器官移植后慢性排斥反应的检验方法以及尿液组分的测定方法

技术领域

本发明涉及一种通过检测从身体取出的体液，检测在器官移植后开 始的慢性排斥反应的方法。具体地讲，本发明涉及通过测定体液中的三 氧化氮(NO3)、基质金属蛋白酶(称作“MMP-2”)或其前体，检 测在器官移植后的慢性期出现的排斥(慢性排斥)的方法；本发明还涉 及测定尿液中的MMP-2或其前体的方法。

本发明背景

对肾移植患者，通常通过肾活组织检查来诊断慢性排斥反应。然 而，患者所经受的定期肾活组织检查有可能使其肾功能受到损害。而 且，上述的慢性排斥反应进展缓慢，并伴有不良的主观症状，因此大多 的患者拒绝接受痛苦的肾活组织检查。

同时，因为由于慢性排斥反应导致肾功能损害，已有人进行了肾功 能检查以给出表明慢性排斥反应进展的指标。在所述检查中，将作为蛋 白质通透性升高、反映肾小球异常的尿蛋白、尿白蛋白和运铁蛋白等指 标加以测定分析，并将血肌酸酐、血液尿素氮(BUN)、血液β2-微球 蛋白和血液α1-微球蛋白作为肾小球过滤速率(GFR)下降的指标加以 分析测定。然而，在慢性排斥反应的进程中，该检查的测定值变化温和， 而当检测到异常测定值时，所述的慢性排斥反应已经产生了晚期症状。 到目前为止，还没有任何一种已知的方法能够通过检测体液如尿液和血 液中的内源物质来早期检测慢性排斥反应。由于目前还没有简单的检测 方法，如得不到适当的治疗，具有慢性排斥不良主观症状的患者将步入 晚期，经常导致所述的患者丧失其肾功能。

本发明的目的在于提供一种在器官移植后的早期就能检测到慢性 排斥反应的简单方法。

本发明的公开

NO3和NO2是NO自由基在生物体内的最终代谢产物。NO自由基 是在发生炎症和器官损伤时由有粒白细胞和巨嗜细胞产生的。因此这些 代谢产物在发生炎症、由于器官损伤导致的局部缺血性心脏病、休克、 移植后的急性排斥和细菌感染期间可临床检测到。然而，还没有有关移 植后慢性排斥期间的NO自由基的报道。所以，对进展缓慢的排斥反应 是否引起在体内产生NO3以及体液内的NO3是否能作为测验慢性排斥 的标志进行了研究，并已经发现体液内的NO3能作为慢性排斥的检测标 志。

而且，MMP-2，一种降解组成基底膜的胶原的酶，在组织恢复和 再生期间发挥作用。对于癌症，还认为该酶是在癌细胞浸润到基底膜期 间降解胶原的酶。经过深入细致的研究，本发明的发明人已经发现 MMP-2或其前体从不渗漏到(即使有渗漏的话，也只有痕量的MMP-2 或其前体渗漏到)正常个体或肾移植后没有发生慢性排斥反应的患者的 体液如尿液中，而在器官移植后发生了慢性排斥的患者的体液如尿液中 MMP-2或其前体的量却急剧增高。基于以下发现，即，在器官移植后 开始发生慢性排斥反应之后分泌到体液如血液和尿液中的内源物质如 NO3和MMP-2或其前体的浓度显著增高的这一发现，本发明提供了一 种通过检测体液如尿液和血液中的内源物质来检测器官移植后的慢性 排斥反应的方法；根据该方法使用的测试试剂盒；以及测定尿液中的 MMP-2或其前体的方法。

