부를 확인한 것으로, 검출 시간, 온도 및 환원제 농도를 최적화하기 전인 12 h, 37 ℃, 1 M NaOH 조건 하에서 실시예 13 내지 20의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 분석한 그래프이다. 내삽된 이미지는 상기 카드뮴 이온의 농도별 시료에 사람 혈청 알부민 및 환원제를 첨가하여 형광강도를 촬영한 이미지이다.
도 6은 실시예 6의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 다양한 온도 하에서 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 분석한 도표이다.
도 7은 실시예 21 내지 27의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 분석한 도표이다.
도 8은 본 발명의 검출 조건 중에서 온도를 55 ℃에서 37 ℃로 한 것을 제외하고는 모두 최적화된 검출 조건에서 수행하여 각각의 결과를 비교한 그래프이다.
도 9는 모두 최적화된 검출 조건에서 다양한 농도의 카드뮴 이온을 포함하는 시료로부터 카드뮴을 검출한 그래프이다. 내삽된 이미지는 상기 카드뮴 이온의 농도별 시료에 사람 혈청 알부민 및 환원제를 첨가하여 형광강도를 촬영한 이미지이다.
도 10A는 카드뮴 이온이 존재하는 시료와 존재하지 않는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액과 대조군을 에너지 분산 엑스선 분광학(energy-disperive X-ray spectroscopy, 제조사: JEOL(Japan), 모델명: JEM-2100F)로 분석한 결과를 나타낸 표이다
도 10B는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액을 투과전자현미경(transmission electron microscopy, 제조사: JEOL(Japan), 모델명: JEM-2100F)으로 촬영한 사진이다.
도 10C는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액을 동적광산란법(dynamic light scattering, 제조사: Otsuka electronic(Japan), 모델명: ELS-Z)으로 측정 하여 나타낸 그래프이다.
도 10D는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액을 형광 방출 스펙트럼(fluorescence emission spcetra, 제조사: Mannedorf(Switzerland), 모델명: TECAN)으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 카드뮴 이온 농도에 따라, 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액에 형성된 카드뮴 나노클러스터에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 서로 다른 카드뮴 이온 농도를 갖는 시료를 이용한 점을 제외하고는 시험예 8의 검출 과정과 모두 동일하게 얻은 반응이 종료된 검출액을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 카드뮴 이온 농도에 따라, 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액에 형성된 카드뮴 나노클러스터에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 서로 다른 카드뮴 이온 농도를 갖는 시료를 이용한 점을 제외하고는 시험예 8의 검출 과정과 모두 동일하게 얻은 반응이 종료된 검출액을 말디토프 질량분석기(MALDI-TOF MS, 제조사: ASTA (KOREA))로 측정한 결과 그래프이다.
도 13은 수돗물(A), 분수대물(B), 연못물(C)과 같은 실제 시료로부터 최적화된 조건하에서 본 발명의 카드뮴 검출 방법을 수행한 후의 시료에서 형광 이미지를 얻고 이의 형광세기를 분석(도 10D를 제외한 모든 그래프의 형광세기 및 이미지는 ChemiDoc system(Bio-rad)를 사용하였음)하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 카드뮴 이온에 대한 본 발명의 카드뮴 검출 방법의 특이성을 확인하기 위한 것으로, 사람 혈청 알부민 및 환원제를 이용하여 카드뮴을 검출할 때, 금속 이온을 포함하는 다양한 시료에 본 발명의 카드뮴 검출 방법을 수행하고, 이의 형광세기를 분석한 그래프이다. 도 14A는 ChemiDoc system(Bio-rad)을 이용하여 측정된 형광 이미지를 분석하여 얻은 그래프이고, 도 14B는 추가적으로 카드뮴 이온 (Cd ²⁺ ) 보다는 형광세기가 약하지만 어느 정도 형광을 보이는 금 이온(Au ³⁺ ), 크로뮴 이온(Cr ^{3 +} ), 구리 이온(Cu ^{2 +} )에 대해 TECAN을 이용하여 찍은 형광 스펙트럼 그래프이다.
도 15는 본 발명에 따른 카드뮴 검출용 키트의 일 구현예에 대한 모식도이다.
도 16은 본 발명에 따른 카드뮴 검출용 키트의 다른 구현예에 대한 모식도이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명은 알부민과 카드뮴의 반응을 통해 카드뮴 나노클러스터를 형성하고, 상기 카드뮴 나노클러스터가 형광을 띈다는 특성을 이용함으로써, 고감도의 카드뮴 이온에 대해 선택적이며, 쉽고 빠르고 저렴한 카드뮴 검출방법을 발명하였다.

일반적으로 금속 나노클러스터는 금속 원자들이 수 나노미터의 크기를 형성하며 뭉쳐있는 것으로, 클러스터의 크기에 따라 광학적, 촉매적, 자기적 측정 방법을 이용할 수 있다. 금속 나노클러스터 형성하는 방법에는 역미셀 합성 방법, 극성 유기 용매에서 금속염의 환원을 이용하여 리간드로 안정화된 클러스터를 형성 방법, 열적으로 불안정한 금속 유기 선구물질을 분해하여 비수용액에서 합성하는 방법 등이 있다. 이러한 방법들은 독성이 있고, 비싸며 환경적으로 좋지 않다.

이에 반해 본 발명은 알부민 및 환원제를 이용한 검출 방법을 통해, 시료 내에 존재하는 카드뮴과 알부민의 반응에 의해 카드뮴 나노클러스터를 형성하는 것을 이용한 새로운 카드뮴의 검출방법으로 상술한 종래기술에 비해 검출시간이 빠르고, 간단하며, 저렴하다.

게다가, 본 발명의 카드뮴 검출 방법은 시료와 알부민 및 환원제를 포함하는 검출 조성물을 혼합한 후, 검출 시간이 소요된 뒤 별도의 분리 및 세척 과정을 거치지 않고, 그 상태 그대로 카드뮴의 검출 및 분석이 가능하므로, 검출 과정이 매우 간단하고 편리하다.

본 발명의 일 측면은 아래 단계를 포함하는 카드뮴의 검출방법에 관한 것이다.

Ⅰ) 알부민 및 환원제를 포함하는 검출조성물과 카드뮴이 함유된 시료를 혼합하고, 반응시켜 카드뮴 나노클러스터를 수득하는 단계; 및

Ⅱ) 상기 카드뮴 나노클러스터에 자외선을 조사하고, 형광 스펙트럼을 얻는 단계

우선, Ⅰ) 알부민 및 환원제를 포함하는 검출조성물과 카드뮴이 함유된 시료를 혼합하고, 반응시켜 카드뮴 나노클러스터를 수득한다.

이때, 상기 환원제는 알부민과 동시에 시료액에 혼합하거나, 알부민을 시료액에 먼저 혼합한 후, 약 1 내지 10 분 후 혼합할 수 있다. 알부민과 환원제를 동시에 시료액에 혼합하는 경우와 알부민을 시료액에 먼저 혼합한 후 환원제를 혼합하는 두 경우 모두 카드뮴 나노클러스터의 합성 및 검출에 큰 영향을 주지 않으므로, 상황에 따라 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

상기 알부민은 난 알부민 또는 사람 혈청 알부민 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알부민을 제외한 소 혈청 알부민 등을 사용할 경우, 카드뮴 이온과 반응하여 카드뮴 나노클러스터를 형성하지 않기 때문에, 카드뮴 이온의 존재 여부와 농도를 검출할 수 없다는 문제가 있다.

또한, 상기 알부민은 사람 혈청 알부민인 것이 가장 바람직한데, 난 알부민을 사용하여도 카드뮴과 결합을 통해 카드뮴 클러스터를 형성하지만, 검출 시간이 12 시간이 요구되며, 12 시간 이하의 검출 시간에서는 카드뮴 이온에 대한 감도가 저하되어 검출이 용이하지 않는 단점이 있어, 짧은 검출 시간 내에 카드뮴을 검출하기 위해서는 사람 혈청 알부민을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

반면 상기 소 혈청 알부민은 12 시간 이상의 검출 시간에서, 전혀 카드뮴 나노클러스터를 형성하지 못하므로, 이는 카드뮴 검출에 전혀 용이하지 않다.

상기 환원제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 수산화나트륨 (NaOH), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 포름산 (Formic acid), 소듐 보로하이드라이드 (NaBH ₄ ) 및 옥살산 (Oxalic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 가장 바람직하게는 수산화나트륨일 수 있다.

