测定游离铜的方法 |
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申请号 | CN201480023975.4 | 申请日 | 2014-04-29 | 公开(公告)号 | CN105556288A | 公开(公告)日 | 2016-05-04 |
申请人 | 卡诺克斯4德鲁格有限公司; | 发明人 | 尼古拉·安东尼·克拉布弗; 弗朗西斯科·贝拉尔迪; 马尔塞洛·莱奥波尔多; 罗伯托·佩罗内; 罗莎娜·斯科尤缇; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种用于测定血清中“游离” 铜 (即结构上没有结合到铜蓝蛋白的血清铜部分)的新方法。本发明还涉及一种高敏感度和 精度 的用于测定患有阿尔茨海默氏病的患者的血清样品中游离铜的方法。 | ||||||
权利要求 | 1.一种用于在体外测定血清样品中游离铜的浓度的方法,包括以下步骤: |
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说明书全文 | 测定游离铜的方法技术领域[0001] 本发明涉及一种测定血清中“游离”铜(即结构上没有结合到铜蓝蛋白的血清铜部分)的新方法。本发明还涉及一种高敏感度和精确度的测定患有阿尔茨海默氏病的患者的血清样品中游离铜的方法。 背景技术[0002] 血清铜的测定在大量疾病中是最重要的,例如在阿尔茨海默氏病(AD)中。阿尔茨海默氏病是一种神经性疾病,其特点是记忆力减退和进行性痴呆。该疾病出现的原因与β-淀粉样(Aβ)蛋白和Tau肽在大脑内的聚集密切相关。而且,载脂蛋白E(APOE)基因的ε4等位基因已被证明增加阿尔茨海默氏病的风险。关于“淀粉样蛋白级联”,其被公认为阿尔茨海默氏病发病的最流行假说,最近出现了新的细节。事实上,不同的致病途径已被假定促进阿尔茨海默氏病的发病和进展。有大量证据证明氧化应激,主要通过金属氧化还原反应,可引起对阿尔茨海默氏病的大脑的大脑损伤。具体地,已经提出β-淀粉样蛋白的超金属化可以基于氧化应激和过氧化氢生产的氧化还原循环,确定Aβ蛋白低聚体的形成和沉淀。金属体内平衡的紊乱导致游离铜的形成,游离铜的形成可能供给大脑铜储层并进入Aβ氧化应激循环,产生对阿尔茨海默氏病的多效性。这篇论文现在得到了多方面的证据支持,这些证据显示游离铜略有增加,但在阿尔茨海默氏病患者的血清中上升显著。 [0003] 铜蓝蛋白是血液中的主要载铜蛋白质,且其在结构上结合6个铜原子以形成蛋白质的活性形式,该活性形式占循环铜的约85-95%,剩余的铜被定义为游离铜。在先前的研究中,本发明人常从铜和铜蓝蛋白的测量开始测定血清中的游离铜,计算如下:血清铜浓度通过用原子吸收光谱技术,该技术利用配备了具有HGA800平台的石墨炉的A Aanalyst 300 Perkin Elmer原子吸收分光光度计,或根据Abe等人Clin Chem 1989(Randox Laboratories,Crumlin,UK)的比色测定法测量进行复核;铜蓝蛋白的浓度通过根据Wolf PL Crit Rev Clin Lab Sci 1982的免疫比浊法(Horiba ABX,Montpellier,France)进行分析,对于每个血清铜和铜蓝蛋白对来说,已经根据Walsh等人Ann Clin Biochem 2003描述的标准方法计算了结合到铜蓝蛋白上的铜(CB)的量和未结合到铜蓝蛋白上的铜(“游离”铜)的量。该计算用μmol/L表达“游离”铜并基于铜蓝蛋白包含0.3%的铜的证据。而且,本发明人最近描述了测量铜蓝蛋白氧化酶活性的方法,该方法采用邻联茴香胺二盐酸盐为底物。 [0004] 先前,已经描述了从商业标准(Human Serum Ceruloplasmin,Sigma-Aldrich)的蛋白质氧化酶活性开始测定铜蓝蛋白的量的方法,但是光谱分析显示蛋白质的吸光度峰衰减,降低了利用酶法检测以量化蛋白质的量的信心,该蛋白质的量对估计游离铜的值来说是必须的。 [0005] 基于现有技术所描述的酶法对铜和铜蓝蛋白进行定量具有一些缺点,如高成本、市售铜蓝蛋白的可变纯度、一般建议采用国际单位(UI)报告血清酶以及所测定的浓度准确度低。 [0006] Hyo Jung Sung等人(J.Am.Chem.Soc.2009)描述了用于测定生物体系中的游离铜的香豆素探针的合成和使用。 发明内容[0008] 本发明的目的是一种用于在体外测定血清样品中游离铜的浓度的方法,包括以下步骤: [0009] (a)将血清样品装载在树脂上进行固相萃取,得到结合级分和包括游离铜的洗脱级分; [0010] (b)使用香豆素荧光探针测定在步骤a)中洗脱出的级分中的游离铜的浓度。 [0011] 本发明的另一个目的是用于在体外测定游离铜的浓度以诊断患者的阿尔茨海默氏病的方法,该方法包括同样的步骤a)、步骤b)和将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值)进行比较的另一步骤c),其中较高浓度的游离铜确认阿尔茨海默氏病的临床诊断。 [0012] 本发明的另一个目的是用于在体外测定游离铜的浓度以预后患者的阿尔茨海默氏病的方法,其中在随后的时间点对从患者处收集的血清样品重复方法的步骤a)和步骤b),并对这些样品中的游离铜的浓度随时间的进展进行评估。 [0013] 本发明的另一个目的是用于在体外测定游离铜的浓度以评估患有轻度认知功能障碍的患者从轻度认知功能障碍的状态(MCI)向阿尔茨海默氏病转化的可能性的方法,该方法包括同样的步骤a)、步骤b)和将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值)进行比较的另一步骤c),其中较高浓度的游离铜指出从轻度认知功能障碍向阿尔茨海默氏病的转化。 [0014] 本发明的另一个目的是一种用于检测血清中的游离铜的试剂盒,包括一个或多个对固相进行层析萃取的装置和一个或多个香豆素荧光探针。 [0015] 本发明人观察到由于血蛋白的存在,对血清中的游离铜的浓度估计不准确;而且,他们还观察到从血蛋白中分离低分子量化学元素的各种方法(例如用膜过滤设备)不能准确测定游离铜的浓度。在本文中所描述的发明是基于从血蛋白中分离游离铜的步骤的选择和荧光探针的特殊种类的选择。 [0016] 本发明的方法相比于现有技术的测定方法具有多个优点: [0017] -能够高精度和准确地测定血清中的游离铜的浓度; [0018] -允许用非常降低的成本和时间测定血清中游离铜的浓度; [0020] 图1.在Cu++(10-4M)存在下在HEPES:DMSO 9:1(λex=430nm,490nmλem)中香豆素荧光探针7-(二乙氨基)-2-氧代-N-((吡啶-2-基)甲基)-2H-色烯-3-甲酰胺的校正曲线。 [0021] 图2.在Cu++(10-5M)存在下在HEPES:DMSO 9:1(λex=430nm,490nmλem)中香豆素荧光探针7-(二乙氨基)-2-氧代-N-((吡啶-2-基)甲基)-2H-色烯-3-甲酰胺的校正曲线。 [0022] 图3.受试者工作特征(ROC)曲线。根据本发明的一个实施例对702个样品进行了分许。曲线表明采用本发明,阿尔茨海默氏病的诊断能够获得高特异性(80%)和离散敏感性(60%)。 [0023] 图4.根据血清游离铜含量预测受阿尔茨海默氏病影响的患者的恶化概率模型(简易精神状态检查)。圆圈代表患者的游离血清铜的值。线代表简易精神状态检查恶化的预测概率的模型。这些患者来自具有高于-0.138的Z值,对应于2.1μmol/L的游离铜值,比游离铜值低于该含量的那些患者具有增加的恶化概率的当前研究小组。 [0024] 图5.游离铜浓度还能够用于预测抱怨轻度认知功能障碍的受试者的百分比,这些受试者将发展阿尔茨海默氏病。具有大于1.6μM的游离铜浓度的轻度认知功能障碍的受试者具有较高的转化为阿尔茨海默氏病的百分比。 [0025] 图6.根据一个实施例用于实施本发明的方法的装置的照片。 [0026] 图7.通过固相萃取分离的血清样品的分光光度分析。