具体地讲，本发明涉及：

(1)一种早期检测在器官移植后发生的慢性排斥反应的方法，该 方法对从身体取出的体液进行检测；

(2)一种检测在器官移植后发生的慢性排斥反应的方法，其特征 在于检测体液中的三氧化氮(NO3)、基质金属蛋白酶(MMP-2)或 其前体；

(3)上文(2)所述的方法，其特征在于检测体液中的NO3；

(4)上文(2)所述的方法，其特征在于检测体液中的MMP-2 或其前体；

(5)上文(2)、(3)或(4)所述的方法，其中所述的体液 包括人尿或血液；

(6)上文(2)所述的方法，其特征在于检测尿样中的MMP-2 或其前体；

(7)上文(2)、(3)、(4)、(5)或(6)所述的方法， 其中所述的器官移植是肾移植；

(8)上文(6)所述的方法，其特征在于预先设定用于判定在肾 移植后是否出现了慢性排斥反应的判定值，基于尿样中的MMP-2前体 的浓度，该判定值在0.1-10.0ng/ml的范围内；

(9)上文(8)所述的方法，其特征在于将所述的判定值预先设 定在0.5-5.0ng/ml的范围内；

(10)上文(6)所述的方法，其特征在于检验尿样中的MMP- 2前体的浓度和肌酸酐浓度，预先设定用于确定在肾移植后是否出现了 慢性排斥反应的指数判定值，以肌酸酐浓度校正后，该指数判定值在 0.1-20.0ug/g肌酸酐的范围内；

(11)上文(10)所述的方法，其特征在于将所述的判定值预先 设定在0.5-10.0ug/g肌酸酐的范围内；

(12)上文(2)、(4)-(11)中任一项所述的方法，其中 所述的检测以免疫测定方法进行；

(13)上文(12)所述的方法，其中所述的免疫测定是酶免疫测 定；

(14)上文(12)或(13)所述的方法，其中所述的免疫测定 是夹心测定；

(15)一种用免疫测定来检验尿中MMP-2或其前体的方法；

(16)一种用于早期检测在器官移植后发生的慢性排斥反应的试 剂盒，该试剂盒用于对从身体取出的体液进行检验；

(17)一种用于检测在器官移植后发生的慢性排斥反应的试剂 盒，该试剂盒用于检测体液中的三氧化氮(NO3)、基质金属蛋白酶 (MMP-2)或其前体；

(18)一种用于检测在器官移植后发生的慢性排斥反应的试剂 盒，该试剂盒用于检测尿液或血液中的MMP-2或其前体；

(19)上述(18)所述的试剂盒，其中所述的检测以免疫测定方 法进行；

(20)一种早期诊断器官移植后发生的慢性排斥反应的方法，该 方法通过检验体液而进行；

(21)一种诊断器官移植后发生的慢性排斥反应的方法，其特征 在于检测体液中的三氧化氮(NO3)、基质金属蛋白酶(MMP-2)或 其前体；

(22)上述(21)所述的诊断方法，其中所述的体液包括尿液或 血液。

附图的简要描述

图1是显示肾移植患者的尿MMP-2前体浓度的直方图；

图2是显示肾移植患者的尿MMP-2前体浓度经肌酸酐浓度校正后 的直方图。

实施本发明的最好方式

本发明提供了一种通过检测由于器官移植后的慢性排斥而分泌到 体液中的内源物质，以简单的方式来早期检测器官移植后的慢性排斥反 应的方法。根据本发明，体液(样品)包括人等的体液如尿液和包括血 清和血浆在内的血液组分。任何尿样均可使用，如果该样品是经收集的 或该样品是经收集并贮藏的，只要要被检测的物质如MMP-2或其前体 可能稳定。对收集尿样的方法和时间没有特别的限制，只要它们不损害 MMP-2或其前体等的临床意义即可。任何以常规方式收集并贮藏的尿 样均可使用。有时可将尿液收集在例如加有抗菌剂的容器中，以在尿样 贮藏期间维持其稳定性，只要所加的抗菌剂不干扰所述的测定，这样的 尿样就可采用。另外，不受特别的限制，器官移植包括肾移植、肝移植、 心移植和胰腺移植，但是肾移植是特别优选的。