상기 알부민이 카드뮴 이온과 만나게 되면, 알부민이 카드뮴 이온을 감싸면서 격리시켜(sequester) 빠져나가지 못하게 봉입(entrapping)하여 카드뮴 클러스터를 형성하게 되는데, 이 과정에 있어서, 높은 pH의 환원제를 첨가하면 상기 알부민이 갖고 있는 환원시키는 능력이 활성화되어 내부에 봉입(entrapped)되어 있던 카드뮴 이온이 그 자리에서(in-situ) 바로 환원되어 카드뮴 나노클러스터를 형성하게 된다.

즉, 상기 환원제 중에서 pH가 가장 높은 수산화나트륨을 사용하면, 다른 환원제를 첨가하는 경우에 비해 상기 알부민의 능력을 활성화하고, 상기 알부민 내부에 봉입되어 있는 카드뮴 이온의 환원을 촉진하여, 빠르게 카드뮴 원자(atom)로 이루어진 카드뮴 나노클러스터가 형성되도록 하는 효과를 가져, 검출 시간을 2시간으로 현저히 단축시킬 수 있다.

다만, 상기 Ⅰ) 단계에서 환원제의 농도는 0.25 내지 0.9 M인 것이 바람직한데, 상기 환원제의 농도가 0.25 M 미만이거나, 0.9 M을 초과하게 되면 카드뮴과 알부민의 반응을 통해 형성되는 카드뮴 나노클러스터 제조 시간이 길어지기 때문에, 정확한 검출을 위해 필요한 시간이 길어지게 되는 문제가 있다. 다만, 상기 환원제의 농도가 0.25 M 미만이거나, 0.9 M을 초과하는 조건에서 억지로 검출 시간을 짧게하여 측정한 경우, 낮은 검출 감도를 갖게되는 문제가 발생한다.

또한, 상기 알부민 및 환원제를 포함하는 검출조성물과 카드뮴이 함유된 시료를 혼합할 시, 카드뮴 이온이 알부민과 반응하여 형광세기를 나타내는 카드뮴 나노클러스터가 형성되는데, 이때 상기 시료액 내에 존재하는 카드뮴 이온의 농도에 따라 상기 카드뮴 나노클러스터의 직경이 달라지게 된다. 구체적으로 시료액 내에 존재하는 카드뮴 이온의 농도가 높을수록 상기 카드뮴 나노클러스터의 직경은 커지게 되고, 상기 시료액 내에 존재하는 카드뮴 이온의 농도가 낮을수록 상기 카드뮴 나노클러스터의 직경은 작아지게 된다.

일예로, 10 mM의 CdCl ₂ ㅇ2H ₂ O 500 ㎕의 시료와 알부민이 반응한 결과, 약 4 내지 5.5 ㎚의 직경을 갖는 카드뮴 나노클러스터가 형성되었다. 하나의 카드뮴 나노클러스터에는 카드뮴 원자가 약 20 개 포함되어 있었다.

상기 형성된 카드뮴 나노클러스터의 양과 직경에 따라 형광세기가 달라지게 되므로, 카드뮴 이온을 정성적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 정량적으로도 검출 할 수 있다.

다만, 상기 카드뮴 나노클러스터를 형성하기 위해서는 상기 Ⅰ) 단계의 반응이 50 내지 60 ℃ 온도하에서 수행되어야 한다. 만약 50 ℃ 미만의 온도 조건에서 반응을 수행하게 되면 알부민과 카드뮴 이온의 반응속도가 느려지기 때문에 카드뮴 나노클러스터가 형성되는데 많은 시간이 소모된다.

게다가 억지로 검출 시간을 짧게하여 측정할 경우 상기 알부민과 카드뮴 이온의 반응이 완전히 이루어지지 않은 상태에서 측정되기 때문에 카드뮴 이온에 대한 감도가 현저히 떨어지는 문제 발생한다.

또한, Ⅰ) 단계의 반응이 60 ℃를 초과한 온도하에서 수행될 경우, 단백질 변형이 야기되기 때문에 알부민의 활성이 저하되어, 카드뮴 이온과 제대로 반응하지 못하므로 카드뮴 나노클러스터를 형성하지 못하게 되고, 결국 카드뮴 이온을 검출할 수 없다.

결론적으로, 상기 Ⅰ) 단계에서 상기 알부민과 시료 내에 존재하는 카드뮴 이온이 반응하여 검출이 가능한 카드뮴 나노클러스터가 형성되기 위해서, 상기 Ⅰ) 단계는 상술한 환원제의 농도조건과 온도 조건을 모두 만족하는 범위에서만 2 내지 4 시간의 짧은 검출 시간 내에 고감도로 카드뮴 이온을 검출할 수 있는데, 어느 하나라도 상기 조건을 벗어날 경우에는 카드뮴을 검출하는데 소요되는 검출 시간이 4 배 이상 증가하고, 검출 감도가 현저히 저하 되는 문제가 발생한다.

이러한, 상기 카드뮴 나노클러스터는 자외선 조사 후, 형광을 띄는 특성을 가지고 있다. 최종적으로, Ⅱ) 상기 카드뮴 나노클러스터에 자외선을 조사하고, 형광 스펙트럼을 얻어, 이를 분석함으로써 카드뮴 이온을 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다.

상기 카드뮴 나노클러스터에 자외선을 조사하는데, 이는 바람직하게 300 내지 400 ㎚ 사이의 파장을 갖는 광으로 보다 더 바람직하게는 350 내지 370 ㎚일 수 있다.

또한, 상기 형광 스펙트럼에 기초하여 카드뮴 이온의 농도를 도출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 카드뮴 이온의 검출은 형광 스펙트럼 측정시 430 내지 490 ㎚의 파장에서 형광 세기의 증가를 측정하여 카드뮴 이온의 존재 및 농도를 확인하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 카드뮴 이온의 존재를 확인하기 위해서는 검출대상이 되는 카드뮴 이온을 다른 배율로 희석하여 얻은 복수의 측정 시료를 이용하여 상술한 과정을 통해 형광 스펙트럼을 얻고, 이로부터 도출되는 형광세기를 요소로 하여, 적어도 2 개 이상의 측정점을 기초로 내삽법 또는 외부삽입법에 의해 생성된 선(검량선)을 얻는다. 상기 검량선을 이용하여 실제 시료로부터 측정한 형광세기로부터 근사적으로 실제 시료 내에 존재하는 카드뮴 이온의 농도를 도출할 수 있다.

또한, 상기 검량선으로부터 기울기를 계산하고, 실제 시료로부터 본 발명의 검출 방법으로 측정하여 얻은 형광세기를 상기 기울기에 대입함으로써, 상기 실제 시료에 존재하는 카드뮴 이온의 농도를 간접적으로 도출할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 카드뮴 검출 방법은 세척 단계와 같은 별도의 추가과정 없이 바로 검출 조성물을 시료와 혼합하여 빠른 시간 내에 실제 시료 속 카드뮴의 농도를 정확하게 측정할 수 있다. 특히 세척의 과정 없이 균질한 카드뮴 이온을 검출할 수 있다는 특성을 가지고 있다.

본 발명에 따른 상기 카드뮴 검출 방법에서 검출 가능한 카드뮴 허용치는 3 내지 5 ppb 정도이고, 검출 성능은 0.01 내지 0.05 ppb이다.

상술한 검출 방법의 전반적인 과정이 도 1에 나타나 있다. 이를 참고하면 상기 알부민을 포함하는 검출액을 카드뮴을 함유하고 있지 않은 시료액(A)에 넣은 경우, 카드뮴에 의한 카드뮴 클러스터가 생성되지 않기 때문에 형광 세기가 나타나지 않으나, 카드뮴을 함유하고 있는 시료액(B)에 각각 혼합하고, 여기에 환원제를 첨가한 경우에는 카드뮴과 상기 알부민과의 반응에 의해 카드뮴 나노클러스터가 형성되기 때문에 광 조사 후, 형광 세기가 나타나는 것을 확인할 수 있다.

