수용액으로부터 중금속의 제거 및 분석을 위한 착화된 착화제 및 착화되지 않은 착화제에 대한 모노클로날 항체의 가변성 도메인의 폴리펩타이드

수용액으로부터 중금속의 제거 및 분석을 위한 착화된 착화제 및 착화되지 않은 착화제에 대해 모노클로날 항체의 가변성 도메인의 폴리펩타이드

본 발명은 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA)또는 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(DTPA)와 같은 수용성 컴플렉손(complexon)에 대해 높은 특이성과 결합성으로 결합하며, 이들 컴플렉손이 금속이온과 착화된 후에도 컴플렉손에 대해 높은 특이성과 결합성을 보유하는 모노클로날 항체(mAB)에 관한 것이다. 따라서, 이들 mAB는 EDTA또는 DTPA와 착화되는 독성 중금속을 제거시키기 위해, 예를 들어 필터 또는 다른 지지체에 결합시켜 사용할 수 있다. 더욱이, 이들 mAB는 수용액중의 EDTA또는 DTPA를 정량적으로 측정하기 위한 면역 검정(RIA, ELISA 등)의 성분으로도 적합하다.

EDTA와 같은 컴플렉손에 결합되는 중금속은 음료수 공급 분야에서는 심각한 위험물이다. 이러한 이유 때문에, EDTA 농도를 빠르고, 정확하며, 정량적으로 측정하는 것이 폐수 또는 음료수로부터 EDTA 금속 착물의 제거 만큼이나 매우 중요하다.

종양 치료를 목적으로 친수성 컴플렉손에 대한 mAB를 수득하기 위해 연구개 발하던중, 놀랍게도 본 발명자는 착화되지 않은 EDTA 또는 DTPA 및 금속-착화된 EDTA 또는 DTPA에 대해 높은 결합성을 갖는 mAB를 생성하는데 성공하였다.

mAB는 하기와 같이 제조된다. 실시예에서 각가 설명되는 바와 같이, 이소티오시아네이토벤질-DTPA는 합텐(hapten)으로서 사람 혈청 알부민에 결합되며 이트륨 이온과 착화된다. 이어서 이러한 합텐-담체-착물은 적합한 마우스를 면역화시키는데 사용되며, 가장 높은 항-DTPA 항체 역가를 갖는 마우스의 비장을 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 생성된 하이브리도마는 하기에 설명되는 특이 효소-결합된 면역검정법(ELISA)으로 시험된다.

ELISA에는 사람 혈청 알부민(HSA)-벤질-DTPA를 함유하는 용액이 부하된 고체상이 포함된다. 시험될 mAB를 함유한 상등액을 유리된 컴플렉손 또는 이의 금속 이온 착물과 예비항온처리하고,특정 고체상 대한 이의 결합을 측정한다. 이러한 목적을 수행하기 위하여, 항-마우스-면역글로블린 항체에 결합된 효소 증폭 시스템을 이용한다. 이 방법의 상세한 설명은 실시예 2 및 3에 기술되어 있다.

이러한 시험 시스템에 의하여, 표 1에 기술된 특성을 갖는 mAB가 수득된다.

많은 다른 항-DTPA/EDTA mAB와는 달리 이들 mAB는 APAAP 기술「참조 : Cordell et al., J. Histochem. Cytochem. 32:219, 1984]에 의해 냉동보존된 조직상에서 측정된 바와 같이 정상적인 사람 조직에는 결합하지 않는다. 따라서, 진단 및 치료분야에서 이들 mAB를 생체내에서 사용할 수 있다.

착화된 형태 및 착화되지 않은 형태의 컴플렉손 DTPA 및 EDTA (실시예 4)는 경쟁자로서 사용된다. 또한, 구조적으로 연관된 화합물 트랜스아코니트산 및 1,2-디아미노에탄은 억제제로서 사용된다.(참조: 표 I), mAB 항원 결합을 50% 억제시키는, 표 I 에 제시된 과량의 경쟁자는, 열거된 mAB가 착화되지 않는 EDTA 또는 DTPA 및 금속이온 착화된 EDTA 또는 DTPA에 강하게 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 특성으로 인해, 예를 들어 필터 또는 다른 고체 지지체상에 결합된 mAB를 액체로부터 착화되지 않은 EDTA 또는 DTPA 및 EDTP-금속 이온 또는 DTPA-금속 이온 착물을 제거시키는데 사용할 수 있다. 마찬가지로, mAB-/EDTA-금속 이온 착물의 침전반응은 독성 금속이온을 제거시키는데 적합하다.

