用于测定体液中钾离子的方法和组合物

本发明涉及生物或非生物液体中的离子(下面称为分析物)测定 的方法和试剂。

本发明的理论根据是许多分析物有激活或抑制敏感酶的作用。分 析物可以是阳离子、阴离子、金属或非金属、单质或化合物。在实践 中，经常发现样本中的分析物浓度超过相关分析指示酶的敏感性范 围，或存在有其它离子对酶的敏感性产生干扰。本发明从多种途径提 出并解决这些问题的方案。

在生物化学的临床实践中，血清电解质测量是医院里使用最普遍 的分析方法。这些测量不论对于常规试验还是对于急诊，甚至对于生 命处于危急中的状态(此时分析速度是极为重要的)都是必需的。由 于医院里产生拖延的主要原因是要把样本从病房送到诊断实验室，因 此，在紧急情况下，一种易于在床边进行的方法变得特别重要。

在生物化学的临床实践中，钾和钠的普通分析方法是火焰光度法。 该方法的原理是，某些原子通过加热刺激被激发，当原子回到基态时 则发出具有特征波长的光。火焰中由原子产生的特征波长辐射能的 强度直接与火焰中激发原子的数量成正比，而原子数量直接与样本中 所关心物质的浓度成正比。这种方法需要的装置复杂而且昂贵，并且 要使用可燃气体。

另一种特别适于钠、钾和氯的方法是使用离子选择电极。理想的 情况是，每个电极都具有单离子选择特性，使电极只对一种离子有反 应。实际情况却不是这样，所有的离子选择电极都存在有干扰离子。 况且，尽管能对离子特异性电极进行校正，但通常特异性仍不是绝对 的。电极可测量由于特异离子的存在而产生的电位，但仪器比较昂贵。 这两种方法都不能进行分光光度分析，因此临床上对于离子测定的需 要，大大提高了市售可得的临床分析仪器的复杂性，其中大部分都是 为分光光度法而设计的。两种方法都需要相当程度的技艺和知识才能 成功地实施。

同样，用库仑法对氯离子进行常规测定需要特殊的仪器。此滴定 过程的终点通过难溶氯化银产物的形成而增加的电流量确定。换句话 说，可能利用的电位测定也是很费时间的，还需要另外的仪器设备。

另外，对于氯离子而言，有许多电位法和滴定法，例如其中包括：

通过二苯卡巴腙络合物滴定游离Hg2+

铁离子的硫氰酸盐络合物的比色测定，它是在由于HgCl2的沉 淀而发生的汞络合物的解离之后形成的(Skeggs，Clin.Chem. 10，1964，918f.；Schmidt，Zentralblatt Pharm.124 (9)，1985，527f)

用相应的汞盐(Renschler)比色测定氯冉酸

由无色汞盐比色测定二乙基二硫代氨基甲酸的Cu2+络合物 (DE2137146)

颇为普遍的TPTZ法(tripyridile-s-triazine) (R.Fried，Zeitschr.Klin.Chem.，Klin.Bioch.10， 1972，280f；DOS 215 3387)，它的基础也是随着汞络合物的 解离而形成有色的金属络合物。

这些方法的主要缺点是使用了剧毒物质的溶液。有些方法复杂而 不精确(如滴定法)。许多试剂不稳定，标定曲线不成直线(如硫氰 酸盐法)。另外，为了避免试样中蛋白质含量的干扰，某些方法需进 行预处理。

WO83/002670公开了一种改进的TPTZ法，但其不 利之处是仍然使用了毒性汞化合物。唯一没有使用汞离子的比色法是 在高氯酸溶液中测定Fe(III)的六氯络合物(F.Hoppe.Ther. Ggw.110(4)，1971，554f.；H.Mahner，Zeitsehr.Klin. Chem.，Klin.Biochem.11(11)，1973，451f.；W.T.LaW， Clin.Chem.26(13)1980，1874f.；US4278440)。此方法最 大的局限性是使用了侵蚀性的强酸试剂，因而不适于机械的吸管系统。 另一不足之处是受到试样中胆红素的干扰。

钙是临床实验室中电解质测定的另一个例子。人体液中此金属离 子的浓度被调控在很窄的范围内。病理上的高或低浓度都可能导致危 及生命的紊乱，如肾功能不全、胰腺炎、痉挛和充血性心力衰竭。

Tisdall介绍的方法是一种测定钙的最早的方法(J.Biol. Chem.，63：461-465，1925)。其中，钙由草酸沉淀，然后进行 比色测定。该方法包括离心步骤，因此也是很费时间的；它并不具有 钙特异性，而是取决于对试样的细心操作。通过滴定后直接进行比色 的方法在许多实验室已经获得成功。前一过程的不足仍然是试验复杂 繁琐，并且需要大量试样。在后一过程中，钙影响染料如邻甲酚酞配 位酮的颜色，它可通过光度仪测量。由于此方法很简单，它在临床实 验室里有自动化趋势。但是，这种方法仍然使用了侵蚀性的高碱性溶 液和毒性物质。还特别易于受到许多血清成份的干扰，例如脂类、蛋 白质、磷酸盐和胆红素等，其结果与原子吸附法和火焰光度法不很一 致。比色分析的另一个缺点是标定曲线不成直线，颜色在很大程度上 取决于温度。

W.H.Outlaw和O.H.Lowry介绍了测定组织中钾离 子的酶介法(Analytical Biochemistry 92：370-374， 1979)。该方法采用兔肌肉中由钾钠离子活化的丙酮酸激酶，前 者的激活效力大约高出40倍。由于这种非特异性，此方法可能适用 于植物材料，其中钾离子是主要的阳离子，但它不适于测量人体液如 血清，因为其中钠离子的含量超过30倍。因此使用Lowry等人介 绍的酶光度技术测量血浆或血清中的钾时，钠离子的存在将引起不可 接受的干扰。另一问题是铵离子也具有与钾离子相似的活化作用。以 上出版物既没有提出并解决与分析生物液体如血清中钾离子有关的关 键问题，也没有提出任何测定钠离子的方法。