상기 형광 스펙트럼의 분석은 상기 카드뮴 나노클러스터의 형광 스펙트럼 중에서 최대 형광세기를 나타내는 파장에서의 형광세기를 분석함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 카드뮴 나노클러스터는 흡수파장이 350 내지 370 ㎚ 대략 365 ㎚이고, 방출파장은 400 내지 500 ㎚ 대략 460 ㎚에서 가장 강한 형광신호를 나타낸다.(도 10D) 이러한 현상을 응용하여 형광 특성을 갖는 카드뮴 나노클러스터로부터 카드뮴을 검출할 수 있는 방법을 본 발명에서 제공하고 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 카드뮴 검출방법은 시료에 알부민과 환원제의 순차적 또는 동시에 첨가하여, 시료 내에 존재하는 카드뮴과 반응하는 과정을 통해 카드뮴 나노클러스터가 형성된다.

상기 카드뮴 나노클러스터는 시료 내에 존재하는 카드뮴의 농도에 따라 하나의 클러스터를 형성하기 위해 사용되는 카드뮴 원자의 수가 달라지게 되고, 이로 인해 상기 과정을 통해 형성된 카드뮴 나노클러스터는 카드뮴의 농도에 따라 발생되는 형광세기에 차이를 갖게 되는 것이다.

따라서, 상기 형광세기의 차이를 통해 시료 내에 존재하는 카드뮴의 존재 여부와 농도를 측정할 수 있다. 구체적으로 카드뮴 이온이 존재하는 시료로부터 본 발명에 따른 검출 방법을 통해, 카드뮴 나노클러스터를 형성시키고, 이의 형광세기로부터 상기 시료 내에 존재하는 카드뮴의 농도를 간접적으로 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 알부민 및 환원제를 포함하는 카드뮴 검출용 조성물에 관한 것이다.

상기 알부민은 환원제 1 중량부를 기준으로 하여 20 내지 30 중량부일 수 있는데, 상기 알부민이 환원제 1 중량부를 기준으로 하여 20 중량부 미만이거나 30 중량부를 초과하면 형광세기가 5000 au 이하로 낮은 검출 한계를 가지게 되며, 검출을 위해 요구되는 시간이 매우 길어지게 되는 문제가 발생한다.

상기 카드뮴 검출용 조성물은 시료로부터 카드뮴의 존재 여부와 카드뮴의 농도를 검출하기 위해 사용되는 것으로, 상기 시료 내에 존재하는 카드뮴과 알부민과의 반응에 의해 카드뮴 나노클러스터가 형성되고, 이의 형광세기를 측정 및 분석하여, 시료 내에 존재하는 카드뮴의 존재 여부와 카드뮴의 농도를 검출할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 카드뮴 검출용 조성물은 시료에 존재하는 다른 물질들과는 반응하지 않고, 카드뮴 이온에 대해서만 특이적으로 반응하여 카드뮴 나노클러스터를 형성하기 때문에, 고감도로 손쉽고, 저렴하면서 빠르게 카드뮴만을 특이적으로 검출할 수 있다.

상기 알부민은 난 알부민 또는 사람 혈청 알부민 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알부민을 제외한 소 혈청 알부민 등을 사용할 경우, 카드뮴 이온과 반응하여 카드뮴 나노클러스터를 형성하지 않기 때문에, 카드뮴 이온의 존재 여부와 농도를 검출할 수 없다는 문제가 있다.

또한, 상기 알부민은 사람 혈청 알부민인 것이 가장 바람직한데, 난 알부민을 사용하여도 카드뮴과 결합을 통해 카드뮴 클러스터를 형성하지만, 검출 시간이 12 시간이 요구되며, 12 시간 이하의 검출 시간에서는 카드뮴 이온에 대한 감도가 저하되어 검출이 용이하지 않는 단점이 있어, 짧은 검출 시간 내에 카드뮴을 검출하기 위해서는 사람 혈청 알부민을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

반면 상기 소 혈청 알부민은 12 시간 이상의 검출 시간에서, 전혀 카드뮴 나노클러스터를 형성하지 못하므로, 이는 카드뮴 검출에 전혀 용이하지 않다.

상기 알부민은 증류수, 완충용액 등 다양한 수용액에 용해된 액상이거나, 고체 파우더 형태일 수 있는데, 가장 바람직하게는 고체 파우더 형태일 수 있다. 왜냐하면 장기간 보관이 가능하며, 보관 또는 운반에 용이하기 때문이다.

상기 알부민이 액상일 경우, 완충용액을 사용하지 않고 일반 증류수를 이용해도 쉽게 변성되지 않을뿐더러 카드뮴에 대한 높은 감도를 유지하므로, 상기 알부민을 변성시키지 않는 용액이면 특별히 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다.

상기 환원제는 수산화나트륨 (NaOH), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 포름산 (Formic acid), 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4) 및 옥살산 (Oxalic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 환원제는 증류수, 완충용액 등 다양한 수용액에 용해된 액상이거나, 고체 파우더 형태일 수 있는데, 바람직하게는 고체 파우더 형태일 수 있고 더욱 바람직하게는 고체상태 NaOH일 수 있다.

상기 환원제가 다양한 수용액에 용해된 액상일 경우, 상기 수용액은 상기 환원제를 변성시키지 않는 용액이면 특별히 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다.

상기 알부민이 카드뮴 이온과 만나게 되면, 알부민이 카드뮴 이온을 감싸면서 격리시켜(sequester) 빠져나가지 못하게 봉입(entrapping)하여 카드뮴 클러스터를 형성하게 되는데, 이 과정에 있어서, 높은 pH의 환원제를 첨가하면 상기 알부민이 갖고 있는 환원시키는 능력이 활성화되어 내부에 봉입(entrapped)되어 있던 카드뮴 이온이 그 자리에서(in-situ) 바로 환원되어 카드뮴 나노클러스터를 형성하게 된다.

즉, 상기 환원제 중에서 pH가 가장 높은 수산화나트륨을 사용하면, 다른 환원제를 첨가하는 경우에 비해 상기 알부민의 능력을 활성화하고, 상기 알부민 내부에 봉입되어 있는 카드뮴 이온의 환원을 촉진하여, 빠르게 카드뮴 원자(atom)로 이루어진 카드뮴 나노클러스터가 형성되도록 하는 효과를 가져, 검출 시간을 2시간으로 현저히 단축시킬 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 알부민과 환원제 모두 고체 파우더 형태인 것일 수 있는데, 실제 다양한 장소 및 환경에서 사용하기 위하여, 장기간 보관이 용이하고, 운반이 쉽고 가볍고 부피가 작아야 하는데, 액상으로 존재할 경우 장기간 보관시 알부민이 변성될 수 있고, 외부 환경 조건 변화에 민감해져 보관 장소에 어려움이 있다. 또한, 정확한 양을 첨가하거나, 용액을 덜어내는데 있어 추가 기구가 필요하게 되고, 검출하고자 하는 과정마다 상기 추가 기구의 세척이 요구되므로, 실제 키트를 사용하기 위한 장소에 제약이 존재하게 된다. 아울러 부피를 줄이고자 알부민과 환원제를 혼합하여 보관할 경우, 알부민의 단백질 구조가 풀어져 비활성화되는 문제가 있다.

따라서, 알부민 및 환원제가 파우더 형태인 것이 바람직하고, 장점으로는 외부 환경 변화에 민감하지 않아 보관이 용이하며, 장기간 알부민의 단백질 구조를 유지할 수 있으므로 장기간 보관이 가능할 뿐만 아니라, 보관 용기에 상기 알부민과 환원제를 각각 또는 혼합하여 1 회 분량의 양을 넣어 놓고, 상기 보관 용기에 카드뮴을 검출하고자 하는 시료(연못, 분수대, 수돗물 등의 시료)를 일정량 부어 바로 확인이 가능하므로 검출하고자 하는 시료가 위치한 장소에 관계없이 어느 곳에서나 바로 카드뮴 검출이 가능하다는 장점이 있다.

또한 본 발명의 또 다른 측면은 상기 카드뮴 검출용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 카드뮴 검출용 키트에 관한 것이다.

구체적으로 상기 카드뮴 검출용 키트는 검출 조성물을 포함하는 것으로, 시료와 검출 조성물이 혼합되는 반응 공간을 갖는 챔버라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 필요에 따라 가열 수단, 형광 광원, 형광 검출기, 디스플레이부 등을 추가로 구비할 수 있다.

상기 구성요소가 모두 포함된 카드뮴 검출용 키트의 일 구현예를 도 15A에 구체적으로 나타내었으며, 이를 참조하면, 상기 카드뮴 검출용 키트는 아래와 같이 구성될 수 있다.

