[0001] 本发明涉及新型化合物、及用该化合物作为螯合显色剂的试样中的铁浓度测定方法。

[0002] 血清及血浆中的铁浓度测定被用于贫血、缺铁性贫血，肝硬化等的诊断，在临床检查的领域是重要的测定项目之一。

[0003] 作为铁浓度的测定方法，例如，通常为采用联吡啶、邻二氮杂菲等各种金属螯合显色剂的比色分析法，作为显色剂，常用的有红菲绕啉磺酸钠、2-亚硝基-5-(N-丙基-N-磺丙基氨基)苯酚(Nitroso-PSAP)、3-(2-吡啶基)-5,6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1,2,4-三嗪二钠盐、三吡啶三嗪、菲洛嗪等铁螯合显色剂。

[0004] 这些铁螯合显色剂都是与二价的铁形成螯合物后显色的显色剂，因此，使用时需要与还原三价的铁的还原剂并用。作为三价的铁的还原剂，已知有L-抗坏血酸、巯基乙酸、盐酸羟胺、氢醌、亚硫酸氢盐、亚硫酸钠、硫酸肼、偏亚硫酸氢盐(焦亚硫酸盐)等。

[0005] 然而，这些还原剂在保存中会分解，因此，以往使用的铁浓度测定用试剂在试剂的保存稳定性方面存在着问题。

[0006] 因此，作为与二价的铁和三价的铁两者反应的色素，本发明人开发了下述式[A]表示的化合物(9-(2-羧基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮，以下，简称为CPF)(非专利文献1)。

[0007]

[0008] 现有技术文献

[0009] 非专利文献

[0010] 非专利文献1：Mitsuru Hoshino et al.,Yakugaku Zassi,2011,vol.131,No.7,p.1095-1101

[0011] 发明要解决的问题

[0012] 用CPF作为铁螯合显色剂测定铁浓度时，具有不需要使用在试剂的保存稳定性方面存在着问题的还原剂的优点。然而，另一方面，存在着诸如测定的空白值变高的问题。

[0013] 本发明是鉴于上述的情况完成的，目的在于提供一种铁浓度测定时的空白值低且可以进行高灵敏度的铁浓度测定的螯合显色剂，及采用了该螯合显色剂的铁浓度测定方法和试剂盒。

[0014] 解决问题的方法

[0015] 出于解决上述问题的目的，本发明由以下的技术方案构成。

[0016] 1)下述式[1]表示的化合物或其盐

[0017]

[0018] (式中，R1、R2各自独立地表示-SO3H及-CO2H中的任意一种)(以下，记载为“式[1]表示的化合物”时，有包含式[1]表示的化合物和其盐的情况)。

[0019] 2)铁浓度测定方法，其中，用式[1]表示的化合物或其盐作为螯合显色剂，使该化合物与试样中的铁接触后，基于生成的显色的程度来测定试样中的铁浓度。

[0020] 3)铁浓度测定用试剂盒，其中，含有式[1]表示的化合物或其盐作为构成试剂。

[0021] 即，为了解决上述问题，本发明人进行了潜心研究，其结果，合成了上述式[1]表示的新型化合物。进而，发现该化合物与铁形成螯合物时的显色优异，且水溶性也高。进而，发现用式[1]表示的化合物作为螯合显色剂进行铁浓度的测定时，能够高灵敏度地测定铁浓度，从而完成了本发明。

[0022] 发明的效果

[0023] 本发明提供式[1]表示的新型化合物，且本发明的技术效果如下。即，用该化合物作为螯合显色剂时，即使不使用还原剂也能够进行试样中的铁浓度的测定。并且，由于试剂空白值比以往使用的CPF变低，且与铁形成的螯合物的显色不褪色、稳定，因此，能够比以往更为高灵敏度地且更为高精度地实施铁浓度的测定。再者，该化合物与二价的铁、三价的铁中的任意一种均能够反应并形成螯合物。因此，作为用该化合物作为构成要素的铁浓度测定试剂及试剂盒，不需要含有还原剂，在试剂的保存稳定性方面也具有优异的特性，并且，该化合物由于水溶性高，作为试剂的操作性能也优异。附图说明

[0024] 图1是实施例3中得到的、用9-(2,4-二磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(4S-SPF)作为螯合显色剂进行的吸光度的测定结果。

[0025] 图2是实施例3中得到的、用9-(4-羧基-2-磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(2S-4CPF)作为螯合显色剂进行的吸光度的测定结果。

[0026] 图3是比较例1中得到的、用现有的CPF作为螯合剂进行的吸光度的测定结果。

[0027] 图4是实施例4中得到的、用9-(2,4-二磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(4S-SPF)作为螯合显色剂进行的吸光度的测定结果。

[0028] 图5是实施例4中得到的、用9-(4-羧基-2-磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(2S-4CPF)作为螯合显色剂进行的吸光度的测定结果。