分光光度分析能够证实蛋白质存在于滤液中;越高蛋白质的存在,游离铜就回收率方面的性能就越差,因为这些蛋白质遮挡铜读取。随着曲线宽度减少,蛋白质成分降低,因此游离铜的回收率提高。 [0027] 图8A和8B.通过膜过滤分离的血清样品的分光光度分析。 [0028] 图9.描述了多项式和“非参数局部加权散点平滑”(局部加权散点平滑)线性回归分析,得到依据现有技术的参考测试(计算铜)或依据根据本发明的方法(C4D)测定的未结合到铜蓝蛋白上的铜(非-CP铜)的值。 [0029] 图10.描述了依据现有技术的参考测试(计算铜)或依据根据本发明的方法(C4D)测定的在健康受试者、轻度认知功能障碍(MCI)受试者和阿尔茨海默氏病(AD)受试者中的非-CP铜的置信区间(95%)。 [0030] 图11.描述了通过使用根据现有技术的参考测试(计算铜)或依据根据本发明的方法(C4D)测定的非-CP铜浓度的值得到的ROC曲线。 具体实施方式[0031] 如前所述,本发明涉及一种用于在体外测定血清样品中游离铜的浓度的方法。在本说明书中,术语“游离铜”指的是一般循环中的铜,该铜在结构上未结合到铜蓝蛋白上。“游离铜”最近也被命名为“不稳定的”铜,指的是其不稳定地结合到白蛋白、小分子肽、氨基酸和其他微营养素上的性质,且在它们之间容易交换。游离铜是一种小分子量的铜,能够穿过血脑屏障,很容易地到达大脑组织。 [0032] 为了从血清样品的血蛋白中分离游离铜,该方法包括固相萃取(SPE)色谱法的第一步骤(a)。血清样品可以根据本领域技术人员已知的方法(例如离心法)从全血中获得。血清在进行分离之前可以被适当的稀释,优选根据1和10之间的稀释因子进行稀释。血清可以,例如在生理溶液(0.9%NaCl)中被稀释,该生理溶液也可以用作色谱法的流动相。 [0033] 血清样品被装载(接种)在固定相(可以结合血蛋白的树脂)上,通常在小色谱柱(例如200mg、300mg、400mg、500mg、600mg色谱柱)中。存在于血清样品中的血蛋白,包括铜蓝蛋白在内被固相吸收,然而从固相中洗脱出的包括铜的级分被收集并经过该方法的第二步骤b)。因此,在本说明书中,“洗脱级分”是指没有被用于固相萃取色谱法(固相上的色谱萃取)中的树脂所吸收的级分。 [0035] 在步骤a)中,聚烯烃,优选选自例如聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚甲基戊烯(PMP)、聚丁烯-1(PB-19)的热塑性聚烯烃可以被用作固相。所述固相可以具有例如在35%和75%之间的结晶度。 [0036] 根据本发明的一个实施方式,超高分子量聚乙烯(即原子量在3MDa和6MDa之间)的树脂,比如Sigma-Aldrich市售的批号#434264-1KG(超高分子量聚乙烯(UHMPE)和任何其他等效的商业树脂),将被使用作为固相。因此,整个步骤a)非常快且容易实现自动化;而且该固相一旦用合适的溶剂(例如像甲醇)再生,可以再用于其他分离,具有经济优势。 [0037] 该方法包括用香豆素荧光探针测定在步骤a)中洗脱出的级分中的铜的第二步骤b)。香豆素荧光探针是螯合荧光探针,当其结合[Cu++]时,荧光发射的衰减可以被记录。香豆素荧光探针可以选自例如具有以下结构通式的化合物: [0038] [0039] 其中 [0040] R1为N[(CH2)nCH3]2,其中n为0到5; [0041] R2为H、F、Cl、Br、NO2、OCH3、环己基。 [0042] 根据本发明的另一个实施方式,所述香豆素荧光探针选自上述组,其中R1为n=1的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的H、F、Cl、Br、NO2、OCH3、环己基。 [0043] 根据本发明的另一个实施方式,所述香豆素荧光探针选自上述组,其中R1为n=2的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的H、F、Cl、Br、NO2、OCH3、环己基。 [0044] 根据本发明的另一个实施方式,所述香豆素荧光探针选自上述组,其中R1为n=3的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的H、F、Cl、Br、NO2、OCH3、环己基。 [0045] 根据本发明的另一个实施方式,所述香豆素荧光探针选自上述组,其中R1为n=4的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的H、F、Cl、Br、NO2、OCH3、环己基。 [0046] 根据本发明的另一个实施方式,所述香豆素荧光探针选自上述组,其中R1为n=5的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的H、F、Cl、Br、NO2、OCH3、环己基。 [0047] 根据本发明的另一个实施方式,所述香豆素荧光探针为具有以下结构式的7-(二乙氨基)-2-氧代-N-((吡啶-2-基)甲基)-2H-色烯-3-甲酰胺: [0048] [0049] 该香豆素荧光探针可用于例如有机溶剂(如乙醇、甲醇、DMSO)中,有机溶剂与缓冲溶液(如磷酸盐缓冲液(PBS)或羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes))混合。在一个实施方式中,该香豆素荧光探针被用于HEPES:DMSO的溶液中。 [0050] 该香豆素荧光探针将被用于与样品的反应中,优选浓度范围在0.1μM和10μM之间,例如1μM、2.5μM、5.0μM、9μM。本发明人发现,在这个范围内,游离铜的浓度和荧光发射之间存在直接相关性,激发波长(λex)为例如430nm和吸收波长(λem)为490nm。 [0051] 为了测定游离铜的浓度,步骤b)可包括制备校正曲线的进一步的步骤。为了制备校正曲线,可以使用已知浓度的铜的多个等分部分。优选地,这个曲线将在0.1μM和10μM之间的范围内(见图1)。 [0052] 正如先前在受阿尔茨海默氏症影响的患者中所报道的,未结合到铜蓝蛋白上的血清铜(“游离”铜)出现升高,这种增加虽然轻微,但通常足以将阿尔茨海默氏病受试者与健康老年受试者(也在疾病的早期阶段)区分开。 [0053] 因此,本发明的一个目的是一种用于在体外在疑似患有阿尔茨海默氏病的患者中诊断阿尔茨海默氏病的方法,该方法包括将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值)进行比较的进一步的步骤c),其中较高浓度的游离铜确认阿尔茨海默氏病的临床诊断。 [0054] “用于在体外诊断阿尔茨海默氏病的方法”的表达是指一种用于在疑似患有阿尔茨海默氏病的患者中确认阿尔茨海默氏病的临床诊断的方法。 [0055] 显然,如果血清被装载在色谱上之前已经在与阈值进行比较的步骤c)中根据某一稀释因子被稀释,那么在步骤b)中测定的游离铜浓度将必须乘以稀释因子。 [0056] 铜的阈值(截止值)可以通过例如ROC(受试者工作特征)曲线来测定,该曲线通过处理健康个体和患有阿尔茨海默氏病的个体的一组样品(统计上显著的)的浓度获得。通过这样的处理得到的阈值在0.5μm和50μm之间,优选地在0.5μm和3μm之间,例如1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm。 [0057] 优选地所述诊断方法将被用作在疑似患有阿尔茨海默氏病的患者中进行阿尔茨海默氏病的临床诊断的确认测试,阿尔茨海默氏病伴随“铜表型功能障碍”。 [0058] 如Squitti等人,Neurology(2009)所示,为了监测患者的阿尔茨海默氏病的预后以及预测从轻度认知功能障碍向阿尔茨海默氏病的转化,测定所述患者的血清中游离铜的浓度是重要的(图5)。 [0059] 轻度认知功能障碍的临床症状的特征在于记忆障碍、通过客观措施可验证、尚未准予痴呆的界定。准确诊断的重要性在于,尽管症状温和,但轻度认知功能障碍通常被认为是阿尔茨海默氏病的前兆。这是由于从轻度认知功能障碍进展为阿尔茨海默氏病的高统计率。 [0060] 通常,从健康状态到阿尔茨海默氏病的年转化率在从0.17%到3.86%的范围内。