상기 카드뮴 검출용 키트는(100)는 반응공간을 갖는 챔버(110);

상기 챔버(110)의 하단에 위치하여 상기 챔버(110)를 가열하는 가열수단(120);

상기 챔버(110)의 좌측에 이격되어 위치한 광원(130); 및

상기 챔버(110)의 우측에 이격되어 위치한 형광 검출기(140);을 포함한다.

상기 형광 검출기(140)와 전기적으로 연결된, 상기 카드뮴 검출용 키트(100)의 외부에 위치하는 디스플레이부(150)가 더 구비될 수 있는데, 이는 도 15B에 구체적으로 나타내었다.

상기 카드뮴 검출용 키트는 전원 장치를 더 구비할 수 있는데, 상기 전원장치는 외부 콘센트 또는 충전이 가능한 것으로, 상기 카드뮴 검출용 키트의 각각 장치에 적합하도록 전압 강하 및 정류를 하여 전원을 공급하게 된다. 본 발명의 전원장치는 90~120 V의 교류를 이용하여 충전하며 DC 12V를 공급하는 충전가능한 리튬 이온 방식의 배터리 셀을 이용할 수 있어 휴대가 용이하다.

상기 디스플레이부(150)는 상기 형광 검출기(140)로부터 도출된 형광 검출값이 표시되거나, 이로부터 계산된 카드뮴 이온 농도가 표시될 수 있다.

또한 상기 디스플레이부(150)는 LCD 모듈과 별도의 전하강하 장치를 사용하여 LCD 장치에 공급하며 마우스 및 키보드 등의 입력 장치 없이 터치 방식으로 직접적으로 화면을 통하여 제어 및 모니터링이 가능하도록 설계하였다.

본 발명에 다른 카드뮴 검출용 키트는 카드뮴 검출용 조성물과 시료가 혼합되는 반응 공간을 갖는 상기 챔버(110)가 구비되어 있고, 여기에 상기 광원(130)으로부터 자외선 영역의 빛이 조사된 후, 상기 카드뮴 검출용 조성물과 시료가 혼합된 용액(반응 공간)을 통과해 나온 빛을 다시 형광 검출기(140)에 전달되어, 상기 카드뮴 검출용 조성물과 시료가 혼합에 의해 형성된 카드뮴 나노클러스터에 따라 형광 세기를 측정하여 분석하는 일련의 과정을 통해 카드뮴의 농도를 분석하는 장치이다.

따라서, 상기 챔버(110)는 광원의 투과성을 좋게 하기 위하여 빛이 조사되는 입,출력부를 석영(quartz)으로 제작하였다.

또한 상기 챔버(110)는 광 투과거리가 약 0.5 내지 4 ㎜일 수 있다.

상기 광원(130)은 상기 챔버(110)의 반응 공간 내에 상기 시료와 검출 조성물의 혼합하여 형성된 카드뮴 나노클러스터로부터 형광 스펙트럼을 획득하기 위하여 자외선 파장 범위의 형광 광원을 조사할 수 있는 장치일 수 있는데, 상기 광원(130)은 350 내지 370 ㎚의 광원을 제공할 수 있는 장치이면 이에 제한되지 않으나, 현장에서 무리 없이 카드뮴 농도를 측정하기 위해서 UV 램프로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 형광 검출기(140)는 상기 광원(130)에서 챔버(110)로 자외선이 조사되고, 이로부터 발생하는 형광을 검출할 수 있는 검출 수단이다.

상기 형광 검출기(140)는 1 ㎚ 내지 2 ㎚ 간격으로 측정이 가능하도록 구성하였다.

상기 가열 수단(120)은 운반이 용이할 정도로 부피가 작고, 45 내지 60 ℃로 가열할 수 있는 장치이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 챔버(110)의 반응 공간을 향해서 가열용 빛을 사출하는 블루 LED(light emitting diode) 소자 또는 PN 반도체를 포함하는 복수의 가열 수단일 수 있다. 이는 시료의 종류에 관계없이 균일한 온도분포로 가열할 수 있고, 부피가 작아 운반 및 보관이 용이하기 때문에 가장 바람직하다.

상기 가열 수단은 60 ℃를 초과하면, 제어할 수 있도록 제어 장치 또는 알람 장치가 구비될 수 있다.

또한 본 발명의 카드뮴 검출용 키트의 다른 구현예를 도 16A에 구체적으로 나타내었으며, 이를 참조하면, 상기 카드뮴 검출용 키트는 아래와 같이 구성될 수 있다.

상기 카드뮴 검출용 키트(200)는 반응공간을 갖는 챔버(210);

상기 챔버(210)의 측면에 위치한 광원(220);

상기 광원(220)과 상기 챔버(210)를 사이에 두고, 서로 대향되도록 위치한 형광 검출기(230);을 포함한다.

상기 형광 검출기(230)와 전기적으로 연결된, 상기 카드뮴 검출용 키트(200)의 외부에 위치하는 디스플레이부(240)가 더 구비될 수 있는데, 이는 도 16B에 구체적으로 나타내었다.

상기 디스플레이부(240)는 상기 형광 검출기(230)로부터 도출된 형광 검출값이 표시되거나, 이로부터 계산된 카드뮴 이온 농도가 표시될 수 있다.

또한 상기 디스플레이부(240)는 LCD 모듈과 별도의 전하강하 장치를 사용하여 LCD 장치에 공급하며 마우스 및 키보드 등의 입력 장치 없이 터치 방식으로 직접적으로 화면을 통하여 제어 및 모니터링이 가능하도록 설계하였다.

상기 카드뮴 검출용 키트는 전원 장치를 더 구비할 수 있는데, 상기 전원장치는 외부 콘센트 또는 충전이 가능한 것으로, 상기 카드뮴 검출용 키트의 각각 장치에 적합하도록 전압 강하 및 정류를 하여 전원을 공급하게 된다. 본 발명의 전원장치는 90~120 V의 교류를 이용하여 충전하며 DC 12V를 공급하는 충전가능한 리튬 이온 방식의 배터리 셀을 이용할 수 있어 휴대가 용이하다.

본 발명에 다른 카드뮴 검출용 키트는 카드뮴 검출용 조성물과 시료가 혼합되는 반응 공간을 갖는 상기 챔버(210)가 구비되어 있고, 여기에 상기 광원(220)으로부터 자외선 영역의 빛이 조사된 후, 상기 카드뮴 검출용 조성물과 시료가 혼합된 용액(반응 공간)을 통과해 나온 빛을 다시 형광 검출기(230)에 전달되어, 상기 카드뮴 검출용 조성물과 시료가 혼합에 의해 형성된 카드뮴 나노클러스터에 따라 형광 세기를 측정하여 분석하는 일련의 과정을 통해 카드뮴의 농도를 분석하는 장치이다.

따라서, 상기 챔버(210)는 광원의 투과성을 좋게 하기 위하여 빛이 조사되는 입,출력부를 석영(quartz)으로 제작하였다.

또한 상기 챔버(210)는 광 투과거리가 약 0.5 내지 4 ㎜일 수 있다.

상기 광원(220)은 상기 챔버(210)의 반응 공간 내에 상기 시료와 검출 조성물의 혼합하여 형성된 카드뮴 나노클러스터로부터 형광 스펙트럼을 획득하기 위하여 자외선 파장 범위의 형광 광원을 조사할 수 있고, 이와 더불어 상기 챔버(110)의 반응 공간을 향해서 가열용 빛을 사출할 수 있다.

상기 광원(130)은 350 내지 370 ㎚의 광원을 제공할 수 있는 제1 광원만으로 이루어져 있거나, 350 내지 370 ㎚의 광원을 제공할 수 있는 제1 광원과 가열용 빛을 사출하는 제2 광원으로 이루어져 있을 수 있다.

상기 제1 광원은 350 내지 370 ㎚의 광원을 제공할 수 있다면 특별히 이에 제한되지 않으나, 현장에서 무리 없이 카드뮴 농도를 측정하기 위해서 UV 램프로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 제2 광원은 45 내지 60 ℃로 가열할 수 있는 가열용 빛을 사출하는 것이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 블루 LED(light emitting diode) 소자일 수 있는데, 이는 시료의 종류에 관계없이 균일한 온도분포로 가열할 수 있다.

상기 가열 수단은 60 ℃를 초과하면, 제어할 수 있도록 제어 장치 또는 알람 장치(미도시)가 추가로 구비될 수 있다.