[0029] 图6是比较例2中得到的、用现有的CPF作为螯合剂进行的吸光度的测定结果。

[0030] 图7是实施例5中得到的、用4S-SPF作为螯合显色剂进行测定后得到的500～700nm范围的吸收曲线。

[0031] 图8是实施例5中得到的、用2S-4CPF作为螯合显色剂进行测定后得到的500～700nm范围的吸收曲线。

[0032] 图9是比较例3中得到的、用现有的CPF作为螯合显色剂进行测定后得到的500～700nm范围的吸收曲线。

[0033] 图10是实施例6中得到的、用4S-SPF作为螯合显色剂得到的血清铁浓度测定值、与用现有的铁螯合显色剂红菲绕啉得到的血清铁浓度测定值的关系图。

[0034] 符号的说明

[0035] 图1、图2、图3、图4、图5、图6中，-●-表示用铁水溶液作为试样时的结果，-○-表示用生理盐水作为试样时的结果。

[0036] 图7、图8、图9中，实线(─)表示用铁水溶液作为试样时的结果，虚线(┈)表示用生理盐水作为试样时的结果。

[0037] 在本发明的式[1]表示的化合物中，优选R1相对于氧杂蒽骨架的键合位置位于邻位，R2相对于氧杂蒽骨架的键合位置位于对位。即，更优选下述式[B]表示的化合物或其盐。

[0038]

[0039] (式中，R1、R2各自独立地表示-SO3H及-CO2H中的任意一种)。

[0040] 式[1]中，优选R1和R2中的至少一方为-SO3H。

[0041] 作为本发明的式[1]表示的化合物的盐，例如，可以列举钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土类金属盐，铵盐、三乙胺盐、二甲胺盐等有机胺盐等。特别优选的是钠盐、钾盐。

[0042] 作为本发明的式[1]表示的化合物，例如，可以列举下述式[2]表示的9-(2,4-二磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(式[B]中R1＝SO3H、R2＝SO3H的化合物，以下，称之为4S-SPF)或其盐，

[0043]

[0044] 或下述式[3]表示的9-(4-羧基-2-磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(式[B]中R1＝SO3H、R2＝COOH的化合物，以下，称之为2S-4CPF)或其盐等。

[0045]

[0046] 作为本发明的式[1]表示的化合物，例如，可以按照以下的合成路线进行合成。

[0047] 作为4S-SPF，例如，可以按照以下的合成路线(合成路线A)进行合成。

[0048] [合成路线A]

[0049]

[0050] 对于在合成路线A中使用的磺酸的、M表示的抗衡阳离子的种类没有特别的限定，可以列举钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土类金属盐，铵盐、三乙胺盐、二甲胺盐等有机胺盐等。特别优选的是钠盐、钾盐。

[0051] 作为在合成路线A中使用的1,3,4-苯三酚的R，可以列举氢原子，或乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基等酰基类保护基。特别优选的是氢原子或乙酰基。

[0052] 作为在合成路线A中使用的强酸(Strong acid)，可以列举硫酸、氯化氢、溴化氢、硝酸、过氯酸、碘化氢等。特别优选的是硫酸、氯化氢。

[0053] 作为在合成路线A中使用的溶剂(Solvent)，可以列举甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇等低级醇类，辛醇、月桂醇、肉豆蔻醇、十六烷醇、十八烷醇等高级醇类(碳原子数6以上且不含有不饱和键)。特别优选的是乙醇、异丙醇。

[0054] 作为在合成路线A中使用的氧化剂(Oxidizing agent)，可以列举在溶液中易于生成游离自由基、具有强力的氧化作用的过硫酸盐类。例如，可以列举过硫酸钾(KPS)、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)，特别优选的是过硫酸钾(KPS)。

[0055] 作为4S-SPF的具体的合成法，例如，可以通过将2,4-二磺酸基苯甲醛和1,3,4-苯三酚(相对于2,4-二磺酸基苯甲醛为2～10倍摩尔)在适量的上述强酸和溶剂的存在下加热至40℃～180℃的程度，随后不纯化中间体，在上述氧化剂的存在下加热至40℃～180℃的程度来合成。反应结束后，可以用目标产物的溶解度低的溶剂，例如，可以用乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、乙腈、丙酮等溶剂除去未反应的试剂、其他溶剂、原料试剂、杂质等。通过如上所述的操作进行纯化，能够得到作为目标产物的化合物。

[0056] 作为2S-4CPF，例如，可以按照下述的合成路线(合成路线B)进行合成。

[0057] [合成路线B]

[0058]

[0059] 作为在合成路线B中使用的磺化剂(Sulfonation agent)，可以列举氯磺酸、发烟硫酸、硫酸等在亲电取代反应中导入磺酸基的试剂，特别优选的是氯磺酸。

