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荧光pH敏感性染料和其使用方法
申请号	CN201380028391.1	申请日	2013-03-14	公开(公告)号	CN104640933A	公开(公告)日	2015-05-20
申请人	生命科技公司;			发明人	K.吉; U.辛赫; A.鲁卡维什尼科夫; D.比查姆; S-J.黄; M.简斯; W.周;
摘要	本文揭示用于使用pH敏感性荧光染料来检测样品pH的化合物、组合物、方法和试剂盒。本文所揭示的化合物为包含具有一或多个给电子基团的苯胺部分的新颖氧杂蒽衍生染料，所述染料是用于活体外或活体内检测样品pH。本文还描述用于制备所述染料以供在所揭示的组合物、方法和试剂盒中使用的方法。
权利要求	1.一种pH敏感性荧光染料化合物，其具有结构式(I)：其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 a a a b R和R 可相同或不同，各自独立地为H、卤素、-OR 、-SR、-NRR或给电子基团； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基； 4 R是选自由烷基和经取代的烷基组成的群组； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质； a R为H、烷基或经取代的烷基； b R为烷基或经取代的烷基；且 7 8 9 10 R、R、R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 2.根据权利要求1所述的化合物，其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 R和R 可相同或不同，各自独立地为H或卤素； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； 4 R为烷基； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 7 8 9 10 R、R、R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 3.根据权利要求1所述的化合物，其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 R和R 可相同或不同，各自独立地为H、C1或F； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； 4 R为烷基； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 7 8 9 10 R、R、R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 4.根据权利要求1所述的化合物，其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 R和R 各自为H； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； 4 R为烷基； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 7 8 9 10 R、R、R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 5.根据权利要求1所述的化合物，其中 1 R为甲氧基； 2 6 R和R 各自为H； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为甲基或乙基； 4 R为甲基或乙基； 5 R为甲基；乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)c c NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚d d 糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc；且 7 8 9 10 R、R、R和R 可相同或不同，各自独立地为甲基或丙烯基。 6.一种pH敏感性荧光染料化合物，其具有结构式(II)：其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 a a a b R和R 可相同或不同，各自独立地为H、卤素、-OR 、-SR、-NRR或给电子基团； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基； 4 R是选自由烷基和经取代的烷基组成的群组； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质； a R为H、烷基或经取代的烷基； b R为烷基或经取代的烷基；且 7 8 R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基或烯基。 7.根据权利要求6所述的化合物，其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 R和R 可相同或不同，各自独立地为H或卤素； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； 4 R为烷基； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 7 8 R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 8.根据权利要求6所述的化合物，其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 R和R 可相同或不同，各自独立地为H、C1或F； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； 4 R为烷基； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 7 8 R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 9.