内源物质包括三氧化氮(NO3)、基质金属蛋白酶(MMP-2)或 其前体等。

分析测定(定量测定等)样品内的NO3量的方法是已知的(例如， Griess方法等)，根据本发明，NO3的量可按已知方法测定。例如，可 采用测量硝酸盐型氮和亚硝酸盐型氮的商售自动分析仪，用高性能液相 色谱(HPLC)来测定NO3。NO3也可采用96孔小平板和商售的NO比色试剂盒以及NO荧光分析测定试剂盒，用小平板读出器等加以分析 测定。另外，任何能够测定NO3的系统均可采用。

NO3存在于正常个体或接受了器官移植但没有发生慢性排斥反应 的患者的血清等中，但是，器官移植后发生了慢性排斥反应的患者血清 等中的NO3的量却显著增高。因此，通过将判定值预先设定为某一适当 的数值，就可高精确度地判定出在患者中是否发生了慢性排斥反应。所 述判定值的大小取决于所用样品的类型或移植器官的类型。必须根据这 些类型适当确定判定值，但是，对于肾移植患者的血清样品而言，该判 定值优选在50-120uM(血清中的NO3浓度)的范围内。

MMP-2以其前体，前-MMP-2，的形式从细胞中释放出来。然后， 所述的前体再转化为MMP-2。根据本发明，术语“MMP-2的前体”是 指能够有可能转化为MMP-2的物质，尤其指前-MMP-2。该前-MMP-2 可与抑制剂如TIMP(金属蛋白酶的组织抑制剂)-2和TIMP-1形成复 合物，本发明中所述的前体包括以这些复合物形式存在的前-MMP-2。 该前-MMP-2可以任何形式存在，对此本发明没有特别限制。

分析测定(定量测定等)样品中的MMP-2或其前体的方法是已知， 根据本发明，可由已知方法测定(定量测定)MMP-2或其前体。例如， 可在对MMP-2或其前体特异的系统中完成分析测定MMP-2或其前体的 方法，以确定以蛋白质浓度或酶活力水平表示的MMP-2或其前体的浓 度。对MMP-2或其前体特异的任何方法均可用来确定MMP-2或其前体 等的浓度，本文对这些方法没有特别的限制，但是，可优选采用重现性 好且高度敏感的方法。

具体地讲，测定蛋白质浓度的方法包括采用对MMP-2或其前体特 异的抗体的免疫学方法。另外，测定酶活力水平的方法包括采用对 MMP-2有高特异性的底物的生物化学方法。

按照测量酶活力的生物化学方法，对MMP-2有高度选择性的底物 包括很难被样品中的酶(例如，丝氨酸蛋白酶、肽酶和酯酶，除了 MMP-2)水解的底物和易被MMP-2水解的底物，所述的底物包括，例 如，明胶、胶原蛋白或具有这些特征性结构部分的合成底物；而优选的 底物包括(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰-L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L- 亮氨酰-L-(N-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基丙腈)-L-丙氨酰 -L-精氨酰胺(MCA)或N-乙酰-L脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L-亮氨酰- L-亮氨酰-甘氨酸乙酯。

至于测定MMP-2酶活力的方法，可对MMP-2水解底物得的水解 产物直接加以测定，或者结合采用可高度敏感地特异分析任何所述水解 产物的系统来对酶活力进行间接测定。

分析测定(定量测定等)MMP-2前体的方法可按如下方法进行， 即，通过已知方法(例如，用胰蛋白酶处理或用乙酸4-氨基苯基汞处理) 将MMP-2前体降解成MMP-2，并分析测定所产生的MMP-2的酶活力。

所有的已知免疫测定方法均可采用。可采用通常的固相免疫测定 法，包括夹心测定法、竞争测定法和结合抑制测定法。具体的方法包括： 采用将其中的底物固定在固体载体(不是抗体)上的测量系统并利用酶 和底物间的结合能力的方法，和不采用标记抗体通过表面胞质团反应 (SPR)而直接检测MMP-2或其前体与固定化的抗体结合的方法。这 些方法更具体地公开在日本专利公开No.60-2187、日本专利公开 No.7-34014和日本专利公开No.6-213888和No.7-159402中。另外，测 定方法还可包括利用凝集反应的方法或采用乳汁和血细胞的比浊法以 及Western印迹法。在测定原理方面不同的这些方法均可用于所述的测 定。通常，利用固定在不溶载体上的抗体和标记抗体的夹心测定法是优 选的。