상기 형광 검출기(230)는 상기 광원(220)에서 챔버(210)로 자외선이 조사되고, 이로부터 발생하는 형광을 검출할 수 있는 검출 수단이다.

상기 알부민은 고체 상태 파우더일 수 있다.

상기 환원제는 고체 상태 NaOH일 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

<재료 및 기구>

<재료>

50 ㎎/㎖의 소 혈청 알부민을 사용하였고, 이는 Fitzgerald(USA)에서 구입하였다. 50 ㎎/㎖의 사람 혈청 알부민, 50 ㎎/㎖의 난 알부민을 사용하였고, 이들은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd에서 구입하였다.

환원제는 1 M NaOH 용액을 제조하여 사용하였고, NaOH는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

카드뮴을 함유하고 있는 시료는 10 mM CdCl2ㅇ2H2O을 사용하였는데, 상기 카드뮴 클로라이드 디하이드레이트(CdCl2ㅇ2H2O) 역시 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

<기구>

혼합배양기(Incubated shaker)는 Jeiotech(Korea)의 제품을 사용하였고, 이의 모델명은 SI-300R이다. 또한, 형광 스펙트럼 측정기기는 TECAN을, 형광 이미지는ChemiDoc system(Bio-rad)를 사용하였고, 상기 얻은 형광 이미지로부터 형광세기를 분석하기 위해서는 ChemiDoc 프로그램(Image Lab Software cersion 4.0(USA)를 사용하였다.

< 실시예 >

본 발명에 따른 카드뮴 검출 방법을 수행함에 있어서, 알부민, 환원제 또는 카드뮴의 존재 여부에 따라 도출되는 형광세기를 비교하기 위하여, 아래 표 1과 같이 실시예를 제조하여 실험하였다.

시험예

< 시험예 1> 사람 혈청 알부민 및 환원제를 사용하여 시료로부터 카드뮴 검출.

실시예 1 내지 6에 따른 검출조성물과 시료를 이용하여 아래와 같은 방법으로 검출을 각각 수행하고, 이에 따른 각 형광 스펙트럼을 얻었다. 37 ℃, 300 rpm에서 시료를 검출 조성물과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 12 시간동안 37 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 스펙트럼을 측정하였다.

상술한 바와 같이, 실시예 1 내지 6의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 카드뮴 이온 즉 염화카드뮴, 사람 혈청 알부민, NaOH의 존재 유무에 따른 형광세기를 비교하였는 바, 본 발명에 따른 검출 조성물(알부민과 환원제)을 사용한 실시예 6에서만 약 8000 au의 높은 형광세기를 확인할 수 있었다. 이는 카드뮴 나노클러스터가 형성됨에 따라 형광세기가 다른 실시예에 비해 높게 나타난 것으로, 본 발명에 따른 검출 과정을 통해서만 카드뮴의 존재 여부와 농도를 확인할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 시료에 카드뮴이 존재하지 않으면, 검출 조성물을 혼합하여도 형광을 나타내지 않는다는 것을 실시예 4로부터 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 검출 조성물을 이용한 검출 방법은 카드뮴과 선택적으로 반응하고, 상기 반응을 통해 카드뮴 나노클러스터를 형성된다는 것을 알 수 있다. 실시예 3 내지 5의 경우 검출조성물 중 알부민에 존재하는 트립토판의 잔기로부터 발생되는 형광으로 인해 다소 형광세기가 증가함을 확인할 수 있으나, 이는 카드뮴의 존재하에 증가되는 형광세기보다 2.5배 이상 낮은 수치이기 때문에, 카드뮴을 검출함에 있어서 전혀 영향을 미치지 않는 정도이다.

< 시험예 2> 난 알부민 및 환원제를 사용하여 시료로부터 카드뮴 검출.

실시예 7 내지 12에 따른 검출조성물과 시료를 이용하여 아래와 같은 방법으로 검출을 각각 수행하고, 이에 따른 각 형광 이미지를 얻었다. 37 ℃, 300 rpm에서 시료를 검출 조성물과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 12 시간동안 37 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 이미지를 분석하였다.

상술한 바와 같이, 실시예 7 내지 12의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 카드뮴 이온 즉 염화카드뮴, 난 알부민(OVA), NaOH의 존재 유무에 따른 형광세기를 비교하였는 바, 상기 도 2에서 사람 혈정 알부민(HSA)을 사용하여 얻은 형광 세기보다 낮지만 유사한 패턴을 갖는 것을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명에 따른 검출 조성물을 모두 사용한 실시예 12에서만 약 6000 au의 높은 형광세기를 확인할 수 있었고, 이는 본 발명에 따른 검출 조성물에 의해 카드뮴 나노클러스터가 형성됨에 따라 형광세기가 다른 실시예 7 내지 11에 비해 높게 나타난 것임을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 검출 조성물을 이용한 검출 방법을 통해서 시료 내에 존재하는 카드뮴의 존재 여부 및 농도를 도출할 수 있다는 것을 알 수 있다.

또한, 카드뮴이 존재하지 않는 실시예 10을 통해 본 발명의 검출 조성물만으로 높은 형광을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있으므로, 본 발명에 따른 검출 방법은 카드뮴에 대해서 선택적으로 반응하고, 상기 알부민과 카드뮴의 반응을 통해 카드뮴 나노클러스터를 형성하기 때문에, 감도가 높다는 것을 알 수 있다. 다만 상기 실시예 9 내지 11의 경우 알부민이 갖고 있는 트립토판의 잔기로부터 발생되는 형광으로 인해 다소 형광세기가 증가하였으나, 이는 카드뮴의 존재 하에 증가되는 형광세기보다 5 배 이상 낮은 수치이기 때문에, 카드뮴의 검출에 전혀 영향을 미치지 않는 정도이다.

다만 난 알부민을 이용하여 형성된 카드뮴 나노클러스터는 사람 혈청 알부민을 이용하여 형성된 카드뮴 나노클러스터보다 형광세기가 1.5~2 배 낮음을 확인할 수 있고, 감도가 사람 혈청 알부민을 이용한 경우보다 더 낮음을 확인하였다.

그러나, 난 알부민은 감도 및 검출 시간이 길고, 형광 세기가 다소 낮으나, 가격이 저렴하므로 정성적인 카드뮴 검출에 이용할 수 있어 용도 및 장소에 따라 난 알부민 또는 사람 혈청 알부민 중 적절히 선택할 수 있다.

< 시험예 3> 소 혈청 알부민 및 환원제를 사용하여 시료로부터 카드뮴 검출.

비교예 1 내지 6에 따른 검출조성물과 시료를 이용하여 아래와 같은 방법으로 검출을 각각 수행하고, 이에 따른 각 형광 이미지를 얻었다. 37 ℃, 300 rpm에서 시료를 검출 조성물과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 12 시간동안 37 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 이미지를 측정하였다.

상술한 바와 같이, 비교예 1 내지 6의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 카드뮴 이온 즉 염화카드뮴, 소 혈청 알부민(OVA), NaOH의 존재 유무에 따른 형광세기를 비교하였는 바, 상기 도 2 및 도 3과 다른 결과가 나타났다.

구체적으로, 비교예 3 내지 비교예 6은 모두 약 2000 내지 3000 au의 형광세기를 나타내고 있었다.

즉, 비교예 6과 다른 비교예 3 내지 5와 형광세기가 큰 차이가 없는 것으로 보아 소 혈청 알부민은 카드뮴 이온과 반응하여 카드뮴 나노클러스터를 형성하지 못한다는 것을 알 수 있다.

특히, 비교예 3 내지 6은 알부민만 첨가한 실시예 3 및 9와 유사한 정도의 형광세기를 나타내고 있으므로, 이를 통해 소 혈청 알부민의 트립토판 잔기로부터 측정된 형광세기라는 것을 알 수 있다. 다시 말해 소 혈청 알부민은 카드뮴 이온과 반응하지 않는다는 것을 알 수 있다.

< 시험예 4> 카드뮴 이온의 농도별 시료에 대한 사람 혈청 알부민 및 환원제를 이용한 카드뮴 검출

아래 표 2의 검출 조성물과 시료를 혼합하여 형광 세기를 도출하였다. 검출 과정은 구체적으로 37 ℃, 300 rpm에서 시료를 알부민과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 12 시간동안 37 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 이미지를 측정하였다.