因此，本发明的目的是提供一种方法和试剂以避免上述问题。本 发明通过液体中离子(分析物)的测定方法解决了这些问题，即测定 液体中这些离子对酶活性的影响。

本发明的一个关键特征是使用了选择性结合试剂，以将分析酶的 分析物的游离浓度调整在最佳范围内，尤其是在液体不能稀释时。本 发明的另一方面是，使用了分析酶的竞争性抑制剂以降低它对分析物 的敏感性，从而能在更高浓度下测定分析物。例如，在不易得到选择 性结合试剂或费用过于昂贵时，用这种方法是极其合适的。

本发明的另一特征是使用选择性结合试剂以降低干扰离子的游离 浓度，使得干扰水平可以忽略。还利用了这一事实：即竞争性抑制剂 与干扰离子的竞争性比与分析物的竞争性更强，从而相对于干扰离子 来说，增加了酶对分析物的敏感性。

选择最佳反应条件是一个重要方面，包括选择适当的同工酶，要 使得分析物的促进或抑制效应比干扰离子的强得多。另外，分析物和 干扰离子对分析酶活性的作用应该可以迭加，以便在已知干扰离子浓 度时，能够通过差别方便地确定分析物浓度。已知分析液体中某干扰 离子以相当恒定的浓度存在时，通过使标准(校正)溶液中含有适当 浓度的干扰离子便可进行测定。测定这种分析物的另一种方法是使用 竞争性结合法，其中，分析物从结合试剂中置换出其他离子，然后测 定释放离子对适当的酶活性的效应。

通过在测定血浆或血清中的钾、钠、钙、氯和碳酸氢根离子中的 应用，可以最好地详细阐述这些基本原理。但它们可应用于范围很宽 的离子谱，例如阳离子如镁、锰、锂、铅、锌、铜、铁或其他重金属。 可以测定的非金属离子为质子或铵。还可测定产生铵的物质如尿素。

可以使用的酶如(H.J.Evans et al.，Ann.Rev.Plant Physiol.17：47，1966)：

转移酶如磷酸基团转移酶。这类转移酶可以是丙酮酸激酶。还可 用其他激酶如腺苷酸激酶或己糖激酶等代替丙酮酸激酶，它们对镁离 子或锰离子敏感。另一种转移酶是乙酸激酶(来自大肠杆菌)。另外 一个例子是对锌离子敏感的来自大脑的吡哆醛激酶。

水解酶如糖苷酶类，例如α-或β-D-半乳糖苷酶(来自大肠 杆菌)、羧基肽酶A(来自牛胰脏)、胶原酶(来自Clostridium hystolicum)、淀粉酶(来自唾液或胰脏)或磷酸甘油磷酸酶。

肽水解酶如依赖半胱氨酸或硫醇的蛋白酶，具体例子有Sasaki 等人介绍的(J.Biol.Chem.259：12489-12494，1984) Calpain I和II(也称为钙活化的中性蛋白酶)。后者可以根据A. Kitahara等人介绍的方法(J.Biochem.95：1759-1766， 1984)，从各类动物组织如大鼠的肝和肾、人和猪的红细胞、牛 脑、兔骨骼肌中分离和纯化。另一个例子是二肽氨基肽酶I(E.C. 3.4.14.1，Cathepsin C)(J.Ken Mc Donald， Biochem.Biophys.Res.Commun.24(5)：66，771f)。酶 的另一来源是由基因重组技术得到的蛋白质。

氧化还原酶如甘油脱氢酶(来自产气肠杆菌)、乙醛脱氢酶(来 自酵母)或酪氨酸酶(儿茶酚氧化酶)。

裂解酶如醛缩酶(来自酵母)或碳酸脱水酶(来自牛红细胞)。

其它适宜的酶是来自嗜盐性生物中的各种酶。另一些酶源是由基 因重组技术得到的蛋白质。

选择性结合试剂：可得到大量适于结合分析物或干扰离子的结合 试剂。这种结合试剂或掩蔽物质为穴状配体、冠醚配体、冠醚、足状 配体、球状配体、半球状配体、萼状配体及它们的组合、天然离子载 体如抗生素、环肽如缬氨霉素、配位酮和螯合剂如亚氨基二乙酸、 EDTA、硝基三乙酸及其衍生物。这类化合物见于下列文献的记载： Kontakte(Merck)，1977，No.1，p.11ff and p.29ff；Kontakte (Merck)，1977，No.2，p.16ff；Kontakte(Merck).1977，No. 3，p.36ff；Phase Transfer Catalysts，Properties and Applications(Merck-Schuchardt)1987，Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction；R.M. Izatt et al.，Chemical Reviews 85，271-339(1985)；Data for Biochemical Research，1986，R.M.C.Dawson et al.， Eds.，3rd edit.，399-415(Clarendon Press)Oxford；F. V_gtle etal.，Chem.Macrocycles，Springer Verlag，New York，1985；G.W.Gokel et al.，Eds.，Macrocyclic Polyether Synthesis，Springer Verlag，New York，1982；M.Hiraoka， Ed.，Crown Compounds，Elsevier，Amsterdam，Oxford，New York，1982；J.M.Lehn et al.，J.Am.Chem.Soc.97，6700- 6707(1975)；G.Schwarzenbach et al.，Helv.Chim.Acta 28， 828(1945)；S.F.A.Kettle，Koordinationsverbindungen， Taschentext 3，Verlag Chemie，Weinheim/Bergstr.1972；A.E. Martell et al.，Die Chemie der Metallchelatverbindungen， Verlag Chemie，Weinheim/Bergstr.1958；M.Becke-Goehring et al.，Xomplexchemie，Springer Verlag，1970；F.Kober， Grundlagen der Komplexchemie，Otto Salle Verlag，Frank- furt/Main 1979；G.Schwarzenbach et al.，Helv.Chim.Acta 31，1029(1948)；R.G.Pearson et al.，Science 151，172 (1966).