从轻度认知功能障碍到阿尔茨海默氏病的转化率非常高,在从6%到40%的范围内。在一些情况下,轻度认知功能障碍可能是一种良性疾病,而不发展成痴呆。游离铜浓度将轻度认知功能障碍受试者与健康对照个体区分开,如通过比较两组的方法所揭示(图5)。游离铜浓度也能够被用于预测患有轻度认知功能障碍将发展为阿尔茨海默氏病的受试者的百分比。游离铜浓度>1.6μM的轻度认知功能障碍受试者(转化百分比为每年17%)相对于游离铜浓度≤1.6μM的那些轻度认知功能障碍受试者(转化百分比为每年10%)具有较高的转化成阿尔茨海默氏病的百分比。卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)统计分析证实,铜>1.6μM的轻度认知功能障碍受试者比那些铜≤1.6μM的轻度认知功能障碍受试者具有较高的转化成阿尔茨海默氏病的比率,相比于那些游离铜≤1.6μM的轻度认知功能障碍受试者在三年半内转化成阿尔茨海默氏病的25-30%的百分比,他们在前两年内转化成阿尔茨海默氏病的百分比在24- 35%之间。限制5年的随访分析,铜≤1.6μM的轻度认知功能障碍受试者中转化成阿尔茨海默氏病的百分比小于50%,而在铜>1.6μM的轻度认知功能障碍群组中,50%的患者在4-6年内发生转化(图5)。 [0061] 在一个实施方式中,本发明的方法被用于预测患有轻度认知功能障碍的患者从轻度认知功能障碍(MCI)的状态向阿尔茨海默氏病的转化,包括将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值)进行比较的步骤c),其中较高浓度的游离铜表明从轻度认知功能障碍向阿尔茨海默氏病的转化。阈值例如在0.5μM和3μM之间,优选1.6μM。所述预测方法的步骤a)和b)可以根据上述所公开的步骤a)和b)的任何实施方式进行。 [0062] 本发明的另一个目的是一种用于在体外预后患者的阿尔茨海默氏病的方法,其中该方法的步骤a)和b)根据上述所公开的步骤a)和b)的任何实施方式在于不同时刻收集的所述患者的多个样品上实施,且从每个样品中获得的量化的数据彼此间进行比较,从而构建所述患者的血清样品中游离铜的浓度随时间的进展。 [0063] 本发明的另一个目的是一种用于检测血清中的游离铜的试剂盒,包括用于在固相上进行层析萃取的装置和说明书以及一个或多个荧光香豆素探针。用于在固相上进行层析萃取的装置为比如包含固相树脂的色谱柱。在一个实施方式中,所述装置包括超高分子量聚乙烯作为固相。在另一个实施方式中,所述香豆素荧光探针选自具有上述结构式的化合物。 [0064] 在一个实施方式中,试剂盒还包括一个或多个具有已知滴度的铜的等分对照;这些对照可用来制备校正曲线。 [0066] 示例 [0067] 示例1 [0068] 为了血蛋白分离,建立了固相萃取(SPE)色谱法。超高分子量聚乙烯(UHMPE)树脂(Sigma-Aldrich批号#434264-1KG)被用作固相,能够与血清蛋白相互作用并保留血清蛋白。为了防止蛋白质(铜蓝蛋白)结合的铜的释放,不用纯水,而使用生理溶液(0.9%NaCl)作为流动相,通过蠕动泵抽吸以维持恒定的洗脱流(流速:400μl/min)。1-ml的色谱柱装填500mg的树脂(图6)并使用两种不同的策略进行调节: [0069] -500mg的树脂,装进柱子中,用6ml的生理溶液调节。 [0070] -500mg的树脂悬浮在约3ml的甲醇中,然后用于装填柱子。然后6ml的蒸馏水穿过柱子被洗脱出来以完全去除甲醇,随后是6ml的生理溶液。然后,在这两种情况中,装填50μl的血清并用生理溶液洗脱。第一个250μl的洗出液和随后的500μl等分部分被分别收集。分光光度分析检测到在250μl等分部分中蛋白质缺失(图7的等分部分1),然而在随后的500μl等分部分中观察到蛋白质的存在(图7的等分部分2和等分部分3)。对于任何实验室的需求来说,为了减少收集感兴趣的等分部分的时间,有可能通过减少柱子调节所需的流动相体积来改善方案。