根据权利要求6所述的化合物，其中 1 R为烷氧基或硫烷基； 2 6 R和R 各自为H； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； 4 R为烷基； 5 R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R； c c (CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、d d 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 7 8 R和R 可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 10.根据权利要求6所述的化合物，其中 1 R为甲氧基； 2 6 R和R 各自为H； 3 R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为甲基或乙基； 4 R为甲基或乙基； 5 R为甲基；乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)c c NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚d d 糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc；且 7 8 R和R 可相同或不同，各自独立地为甲基或丙烯基。 11.一种pH敏感性染料化合物，其选自由以下组成的群组： 12.一种用于测定样品pH的组合物，所述组合物包含： a)一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性荧光染料化合物；和 b)载体，其中所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物以有效检测所述样品的pH的量存在。 13.一种用于测定样品pH的组合物，所述组合物包含： (a)一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性荧光染料化合物；和 (b)分析物，其中所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物以有效检测所述样品的pH的量存在。 14.一种用于测定样品pH的方法，所述方法包含： (a)使所述样品与一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性荧光染料化合物接触以形成接触的样品； (b)使所述接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； (c)用适当波长照射所述培育的样品以形成照射的样品；和 (d)检测来自所述照射的样品的荧光发射；其中所述荧光发射用于测定所述样品的pH。 15.一种用于测定样品pH的方法，所述方法包含： (a)使所述样品与一或多种根据权利要求12或13所述的组合物接触以形成接触的样品； (b)使所述接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； (c)用适当波长照射所述培育的样品以形成照射的样品；和 (d)检测来自所述照射的样品的荧光发射；其中所述荧光发射用于测定所述样品的pH。 16.一种用于监测活细胞内部的pH的方法，所述方法包含： (a)使所述细胞与一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性荧光染料化合物接触以形成接触的细胞； (b)使所述接触的细胞培育足以使所述染料化合物或组合物进入所述细胞的时间长度以形成标记的细胞； (c)用适当波长照射所述标记的细胞以形成照射的细胞；和 (d)检测来自所述照射的细胞的荧光发射；其中所述荧光发射用于监测所述细胞内部的pH。 17.一种用于监测活细胞内部的pH的方法，所述方法包含： (a)使所述细胞与一或多种根据权利要求12或13所述的组合物接触以形成接触的细胞； (b)使所述接触的细胞培育足以使所述染料化合物或组合物进入所述细胞的时间长度以形成标记的细胞； (c)用适当波长照射所述标记的细胞以形成照射的细胞；和 (d)检测来自所述照射的细胞的荧光发射；其中所述荧光发射用于监测所述细胞内部的pH。 18.一种用于检测溶液中载体分子的吞噬作用的方法，所述方法包含： (a)使所述载体分子与一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性荧光染料化合物结合以形成载体结合物； (b)使所述载体结合物与细胞接触以形成接触的细胞； (c)培育所述接触的细胞以形成培育的溶液； (d)照射所述培育的溶液以形成照射的溶液；和 (e)检测来自所述照射的溶液的荧光发射；其中荧光发射指示所述载体分子的吞噬作用。 19.一种用于检测溶液中载体分子的吞噬作用的方法，所述方法包含： (a)使所述载体分子与一或多种根据权利要求12或13所述的组合物结合以形成载体结合物； (b)使所述载体结合物与细胞接触以形成接触的细胞； (c)培育所述接触的细胞以形成培育的溶液； (d)照射所述培育的溶液以形成照射的溶液；和 (e)检测来自所述照射的溶液的荧光发射；其中荧光发射指示所述载体分子的吞噬作用。 20.一种用于检测pH相关的细胞内过程的方法，所述方法包含： (a)使一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性荧光染料化合物与细胞接触以形成接触的细胞； (b)培育所述接触的细胞以形成培育的溶液； (c)照射所述培育的溶液以形成照射的溶液；和 (d)检测来自所述照射的溶液的荧光发射；其中增加的荧光发射指示所述细胞内过程的活化。 21.一种用于检测pH相关的细胞内过程的方法，所述方法包含： (a)使一或多种根据权利要求12或13所述的组合物与细胞接触以形成接触的细胞； (b)培育所述接触的细胞以形成培育的溶液； (c)照射所述培育的溶液以形成照射的溶液；和 (d)检测来自所述照射的溶液的荧光发射；其中增加的荧光发射指示所述细胞内过程的活化。 