免疫测定中采用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。任何种类 的动物均可做为所述抗体的来源。当采用两种类型的抗体如在夹心测定 法中，将固定化抗体和经标记的抗体结合起来形成三明治型的复合体即 可令人满意，无论所述的固定化抗体和经标记的抗体是相同种的抗体还 是不同种的抗体。至于用于标记抗体的物质，放射性物质、酶、荧光物 质和生物素均可采用。

根据本发明的用于检测慢性排斥反应的本发明方法，可将MMP-2 或其前体(蛋白质浓度或酶活力水平等)的测量值本身或其增高值直接 用于判定慢性排斥的存在与否，也可通过计算出与其他标记的比值来得 出该值的相对值，将该相对值作为MMP-2或其前体的指数用于进行所 述的判定。例如，对于尿样而言，本文描述了基于尿肌酸酐浓度的校正 方法(该方法的特征在于用尿中的肌酸酐浓度去除MMP-2或其前体的 浓度)。为实践本发明的方法，优选将判定值预先设定在能将至少90％ 或以上的在器官移植后器官功能基本正常的患者判定为正常的范围 内。也可定期地对器官移植的患者进行NO3或MMP-2或其前体的测 定，并根据所得到的测量值或上述指数的增高值来确定慢性排斥发生了 与否。

根据本发明，如以下实施例所示，还可实施对含有底物如明胶的聚 丙烯酰胺凝胶进行电泳，来检测由于底物如明胶的分解而产生的条带出 现与否的方法，该方法不用对样品中的MMP-2或其前体进行定量。

下面结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不仅限于这些 实施例。 实施例1

对肾移植后凭肾活组织检查诊断为发生了慢性排斥反应的患者的 血清样品(A)、凭肾活组织检查等诊断为没有发生慢性排斥反应的患者 (该患者的肾功能几乎近于正常，其血清的肌酸酐水平为1.2mg/100ml 或更低)的血清样品(B)和正常个体的血清样品(C)，用硝酸盐型氮和亚 硝酸盐型氮自动分析仪(TCI-NOX1000，东京化学工业株式会社出品) 进行了NO3量的测量。结果如表1所示，肾移植后诊断出发生了慢性排 斥反应的患者的血清NO3浓度明显高于肾移植后具正常肾功能的患者 的血清NO3浓度和正常个体的血清NO3浓度。该表显示，血液中的NO3可作为慢性排斥反应的有效标志。

表1 肾移植患者和正常个体的

血清NO3浓度(μM)     样品 样品数目(n) 平均值±标准误差     范围 血清A(慢性排斥反应)     15    238.2±133.3* 74.3-536.5 血清B(无慢性排斥反应)     24     35.8±21.6  4.3-83.7 血清C(正常个体)     7     31.6±15.0  15.4-59.6

*P＜0.01；与无慢性排斥反应的患者或正常个体组的比较(T-测验) 实施例2(酶谱，MMP-2的生化检测)

向尿样中加入等体积的含8％SDS和40％甘油的0.5MTris缓冲液 (pH6.8)，然后充分混合。在制备好含1mg/ml明胶的8％聚丙烯酰胺凝 胶后，将上述混合物在该凝胶中电泳。电泳后，于室温下将凝胶在含2.5％ Triton X-100的10mM Tris缓冲液(pH8.0)中振荡漂洗两次，30分钟。 接着，将缓冲液置换为含0.5mM氯化钙和10μM氯化锌的50mM Tris 缓冲液(pH8.0)，于37℃下温育16小时。用1％考马斯蓝R-250、5％ 乙酸和10％甲醇对凝胶染色30分钟，接着用5％乙酸和10％甲醇脱色。