[0060] 合成路线B中，作为将甲基转换为醛基的氧化剂(Oxidizing agent)，可以列举氧化锰、硫酸锰等。

[0061] 作为在合成路线B中使用的1,3,4-苯三酚的R，可以列举氢原子，或乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基等酰基类保护基。特别优选的是氢原子、乙酰基。

[0062] 作为在合成路线B中使用的强酸(Strong acid)，可以列举硫酸、氯化氢、溴化氢、硝酸、过氯酸、碘化氢等，特别优选的是硫酸、氯化氢。

[0063] 作为在合成路线B中使用的溶剂(Solvent)，可以列举甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇等低级醇类，辛醇、月桂醇、肉豆蔻醇、十六烷醇、十八烷醇等高级醇类(碳原子数6以上且不含有不饱和键)，特别优选的是乙醇。

[0064] 合成路线B中，作为用于将醛化合物转换为目标产物的氧化剂，可以列举在溶液中易于生成游离自由基、具有强力的氧化作用的过硫酸盐类。例如，可以列举过硫酸钾(KPS)、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)，特别优选的是过硫酸钾(KPS)。

[0065] 作为2S-4CPF的具体的合成法，可以列举以下的方法。首先，将对甲苯甲酸在上述磺化剂(相对于对甲苯甲酸为2～10倍摩尔量)的存在下加热至0℃～95℃的程度，得到的化合物用正相柱或反相柱纯化。随后，将得到的化合物在上述氧化剂(相对于得到的化合物为5～20倍摩尔量)和过量的强酸的存在下加热至0℃～120℃的程度，从而制备醛化合物。进而，对醛化合物不进行纯化，加入1,3,4-苯三酚(相对于4-甲基-3-磺基苯甲酸为2～10倍摩尔)，在适量的上述强酸和溶剂的存在下加热至0℃～90℃的程度，从而进行反应。随后，将得到的反应产物在上述氧化剂(相对于4-甲基-3-磺基苯甲酸为1～10倍摩尔)的存在下加热至0℃～90℃的程度来进行反应，从而得到目标产物2S-4CPF。纯化得到的2S-4CPF时，可以进一步用2S-4CPF的溶解度低的溶剂，例如，可以用乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、乙腈、丙酮等溶剂除去未反应的试剂、其他溶剂、原料试剂、杂质等。

[0066] 本发明的铁浓度测定方法是“用式[1]表示的化合物或其盐作为螯合显色剂，使该化合物与试样中的铁接触后，基于生成的显色的程度来测定试样中的铁浓度的铁浓度测定方法”。

[0067] 在本发明的铁浓度测定方法中使用的式[1]表示的化合物的具体例子如上述。作为在铁浓度测定方法中使用的螯合显色剂，优选4S-SPF或2S-4CPF。

[0068] 本发明的螯合显色剂的使用量可以根据该螯合显色剂的特性来决定，对其没有特别的限定。例如，作为含有螯合显色剂而成的试液中的浓度为0.5～5mM，优选为0.5～2mM，作为铁浓度测定时的最终的反应液中的浓度为0.1～1mM，优选为0.2～0.5mM。

[0069] 实施本发明的铁浓度测定方法时，除了使用本发明的螯合显色剂以外，还可以依据本身已知的直接法、或国际标准法、国际标准法的松原改进法来实施铁浓度测定方法。并且，测定条件(例如，反应时间、测定波长等)、或测定操作法也可以根据本身已知的方法来实施。

[0070] 本发明的铁浓度测定方法中，作为使本发明的螯合显色剂与试样中的铁接触的方法，只要是最终能够得到含有试样、本发明的螯合显色剂的溶液的方法即可。

[0071] 作为具体的方法，例如，可以列举以下的方法。

[0072] 1)配制含有缓冲剂而成的溶液(第一试液)、含有本发明的螯合显色剂的溶液(第二试液)，在试样中依次加入第一试液、第二试液的方法，

[0073] 2)配制含有本发明的螯合显色剂而成的溶液，在试样中加入该溶液的方法。

[0074] 如果考虑到用自动分析仪进行测定的情况，则1)的方法(双试液法)较为普遍，是优选的。

[0075] 作为溶解本发明的螯合显色剂的溶液，由于铁浓度的测定需要在螯合显色剂的最佳pH范围内进行，因而优选的是缓冲液。

[0076] 本发明的铁浓度测定方法中，铁浓度测定时的最终的反应液的优选pH为pH6～10，更优选为pH6～9。作为构成用于使pH处于如上所述的范围的缓冲液的缓冲剂，通常在本领域中使用的缓冲剂全部可以使用。具体而言，例如，可以列举三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸等Good’s缓冲剂，甘氨酸，醋酸，柠檬酸，酒石酸等。