22.一种用于鉴别细胞群体中的目标细胞的方法，其中所述目标细胞相对于所述群体内的相邻细胞经差异性标记，所述方法包含： (a)使一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性染料化合物与所述细胞群体接触以形成接触的细胞群体； (b)使所述接触的细胞群体培育足以使所述一或多种所述pH敏感性染料化合物进入所述目标细胞的一段时间，由此形成培育的细胞群体；和 (c)照射所述培育的细胞群体，其中所述目标细胞通过相对于所述群体内的相邻细胞的差异标记来鉴别。 23.一种用于鉴别细胞群体中的目标细胞的方法，其中所述目标细胞相对于所述群体内的相邻细胞经差异性标记，所述方法包含： (a)使一或多种根据权利要求12或13所述的组合物与所述细胞群体接触以形成接触的细胞群体； (b)使所述接触的细胞群体培育足以使所述一或多种所述组合物进入所述目标细胞的一段时间，由此形成培育的细胞群体；和 (c)照射所述培育的细胞群体，其中所述目标细胞通过相对于所述群体内的相邻细胞的差异标记来鉴别。 24.一种用于诊断或检测受检者疾病的方法，所述方法包含： (a)使从怀疑患有所述疾病的受检者获得的样品与一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性染料化合物接触以形成接触的样品； (b)使所述接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； (c)用适当波长照射所述培育的样品以形成照射的样品；和 (d)检测来自所述照射的样品的荧光发射；其中所述荧光发射用于诊断或检测所述疾病。 25.一种用于诊断或检测受检者疾病的方法，所述方法包含： (a)使从怀疑患有所述疾病的受检者获得的样品与一或多种根据权利要求12或13所述的组合物接触以形成接触的样品； (b)使所述接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； (c)用适当波长照射所述培育的样品以形成照射的样品；和 (d)检测来自所述照射的样品的荧光发射；其中所述荧光发射用于诊断或检测所述疾病。 26.根据权利要求14或25所述的方法，其中所述疾病是选自癌症、免疫相关疾病、氧化应激相关疾病和与中枢神经系统相关的疾病。 27.一种用于测定样品pH的试剂盒，其包含： (a)一或多种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的pH敏感性染料化合物； (b)一或多个容器；和任选地， (c)用于测定所述样品的pH的说明书。 28.一种用于测定样品pH的试剂盒，其包含： (a)一或多种根据权利要求12或13所述的组合物； (b)一或多个容器；和任选地， (c)用于测定所述样品的pH的说明书。 29.一种合成结构式(I)的化合物的方法，所述方法包含：使结构式(III)的化合物：与结构式(IV)的化合物接触：以形成结构式(I)的化合物， 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 其中R、R、R、R、R、R、R、R、R和R 如权利要求1中所定义。
说明书全文	荧光pH敏感性染料和其使用方法 [0001] 相关申请案的交叉参考 [0002] 本申请案要求2012年5月30日提交的美国临时申请案第61/653,333号和2012年5月31日提交的美国临时申请案第61/653,616号的优先权权益，所述临时申请案以引用的方式全文结合到本文中。技术领域 [0003] 揭示新颖的pH敏感性荧光染料，和用于包括监测细胞内过程在内的多种应用的分析。背景技术 [0004] 用于生物研究和医学诊断学的pH敏感性荧光染料分成两组，各组的区别在于对pH改变的荧光反应的起源。第一组包括具有由荧光团中的酚系羟基电离控制的荧光的化合物。实例包括荧光素、羧基荧光素、和HPTS指示剂。 [0005] 美国专利公开案第2006/0051874号描述结合到用于监测血库中的血液pH的荧光检测器中的荧光素样结构。因为这些类型的分子的电离程度会在环境酸度降低后增加，所以它们随着pH的增加变得更具荧光性。 [0006] 第二组的荧光pH 传感器包括氨基(脂肪族或芳香族)作为指示剂部分，连同荧光染料报告部分一起。当此类分子吸收光子，产生电子激发态时，氨基的孤对电子转移到由于激发而空出的轨道。此类电子转移称为光诱导电子转移(PET)，防止受激分子发生辐射跃迁，从而使染料的荧光淬灭。氨基质子化会改变所述对的轨道的性质和能量且阻止PET。因而，荧光报告部分对pH改变作出反应。因为氨基质子化会消除淬灭，所以基于PET的传感器随着pH的降低变得更具荧光性。 [0007] 基于PET的pH传感器的实例包括LysoSensorTM染料，其含有二甲基氨基作为指示剂部分；和 5E染料，其具有假吲哚指示剂基团。这些传感器的一个缺点是工作范围由于指示剂氨基的低pKa而移到酸性侧。 [0008] 一系列基于若丹明的pH传感器描述于PCT公开案第WO2005/098437号(史密斯(Smith)等人)中。所述染料具有在氧杂蒽部分的邻位被-OH或-SH(或其去质子化形式)- -取代的苯环，使得去质子化为带负电荷状态会淬灭荧光且仅在带负电荷的-O或-S 质子化为中性状态后，荧光才得以恢复。典型地，这种情况发生时的pH小于pH 6。WO 2005/098437声称，-OH或-SH基团的电离状态引起染料的pH反应且染料中四甲基若丹明的强吸电子特性显著地降低指示剂基团的pKa，因此使传感器的工作范围移向高酸性pH值。然而，这会限制WO2005/098437中所述的染料在生理学pH(例如pH 6-7)下，尤其在生物系统中的适用性。这些染料的额外缺点是其pKa不可调。此外，我们已经发现这些化合物在溶液中不稳定。 [0009] 因此，需要具有改进的特性(包括在至少一些化合物中，检测生物系统中的pH改变的能力)的额外pH敏感性荧光染料。本发明的目标是开发一类新颖的相对稳定的荧光pH传感器，其在UV/VIS光谱的红色部分中发荧光，优选地具有朝向中性和其它生物相关pH值的工作范围，由此减轻或去除所属领域中已知的化合物的缺点。发明内容 [0010] 本文描述用于使用pH敏感性荧光染料来检测样品中的pH的化合物、组合物、方法和试剂盒，一方面，其特征在于省去了如WO2005/098437所需的羟基或硫醇基团。