可以结合多价离子，特别是二价阳离子的螯合剂有例如乙二醇- 二-(2-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(简写为EGTA) 和(乙二胺)四乙酸(EDTA)。

虽然有许多结合试剂可以结合多价离子，如EDTA及其衍生物， 但结合单价离子的试剂比较少见。四苯硼结合钾离子。但是，一种具 有更大可能性的化合物是穴状配体，它们是能够在水溶液中选择性结 合单价阳离子的试剂的例子(R.M.Izatt et al.，Chem. Reviews 85：271-339)。穴状配体的突出例子是Kryptofix_， Merck-Schuchardt公司的化合物，例如：

4，7，13，16，21-五噁-1，10-二氮二环〔8.8. 5〕-二十三烷，Kryptofix_221，p.438，Merck-Schuchardt catalogue，dated 1987/88，no.810646(K221)。

4，7，13，16，21，24-六恶-1，10-二氮二环〔8.8. 8 〕二十六烷，Kryptofix_222，p.438，Merck-Schuchardt catalogue，dated 1987/88，no.810647(K222)。

可用下面所列的物质作为排除干扰离子的掩蔽化合物：阴离子穴 状配体、杂环烷(heterocyclophanes)、catapinands 和无机金属络合物或难溶盐类。文献中公开了阴离子络合化合物的特 殊例子，如氮杂单环或氮杂聚环、大环四级四面体化合物、大环双金 属络合物、共价结合有路易斯酸中心的大环、质子化或烷基化的四级 穴状配体或catapinands(F.P.Schmidtchen，Nachrichten Chem.Techn.lab.36(1)，1988，S.8f；E.Graf，J.Amer. Chem.Soc.98(20)，1976，6403f；C.H.Park，J.Amer. Chem.Soc.90(9)，1968，2431f)以及Fe(III)的六氯络合 物或硝酸银。 结合试剂的功能

这些结合试剂用于下述目的：

1.干扰离子的选择性结合。

2.如果样本不能稀释，则将分析物的浓度降到最佳的测定水平。

3.本发明的具体方案是一种方法，其中，存在有结合试剂并与 “指示”离子络合，分析离子以化学计量方式取代络合物中的指示离 子，测定被取代的指示离子对酶活性的影响，从而间接测得分析离子 的浓度。例如，在此方法中，酶是丙酮酸激酶、指示离子是钾、结合 试剂是Kryptofix_221、待测离子是钠；或者酶是激酶、指示 离子是Mg2+、结合试剂是螯合剂如EDTA、离子是金属；或者酶 是吡哆醛激酶、指示离子是Zn2+、结合试剂是Kryptofix_221、 离子是重金属；或酶是α-淀粉酶、结合试剂是Ag或Hg、待测离 子是氯；或酶是胶原酶、结合试剂是螯合剂如EDTA、待测离子是 钙。

分析液体：进行分析物测定的生物液体有例如血液、血清、血浆、 汗、渗出液或渗出物或尿。其他的液体例子有自来水或食品提取物， 或水果或发酵液体如葡萄酒。 应用一般原理测定钾离子和钠离子

基于丙酮酸激酶对钾离子的敏感性而测定血清或血浆中钾离子时， 对于成功的测定的基本要求是克服钠离子和铵离子的干扰。根据本发 明的一般原理，这些要求可由下面一个或多个步骤实现：

1.用适宜的结合试剂(如Kryptofix_221)选择性结合钠 离子。

2.选择脂嗜热杆菌(Bacillus stearothermophilus)， 而不是选择兔肌肉作为丙酮酸激酶的来源，因为相对于钠离子而言， 细菌酶对钾离子的敏感性是肌肉酶的两倍。

3.在测定中加入敏感性指示酶的竞争性抑制离子，如用锂离子 与钠离子和钾离子竞争。

4.酶促除去铵离子。

由于锂离子作为竞争剂对钾离子的影响较小，因此与钠离子相比 较，其净效应是丙酮酸激酶对钾离子的相对敏感性进一步增加了50％。 而且，有锂离子存在时，钾离子和钠离子对丙酮酸激酶的影响变为可 迭加的，而不是协同作用的。这样，如果已知其他离子的浓度，便能 够任意测定钾离子或钠离子的浓度。

在没有结合试剂时，采用步骤2和3便可得到丙酮酸激酶对钾离 子比对钠离子的相对敏感性为100∶1。这意味着，即使钠离子的 浓度极为不正常，如110或170mmol/L，测定钾离子的误差相 对于正常血浆中钠离子浓度为140mmol/L来说(实例A)将不会 超过0.3mmol/L。对于许多临床试验来说这不能算是很精确的。 但是，如果已知血浆中钠离子的真实浓度。那么钾离子的精确测定能 够降至±0.05mmol/L(实例B)。如果把步骤1-3结合起来， 并包括进结合试剂Kryptofix_221，那么相对于钠离子而言，丙酮 酸激酶对钾离子的相对敏感性增加到500∶1。在这些情况下。不 需知道钠离子浓度，便可测定血浆中钾离子的浓度至0.05mmol/ L(实例C)。

测定钾离子的这些方法证实了本发明减少干扰的一般原理的实用 性。另一方面，血清或血浆中钠离子的测定，可更好地阐述这些原理 在调节有效分析物浓度方面的应用。本发明中测定钠离子的方法是利 用其活性对钠离子敏感的酶。这类酶的一个实例是β-半乳糖苷酶 (Kuby et al.，J.Amer.Chem.Soc.75：890，1953)。然 而，酶最敏感的钠离子浓度的范围比没有稀释时一般血浆样本中的值 低得多。

根据本发明的原理，采用下面步骤可将试样不能稀释时的有效钠 离子浓度降至最佳水平。

1.使用钠离子结合试剂如Kryptofix_221。

2.使用锂离子作为β-半乳糖苷酶的竞争性抑制剂，从而降低 酶对钠离子的敏感性。

结合步骤1和2，能方便地用β-半乳糖苷酶测定血浆或血清中 的钠离子浓度，并可控制结合试剂的用量以将钠离子浓度的信号降至 最低，即在110mmol/L以下，而加强通常的分析范围(110 -170mmol/L)的信号(实例D)。