이러한 사용에 특히 적합한 mAB는 EDTA 및 이의 착물과의 상호작용이 특히 강한 mAB BW 2050/535이다.

따라서, 본 발명은 금속 이온과 착화된 EDTA 또는 DTPA 및 착화되지 않은 EDTA 또는 DTPA에 대한 높은 친화성을 갖는 mAB, 이의 제조방법, 및 진단 또는 치료제의 성분으로서 또는 독성 금속 이온을 제거시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 실시예 및 특허청구범위에서 보다 상세히 기술된다.

[실시예 1]

(EDTA- 또는 DTPA- 특이적 mAB의 제조)

합텐으로서 이소티오시아네이토벤질-DTPA를 문헌「참조: NW Brechbiel et al., Inorganic Chemistry 25: 2772-2781 (1986)]에 따른 방법에 따라 담체로서 사람 혈청 알부민(HSA)에 HSA분자당 19개의 벤질-DTPA 분자 비율로 결합시킨다. 비표지된 YCl ₃ 가 착화된 합텐-담체 착물 20

[실시예 2]

(DTPA 또는 EDTA 착물에 의한 mAB에 대한 정량적 억제 ELISA)

분할될 수 있는 96-웰 폴리스티렌 미세역가 평판(U-형) 타입 B(Nunc에서 공급, 제4-60445)를 지지체 물질로서 사용한다. 검정은 하기 방법에 따라 수행한다.

(1) pH 7.2의 PBS

(2)상등액을 흡출시키고, pH 7.4의 0.05M 트리스-시트레이트 완충액(세척용액1)을 사용하여 3회 세척한다(1회 세척시, 웰당 세척 용액 250㎖을 도입하고 2분동안 정치시킨후 흡출시킨다).

(3)미세역가 평판이 즉시 필요하지 않은 경우, 이를 RT에서 밤새 셀룰로오즈상에 정치시킨다(입구를 밑으로 하여). 이어서 평판을 밸런스 건조기(Gaplast에서 공급, Postfach 529, 8100 Garmisch-Partenkirchen)를 사용하면서 필름으로 열-밀봉시킨다. 이 조건하에서, 평판은 4

(4)웰당 차단 용액(blocking solution) 250㎖를 적용시키고, 30분 동안 37

(5)차단시키는 동안, 희석된 하이브리도마 상등액을 경쟁자와 예비항온처리한다.(참조: 실시예 3 또는 실시예 6).

(6)적당히 예비 희석되고 예비 항온처리된 시험될 하이브리도마 상등액 50㎖를 웰당 적용시키고, 30분 동안 실온에서 항온처리한다.

(7)이어서 세척 용액 2를 사용하여 3회 세척한다.

(8)다음, 차단 용액중에 1:500의 비율로 희석되고 알칼리 포스파타제로 표지된 염소-항-마우스-IgG ₁ 항체 50㎖를 웰당 적용시키고, 30분 동안 실온에서 항온처리한다.

(9) Enzygnost ^R (Boehringwerke AG )세척 용액을 사용하여 3회 세척한다.

(10)이어서, 0.1mM NADP 50㎖를 가한다.

(11)다음, 30분 동안 실온에서 항온처리한다.

(12)NADP와 항온처리하는 동안, 증폭제 시스템은 하기와 같이 제조한다 : 평판당- p-요오도 니트로테트졸륨 바이올레트(INT) 2부 및 pH 7.2의 PBS 1부, 또한 디아포라제(DIAPHORASE) 1부를 가하고, 또한 ADH 1부를 이 혼합물에 피펫팅한다.

(13)증폭제 시스템 50㎖를 웰당 가한다.

(14)투명한 색에서 적색으로 선명한 색변화가 발생하는 경우, 웰당 0.1NH ₂ SO ₄ 용액 100㎖를 가하여 반응을 정지시킨다.

(15)흡광도를 TITERTEK ^R MULTISCAN으로 492nm에서 측정한다.

블랭크값은 증폭제 용액 50㎖ 및 0.1NH ₂ SO ₄ 100㎖와 함께 NADP 50㎖를 사용하여 측정한다.