另一方面，如本文所揭示的pH敏感性荧光染料允许检测UV/VIS光谱的红色部分中对pH改变的荧光反应。本发明教示提供一系列新的pH敏感性红色荧光染料，其具有优于现有的荧光pH传感器的显著且意外优点，即在苯胺部分中的烷氧基取代基的对位存在二烷基氨基会产生生理学pKa值且本文提供的染料的pKa也可调。因此，本文提供的pH敏感性荧光染料可经改质以适合待分析的特定应用或条件。 [0011] 在某些实施例中，提供新颖染料化合物用作荧光pH传感器，所述染料化合物具有结构式(I)： [0012] [0013] 其中 [0014] R1为烷氧基或硫烷基； [0015] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、卤素、-ORa、-SRa、-NRaRb或给电子基团； [0016] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基； [0017] R4是选自由烷基和经取代的烷基组成的群组； [0018] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRRc；其中n为1到6的整数，且R和Rc可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或Rd，其中Rd为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质； [0019] Ra为H、烷基或经取代的烷基； [0020] Rb为烷基或经取代的烷基；且 [0021] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0022] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0023] R1为烷氧基或硫烷基； [0024] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H或卤素； [0025] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0026] R4为烷基； [0027] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0028] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0029] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0030] R1为烷氧基或硫烷基； [0031] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、Cl或F； [0032] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0033] R4为烷基； [0034] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0035] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0036] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0037] R1为烷氧基或硫烷基； [0038] R2和R6各自为H； [0039] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0040] R4为烷基； [0041] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0042] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0043] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0044] R1为甲氧基； [0045] R2和R6各自为H； [0046] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为甲基或乙基； [0047] R4为甲基或乙基； [0048] R5为甲基；乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)c cnC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡d d 聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc；且 [0049] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为甲基或丙烯基。 [0050] 在某些实施例中，提供新颖染料化合物用作荧光pH传感器，所述染料化合物具有结构式(II)： [0051] [0052] 其中1 [0053] R为烷氧基或硫烷基；2 6 a a a b [0054] R和R 可相同或不同，各自独立地为H、卤素、-OR 、-SR、-NRR或给电子基团；3 [0055] R为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基；4 [0056] R是选自由烷基和经取代的烷基组成的群组；5 [0057] R是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质； [0058] Ra为H、烷基或经取代的烷基； [0059] Rb为烷基或经取代的烷基；且 [0060] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0061] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0062] R1为烷氧基或硫烷基； [0063] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H或卤素； [0064] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0065] R4为烷基； [0066] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0067] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0068] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0069] R1为烷氧基或硫烷基； [0070] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、Cl或F； [0071] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0072] R4为烷基； [0073] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0074] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0075] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0076] R1为烷氧基或硫烷基； [0077] R2和R6各自为H； [0078] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0079] R4为烷基； [0080] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0081] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0082] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0083] R1为甲氧基； [0084] R2和R6各自为H； [0085] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为甲基或乙基； [0086] R4为甲基或乙基； [0087] R5为甲基；乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)c cnC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡d d 聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc； [0088] R7和R8可相同或不同，各自独立地为甲基或丙烯基。 [0089] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的组合物，所述组合物包含： [0090] a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物；和 [0091] b)载体， [0092] 其中所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物以有效检测样品pH的量存在。 [0093] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的组合物，所述组合物包含： [0094] (a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物；和 [0095] (b)分析物， [0096] 其中所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物以有效检测样品pH的量存在。 [0097] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的方法，所述方法包含： [0098] (a)使样品与一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物接触以形成接触的样品； [0099] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0100] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0101] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0102] 其中所述荧光发射用于测定样品pH。 [0103] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的方法，所述方法包含： [0104] (a)使样品与一或多种本文所述的组合物接触以形成接触的样品； [0105] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0106] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0107] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0108] 其中所述荧光发射用于测定样品pH。 [0109] 在某些实施例中，提供用于监测活细胞内部的pH的方法，所述方法包含： [0110] (a)使细胞与一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物接触以形成接触的细胞； [0111] (b)使接触的细胞培育足以使所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物进入所述细胞的时间长度以形成标记的细胞； [0112] (c)用适当波长照射标记的细胞以形成照射的细胞；和 [0113] (d)检测来自照射的细胞的荧光发射； [0114] 其中所述荧光发射用于监测所述细胞内部的pH。 [0115] 在某些实施例中，提供用于监测活细胞内部的pH的方法，所述方法包含： [0116] (a)使细胞与一或多种本文所述的组合物接触以形成接触的细胞； [0117] (b)使接触的细胞培育足以使所述一或多种组合物进入所述细胞的时间长度以形成标记的细胞； [0118] (c)用适当波长照射标记的细胞以形成照射的细胞；和 [0119] (d)检测来自照射的细胞的荧光发射； [0120] 其中所述荧光发射用于监测所述细胞内部的pH。 [0121] 在某些实施例中，提供用于检测溶液中载体分子的吞噬作用的方法，所述方法包含： [0122] (a)使载体分子与一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物结合以形成载体-染料结合物； [0123] (b)使载体-染料结合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0124] (c)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0125] (d)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0126] (e)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0127] 其中荧光发射指示载体分子的吞噬作用。 [0128] 在某些实施例中，提供用于检测溶液中载体分子的吞噬作用的方法，所述方法包含： [0129] (a)使载体分子与一或多种本文所述的组合物结合以形成载体-染料结合物； [0130] (b)使载体-染料结合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0131] (c)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0132] (d)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0133] (e)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0134] 其中荧光发射指示载体分子的吞噬作用。 [0135] 在某些实施例中，提供用于检测pH相关的细胞内过程的方法，所述方法包含： [0136] (a)使任一种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0137] (b)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0138] (c)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0139] (d)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0140] 其中增加的荧光发射指示所述细胞内过程的活化。 [0141] 在某些实施例中，提供用于检测pH相关的细胞内过程的方法，所述方法包含： [0142] (a)使任一种本文所述的组合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0143] (b)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0144] (c)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0145] (d)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0146] 其中增加的荧光发射指示所述细胞内过程的活化。 [0147] 在某些实施例中，提供用于鉴别细胞群体中的目标细胞的方法，其中所述目标细胞相对于所述群体内的相邻细胞经差异性标记，所述方法包含： [0148] (a)使一或多种本文所揭示的pH敏感性染料化合物与细胞群体接触以形成接触的细胞群体； [0149] (b)使接触的细胞群体培育足以使所述一或多种pH敏感性染料化合物进入所述目标细胞的一段时间，由此形成培育的细胞群体；和 [0150] (c)照射培育的细胞群体，其中所述目标细胞通过相对于所述群体内的相邻细胞的差异标记来鉴别。 [0151] 在某些实施例中，提供用于鉴别细胞群体中的目标细胞的方法，其中所述目标细胞相对于所述群体内的相邻细胞经差异性标记，所述方法包含： [0152] (a)使一或多种本文所揭示的组合物与细胞群体接触以形成接触的细胞群体； [0153] (b)使接触的细胞群体培育足以使所述一或多种组合物进入所述目标细胞的一段时间，由此形成培育的细胞群体；和 [0154] (c)照射培育的细胞群体，其中所述目标细胞通过相对于所述群体内的相邻细胞的差异标记来鉴别。 [0155] 在某些实施例中，提供用于诊断或检测受检者的疾病的方法，所述方法包含： [0156] (a)使从怀疑患有所述疾病的受检者获得的样品与一或多种本文所揭示的pH敏感性染料化合物接触以形成接触的样品； [0157] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0158] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0159] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0160] 其中所述荧光发射用于诊断或检测所述疾病。 [0161] 在某些实施例中，提供用于诊断或检测受检者的疾病的方法，所述方法包含： [0162] (a)使从怀疑患有所述疾病的受检者获得的样品与一或多种本文所揭示的组合物接触以形成接触的样品； [0163] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0164] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0165] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0166] 其中所述荧光发射用于诊断或检测所述疾病。 [0167] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的试剂盒，所述试剂盒包含： [0168] (a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物； [0169] (b)一或多个容器；和任选地， [0170] (c)用于测定样品pH的说明书。 [0171] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的试剂盒，所述试剂盒包含： [0172] (a)一或多种本文所述的组合物； [0173] (b)一或多个容器；和任选地， [0174] (c)用于测定样品pH的说明书。 [0175] 在某些实施例中，提供用于合成结构式(I)的化合物的方法： [0176] [0177] 所述方法包含： [0178] 使结构式(III)的化合物： [0179] [0180] 与结构式(IV)的化合物接触： [0181] [0182] 以形成结构式(I)的化合物， [0183] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如先前所定义。 [0184] 本发明的其它实施例和说明性方面、特征和优点将根据以下详细描述变得显而易知。然而，应了解所述详细描述和具体实例虽然指示优选的实施例，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于所属领域技术人员根据这一详细描述将变得显而易知。附图说明 [0185] 尽管以下图式描绘本发明的多个实例，但本发明不限于所述图式中所描绘的实例。 [0186] 图1为细胞内区室和细胞器的pH值的示意性图示。 [0187] 图2描述pH敏感性荧光染料化合物的细胞摄取。图A是使用根据本文揭示的实施例的化合物和方法时，pH敏感性荧光染料结合化合物(包括用于监测吞噬作用的染料结合细菌和用于监测内吞作用的染料结合粒子)的细胞摄取的示意性图示。图B是展示已将根据本发明教示的某些实施例的pH敏感性荧光染料化合物内化的细胞的荧光显微照片。 [0188] 图3图解展示pH与化合物(1)的荧光的关系。图A展示随pH而变的化合物(1)的荧光强度。图B展示化合物(1)的pKa。 [0189] 图4图解展示结合化合物(4)的EGF的内化。左图展示用EGF预处理的细胞且右图展示用染料结合的EGF处理的细胞。 [0190] 图5展示化合物(4)在细胞中的内化。 [0191] 图6展示来自位于细胞内部的化合物(4)的荧光信号随着外部pH变化的变化，其反映了质子通过细胞膜中的尼日利亚菌素孔的平衡。 [0192] 图7展示如由经化合物(4)标记的细胞的荧光所测量的细胞溶质pH的循环。 [0193] 图8展示来自IgG结合物(IgG与化合物(1)结合)的荧光信号的pH活化。具体实施方式 [0194] 一系列基于若丹明的pH传感器(史密斯等人；PCT公开案第WO2005/098437号，以全文引用的方式结合到本文中)呈现基于X取代基(参看下文方案I，即羟基或硫醇基团)的电离状态的pH依赖性，使得-OH或-SH基团去质子化为带负电荷的状态会淬灭荧光。仅- -在带负电荷的-O或-S 质子化后，荧光才得以恢复，如方案1中所说明： [0195] 方案1 [0196] [0197] 然而，已经意外地发现在对应X位置处进行烷氧基取代仍能够证实回应于pH改变而经调节的荧光。因此，虽然不希望受理论束缚，但仍假定是芳基环上4位的氮的质子化在调节荧光。在任何情况下，本发明均以如下意外发现为基础：迄今不可缺少的羟基或硫醇基3 团X可省去，限制条件是取代基氮保留。有利地，在R位置处添加二烷基氨基会产生生理学pKa。 [0198] 此外，本文所提供的pH敏感性荧光染料在UV/VIS光谱的红色部分中发荧光且具有与其它pH敏感性染料相比不同的化学特性。意外地发现：1)苯胺部分的吸电子能力可3 通过向苯环中添加各种给电子基团来调节；和2)在R位置处添加给电子基团(例如二烷 2 6 基氨基)和/或在位置R和/或R 处添加卤素可用于将pH敏感性荧光染料的pKa调整为 1 6 生理学pH或接近生理学pH。此外，通过改变在位置R-R处的给电子基团，可调节pH敏感性荧光染料的pKa以适合特定需要。 [0199] 此外，已发现史密斯等人(上文)所述的染料在溶液中不稳定，这最有可能是由于需氧氧化(例如，通过暴露于环境空气而氧化)。此外，史密斯等人所述的染料的四甲基若丹明报告部分的强吸电子特性显著降低方案1的X位置处指示剂基团的pKa，因此使传感器的工作范围移向酸性pH值。 [0200] 因此，在某些实施例中，本发明提供具有苯胺部分(其中氨基可如本文所揭示经取代或改质)的pH敏感性荧光染料，其中所述苯胺部分的苯环在荧光团的邻位不含羟基和硫醇取代基，或在某些实施例中，在所有位置均不含羟基和硫醇。具体说来，这些pH敏感性荧光染料化合物可代替史密斯等人(上文)所需的羟基或硫醇取代基具有如下部分，其中羟基或硫醇基团的氧或硫已经结合到醚或硫醚键联中，例如作为烷氧基或呋喃部分或其硫类似物的一部分。换个角度来看，本文所提供的保留醚化形式的氧或硫的pH敏感性荧光染料化合物为通过向苯环战略性引入给电子基团(EDG)，从而产生富电子苯胺部分，由此使pKa接近生理学范围(例如pH 6-8)移动来提供所述分子的增加的电子密度的染料化合物。相应地，苯环可经给电子基团取代一或多次(例如，1、2、3或4次)，所述给电子基团为相同或不同的。在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物的醚化O或S经另一个给电子基团置换。不管所述醚化O或S是否经另一个EDG置换，可在苯环上提供补充性给电子基团以进一步调节pKa。在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物可在苯环上包含共计2个给电子基团，具体说来是紧挨着苯环具有可用的孤对电子的类型的2个给电子基团(例如烷氧基或二烷基氨基，任选地如本文所述经取代)。另外，可进行改质以调节本发明的pH敏感性荧光染料化合物的量子产率。因此，如本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物具有优于其它基于PET的染料的显著优点且有利地提供具有改进的稳定性和/或在生理学应用范围内的pKa的益处。此外，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物的pKa可调整到特定pKa，视苯环上(例如，苯胺部分上)所用的给电子基团而定。 [0201] 在某些实施例中，苯胺的氨基的pKa通过将氨基改质成更具碱性的氮官能团来调节。