由丙酮酸激酶也可测定钠离子浓度，前提是选择这样的条件：降 低钾离子对酶活性的促进，并在反应混合物中加入钾离子结合试剂如 Kryptofix_222(实例E)。

测定血浆钠离子浓度的另一种方法是用钠离子取代Kryptofix_ 221中的钾离子，释放的钾离子促进的丙酮酸激酶的活性与血浆钠 离子的浓度成正比(实例F)。

本发明另外的具体方案是测定生物液体和非生物液体的组合物和 试剂。

本发明的试剂可以溶解或干燥形式存在。还可使试剂浸渍到适宜 的载体中。一种试验条形式的诊断剂可在挥发性溶剂如丙酮中，用常 规制备试验条必需的试剂的溶液浸渍载体材料，如滤纸、纤维素或合 成纤维毛而制得。此浸渍过程可进行一次或多次。完成的试纸可以这 种形式使用，或以已知方式贴在手柄上，或最好密封在合成树脂和细 网之间。

本发明的实施方案在下文中作出详细的描述，但不能以任何一种 详细描述或其结合来限制本发明，尤其是除了本实施方案中描述的以 外，还可使用各种机械或化学的改变。 钾离子分析方法的详细说明

这一部分用本发明所述原理更详细地介绍测定钾离子的方法。为 了测定液体如血浆中的钾离子，将体液与含有腺苷二磷酸(ADP)、 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、 丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的缓冲混合物保温。混 合物中通过PK和LDH催化的反应形成的丙酮酸盐和随之形成的乳 酸，完全取决于所存在的适宜的阳离子，没有它们的存在PK则几乎 没有活性。NADH在340nm处有强烈吸收，而NAD没有。

在选择的分析条件下(包括细菌PK所需的锰离子的存在)， NADH的氧化速率与钾离子的浓度成正比(参见实例A～e)。

在这些条件下，发生下列反应： (1)PEP+ADP+H+ PK丙酮酸盐+ATP (2)丙酮酸盐+NADH+H+ LDH乳酸+NAD+ 体系中钾离子的浓度决定反应式(1)的速率，而它又限制反应(2) 的速率。有几种可以测定反应速率的方法。一种标准方法是用分光光 度计测量反应(2)中NADH的消失速率。NADH在340nm 处有强烈吸收，而NAD没有。因此，通过反应混合物在340nm (或另一个波长)处的吸收降低能够直接测定反应速率，由此可计算 出混合物中的钾离子浓度。另外，可以利用这一事实，即反应(1) 和(2)都消耗H+，因而降低反应混合物中质子的浓度。用pH计可 以测量质子浓度下降的速率，或者用滴定法测定。在用pH计或滴定 法时，所用缓冲液的浓度比分光光度技术中要小得多。可用其他仪器 如荧光仪或光度计监测丙酮酸激酶的活性。

还有许多其他方法可以测定与PK活性相关的聚积的丙酮酸盐。 它们包括测定无机磷酸盐或氧耗或过氧化氢；由丙酮酸氧化酶催化产 生的乙酰基磷酸盐或二氧化碳；腙的形成(与2，4-二硝基苯肼)； 测量丙酮酸羧化酶催化的反应物或产物；丙酮酸脱羧酶或丙酮酸脱氢 酶；黄素偶联系统的使用；及测量微量物质浓度的同位素法(M.N. Berry et al；Analytical Biochem.118：344-352， 1981)。

在200份血清样本的测量中，与用其他方法如火焰光度法或离 子选择电极得到了一致的结果。本方法的重要干扰离子是铵离子，它 通常存在于血清中或在放置过程中聚积。在反应混合物中加入α-酮 戊二酸(KG)和谷氨酸脱氢酶可以完全避免铵离子的干扰。根据下 述反应通过预保温可以除去铵离子：

NH4++KG+NADH→谷氨酸+NAD+

在铵离子含量高的溶液如尿中，可以使用偶联反应：

NH4++KG+NADPH→谷氨酸+NADP

葡萄糖-6-P+NADP→6一磷酸葡糖酸+NADPH

偶联法使用了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。假如加入的葡萄糖-6 -P和KG对于存在的任何铵离子是过量的，则当试剂中保存有NADH 时，可以除去所有的铵离子。

采用10μl血浆或血清样本，在37℃时酶法测定钾离子的主 要试剂的典型浓度范围如下：

PK(脂嗜热杆菌)                50-10000U/L

PEP(中性Tris盐)               0.3-30mmol/L

Kryptofix_221               0-30mmol/L

NADH                          0.01-0.8mmol/L

缓冲液pH7-8                   50-500mmol/L

Mn2+或Mg2+                         1-10mmol/L

LiCl                                 2-100mmol/L

ADP(游离酸)                          0.5-10mmol/L

LDH(于25℃测定)                      5000-100000U/L

血清清蛋白                           0-5g/L

GDH(于25℃测定)                      2500-20000U/L

KG(游离酸)                           1-10mmol/L

另一个对钾离子敏感的例子是甘油脱氢酶(E.C.C.Lin et al.，B235，1820，1960)。采用甘油脱氢酶在37℃时酶法 测定钾离子的主要试剂的典型浓度范围如下：

甘油脱氢酶                        50-1000U/L

甘油                              0.3-3mol/L

Kryptofix_221                   0-30mmol/L

NAD                               0.1-5.0mmol/L

缓冲液pH9                         20-500mmol/L

血清清蛋白                        0-5g/L

GDH(于25℃测定)                   2500-20000U/L

KG(游离酸)                        1-10mmol/L

对钾离子敏感的另一种酶是乙醛脱氢酶(S.Black，Arch. Biochem.Biophys.34：86，1951)。采用乙醛脱氢酶在37 ℃时酶法测定钾离子的主要试剂的典型浓度范围如下：

乙醛脱氢酶                        50-10,000U/L

乙醇醛                            0.3-30mmol/L

Kryptofix_221                   0-30mmol/L

NAD                                 0.05-2.0mmol/L

缓冲剂pH7-8                         50-500mmol/L

二硫苏糖醇                          0.1-2mmol/L

血清清蛋白                          0-5g/L

GDH(于25℃测定)                     2500-20000U/L

KG(游离酸)                          1-10mmol/L

可用乙醛(0.02-1mmol/L)代替乙醇醛。

乙醛脱氢酶还抑制酯酶的活性，因此，监测从4-硝基苯乙酸中 释放的4-硝基苯酚能够测定钾离子的浓度。基于乙醛脱氢酶的酯酶 活性，在37℃时酶法测定钾离子的主要试剂的典型浓度范围如下：