[0077] 进而，在含有本发明的螯合显色剂的溶液中，除了这些试剂以外，可以共存有防腐剂、稳定剂、反应促进剂、离子浓度调节剂等通常在该领域使用的试剂。

[0078] 在这些试剂类中，优选选择在本发明的螯合显色剂的最佳pH范围内稳定性高，且不阻碍本发明的螯合显色剂的显色的试剂。并且，这些试剂类的浓度范围等也可以适当地选择在本身已知的该测定方法中通常采用的浓度范围等。

[0079] 并且，在本发明的测定方法中使用的含有螯合显色剂的溶液、上述双试液法中的第一试液、第二试液中可以含有表面活性剂。

[0080] 作为这种表面活性剂，只要是在本领域中通常使用的表面活性剂、且不阻碍本发明的螯合显色剂的显色的即可，对其没有特别的限定。具体而言，例如，可以列举聚乙烯吡咯烷酮类，聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十二烷基醚等聚氧乙烯烷基醚类，例如，聚氧乙烯辛基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚类，例如，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐三油酸酯等聚氧乙烯烷基酯类，例如，辛酰基-N-甲基葡萄糖酰胺、壬酰基-N-甲基葡萄糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡萄糖酰胺等甲基葡萄糖酰胺衍生物，例如，正辛基-β-D-葡萄糖苷等烷基糖衍生物等非离子型表面活性剂，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸、脱氧胆酸、胆酸、三(羟基甲基)氨基甲胺十二烷基硫酸盐(Tris DS)等阴离子型表面活性剂，例如，十八烷基胺醋酸盐、十四烷基胺醋酸盐、硬脂胺醋酸盐、月桂胺醋酸盐、月桂基二乙醇胺醋酸盐等烷基胺盐，例如，氯化十八烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、氯化月桂基三甲基铵、甲基硫酸烯丙基三甲基铵、氯化苯甲烃铵、氯化十四烷基二甲基苄基铵、氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化月桂基二甲基苄基铵等季铵盐，例如，氯化月桂基吡啶、氯化硬脂酰胺基甲基吡啶等烷基吡啶盐等阳离子型表面活性剂，月桂酰基甲基-β-丙氨酸钠、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐等两性表面活性剂等。并且，这些可以单独使用，也可以适当组合两种以上使用。

[0081] 作为上述表面活性剂的使用浓度，可以在通常在该领域使用的范围适当地进行选择。作为上述表面活性剂在含有本发明的螯合显色剂而成的溶液、双试液法的第一试液和/或第二试液中的浓度，通常为0.0001～10％(W/V)的程度，优选为0.001～5％(W/V)的程度，作为在最终的反应液中的浓度，通常为0.001～10％(W/V)的程度，优选为0.01～5％(W/V)的程度。

[0082] 在将本发明的螯合显色剂作用于试样后，可以根据本身已知的直接法等铁浓度测定法来测定因螯合显色剂的显色产生的吸光度变化，测定时使用的自动分析仪、分光光度计等可以无例外地使用通常在本领域使用的装置。并且，毋庸多言，吸光度变化也可以根据使用主波长和副波长的双波长测定来求出。

[0083] 用双波长进行测定时，用于吸光度测定的测定波长可以在所使用的本发明的螯合显色剂的最大吸收波长附近，且根据测定中使用的设备的设定波长来做适当选择。在使用通用的血清铁浓度测定用自动分析仪时，通常可以在主波长600nm附近、副波长700nm附近进行测定。

[0084] 作为在本发明的方法中使用的试样，例如，可以列举尿、血清、血浆等生物体成分。

[0085] 现有的铁浓度测定方法中，由于采用的是与二价的铁形成螯合物后显色的显色剂，因此，需要使与试样中的转铁蛋白结合的三价的铁从转铁蛋白中游离出来，并还原为二价的铁。因此，需要使用还原剂。

[0086] 然而，本发明的铁浓度测定方法中，由于测定中使用的本发明的式[1]表示的化合物与二价的铁、三价的铁两者反应，因而不需要使用还原剂。

[0087] 此外，使用本发明的螯合显色剂时，可以在不存在还原剂的条件测定试样中的铁浓度，但在还原剂的存在条件进行测定时也不会对测定产生影响。

[0088] 关于本发明的铁浓度测定方法，如果以所述1)的方法(配制含有缓冲剂而成的溶液(第一试液)、和含有本发明的螯合显色剂而成的溶液(第二试液)，在试样中依次加入第一试液、第二试液的方法)为例来具体说明的话，例如，如下所述。