所述技术的一个优点是通过洗脱甲醇吸附的蛋白质(约2ml)来再生柱子的可能性提供的。再生的和用于3次随后分离的柱子确认预期结果:分光光度分析检测到在250μl等分部分中蛋白质缺失。整个方案发展最多30分钟。优化的方法降低时间到20min或 15min或10min,下降到6周期/小时。 [0071] 1.对比实验 [0072] 在多个已知游离铜浓度的样品中测定游离铜浓度。分析的样品和它们的浓度的列表在表1中被报告。通过本发明的方法测定样品中游离铜浓度,具体地根据在示例1和平行示例中所详细描述的实施方式,在分离步骤中通过使用过滤膜,而不是固相上的色谱萃取(SPE)来测定样品中游离铜浓度。 [0073] 所得结果表明,通过使用不同类型的过滤膜,然而,35%-77%的减少在于样品中所包含的游离铜的回收。具体地,实验表明膜装置不允许从1:10稀释(Cu测定允许的最大稀释)的血清样品中除去蛋白质。 [0074] 相反,使用固相上的色谱萃取(SPE)的过滤产量与接种的血清量成正比。而且,在甲醇洗出液中,得到的蛋白质的量大约与过滤量成反比,证实该方法的准确性(在1mL中过滤10μl后保留的蛋白质>在2.5mL中过滤25μl后保留的蛋白质>在5mL中过滤50μl后保留的蛋白质)。 [0075] 接种50μl,蛋白质级分在前两个500μl的级分中被收集。然后,所有的血清被收集在1mL中。即使不包括初始的250μl级分,其他两个级分是含有蛋白质的级分。 [0076] 总之,用膜装置过滤并非有效,然而用固相上的色谱萃取来过滤更准确且更快。 [0077] 表1 [0078] 由Department of Neuroscience,Fatebenefratelli Hospital,Rome在临床设置中选择的患者和对照血清。 [0079]ID 微摩尔浓度 分类 1647 0.1 对照 1650 0.2 对照 1665 0.1 对照 1666 0.2 对照 1667 0.5 对照 1780 3.2 阿尔茨海默氏病 1794 3.8 阿尔茨海默氏病 1796 4.5 阿尔茨海默氏病 1799 3.55 阿尔茨海默氏病 1802 6.2 阿尔茨海默氏病 1818 3.3 阿尔茨海默氏病 1839 5.6 阿尔茨海默氏病 1848 3.3 阿尔茨海默氏病 1855 3.8 阿尔茨海默氏病 1856 1.6 阿尔茨海默氏病 1876 2.2 阿尔茨海默氏病 1890 2.8 阿尔茨海默氏病 1899 4.2 阿尔茨海默氏病 1901 0.8 对照 1926 2.0 阿尔茨海默氏病 [0080] 2.对比实验 [0081] 在以下描述的实验中,用根据本发明的方法和用现有技术所用的及在Walsh等人Ann Clin Biochem 2003中所述的参考方法(计算铜)均对从重要的个体样品中获得的血清中的“游离铜”的浓度进行了测定。 [0082] 根据本发明的方法在下文中和在图9-11也用名称C4D(Canox4Drug的缩写)来更简短地表示。 [0083] 报告了以下分析: [0084] a.与现有技术的参考测试进行比较; [0085] b.C4D精度测试; [0086] c.C4D线性测试; [0087] d.C4D检测限测试; [0088] e.C4D参考区间测试 [0089] f.区分效度 [0090] ⅰ.方法的比较; [0091] ⅱ.诊断准确度(特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值)。 [0092] 2.1与参考测试进行比较(CLSI术语:真实性/可比性) [0094] 非-Cp铜=全部铜-0.472×Cp [0095] 此过程决定了假阴性值的百分比等于我们的数据库中的11%。根据本发明对非-Cp铜的直接测量不确定这个误差,引起两个分布的不对称。在图9中,描述了对273名测试的受试者用两种测定的值。线性回归、多项式和“非参数局部加权散点平滑”(局部加权散点平滑)回归分析表明线性拟合不尽如人意;表明将二次分量插入到模型中显著增强了表明存在曲率的适用有效性(从0.525到0.591,对R2改变的测试,P<0.001),和表明这样的曲率可以被分段回归分解成两个具有计算出非-Cp铜的临界点值0的线性回归。