乙醛脱氢酶                          50-10000U/L

4-硝基苯乙酸盐                      0.1-2mmol/L

Kryptofix_221                     0-30mmol/L

NADH                                0.001-0.1mmol/L

缓冲液pH7～8                        50-500mmol/L

二硫苏糖醇                          0.1-2.0mmol/L

血清清蛋白                          0-5g/L

GDH(于25℃测定)                     2500-20000U/L

KG(游离酸)                          1-10mmo/L 钠离子的测定

使用PK测定钠离子的原理与测定钾离子类似，但仍存在着关键 性的差异。首先，PK对钾离子的敏感性是对钠离子的大约40～ 100倍之多，取决于上面所述的保温条件。因此，即使血浆钠离子 浓度是钾离子的30倍，钾离子也能干扰钠离子的测定。

根据本发明的一般原理，省去锂离子，优选来自兔肌肉的PK而 不是细菌酶，并用镁离子代替锰离子。在一种方法中，使钾离子与 Kryptofix_222特异性结合，并直接测定钠离子对PK活性的影 响(实例E)。

采用丙酮酸激酶，在37℃时酶法测定钠离子的主要试剂的典型 浓度范围如下：

PK(兔肌肉)                       50-10000U/L

PEP(中性Tris盐)                  0.3-30mmol/L

Kryptofix_222                  0.4-4mmol/L

NADH                             0.01-0.8mmol/L

缓冲液pH7-9                      50-500mmol/L

Mg2+                            1-10mmol/L

ADP(游离酸)                      0.5-10mmol/L

LDH(于25℃测定)                  500O-100000U/L

血清清蛋白                       0-5g/L

GDH(于25℃测定)                  2500-20000U/L

KG(游离酸)                       1-10mmol/L

在另一方法中，用钠离子置换Kryptofix_221中的钾离子， 释放的钾离子促进PK活性的程度取决于钠离子的浓度(实例F)。

通过丙酮酸激酶测定从Kryptofix_221中置换出的钾离子 时，从而在37℃下酶法测定钠离子的主要试剂的典型浓度范围如下：

PK(兔肌肉)                       50-10,000UU/L

PEP(中性Tris盐)                  0.3-30mmol/L

Kryptofix_221                  1-10mmol/L

NADH                              0.01-0.8mmol/L

缓冲液pH9-10                      50-500mmol/L

Mg2                              1-10mmol/L

ADP(游离酸)                       0.5-10mmol/L

LDH(于25℃测定)                   5000-100000U/L

KCl                               2-10mmol/L

血清清蛋白                        0-5g/L

GDH(于25℃测定)                   2500-20000U/L

KG(游离酸)                        1-10mmol/L

更精确的测定方案使用依赖钠离子的酶如β-半乳糖苷酶(实例 D)。

使血浆与含有2-硝基苯-β-D吡喃半乳糖(NPG)和β- D-半乳糖苷酶的缓冲液一起保温。β-D-半乳糖苷酶催化的反应 取决于存在的钠离子，因此通过酶活速率便可测定钠离子浓度。这个 方法的关键特征是在测定钠离子浓度可能超过100mmol/L的血 清或其他生物体液时，使用适量的钠离子选择性结合试剂(如 Kryptofix_221)以降低钠离子浓度。使酶在通常的分析范围内 (110-170mmol/L)对钠离子浓度的微小变化最敏感。在 选择的分析条件下(包括存在有高浓度的镁离子和锂离子)，2-硝 基苯酚和半乳糖的形成速率基本上与待测钠离子的浓度成正比。β- 半乳糖苷酶的最佳活性需要有镁离子。锂离子与钠离子具有竞争生， 因而提高了酶对钠离子的Km值。

许多其他化合物都适于作为β-D-半乳糖苷酶的底物。通常， 把含有半乳糖苷酶的样本与适当的β-D-半乳糖苷酶底物混合，底 物被酶裂解，然后以适当的方式测定裂解的产物之一。可以测定由酶 解释放出来的糖苷或糖苷配基中的任一种。通常是测定糖苷配基。作 为底物，可用天然底物乳糖，但最好是用生色半乳糖苷。例如，在 Biochem.Z.333：209(1960)中，公开了苯基-β -D-半乳糖苷，以及在芳环上有取代基的进一步的衍生物，如2- 硝基苯-β-D-半乳糖苷(NPG)和3-硝基苯-β-D-半乳 糖苷，作为β-D-半乳糖苷酶的底物。用光度法在紫外范围内测定 水解释放的酚或在硝基酚的情况下在可见波长范围内测定。与氨基交 替比林偶联的氧化物也可用作随后的指示反应(Analytical Biochem.40：281，1971)。在DE3345748和DE 3411574中公开了其他底物。

采用10μl血浆或血清样本，在37℃时酶法测定钠离子的主 要试剂的典型浓度范围如下：

β-D-半乳糖苷酶                25-7500U/L

NPG                            0.25-5mmol/L

Kryptofix_221                0-10mmol/L

缓冲液pH7-9.5                  200-500mmol/L

Mg2+                          0.01-10mmol/L

EGTA(锂盐)                     0-20mmol/L

血清清蛋白                     0-5g/L

EGTA即亚乙基二(氧亚乙基次氮基)四乙酸。也可用双试验 的形式在同一比色杯中，用酶法分析钠离子和钾离子(实例G)。 钙离子的测定

测定钙离子时，将血浆样本(或其他体液)与缓冲混合物一起保 温，此缓冲混合液含有肽底物琥珀酰-亮氨酰-甲硫氨酰-P-硝基 苯胺和酶CalpainI。由CalpainI催化的反应依赖于钙离子的 存在，以活性速率可测得钙离子浓度。此法的主要特征是利用了螯合 物，它能与钙离子特异性结合，使钙离子的浓度降至酶的最敏感范围 内。在选择的分析条件下，有L-半胱氨酸和2-巯基乙醇的存在，P -硝基苯胺的形成速率与待测钙离子的浓度基本上成正比。