[0089] 首先，例如，混合待测定铁浓度的试样和含有缓冲剂而成的第一试液(pH3～9，试样为血清等来自于生物体的试样时则为pH3～7)，通常在10～50℃、优选在20～40℃，通常反应2～10分钟，优选反应5分钟左右。随后，混合该反应液和含有本发明的螯合显色剂而成的第二试液(pH7～10)，通常在10～50℃、优选在20～40℃，通常反应2～10分钟，优选反应5分钟左右。随后，以本发明的螯合显色剂与试样中的铁反应生成的显色作为吸光度来进行测定。对于得到的测定值，例如，预先用浓度已知的铁标准液作为试样同样地进行测定后，绘制出表示铁浓度和吸光度的关系的定量曲线，进而通过与该定量曲线进行对照来求出试样中的铁浓度。

[0090] 上述铁浓度的测定可以通过手动操作法来进行，但毋庸多言，也可以用自动分析仪来进行。另外，对于用手动操作法或自动分析仪进行测定时的试剂类的组合没有特别的限制，可以根据所采用的自动分析仪的环境、其他因素等来适当地进行。

[0091] 作为本发明的铁浓度测定用试剂盒，可以是用含有本发明的螯合显色剂的试剂来作为构成试剂的试剂盒。各构成要素的优选实施方式、具体例子及使用浓度等均如上所述。

[0092] 作为本发明的试剂盒的具体的实施方式，既可以是按照单试液(试剂)类测定法用的模式配制的试剂盒，也可以是按照双试液(试剂)类测定法用的模式配制的试剂盒，对此没有特别的限制。例如，可以列举以下所述的构成。

[0093] 1’)由含有缓冲剂而成的第一试液、和含有本发明的螯合显色剂而成的第二试液构成的试剂盒，或

[0094] 2’)用含有本发明的螯合显色剂而成的溶液作为构成试剂的试剂盒。

[0095] 并且，在上述的本发明的试剂盒的具体的实施方式中，含有构成单试剂类测定法用试剂盒或双试液类测定法用试剂盒的螯合显色剂而成的试液中的浓度为0.5～5mM，优选为0.5～2mM。

[0096] 构成该试剂盒的本发明的螯合显色剂的pH为pH3～10，优选为pH6～10。该试剂盒由含有上述含缓冲剂而成的第一试液和含有本发明的螯合显色剂而成的第二试液构成时，含有缓冲剂而成的第一试液的pH优选为pH3～9，含有本发明的螯合显色剂而成的第二试液的pH优选为pH7～10。并且，就用血清等来自生物体的试样作为试样、且用双试液类测定进行测定的试剂盒而言，如上所述，第一试液的pH为pH3～7，优选为pH3～6。

[0097] 并且，在该试剂盒的各试剂中，可以在通常在本领域使用的范围含有在本领域通常使用的、例如、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、反应促进剂等。作为这些的具体例子，如在有关本发明的铁浓度测定方法的说明中所述。进而，也可以含有用于使铁从转铁蛋白中游离的蛋白质变性剂、在测定溶血试样时用于消除对于测定值的影响的咪唑等。

[0098] 例如，作为按照双试液类测定用的模式配制的试剂盒，在第一试液中，除了缓冲剂或pH调整剂以外，还可以含有上述的表面活性剂、有机酸等反应促进剂、离子浓度调节剂等。并且，作为用于测定血清等来自生物体的试样中的铁浓度的试剂盒，第一试液中也可以含有用于使铁从转铁蛋白中游离的蛋白质变性剂。并且，第二试液中也可以含有缓冲剂或pH调节剂、本发明的螯合显色剂的稳定剂。进而，第一试液或第二试液中也可以含有在测定溶血试样时用于消除对于测定值的影响的咪唑等。

[0099] 并且，在该试剂盒中不需要含有还原剂作为构成要素，然而，还原剂对本发明的铁浓度测定方法不会产生影响，因此，在该试剂盒中即使含有还原剂也不会有任何问题。

[0100] 此外，该试剂盒如上述1)所述地由多个试液构成时，作为这些试剂类，可以适当地分散在各试液中的任意一个中，从而使目标成分测定的反应在混合各试液的时间点启动。作为构成这些试液的试剂类的使用浓度，可以在通常在本领域使用的范围进行适当的选择。

[0101] 进而，在该试剂盒中，根据需要可以配备有铁标准品。

[0102] 以下，举出实施例及比较例来更为详细地说明本发明，但本发明并不受这些的任何限制。

[0103] 实施例

[0104] 实施例1、9-(2,4-二磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(式[B]中R1＝SO3H、R2＝SO3H的化合物，以下，称之为4S-SPF)的合成

[0105]

[0106] 用苯甲醛-2,4-二磺酸钠(1)(5.0g、0.016mol，和光纯药工业株式会社制)和1,3,4-三乙酰氧基苯(8.2g、0.032mol，和光纯药工业株式会社制)，将浓硫酸(10ml)、50％乙醇(200ml)作为溶剂，在80℃进行Friedel-Crafts酰化反应。用HPLC对原料的消失进行确认后，进一步加入过硫酸钾(4.4g)，在80℃进行氧化性闭环反应。反应结束后，将反应液放置过夜。析出的结晶用冷却的50％乙醇洗涤后，得到目标产物4S-SPF(2)(产量：5.98g，收率：
77％)。