在蓝色的背景下，在明胶被酶(MMP-2)降解的位置上观察到透明的 带。 实施例3

按实施例2的方法，对下述患者的尿样进行MMP-2活力的测量： 一年或多年以前接受了肾移植并凭肾活组织检查和血清肌酸酐值 (2.0mg/100ml或更高)诊断出发生了慢性排斥反应的患者；和肾移植后一 年之内凭肾活组织检查等诊断为没有发生慢性排斥反应，其肾功能几乎 近于正常的患者(对照组)。结果，在10名发生了慢性排斥反应的患者的 尿样中有8个检测到分子量为70KD的MMP-2，而在对照组的14个尿 样中仅在1个中检测到了MMP-2。

这些结果表明，MMP-2浓度的增高可作为慢性排斥反应的有效标 志。 实施例4(由免疫测定法测定尿MMP-2前体的浓度)

使用含有两种单克隆抗体的血清MMP-2检测试剂盒，所述两种单 克隆抗体在不同的位点识别MMP-2前体分子(用于检测前-MMP-2和用 于检测TIMP-2与前-MMP-2的复合体，而不是用于检测MMP-2)(由富 士药物工业株式会社制造)。由于尿液中的前-MMP-2的浓度比血清中的 低，须对测量血清时采用的方法的条件加以修改，以用于尿液中前体的 测定。具体地讲来，将150ul尿液或试剂盒所含的标准溶液放入试管中， 然后加入含有1％牛血清白蛋白和10mM EDTA的30mM磷酸盐缓冲液 (pH7.0)，接着进行充分混合，并向所得的混合物中加入结合了抗体的 珠子，于室温下反应2小时，用吸气器进行吸气，除去反应溶液，然后 加入试剂盒所含的被标记抗体的溶液300μl，在室温下反应1小时，在 吸气下再次除去反应溶液后，将珠子转移到另一个试管里，然后加入 300μl显色溶液，并在室温下反应30分钟。向所得的反应溶液中加入试 剂盒所附的终止溶液1500μl，使反应终止。以蒸馏水为对照，在492nm 波长下测量反应溶液的吸光度，然后基于按标准溶液的吸光度而做的标 准曲线，来确定尿样中的前-MMP-2的浓度。同时，以常规的方式测定 尿液中的肌酸酐浓度，用以计算出以肌酸酐校正的尿前-MMP-2浓度。 实施例5

按实施例4所述的方法，对来自下列患者的尿样进行前-MMP-2浓 度的测定：肾移植一年或多年后基于肾活组织检查和血清肌酸酐浓度被 诊断为发生了慢性排斥反应的8名患者(发病组)；和肾移植后一年内基 于肾活组织检查等被诊断为没有发生慢性排斥反应，其肾功能几乎近于 正常(其血清肌酸酐的浓度为1.5mg/100ml或更低)的36名患者(对照 组)。

进行了和没进行肌酸酐校正的直方图示于图1和图2中。在没有进 行肌酸酐校正的情况下，通过将判定值预先设定为1ng/ml，对照组中有 92％被判定为阴性，同时肾移植后诊断出慢性排斥反应的患者组100％ 被判定为阳性。在进行了肌酸酐校正的情况下，通过将判定值预先设定 为5μg/g肌酸酐，对照组中的95％被判定为阴性，同时肾移植后诊断出 慢性排斥反应的患者组100％被判定为阳性。即使把判定值设定为1μg/g 肌酸酐，对照组中仍有89％被判定为阴性。 实施例6

按照实施例4所述的方法，对2名肾移植患者在由于肾移植而致的 慢性排斥反应发生前和发生后的尿样进行了前-MMP-2浓度(肌酸酐校 正后的值)的测定。结果列于表2。在慢性排斥反应发生后，前-MMP-2 的浓度极大地升高，这表明前-MMP-2浓度的升高可有效地用于判定肾 移植导致的慢性排斥反应。

表2     发病前     μg/g肌酸酐     发病后     μg/g肌酸酐     患者1     1.3     14.6     患者2     0.6     29.4

工业实用性

通过实施本发明的方法，凭借体液(样品)如血清和尿液中NO3、 MMP-2或其前体浓度的增高，能够在慢性排斥反应的早期即将其检测 出来。