상술한 바와 같이, 실시예 13 내지 20의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 검출 조성물과 혼합된 시료 내에 카드뮴 이온의 농도가 증가할수록 도축되는 형광세기도 증가한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 카드뮴 이온의 농도가 높을수록 알부민과 결합하여 형성된 카드뮴 나노클러스터의 직경이 커지기 때문에, 상기 카드뮴 나노클러스터에 의존적인 형광세기도 증가한다는 것을 알 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 검출 조성물과, 이를 이용한 검출 방법으로 시료 내에 카드뮴 이온이 존재하는 가에 대한 여부뿐만 아니라, 농도도 확인할 수 있음을 알 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 검출방법 및 검출키트를 이용하여 시료에 존재하는 카드뮴의 정량적 및 정성적 검출이 가능하다는 것을 의미한다.

< 시험예 5> 검출 시간을 단축하기 위한 검출 온도 조건.

상기 시험예 1 내지 4에 적용된 12 시간의 반응시간을 단축하기 위하여 검출 과정에서 다양한 조건(온도, 반응시간 및 환원제 농도)들을 확인하였다. 이러한 조건에서 카드뮴을 검출할 경우 종래 직접적인 단백질 합성법(protein directed synthesis method)보다 현저히 시간을 단축할 수 있다.

실시예 6의 검출 조성물과 시료를 이용하여 아래와 같은 방법으로 검출을 각각 수행하고, 이에 따른 각 형광 이미지를 얻었다.

37 ℃, 300 rpm로 시료를 알부민과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 3 시간동안 다양한 온도 조건하에서, 300 rpm로 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 이미지를 측정하였다. 이때, 상기 온도 조건은 각각 25 ℃, 35 ℃, 45 ℃ 및 55 ℃로 하여 각 실험을 진행하였다.

상술한 바와 같이, 실시예 6의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 다양한 온도 하에서 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 검출 방법에서의 검출 시간을 단축하기 위해서는 상기 알부민과 카드뮴 이온의 반응을 통해 형성된 카드뮴 나노클러스터를 제조하는 단계를 최적화하여 카드뮴 나노클러스터가 빠르게 제조되도록 하여 단축시킬 수 있다.

따라서, 상기 내용과 더불어 도 6의 결과를 종합하면 25 ℃에서 55 ℃의 온도 조건 중에서 55 ℃에서 카드뮴을 검출할 경우, 형광세기가 가장 높다는 것을 확인할 수 있다. 이는 동일한 검출 조건 중에서 온도가 55 ℃일 때, 알부민과 카드뮴의 반응이 빠르게 이뤄져 카드뮴 나노클러스터 제조가 빠르게 이루어진다는 것을 의미하는 것이다. 구체적으로 55 ℃에서의 형광세기가 25 ℃에서의 형광세기보다 약 2배 정도 높다는 것을 확인할 수 있다.

< 시험예 6> 검출 시간을 단축하기 위한 환원제 농도 조건.

아래 표 3의 검출 조성물과 시료를 혼합하여 형광 세기를 도출하였다. 검출 과정은 구체적으로 55 ℃, 300 rpm로 시료를 알부민과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 2 시간동안 55 ℃ 조건하에서, 300 rpm로 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 이미지를 측정하였다.

상술한 바와 같이, 실시예 21 내지 의 검출조성물 및 시료를 혼합하여 얻은 각각의 형광 이미지를 분석하여, 도출된 형광세기를 도 7에 나타내었다.

본 발명에 따른 검출 방법에서의 검출 시간을 단축하기 위해서는 상기 알부민과 카드뮴 이온의 반응을 통해 카드뮴 나노클러스터가 합성되는 시간을 단축하여, 형광특성을 나타내는 카드뮴 나노클러스터를 빠른 시간 내에 최대한 확보하여야 한다.

도 7에 나타난 바와 같이, 환원제인 NaOH(수산화나트륨)의 농도를 바꿔준 검출 조성물로 카드뮴 시료를 검출한 결과, 1 M 농도의 환원제(NaOH)를 사용한 실시예 26보다 0.5 M 농도의 환원제(NaOH)를 사용한 실시예 25가 약 2 배 이상 더 높은 형광세기를 나타내고 있음을 알 수 있다.

이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 검출 조성물에서 환원제의 농도를 0.25 내지 0.9 M로 하는 것이, 본 발명의 검출 조성물을 이용하여 카드뮴을 검출하는데 소요되는 시간을 4 배 이상 단축시킬 수 있다.

만일 상기 검출 조성물 중에서 환원제의 농도가 0.25 M보다 낮거나 0.9 M보다 높으면 카드뮴과 알부민의 반응을 통해 카드뮴 나노클러스터가 합성되는 시간이 길어지기 때문에, 충분히 합성되도록 검출시간을 10 시간 이상 할애해야 하며, 검출시간이 10 시간보다 짧은 경우에는 감도 및 정확도가 낮아지는 문제가 있다.

< 시험예 7> 검출 조건에 따른 최적의 검출 시간 확인

실시예 25의 검출 조성물과 시료를 사용하여 다양한 조건에서 시간에 따른 카드뮴 검출 특성을 확인하였다.

구체적으로 55 ℃, 300 rpm에서 시료를 검출 조성물과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 반응 시간을 달리하여, 55 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 스펙트럼을 측정하였다. 상기 반응 시간은 각각 0.5 시간, 1 시간, 1.5 시간, 2 시간. 2.5 시간 및 3 시간으로 하였다. 이는 도 8의 그래프 내에 55 ℃라고 표기하였다.

또한, 상기 검출 조건 중에서 온도를 55 ℃에서 37 ℃로 한 것을 제외하고는 상기 실험과 모두 동일하게 수행하여 상기 실험과 이의 결과를 비교하였다. 이는 도 8의 그래프 내에 37 ℃라고 표기하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 상기 시험예 5, 6에서 확정된 조건(온도 및 환원제의 농도)으로 시료를 검출한 경우, 상기 알부민과 카드뮴 이온의 반응을 통해 형성된 카드뮴 나노클러스터가 완전히 합성되는 시간을 확인할 수 있었다.

우선, 최적화된 환원제 농도를 갖는 실시예 25의 검출 조성물과 시료 및 최적화된 검출 온도 55 ℃로 수행하였을 때, 2 시간 이후부터 가장 높은 형광 세기를 나타내었다.

즉, 본 발명에 따른 카드뮴 검출 방법은 55 ℃ 및 0.5 M 환원제 농도 조건 하에서 검출 조성물 중 알부민과 시료의 카드뮴이 활발하게 반응하여 빠르게 카드뮴 나노클러스터를 형성하기 때문에, 2 시간 이후부터는 높은 형광 세기를 도출할 수 있다는 것을 알 수 있다.

반면, 온도를 37 ℃로 수행하였을 때는 가장 높은 형광세기가 관찰되지 않았다. 즉 반응 시간이 증가됨에도 불구하고 형광세기가 큰 차이를 보이지 않고 있을뿐만 아니라, 전반적으로 형광세기가 약 4000 au이하로 확인되었는 바, 온도가 40 ℃ 미만이면 카드뮴 나노클러스터가 완전히 제조되기까지 3 시간 이상의 긴 시간이 요구된다는 것을 알 수 있다.

결론적으로, 본 발명의 검출 조성물을 사용하여 카드뮴 검출을 수행할 경우, 온도와 환원제 농도를 모두 만족하여야만 알부민과 카드뮴의 반응속도가 빨라, 빠른 시간 내에 형광세기를 도출할 수 있다. 만일 상기 조건 중 어느 하나라도 만족시키지 못한다면 알부민과 카드뮴 이온과의 반응 속도가 현저히 낮아지기 때문에, 카드뮴 농도를 도출하기 위한 충분한 형광세기를 얻기 위해서 시간이 4 배 이상 더 필요하게 되는 단점이 있다.

다양한 농도의 카드뮴 이온을 포함하는 시료를 제조하고, 상기 각 시료에 50 ㎎/㎖ 사람 혈청 알부민 및 0.5 M NaOH의 검출 조성물을 혼합하여 얻은 형광 스펙트럼으로부터 형광세기를 분석하여 도 9에 나타내었다. 여기에 사용된 시료와 검출 조성물을 표 4에 보다 자세히 나타내었다.