[0107] 1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：6.69(2H,s),7.15(1H,d),7.26(2H,s),7.76(1H,d),8.27(1H,s)。

[0108] MALDI TOF质谱(正离子模式：481)。

[0109] 实施例2、2S-4CPF，9-(4-羧基-2-磺基苯基)-2,3,7-三羟基-6-荧光酮(式[B]中R1＝SO3H、R2＝CO2H的化合物，以下，称之为2S-4CPF)的合成

[0110]

[0111] 在氯磺酸(2.56g、21.6mmol)的存在下，将对甲苯甲酸(3)(1.0g、7.3mmol，和光纯药制)在90℃加热4小时，从而进行反应。反应结束后，将得到的反应液投入到冰中，用氢氧化钠水溶液中和后，减压蒸馏反应液。随后，得到的残渣用反相柱(洗脱液为H2O→20％MeOHaq.)进行纯化，得到化合物(4)(产量：1.60g，收率：quant.)。

[0112] 1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：2.55(3H,s),7.23(1H,d),7.74(1H,d),8.29(1H,s)。

[0113] MALDI TOF质谱(负离子模式：215)。

[0114] 随后，用氧化锰-硫酸锰(82mg、1.15mmol)作为氧化剂，使化合物(4)(50mg、0.23mmol)在60％硫酸中、110℃反应4小时。反应结束后，用寅氏盐(Celite)过滤得到的反应液，得到含有化合物(5)的滤液。在得到的滤液中加入1,3,4-三乙酰氧基苯(116mg、
0.46mmol)，在浓硫酸/50％乙醇存在下在80℃进行Friedel-Crafts酰化反应。用HPLC对原料的消失进行确认后，进一步加入过硫酸钾(62mg、0.23mmol)，在80℃进行氧化性闭环反应。反应结束后，反应液放置过夜。将析出的结晶用冷却的50％乙醇洗涤后，得到目标产物
2S-4CPF(6)(产量：16mg，收率：16％)。

[0115] 1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：6.60(2H,s),7.11(1H,d),7.15(2H,s),7.73(1H,d),8.26(1H,s)。

[0116] MALDI TOF质谱(负离子模式：444)。

[0117] 实施例3

[0118] [试液的配制]

[0119] (R-1)第一试液

[0120] 用含有0.5W/V％聚乙烯吡咯烷酮(K-90，和光纯药工业株式会社制)的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH8.0)作为第一试液。

[0121] (R-2)第二试液

[0122] 用含有1mM的实施例1合成的4S-SPF或实施例2合成的2S-4CPF的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH8.0)作为第二试液。

[0123] [试样]

[0124] 配制硫酸亚铁铵水溶液(含有200μg/dL铁)作为试样。

[0125] [吸光度的测定]

[0126] 对于上述试样，用上述的试液，用日本电子BM6050自动分析仪(日本电子株式会社制)并在以下的测定条件进行了吸光度的测定。并且，测定试剂空白值时，用生理盐水代替试样进行了相同的测定。

[0127] [测定条件]

[0128] 分析法/反应时间：[EPA][10]

[0129] 测定点：[44]、[47]～[95]、[98]

[0130] 波长(副/主)：[694][596]

[0131] 试样量：8μL(测定时稀释2倍)

[0132] R-1：60μL

[0133] R-2：20μL

[0134] 测定温度：37℃

[0135] 此外，测定时的4S-SPF或2S-4CPF的浓度为0.23mM。

[0136] [结果]

[0137] 4S-SPF的测定结果示于图1，2S-4CPF的测定结果示于图2。其中，铁水溶液用(-●-)表示，生理盐水用(-○-)表示。

[0138] 比较例1

[0139] [试液的配制]

[0140] (R-1)第一试液

[0141] 用含有0.5W/V％聚乙烯吡咯烷酮(K-90)的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH8.0)作为第一试液。

[0142] (R-2)第二试液

[0143] 用含有1mM CPF的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH8.0)作为第二试液。所使用的CPF是按照Mitsuru Hoshino et al.,Yakugaku Zassi,2011,vol.131,No.7,p.1095-1101(非专利文献1)记载的方法进行合成。

[0144] [试样]

[0145] 配制硫酸亚铁铵水溶液(含有200μg/dL铁)作为试样。

[0146] [吸光度的测定]

[0147] 对于上述试样，用上述的试液，用日本电子BM6050自动分析仪(日本电子株式会社制)并在与实施例3相同的测定条件进行了测定。并且，测定试剂空白值时，用生理盐水代替试样进行了相同的测定。

[0148] 此外，测定时的CPF的浓度为0.23mM。

[0149] [结果]