优选的肽底物可用下面的通式表示：

         R-Pn-P2-P1-X 这里R代表乙酰基、苯甲酰基、苄氧羰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或 3-(2-呋喃基)丙烯酰基；Pn-P2-P1代表不少于2个氨 基酸残基的肽链，在P1位置上的优选氨基酸为Tyr、Met、Lys和 Arg，P2位置上的优选氨基酸为Leu或Val；X代表一个生色 或产荧光基团，它在酶的作用下能释放产生可检测的颜色或荧光变化。 X可以是硝基苯基、萘酚基或硫苯甲酰酯，也可以是进一步带有或不 带有芳环取代基的硝基苯胺、萘酚胺或甲基香豆素基团。T.Sasaki 等人(J.Biol.Chem.259：12489-12494)也记述了一些适 宜的肽衍生物，例如琥珀酰-Leu-Met-MCA(MCA＝4-甲基香豆 素-7-酰胺)、琥珀酰-Leu-Tyr-MCA、琥珀酰-Leu-Leu- Val-Tyr-MCA和叔丁氧羰基-Val-Leu-Lys-MCA。Berg- meyer HU编《酶法分析》，第3版第5卷，84-85页中记述 了进一步的合成底物。

本测定方法所用化合物和试剂的浓度范围如下：

CalpainI                           1000-40000 U/L*

琥珀酰-Leu-Met-P硝基苯胺           1-20mmol/L

螯合剂                          0.01-1mmol/L

L-半胱氨酸                      1-10mmol/L

2-巯基乙醇                      1-10mmol/L

咪唑-HCl缓冲液                  10-100mmol/L

pH                              6-8(优选范围7-7.5)

星号*表示的单位定义为用酪蛋白作为底物于30℃保温30分 钟，使750nm处的光吸收增加1.0的酶量(N.Yoshimura et al.，J.Biol.Chem.258：8883-8889，1983)。

只要pK值在要求的pH值范围内，并且与钙的结合能力可以忽 略不计的任何缓冲液本法均可采用。许多Good型缓冲液(N.E. Good et al.，Biochem.5：467-477，1966)，例如Tris、 HEPES、MOPSO、BES、TES和咪唑可以满足要求(实例H)。可用 胶原酶取代CalpainI，此时则于pH6.5-7.5，0.02 -0.2mmol/L的L-异亮氨酸-L-丙氨酰甘氨酰乙酯的条件 下进行荧光定量测定。 氯离子的测定

测定血液中的氯离子时，将血浆与含有0.01mol/L半胱胺、 4mmol/L Gly-Phe-p-硝基苯胺酰和0.02U/ml Cathep- sin C的缓冲混合物一起保温。p-硝基苯胺的形成完全依赖于氯 离子的存在。另外，可以加入选择性结合试剂以减小钡离子的干扰或 减小氯离子的活性，使其浓度调整至酶的最优范围。在选择的分析条 件下(见实例5)，p-硝基苯胺的形成速率 与样本中氯离子浓度成正比。本例中通过测定405nm处光吸收的 增加值来计算反应速率。

本测定方法化合物的浓度范围为：

柠檬酸缓冲液                      0.01-0.2mmol/L

pH                                4-7(优选5.0-5.5)

半胱胺                            1-20mmol/L

Gly-Arg-p-硝基苯胺酰              1-20mmol/L

Cathepsin C                       2-100mU/ml

任何pK值在要求的pH范围内且仅含可忽略不计的氯离子浓度 的缓冲液，本法均能采用。现有文献表明，上文中列出的所有酶类 (转移酶、水解酶、氧化还原酶和裂解酶)中的酶的实例均依赖于氯， 特别是当这些酶是从嗜盐性生物中提取时是这样。依赖于氯离子的肽 酶类型已有广泛记述。例如二肽肽酶I(Cathepsin C)，E. C.3.4.14.1(J.Ken Mc Dcnald，Biochem.Bio- phys.Res.Commun.24(5)，1966，771f)或二肽肽酶III，E. C.3.4.14.3(J.Ken Mc Donald，J.Biol.Chem. 241(7)1966，1494f)，两者均从寡肽衍生物的氨基末端催化水 解。另一例为血管紧张肽转化酶E.C.3.4.15.1，它为二 肽羧基肽酶，从多种寡肽的羧基末端开始催化水解释放出二肽(P. Bunning et al.，Biochem.26，1987，3374f；RShapiro et al.，Biochem.22，1983，3850f)。

其他不同的二肽或寡肽底物可用来取代Gly-Arg-p-硝基苯胺。 优选的肽底物可用下列通式表示：

         R-Pn-P1-X 这里对于二肽肽酶来说R＝H，Pn-P1代表该肽至少有2个氨基 酸残基。X表示一个生色或产荧光集团，当酶作用时，它能被释放出 来产生可检测的颜色或荧光的变化。X可以是硝基苯基、萘酚基或硫 苯甲酰酯，也可以是进一步有或无芳环取代基的硝基苯胺、萘酚胺或 甲基香豆素基团。对于二肽羧基肽酶来说，X表示肽链的氨基末端， R表示酶作用时可释放的生色或产荧光基团。R可以是有或无进一步 取代基的N-2-呋喃丙烯酰或苯甲酰基团(实例I)。

作为酶学测定氯离子的进一步的实例(实例J)，将血浆与含有 4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯(G1)，D-麦芽七糖苷 (4，6-亚乙基G7 PNP)(5mmol/L)、α-淀粉酶(0.60 U/ml)和α-葡萄糖苷酶(＝30U/ml)的缓冲混合物一起 保温。p-硝基苯酚的产生完全依赖于氯离子的存在，再次使用预稀 释、少量样本或选择性结合试剂来调整氯离子浓度，使其处于酶作用 的最佳范围内。试验原理总结如下，反应速率通过测定405nm处 吸光率的增加量来推算。 5亚乙基-G7PNP+5H2O α-淀粉酶Cl^- 2亚乙基-G6+2G2 PNP+2亚乙基G4+2G3 PNP +亚乙基-G3+G4 PNP 2G2PNP+G3PNP+10H2O α-葡萄糖苷酶＜PNP+100 (PNP＝p-硝基苯酚；G＝葡萄糖)