구체적으로, 55 ℃, 300 rpm로 시료와 알부민을 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 반응 시간을 달리하여, 55 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 스펙트럼을 측정하고, 이를 분석하여 도출된 형광세기를 도 9에 나타내었다. 상기 반응 시간은 2 시간으로 하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 카드뮴 이온의 농도에 따른 그래프의 기울기가 도 5의 그래프의 기울보다 더 가파르다는 것을 알 수 있다. 이는 최적의 검출 조건에서 카드뮴을 검출할 경우 카드뮴에 대한 감도 및 정확도가 더 우수하다는 것을 의미한다.

< 시험예 8> 검출 과정에서 형성된 카드뮴 클러스터의 특성.

실시예 25의 검출 조성물과 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 사용하여 아래 검출 과정을 통해 카드뮴 검출 특성을 확인하였다.

구체적으로 55 ℃, 300 rpm에서 시료를 검출 조성물과 혼합한 후, 2 분 후에 환원제를 첨가하여 혼합해준다. 이후 2 시간 동안, 55 ℃, 300 rpm 조건 하에서 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 반응이 종료된 검출액에 자외선을 조사하여, 상기 반응이 종료된 검출액을 통과해 나온 광원을 분석함으로써 형광 스펙트럼을 측정하였다.

상기 반응이 종료된 검출액은 시료와 검출 조성물이 혼합된 후, 반응이 완전히 종료되어 카드뮴 클러스터, 시료, 미반응된 검출 조성물이 혼합되어 있는 용액을 의미한다.

이와 비교하기 위하여, 카드뮴이 존재하지 않는 시료를 이용했다는 점을 제외하고는 상술한 과정과 모두 동일하게 반응시킨 후, 반응이 종료된 검출액을 제조하였고, 이를 대조군이라 한다.

도 10A는 카드뮴 이온이 존재하는 시료와 존재하지 않는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액과 대조군을 에너지 분산 엑스선 분광학(energy-disperive X-ray spectroscopy, 제조사: JEOL(Japan), 모델명: JEM-2100F)으로 분석한 결과를 나타낸 표이다.

이때, w/CdNCs는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 실시예 25로 상술한 과정으로 반응시켜 제조된 반응이 종료된 검출액을 측정한 것이고, w/oCdNCs는 카드뮴 이온이 존재하지 않는 시료를 이용한 대조군을 측정한 것이다.

도 10A에 나타난 바와 같이, 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 검출한 반응이 종료된 검출액에는 카드뮴 원자가 관찰된 반면, 카드뮴 이온이 존재하지 않는 시료를 이용한 대조군에는 카드뮴 원자가 관찰되지 않았다.

이를 통해, 카드뮴과 알부민의 결합을 통해서만 카드뮴 나노클러스터가 형성된다는 것을 알 수 있다.

도 10B는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액을 투과전자현미경(transmission electron microscopy, 제조사: JEOL(Japan), 모델명: JEM-2100F)으로 촬영한 사진이다.

도 10B에 나타난 바와 같이, 상기 반응이 종료된 검출액 내에 존재하는 카드뮴 나노클러스터를 확인할 수 있고, 상기 카드뮴 나노클러스터의 모양이 구형이라는 것과 약 5 ㎚의 직경을 갖는다는 것을 확인할 수 있다. 다만 상기 카드뮴 나노클러스터의 직경은 카드뮴 이온이 존재하는 시료에서 카드뮴 이온의 농도에 따라 달라질 수 있다.

도 10C는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액을 동적광산란법(dynamic light scattering, 제조사: Otsuka electronic(Japan), 모델명: ELS-Z)으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 10C에 나타난 바와 같이, 상기 반응이 종료된 검출액에 존재하는 카드뮴 나노클러스터의 직경은 약 4.5 내지 5.3 nm라는 것을 확인할 수 있다. 이는 도 10B의 투과전자현미경 결과와 일치한다.

도 10D는 카드뮴 이온이 존재하는 시료를 본 발명에 따른 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액을 형광 방출 스펙트럼(fluorescence emission spcetra, 제조사: Mannedorf(Switzerland), 모델명: TECAN)으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 10D에 나타난 바와 같이, 상기 반응이 종료된 검출액은 반응에 의해 형성된 카드뮴 나노클러스터에 의해 흡수파장이 365 ㎚이고, 방출파장이 460 ㎚라는 것을 확인하였다. 이를 통해 자외선(UV) 하에서 형광을 띄는 카드뮴 나노클러스터가 형성된다는 것을 알 수 있다.

또한, 상기 반응이 종료된 검출액은 자외선(UV) 아래에서 형광이미지 측정 장비 (Chemi-doc, 제조사: Bio-rad(USA), 모델명: Universal Hood Ⅲ))와 분석 프로그램(Image lab software version 4.0)을 이용하여 형광이미지를 얻을 수 있으며, 이에 대한 형광세기를 측정하여 분석할 수 있다는 것을 알 수 있다.

도 11은 카드뮴 이온 농도에 따라, 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액에 형성된 카드뮴 나노클러스터에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 서로 다른 카드뮴 이온 농도를 갖는 시료를 이용한 점을 제외하고는 시험예 8의 검출 과정과 모두 동일하게 얻은 반응이 종료된 검출액을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 나타낸 그래프이다.

다만, 상기 검출 과정에서 시료 내에 존재하는 카드뮴 이온의 농도가 0 nM, 0.1 nM 및 100 nM이 되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 모두 동일하게 수행하였다. 상기 카드뮴 이온의 농도가 다른 시료 각각에 검출 조성물만(실험예 25)을 혼합하여 서로 다른 카드뮴 나노클러스터 농도를 갖는 반응이 종료된 검출액을 얻었고, 이를 HPLC로 분석하였다.

이때, 도 11A는 상기 카드뮴 이온이 존재하는 시료에서 카드뮴 이온의 농도가 0 nM인 것이고, 도 11B는 카드뮴 이온의 농도가 0.1 nM인 것이고, 도 11C는 카드뮴 이온의 농도가 100 nM인 것이다.

도 11에 나타난 바와 같이, 카드뮴 이온의 농도가 증가할수록 HPLC 분석 그래프 중 특정 영역에서의 신호(빨간 원)가 증가하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 형성된 카드뮴 나노클러스터 내에 존재하는 카드뮴 원자의 양을 나타내는 것으로, 다시 말해 시료 내 카드뮴 이온의 농도가 증가할수록 형성되는 카드뮴 나노클러스터의 직경도 증가한다는 것을 알 수 있다.

도 12는 카드뮴 이온 농도에 따라, 시험예 8의 검출 과정을 통해 얻은 반응이 종료된 검출액에 형성된 카드뮴 나노클러스터에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 서로 다른 카드뮴 이온 농도를 갖는 시료를 이용한 점을 제외하고는 시험예 8의 검출 과정과 모두 동일하게 얻은 반응이 종료된 검출액을 말디토프 질량분석기(MALDI-TOF MS, 제조사: ASTA (KOREA))로 측정한 결과 그래프이다.

다만, 상기 검출 과정에서 시료에서 카드뮴 이온의 농도가 0 nM, 0.1 nM 및 100 nM이 되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 모두 동일하게 수행하였다. 상기 카드뮴 이온의 농도가 다른 시료 각각에 검출 조성물만(실험예 25)을 혼합하여 서로 다른 카드뮴 나노클러스터 농도를 갖는 반응이 종료된 검출액을 얻어 이를 분석하였다.

이때, 도 12 A는 상기 카드뮴 이온이 존재하는 시료에서 카드뮴 이온의 농도가 0 nM인 것이고, 도 12 B는 카드뮴 이온의 농도가 0.1 nM인 것이고, 도 12 C는 카드뮴 이온의 농도가 100 nM인 것이다.

도 12에 나타난 바와 같이, 시료 내에 카드뮴 이온이 많을수록 형성된 카드뮴 나노클러스터를 말디토프 질량분석기로 분석한 결과, 그래프의 2 번째 신호가 증가하고 있다는 것을 관찰하였다.

도 12C의 카드뮴이 없을 때와 그래프를 비교했을 때, 카드뮴 존재 시 피크의 shift된 정도인 2 kDa 을 카드뮴 분자량으로 나눠 계산한 바, 약 20개의 카드뮴 원자가 사람 혈청 알부민 안에 캡슐화 되어, 카드뮴 나노클러스터로 형성되었다는 것을 확인하였다.