하기 시약이 사용된다:

NADP-Sigma에서 공급, 주문번호 N-0505,

INT-Sigma에서 공급, 주문번호 I-8377,

ADH-Sigma에서 공급, 주문번호 A-3263,

디아포라제(DIAPHORASE)-Sigma에서 공급, 주문번호 D-2381,

세척용액2-Behring에서 공급, 주문번호 OSEW96, Tween/PBS 함유,

차단용액: 카제인을 가하고 30분 동안 교반시켜, pH 7.2의 PBS중에 3% 카제인 용액을 제조한 후, pH를 7.4로 조절하고, 이어서 입자를 10분동안 4000rpm에서 원심분리시켜 제거시킴.

희석되고 알칼리 포스파타제로 표지된 염소 항-마우스-IgG ₁ (Southern Biotechnology Associates에서 공급, 카달로그 제 1080-04번), 0.1mM NADP 제제 : 20mM Tris, 0.1mM MgSO _4, pH9.5 100

[실시예 3]

(하이브리도마 상등액과 경쟁자의 예비항온처리)

하이브리도마 상등액중의 마우스-IgG 농도를 시판되는 정략적 ELISA 시스템을 이용하여 측정할 수 있으며 이는 당해 분야의 기술 수준으로 가능하다.

ELISA에서 측정된 농도를 참조하여, 하이브리도마 상등액을 Ca ⁺⁺ 및 Mg ⁺⁺ 가 없는 PBS중에 1.25

g을 몰로 전환: 150,000은 1몰 mAB이므로 1.25

^-12 몰.

mAB와 억제제를 1:1 로 취하기 위하여, 8.33×10 ^-12 몰/200

^-12 몰/ 의 농도를 갖는 하이브리도마 상등액 50 에 가한다.

하이브리도마 상등액을 실온에서 30분동안 100,000배, 50,000배, 10,000배, 5,000배, 1,000배, 및 100배 과량의 경쟁자와 함께 항온처리한다. 항온처리물 50

[실시예 4]

(DTPA 또는 EDTA 착물의 생성)

표 1에 나타난 금속 이온에 대한 DTPA 또는 EDTA의 착화 상수는 매우 크므로 DTPA 또는 EDTA와 이들 금속 이온의 등몰량 혼합물의 경우 완전한 포화가 예상된다. 따라서, 적합한 금속 이온을 3배몰 과량으로 DTPA 또는 EDTA와 항온처리한다. 하나의 예로서, 2회 증류시킨 물(2차 증류수)중의 10mM 황산카드뮴 용액(참조:실시예 5) 170

[실시예 5]

(사용된 금속이온의 공급원 및 관련된 물리화학적 변수)

하기 금속 이온 10밀리몰 용액을 2차 증류수중에 제조한다:

염화망간 MW 161.88:Merck에서 공급, 제5934번, Mn의 이온 반경: 80pm

황산카드뮴 MW 256.5: Riedel de Haen에서 공급, 제31145번, Cd의 이온 반경:97pm

염화아연 MW 136.28 : Merck에서 공급, 제8816번, Zn 의 이온 반경:74pm

황산구리 MW 159.61 : Riedel de Haen에서 공급, 제 31294번, Cu의 이온 반경: 96pm

염화이트륨 MW 303.36: Aldrich에서 공급, 제20,491-9호, Y의 이온 반경: 92pm

질산납(II) MW 331.20: Riedel de Haen에서 공급, 제31137호, Pb의 이온 반경:120pm

[실시예 6]

(수성 용매중의 EDTA 또는 DTPA 농도를 측정하기 위한 경쟁적 효소 면역검정)

실시예 2에 기술된 정량적 억제 ELISA에서, 측정될 미지의 EDTA함량을 갖는 수성 샘플(50

[실시예 7]

(특히 적합한 mAB BW 2050/535의 설명)

mAB BW 2050/535의 V _H V _L 유전자를 문헌 [참조: Orlandi et al., Proc. Nat1. Sci. USA 86, 3833 (1989)]에 기술된 방법으로 클로닝시킨 후 서열 분석한다. mAB BW 2050/535의 V _H 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 표 2에 나타나 있으며, V _L 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 표 3에 나타나 있다. V _H 유전자의 서열은 성숙한 단백질의 아미노산 4 내지 110의 암호화 서열을 함유한다. V _L 유전자의 서열은 성숙한 단백질의 아미노산 3 내지 106의 암호화 서열을 함유한다. 아미노산은 3문자 코드로 나타내었다.