[0150] 结果示于图3，其中，铁水溶液用(-●-)表示，生理盐水用(-○-)表示。

[0151] 由图1～3的结果可知，用CPF作为螯合显色剂时，空白值高(图3)，但用本发明的化合物4S-SPF(图1)及2S-4CPF(图2)作为螯合显色剂时，分别可以将空白值控制在低的数值。

[0152] 并且，用CPF作为螯合显色剂时，确认到显色后褪色的情况(图3)，但用4S-SPF(图1)及2S-4CPF(图2)作为螯合显色剂时，没有确认到显色后的褪色，表现出了显色稳定的性能。

[0153] 由以上结果可知，用本发明的化合物作为螯合显色剂时，空白值得到了抑制，能够进行更为高灵敏度的铁浓度的测定。

[0154] 实施例4

[0155] [试液的配制]

[0156] (R-1)第一试液

[0157] 用含有0.5W/V％聚乙烯吡咯烷酮(K-90，和光纯药工业株式会社制)的10mM甘氨酸缓冲液(pH3.2)作为第一试液。

[0158] (R-2)第二试液

[0159] 用含有1mM的实施例1合成的4S-SPF或实施例2合成的2S-4CPF的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH9.0)作为第二试液。

[0160] [试样]

[0161] 使用与实施例3相同的试样。

[0162] [吸光度的测定]

[0163] 对于上述试样，用上述的试液，用日本电子BM6050自动分析仪(日本电子株式会社制)并在与实施例3相同的测定条件进行了吸光度的测定。

[0164] 此外，测定时的4S-SPF或2S-4CPF的浓度为0.23mM。

[0165] [结果]

[0166] 4S-SPF的测定结果示于图4，2S-4CPF的测定结果示于图5。其中，铁水溶液用(-●-)表示，生理盐水用(-○-)表示。

[0167] 比较例2

[0168] [试液的配制]

[0169] (R-1)第一试液

[0170] 用含有0.5W/V％聚乙烯吡咯烷酮(K-90)的10mM甘氨酸缓冲液(pH3.2)作为第一试液。

[0171] (R-2)第二试液

[0172] 用含有1mM CPF的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH9.0)作为第二试液。所使用的CPF是按照Mitsuru Hoshino et al.,Yakugaku Zassi,2011,vol.131,No.7,p.1095-1101(非专利文献1)记载的方法进行合成。

[0173] [试样]

[0174] 使用与实施例4相同的试样。

[0175] [吸光度的测定]

[0176] 对于上述试样，用上述的试液，用日本电子BM6050自动分析仪(日本电子株式会社制)并在与实施例4相同的测定条件进行了测定。

[0177] 此外，测定时的CPF的浓度为0.23mM。

[0178] [结果]

[0179] 结果示于图6，其中，铁水溶液用(-●-)表示，生理盐水用(-○-)表示。

[0180] 由图4～6的结果可知，用CPF作为螯合显色剂时，空白值高(图6)，但用本发明的化合物4S-SPF(图4)及2S-4CPF(图5)作为螯合显色剂时，分别可以将空白值控制在低的数值。

[0181] 并且，用CPF作为螯合显色剂时(图6)时，确认到显色后褪色的情况，但用4S-SPF(图4)及2S-4CPF(图5)作为螯合显色剂时，没有确认到显色后的褪色，表现出了显色稳定的性能。

[0182] 由以上结果可知，用本发明的化合物作为螯合显色剂时，空白值得到了抑制，能够进行更高灵敏度的铁浓度的测定。

[0183] 并且，在实施例4及比较例2中，用pH3.2的第一试液进行了测定。测定血清铁浓度时，使用的是调节至pH3～7的第一试液，但比较图3和图6时可知，用以往的铁螯合显色剂CPF且在测定血清铁浓度的条件测定铁浓度时，显色后的褪色明显。相对于此，比较图1和图4、图2和图5时可知，将本发明的化合物4S-SPF及2S-4CPF用作为螯合显色剂时，即使在血清铁浓度测定条件进行测定，也没有确认到显色后的褪色。由此可知，本发明的化合物特别适于作为在血清铁浓度测定中使用的螯合显色剂，将本发明的化合物用作为螯合显色剂时，能够进行更高灵敏度的血清铁浓度的测定。

[0184] 实施例5

[0185] [试液的配制]

[0186] (R-1)第一试液：使用与实施例3相同的试液。

[0187] (R-2)第二试液：使用与实施例3相同的试液(含有4S-SPF或2S-4CPF)。

[0188] [试样]

[0189] 使用与实施例3相同的试样。

[0190] [吸光度的测定]

[0191] 对于上述试样，用上述的试液，用日立U-3900H分光光度计(日立高新技术株式会社制)并在以下的测定条件进行了测定。并且，在试剂空白值测定中使用了生理盐水。