< 시험예 9> 다양한 시료로부터 카드뮴 검출 유무 확인

도 13은 수돗물(A), 분수대물(B), 연못물(C)과 같은 실제 시료로부터 최적화된 조건하에서 본 발명의 카드뮴 검출 방법을 수행한 후의 시료에서 형광 이미지를 얻고 이의 형광세기를 분석(도 10D를 제외한 모든 그래프의 형광세기 및 이미지는 ChemiDoc system(Bio-rad)를 사용하였음)하여 나타낸 그래프이다.

구체적으로 상기 카드뮴 검출 방법은 55 ℃, 300 rpm로 상기 실제 시료 500 ㎕를 50 ㎎/㎖ 농도의 사람 혈청 알부민 500 ㎕과 혼합한 후, 2 분 후에 50 ㎕의 다양한 농도의 NaOH를 첨가하여 혼합해준다. 이후 다양한 시간동안 55 ℃ 조건하에서, 300 rpm로 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 자외선을 조사하여, 이에 대한 형광 스펙트럼을 측정하였다.

도 13에 나타난 바와 같이, 실제 시료에서 카드뮴 검출 한계는 수돗물 0.75 fM, 분수대 7.65 fM, 연못물 48.2 fM 이라는 것을 확인하였다(표 5 참고). 이러한 결과를 통해 실제 시료에서도 카드뮴의 농도를 매우 고감도로 측정할 수 있다는 것을 알 수 있다.

< 시험예 10> 본 발명에 따른 카드뮴 검출 방법의 특이성

본 발명에 따른 검출 방법이 카드뮴 이온에 대해서 특이성을 갖는다는 것을 확인하기 위하여, 아래와 같은 조건에서 검출을 수행하였다.

구체적으로 55 ℃, 300 rpm로 어느 하나의 금속 이온이 포함된 다양한 시료 500 ㎕를 50 ㎎/㎖ 농도의 사람 혈청 알부민 500 ㎕과 혼합한 후, 2 분 후에 50 ㎕의 다양한 농도의 NaOH를 첨가하여 혼합해준다. 이후 다양한 시간동안 55 ℃ 조건하에서, 300 rpm로 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 바로 자외선을 조사하여, 형광 스펙트럼을 얻고, 이에 대한 형광세기를 분석하여 도 14A 및 도 14B에 나타내었다.

상기 금속 이온은 카드뮴 이온(Cd ^{2 +} ), 금 이온(Au ^{3 +} ), 크로뮴 이온(Cr ^{3 +} ), 철 이온(Fe ^{2 +} ), 니켈 이온(Ni ^{2 +} ), 구리 이온(Cu ^{2 +} ), 은 이온(Ag ⁺ ), 세륨 이온(Ce ^{3 +} ), 팔라듐 이온(Pb ^{2 +} ), 수은 이온(Hg ^{2 +} )이다.

도 14는 카드뮴 이온에 대한 본 발명의 카드뮴 검출 방법의 특이성을 확인하기 위한 것으로, 상술한 과정을 통해 금속 이온을 포함하는 다양한 시료에 본 발명의 카드뮴 검출 방법을 수행하고, 이의 형광세기(fluorescence intensity(au))를 분석한 그래프이다. 도 14A는 ChemiDoc system(Bio-rad)을 이용하여 측정된 형광 이미지를 분석하여 얻은 그래프이고, 도 14B는 추가적으로 카드뮴 이온 (Cd ²⁺ ) 보다는 형광세기가 약하지만 어느 정도 형광을 보이는 금 이온(Au ³⁺ ), 크로뮴 이온(Cr ³⁺ ), 구리 이온(Cu ²⁺ )에 대해 TECAN을 이용하여 찍은 형광 스펙트럼 그래프이다.

도 14A 및 B에 나타난 바와 같이, 다양한 금속 이온들에 대하여 본 검출 방법의 특이성을 측정하기 위하여, 상술한 방법으로 각각의 금속 이온을 포함하는 다양한 시료를 검출 및 분석하여 비교한 결과, 카드뮴 이온을 포함하는 시료에 대해 검출한 결과가, 다른 금속 이온을 포함하는 시료에 대해 검출한 결과보다 형광세기가 약 4 내지 10 배 정도 더 강하게 나타났다. 이를 통해 본 발명의 검출방법은 카드뮴 이온에 대해 특이성 즉 선택성을 가지고 있다는 것을 알 수 있다.

따라서, 다양한 금속 이온이 존재하는 시료에서도, 카드뮴 이온과 본 검출 방법에서 사용되는 알부민과 선택적으로 반응하여 카드뮴 나노클러스터를 형성한다는 것을 확인하였기 때문에, 다양한 물질들이 혼재되어 있는 실제 시료에 본 발명에 따른 검출 방법을 수행하면 고감도 및 선택적으로 카드뮴 이온에 대한 존재 여부와 농도를 측정할 수 있음을 알 수 있다.

< 시험예 11> 본 발명에 따른 카드뮴 검출 방법에 대한 정확도

본 발명에 따른 검출 방법이 카드뮴 이온의 농도를 검출함에 있어서 정확성을 갖는다는 것을 확인하기 위하여, 아래와 같은 조건에서 검출을 수행하였다.

구체적으로 55 ℃, 300 rpm로 카드뮴 이온을 포함하는 다양한 시료 500 ㎕를 50 ㎎/㎖ 농도의 사람 혈청 알부민 500 ㎕과 혼합한 후, 2 분 후에 50 ㎕의 0.5 M NaOH를 첨가하여 혼합해준다. 이후 2 시간 동안 55 ℃ 조건하에서, 300 rpm로 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 바로 자외선을 조사하여, 형광 스펙트럼을 얻고, 이로부터 계산된 검출한계(LOD)를 표 5에 나타내었다. 상기 시료는 수돗물(tap water), 분수대물(fountain water), 연못물(pond water)에 상술한 바와 같이 이때, 10 ^-3 nM, 10 ^-2 nM, 10 ^-1 nM, 10 ⁰ nM의 농도로 카드뮴 이온을 각각 혼합하여 제조한 것이다.

검출한계(LOD)는 LOD=3 × S _R /m으로 계산될 수 있고, 이때 m은 검량선의 기울기이고, S _R 은 표준편차이다.

표 5는 카드뮴 이온을 포함하는 다양한 시료에 대하여 본 발명의 검출 방법을 통해 카드뮴 이온에 대한 검출한계를 계산하여 나타낸 것이다.

표 5에 나타난 바와 같이, 본 카드뮴 검출 방법은 0.75 fM, 7.65 fM, 48.2 fM의 검출한계(LOD)를 가지고 있음을 화인하였다.

본 발명의 카드뮴 검출 방법은 국제적으로 규정된 카드뮴의 허용범위보다 낮은 검출한계(LOD)를 가지기 때문에, 다양한 시료(수돗물, 분수대물, 연못물 등)에서 유해하지 않은 범위의 카드뮴 농도도 검출이 가능하기 때문에 보다 민감하게 카드뮴 이온 농도를 즉각적으로 검출할 수 있다.

한편, 55 ℃, 300 rpm로 카드뮴 이온을 포함하는 다양한 시료 500 ㎕를 50 ㎎/㎖ 농도의 사람 혈청 알부민 500 ㎕과 혼합한 후, 2 분 후에 50 ㎕의 0.5 M NaOH를 첨가하여 혼합해준다. 이후 2 시간 동안 55 ℃ 조건하에서, 300 rpm로 반응시키고(Incubated shaker, 제조사: Jeiotech(Korea), 모델명: SI-300R), 바로 자외선을 조사하여, 형광 스펙트럼을 얻고, 이로부터 측정된 카드뮴의 농도와 계산된 정확도를 표 6에 나타내었다. 상기 시료는 수돗물(tap water), 분수대물(fountain water), 연못물(pond water)에 상술한 바와 같이 이때, 0.5 nM, 1 nM, 5 ¹ nM의 농도로 카드뮴 이온을 각각 혼합하여 제조한 것이다.

이때, 정확도(%)은 측정된 카드뮴의 농도/시료에 첨가된 카드뮴 농도 × 100 (%)이다.

표 6에 나타난 바와 같이, 실제 알고 있는 농도의 카드뮴의 농도 대비 본 발명에 따른 검출 방법을 통해 이온을 검출한 결과, 80~110 %의 높은 정확도(%)을 갖는 것을 알 수 있다. 즉 실제 수돗물, 분수대물, 연못물에 존재하는 다양한 물질에 영향을 받지 않고, 높은 정확성으로 카드뮴 이온의 농도를 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.