由于计算出非-Cp铜的负值可以被认为是方法误差且相对较少,因此只对非负值进行两个测量间的一致性。考虑到不是对两种测量仪器进行比较,而是对两种检测模式(一种为标准模式,基于铜结合到铜蓝蛋白的公式,另一种模式基于根据本发明的直接测量)进行比较,因此计算组内相关系数以评估“一致性”而不是“总体一致性”。 [0096] 与参考测试的对比分析表明: [0097] 组内相关等于0.75(95%的置信区间:0.69-0.80)且在两种检测模式之间不存在系统影响(区别测试,p=0.959)。 [0098] [0099] 本发明人根据样品自身以限定由147名受试者组成的参考区间,对于该参考区间,神经学家已经排除了认知功能障碍的存在和过去及最近心、脑血管发作的存在。对照受试者的平均年龄为49岁(DS=12.8),其中53%为女性,47%为男性。关于性别和年龄对非-Cp铜的影响的初步分析表明性别没有相关影响(F(1.140)=0.846;p=0.359,年龄的平方=0.006),男性和女性的年龄效应的差异不显著(F(1.140)=0.631,p=0.428;年龄的平方= 0.004)。年龄效应证明统计学显著(F(1.140)=5.114;p=0.035;年龄的平方=0.035),表明3.5%的非-Cp铜是由于年龄的变化。关系基本上呈线性,年龄每增加10年,非-Cp铜增加 0.09微摩尔。然后,根据以下公式得到年龄调整值: [0100] 年龄调整的非-Cp铜=(c4d-0.009*(年龄-49.05)) [0101] 新的值使用非参数CLSI方法进行了分析。该参考上限(95%)等于1.91(相关的90%的置信区间等于1.78-2.06)。 [0102] 2.2.辨别能力和数值(微摩尔) [0103] 方差分析显示在两种方法测量的对照、轻度认知功能障碍(MCI)患者和阿尔茨海默氏病(AD)患者中具有清晰的辨别能力(对于测量的非-Cp铜,F(2.265)=47.317,p<0.00,年龄的平方=0.260;对于根据现有技术的方法计算的非-Cp铜,F(2.265)=32.695,p<0.001,年龄的平方=0.198)。图10描述了这三组的平均值和置信区间。 [0104] 考虑到只在对照和受目标病理学(可能和/或很可能的阿尔茨海默氏病的诊断)影响的患者之间进行比较,ROC曲线显示了根据现有技术的参考测试计算的非-Cp铜的0.761的精确度(测量为曲线下的AUC-面积)和用根据本发明的方法测定的非-Cp铜的0.806的精确度。这样的差异证明统计学显著(ROC成对对比,p<0.001)。如在图11突出的,在95%的特异性处,灵敏度从根据现有技术的方法计算的测定的44%到根据本发明的方法测量的测定的56%。 [0105] 2.3诊断准确度(特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值) [0106] 基于对照受试者(1.9)的样品的参考限制的(95%)特异性组,检测到方法灵敏度等于48.3%(95%的置信区间:38%-58%)。阳性测试的似然比(LR+)为9.94,远高于常规所接受的截止值(>5)。阴性测试的似然比(LR-)为0.54,由于高百分比的假阴性(非-Cp铜值<1.9的AD患者),所以该值与常规所接受的截止值(<0.2)相比不高。为了估计测试的阳性预测值(PPV),本发明人推测3种情况,其特征在于可变发生率(基于年龄和基于其它遗传和临床病症)。 [0107] 在下文中,以表格的形式对与上述实验相关的一些结果进行了总结。在表2中,总结了用本发明的方法可得到的诊断准确度的值。在表3.1-3.3中,报告有用于处理在图11中报告的ROC曲线的值。 [0108] 表2 [0109] [0110] 表3.ROC曲线坐标 [0111] 表3.1 [0112] [0113] [0114] 表3.2 [0115] [0116] [0117] [0118] 表3.3 [0119] [0120] [0121] |