本测定方法的化合物浓度范围如下：

Hepes或无氯的缓冲液                0.01-0.5mmol/L

pH                                 6.5-7.5

α-淀粉酶                          60-6000U/L

α-葡萄糖苷酶                      3000-300,000U/L

4，6-亚乙基-G7PNP                  0.5-10mmol/L

上面关于在Cathepsin C(实例I)所讨论的测试中的改变 也适用于实例J。 重金属离子测定

这些重金属紧密地结合于如Kryptofix_221和Kryptofix_ 222这样的穴状配体。因此，它们会取代其他结合松散的金属。例 如一个易被取代的金属离子为锌。锌在血浆中的浓度是很低的。于是， 可以将已与K221络合的锌离子加入缓冲的血清混合物中。假如混 合物中有重金属，锌离子则被取代而释放，释放后的锌离子浓度可用 吡哆醛激酶(取自羊脑)的激活作用来检测，吡哆醛激酶对锌离子是 高度敏感的。许多其他相似的竞争性结合测试法也可以应用，这里只 是通过举例说明并非限制。 碳酸氢根离子的测定

利用本发明原理的变化形式可以测定碳酸氢根离子。许多配体 (如穴状配体)对pH敏感，这个性质可用来测定碳酸氢盐。主要是 利用碳酸氢盐能中和质子的特性。在缓冲能力极小的血清样本中加盐 酸，我们将会看到pH值将作为碳酸氢盐浓度的函数而变化。最终pH 值通过游离钠离子的量(如用β-半乳糖苷酶来测定)来测定，此时 存在有类似Kryptofix_221这样的pH敏感的离子结合试剂，这 是最初的碳酸氢盐浓度的作用。简而言之，将血清酸化至pH4.5 左右，采用等体积HCl(75mmol/L)把所有碳酸氢盐变成氢氧 根离子，然后于pH7.5-7.8与一种检测系统反应，此检测系 统采用稀释的Tris缓冲液(5mmol/L  )与一种离子选择性酶， 如β-半乳糖苷酶和适宜的pH敏感的离子结合试剂。由于必须根据 样本中的钠离子含量进行校正，因此，要得到正确的结果，样本中的 钠离子浓度必须是已知的。此法实际上比利用生色指示剂作为pH测 定(实例K)灵敏得多。

采用10μl的血浆或血清样本，在37℃时，酶法测定碳酸氢 根离子的主要试剂的典型浓度范围如下：

β-D-半乳糖苷酶                    250-7500U/L

NPG                                0.25-5mmol/L 

Kryptofix_221                    0.2-5mmol/L

缓冲液pH7.5-7.8                    1-10mmol/L

Mg2+                              0.01-10mmol/L

EGTA(锂盐)                         0.1-5mmol/L

血清清蛋白                         0-5g/L

使用对通常以微摩尔浓度存在于血浆中的痕量金属(如锌离子) 敏感的酶(如吡哆醛激酶)，可以免去对钠离子浓度的校正。假如痕 量金属与其结合试剂的结合是pH敏感的，且亲和力与钠离子和Kryp- tofix_221之间的亲和力相似，那么，通过在反应混合物中加入 锌离子(其浓度足以超过血浆中固有的浓度)能够测定碳酸氢根离子， 因此，内源锌离子不会干扰。

上面描述的方法简便、快速、准确和精确，使用的仪器价格低廉。 可以避免由易燃气体引起的事故，以及与离子选择电极相关的许多问 题。此法不仅适合于大规模设备进行多种分析，而且还适于价格低廉 的简单仪器进行床边的紧急测定。此方法药盒形式的试剂十分简便。 另外，钾和钠离子的浓度可在同一比色杯中依次测定(实例G)。此 方法无疑还可用于备有能利用干燥化学试剂的仪器的大夫办公室。尽 管这些方法已发展为利用自动色谱仪，但也容易适于自动化或人工操 作的实验室设备，如荧光计、光度仪、同位素计数器等。

本发明将以下述实例进行更详细的说明，以10μl血清或血浆 样本为基础。这些实例仅仅是对本发明的进一步说明而不是限制。

下述实例中的少量样本(10μl，除非对血清或血浆有特别说 明)与试剂1混合(试剂1包括缓冲底物和一些辅助因子)，保温一 段时间，通常为0.1-5分钟，在保温期间通常以一定时间间隔读 取吸光率。然后加入试剂2(含指示酶)，监视反应速率。在某些实 例中，试剂1包含指示酶而试剂2含有合适底物。实例中所指的最终 反应混合物是指样本、试剂1和试剂2的混合物。 实例A  利用丙酮酸激酶测定钾离子浓度，其中不含钠离子结合试剂， 钠离子浓度未知。

最终的保温混合物包含：

Tris-HCl缓冲液pH7.4                    175mmol/L

Li+(17mmol/L LiOH，3mmol/L             20mmol/L

           LiCl)

MnCl2                                 3.0mmol/L

ADP(游离酸)                            2.6mmol/L

PEP(中性Tris盐)                        2.9mmol/L

NADH                                 0.4mmol/L

LDH(25℃测定)                        17000U/L

PK(提自脂嗜热杆菌)                   890U/L

KG                                   4.0mmol/L

GDH(于甘油中；25℃测定)              8600U/L

人血清清蛋白                         140mg/L

钾离子标准液(校准溶液)中含140mmol/L钠离子以补偿 血浆中钠离子对丙酮酸的激活效应。 实例B  利用丙酮酸激酶测定钾离子浓度，其中无钠离子结合试剂， 钠离子浓度已知。

保温混合物和校准溶液同实例A。

在钠离子浓度低于(或高于)140mmol/L时，以每10 mmol/L钠离子浓度加上(或减去)0.1mmol/L钾离子，以 此校正混合物中的钠离子浓度。但是，这个校正必须由分析含已知钠 和钾浓度的水溶液来验证。 实例C  利用丙酮酸激酶测定钾离子浓度，其中含有钠离子结合试剂