[0192] <测定条件>

[0193] 反应时间：5分钟-5分钟

[0194] 测定波长：500～700nm

[0195] 试样量：160μL

[0196] R-1：2400μL

[0197] R-2：800μL

[0198] 测定温度；37℃

[0199]

[0200] 另外，测定时的4S-SPF或2S-4CPF的浓度为0.24mM。

[0201] [结果]

[0202] 用4S-SPF测定得到的吸收曲线示于图7，用2S-4CPF测定得到的吸收曲线示于图8。并且，在图7及图8中，用铁水溶液作为试样时的结果用实线(─)表示，用生理盐水作为试样时的结果用虚线(┈)表示。

[0203] 比较例3

[0204] [试液的配制]

[0205] (R-1)第一试液：使用与比较例1相同的试液。

[0206] (R-2)第二试液：使用与比较例1相同的试液(含有CPF)。

[0207] [试样]

[0208] 使用与比较例1相同的试样。

[0209] [吸光度的测定]

[0210] 对于上述试样，用上述的试液，用日立U-3900H分光光度计并在与实施例5相同的测定条件进行了测定。

[0211] 另外，测定时的CPF的浓度为0.24mM。

[0212] [结果]

[0213] 得到的吸收曲线示于图9。在图9中，用铁水溶液作为试样时的结果用实线(─)表示，用生理盐水作为试样时的结果用虚线(┈)表示。

[0214] 由图7～9的结果可知，用CPF作为螯合显色剂时，在铁-螯合络合物的吸收波长590～600nm处空白对照的吸光度高(图9)，而将本发明的化合物4S-SPF(图7)及2S-4CPF(图8)用作为螯合显色剂时，在590～600nm也可以将空白对照的吸光度抑制在低的数值。

[0215] 由以上结果可知，将本发明的化合物用作为螯合显色剂时，能够抑制空白值，并进行高灵敏度的铁浓度的测定。

[0216] 实施例6

[0217] [试液的配制]

[0218] (R-1)第一试液

[0219] 用含有0.5W/V％聚乙烯吡咯烷酮(K-90)的10mM甘氨酸缓冲液(pH3.2)作为第一试液。

[0220] (R-2)第二试液

[0221] 用含有1mM的实施例1中合成的4S-SPF的100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH9.0)作为第二试液。

[0222] [试样]

[0223] 使用人血清。

[0224] [吸光度的测定]

[0225] 对于上述试样，用上述的试液，用日立7170S型自动分析仪(日立高新技术株式会社制)并在以下的测定条件进行吸光度的测定，从而求出了测定点16(反应开始后5分钟)至最终的测定点34(反应开始后10分钟)的5分钟的吸光度的差(△OD)。

[0226] 预先用铁浓度已知的试样、即多功能校正液A(和光纯药工业株式会社制，铁含量为200μg/dL)代替血清试样，进行同样测定后得到表示铁浓度和吸光度的关系的定量曲线，将得到的△OD套入到该曲线中，从而确定了各试样中的铁浓度。

[0227] 另外，试剂空白值测定中使用了生理盐水。

[0228] <测定条件>

[0229] 分析法/反应时间：[两点终点法][10]

[0230] 测定点：[16]～[34]

[0231] 波长(副/主)：[700][600]

[0232] 试样量：10μL

[0233] R-1：150μL

[0234] R-2：50μL

[0235] 测定温度：37℃

[0236] 第一试液与第二试液混合时的溶液的pH为8.0。并且，测定时的4S-SPF的浓度为0.23mM。

[0237] 并且，用使用现有的铁螯合显色剂、即红菲绕啉并依据直接法的铁浓度测定试剂盒L型WAKO Fe·N(和光纯药工业株式会社制)，按照试剂盒的产品说明书记载的标准操作法测定了与上述相同的试样的铁浓度。

[0238] [结果]

[0239] 图10示出了用使用本发明的化合物(4S-SPF)的试剂得到的血清铁浓度测定值、与用使用现有的红菲绕啉的试剂(L型WAKO Fe·N)得到的血清铁浓度测定值的关系图。

[0240] 由图10的结果的回归分析得到的回归线性关系式和相关系数如以下所示。

[0241] y＝0.988x+0.3

[0242] R＝0.999

[0243] 由以上结果可知，用使用本发明的化合物(4S-SPF)的试剂得到的血清铁浓度测定值、与用使用现有的红菲绕啉的试剂(L型WAKO Fe·N)得到的血清铁浓度测定值显示了良好的相互关系。

[0244] 由此可知，用本发明的化合物作为螯合显色剂，能够定量性地测定血清中的铁浓度。

[0245] 工业实用性

[0246] 本发明提供将本发明的式[1]表示的新型化合物及其盐用作为螯合显色剂的、高灵敏度且精度高的铁浓度的测定方法，及含有由该化合物形成的螯合显色剂作为构成要素的铁浓度测定试剂及试剂盒。