同实例B，但减去人血清清蛋白，每次测定额外加上6μmol Kryptofix_221。选择pH7.8，以使由于各个样本中钾离子 含量不同而引起的钠离子从Kryptofix_221中被取代的变化减少 到最小。 实例D  利用β-D-半乳糖苷酶测定钠离子浓度

变化a：最后的保温混合物含有：

Tris-HCl pH8.7(37℃)              300mmol/L

二硫苏糖醇                        4mmol/L

硫酸镁                         7.5mmol/L

氯化锂                         16mmol/L

EGTA(锂盐)                     0.44mmol/L

人血清清蛋白                   460mg/L

β-半乳糖苷酶                  760U/L

NPG                            1.5mmol/L

Kryptofix_221                1.25μmol/测定

在420nm(或附近)波长下监测反应，以测定游离硝基苯酚 的形成速度，从而测得原始样本中钠离子的浓度。

变化b：为变化a的替代方法，通过预稀释或使用少量样本将样 本浓度降低十倍，这里可以减去穴状配体。

变化C：测定低含量钠离子(例如小于20mmol/L)的液体， 这里可以减去穴状配体。 实例E  利用丙酮酸激酶测定钠离子(当钾离子敏感性消失时，由钠 离子直接激活酶)。

变化a：10μl血浆样本的保温混合物含有：

Tris-HCl pH8.7(37℃)              300mmol/L

MgCl2                            5mmol/L

ADP(游离酸)                       2.6mmol/L

PEP(中性Tris盐)                   2.9mmol/L

NADP                              0.34mmol/L

LDH(25℃测定)                     17000U/L

PK(取自兔肌肉，37℃测定)          2000U/L

KG                                4mmol/L

GDH(在甘油中，25℃测定)            8600U/L

Kryptofix_222                    1.25μmol/测定

钠离子校准溶液中含有4mmol/L钾以补偿血清中钾离子对丙 酮酸激酶的激活效应。 实例F  利用丙酮酸激酶测定钠离子(竞争性结合测试)，钾离子浓 度已知

最终与10μl血浆样本一起保温的混合物包含：

甘氨酸pH9.8                        300mmol/L

MgCl2                             5mmol/L

ADP(游离酸)                        2.6mmol/L

PEP(中性Tris盐)                    2.9mmol/L

NADH                               0.34mmol/L

LDH(25℃测定)                      17000U/L

PK(取自兔肌肉，37℃测定)           1890U/L

KG                                 4mmol/L

GDH(25℃测定)                      8500U/L

KCl                                5mmol/L

Kryptofix_221                    2.5μmol/测定

将氯化钾加入此试剂，并使其以化学计量方式被钠离子从Kryp- tofix_221中取代，从而使样本中的钠离子浓度得以定量化。 实例G  在同一比色杯中测定钾和钠离子浓度(双试验)

钠离子浓度测定首先同实例D，但测定时另外还包含：

ADP(游离酸)                        2.6mmol/L

PEP(中性Tris盐)                    2.9mmol/L

NADH                              0.4mmol/L

KG                                4.0mmol/L

GDH                               8600U/L

通过测定反应速度而测定钠离子后，加入盐酸使保温混合物的pH 降至7.4。

然后加入下列成分以达到指出的最终浓度：

LDH                               1700U/L

PK(来自脂嗜热杆菌)                890U/L

MnCl2                            3.0mmol/L

LiCl                              20.0mmol/L

然后在340nm波长处监测反应速度，但是也可在稍高一些的 波长下测定，以使钠离子指示反应所释放的2-硝基苯酚的可能干涉 降至最低。 实例H  利用Calpain I测定钙离子浓度

在本实例中，离心少量血液样本得到血浆。测定钙离子时，将样 本与含有50mmol/L咪唑-HCl缓冲液pH7.3，5mmol/L L-胱氨酸，2.5mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mmol/L EGTA和5mmol/L Suc-Leu-Met-p-硝基苯胺酰的混合物于 30℃保温。以5分钟为间隔监测405nm波长处的吸光率的增加 值。增加速率与样本中的钙离子浓度成正比。 实例I  利用Cathepsin C测定氯离子浓度

在本实例中，离心少量血液样本得到血浆(5μl)。测定氯离 子时，保温混合物包含0.05mmol/L柠檬酸盐缓冲液pH5.0， 10mmol/L半胱胺，4mmol/L Gly-Arg-p-硝基苯胺酰和 0.01U/ml Cathepsin C。后者已用10mmol/L硫酸钠 盐缓冲液(pH6.8)及43％(V/V)甘油透析出以除去氯离 子。用此法得到的典型的标准曲线如图1所示。 实例J  利用α-淀粉酶测定氯离子浓度

5μl血浆样本的抑制混合物包含：

Hepes或无氯的缓冲液              100mmol/L

pH                                  7.1

α-淀粉酶                        600U/L

α-葡萄糖苷酶                    30000U/L

4，6-亚乙基-G7PNP               5mmol/L

于405nm(或附近)波长监测反应来测定游离4-硝基苯酚 的形成速率，从而测得原始样本中的氯离子浓度。 实例K  利用β-D-半乳糖苷酶测定碳酸氢根离子的浓度

变化a：最终保温混合物包含：

Tris-HCl pH7.8(37℃)              5mmol/L

二硫苏糖醇                        4mmol/L

硫酸镁                            7.5mmol/L

氯化锂                            16mmol/L

EGTA(锂盐)                        0.44mmol/L

人血清清蛋白                      460mg/L

β-半乳糖苷酶                     1500U/L

NPG                               1.5mmol/L

Kryptofix_221                   2.0μmol/测定

EGTA是指亚乙基双(氧亚乙基次氮基)-四乙酸。样本先与 等体积HCl(对于血浆，75mmol/L)保温使样本pH降至4.5。 然后在420nm波长处(或附近)测定游离2-硝基苯酚的形成速 率，从而测得原始样本中碳酸氢盐浓度。对原始样本中的钠离子浓度 进行校正。

变化b：用吡哆醛激酶、吡哆醛和锌离子替代β-半乳糖苷酶和 NGP。