这一特征可有用地作为用另一个给电子基团置换省去的羟基或硫醇基团的替代方法采用；或者，将氨基改质成更具碱性的基团可与用除羟基或硫醇基团外的至少一个给电子基团取代苯环相组合。 [0202] 本文中还包括如下实施例，其中苯胺部分的pKa通过将位置R3处的氨基改质成-NR′R″(其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基(例如，二烷基氨基))来调节以便使pKa接近生理学范围。在某些实施例中，二烷基氨基为二甲基氨基(例如-N(CH3)2)。在某些实施例中，二烷基氨基为二乙基氨基(例如-N(CH2CH3)2)。 [0203] 本文所述的化合物、组合物、方法和试剂盒所靶向的特定特征包括以下一或多者：(1)在生理学范围内的解离常数pKa；(2)较大的稳定性(被视为是针对氧化的)；(3)灵活合成方法，允许连同反应性基团一起引入pKa调节取代基；和4)pKa的可调性。如本文先前所述，本发明的pH敏感性荧光染料化合物通过省去方案I的位置X处先前不可缺少的羟基或硫醇而具有增强的稳定性，且所述羟基或硫醇基团有利地由另一给电子基团，例如烷氧基或硫烷基，优选地烷氧基在同一位置处置换。或者或另外，所述其它给电子基团可在苯环上的其它位置处经取代。在某些实施例中，所述其它给电子基团包括二烷基氨基，其中各烷基可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基。 [0204] 为了实现这些目标，在分析和生物应用中设计、合成和测试一类新颖的pH敏感性化合物。优选的染料化合物的结构包括结构式(I)和(II)。 [0205] 如与连接于芳环的氢原子相比，所述环上的取代基可向芳环给予电子或从芳环吸取电子。取代基因此可分类为给电子基团或吸电子基团。 [0206] 许多给电子基团在邻近于芳环的π(pi)系统的原子上具有孤对电子。烷基、芳香族基团和烯基为给电子基团的实例。吸电子基团一般为其中邻近于芳香族π系统的原子具有形式上的正电荷或δ正电荷(例如，由于连接于更具电负性的原子)的基团。给电子基团关于环系统的进一步取代具有活化效应且倾向于引导进一步邻位/对位取代，而吸电子基团去活化且倾向于引导进一步间位取代。其中的例外是卤素取代基，其虽然总体上为吸电子且去活化的，但由于共振(孤对)给予而倾向于引导进一步邻位/对位取代。表1指示一些常见取代基的相对吸电子和给电子特征。 [0207] 表1：不同芳环取代基的相对给电子/吸电子特征(按最具给电子性到最具吸电子性排列) [0208]取代基相对于H的特征活化/去活化引导 -O- 给电子性强烈活化邻位/对位 -NR2 给电子性强烈活化邻位/对位 -NH2 给电子性强烈活化邻位/对位 -OH 给电子性强烈活化邻位/对位 -OR 给电子性强烈活化邻位/对位 -NHC(O)R 给电子性适度活化邻位/对位 -OC(O)R 给电子性适度活化邻位/对位 -R 给电子性微弱活化邻位/对位 -Ph 给电子性微弱活化邻位/对位 -CH＝CR2 给电子性微弱活化邻位/对位 -H 参考中性邻位/对位 -X(X＝卤基) 吸电子性微弱去活化邻位/对位 -C(O)H 吸电子性适度去活化间位 -C(O)R 吸电子性适度去活化间位 -C(O)OR 吸电子性适度去活化间位 -C(O)OH 吸电子性适度去活化间位 -CF3 吸电子性强烈去活化间位 -CN 吸电子性强烈去活化间位 -S(O)2OH 吸电子性强烈去活化间位 -N(+)H3 吸电子性强烈去活化间位 -N(+)R3 吸电子性强烈去活化间位 -N(+)(O)O(-) 吸电子性强烈去活化间位 [0209] 表1中的符号R尤其表示烷基，不过其可以任何合理方式经取代，所述方式不会使烷基的电子效应从给电子转化为吸电子或从吸电子转化为给电子。本说明书进一步描述用于本说明书中所述的苯胺或苯胺样环的苯基取代的合适给电子基团。 [0210] 定义： [0211] 为了更清楚且简明地描述且指出本发明教示的主题，针对用于以下描述和所附权利要求书的特定术语提供以下定义。在本说明书中，特定术语的例证应被视为非限制性实例。 [0212] 在详细描述本发明教示之前，应了解本发明不限于特定组合物或方法步骤，因为其可改变。应注意，如本说明书和所述权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个提及物。因此，例如，提到“一荧光pH敏感性染料”包括多种染料且提到“一细胞”包括多个细胞等。短语“和/或”表示一种速记方式，指示特定组合预期呈组合形式和呈替代形式分开。为达成说明性目的而非限制，“X和/或Y”可意指“X”或“Y”或“X”和“Y”。 [0213] 应了解，在本发明讨论的温度、浓度、时间等前面隐含有“约”，使得微小和非实质性偏差在本文中的本发明教示的范围内。另外，“包含(comprise)”、包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用不打算为限制性的。应了解，前述一般描述和详细描述均仅为例示性和解释性的且不限制所述教示。 [0214] 除非以上说明书中特别指出，否则以上说明书中陈述“包含”各种组分的实施例也预期为“由所陈述的组分组成”或“基本上由所陈述的组分组成”；说明书中陈述“由各种组分组成”的实施例也预期为“包含”所陈述的组分或“基本上由所陈述的组分组成”；且说明书中陈述“基本上由各种组分组成”的实施例也预期为“由所陈述的组分组成”或“包含”所陈述的组分(这一可互换性不适用于权利要求书中这些术语的使用)。 [0215] 如本文所用，术语“或其组合”是指在所述术语之前所列术语的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”打算包括以下至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果在特定情形中顺序较为重要，那么也包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续这一实例，确切地包括含有一或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。熟练技术人员应了解，除非上下文另外显而易见，否则典型地对呈任何组合的项目或术语的数目无限制。 [0216] 本文所用的章节标题仅用于组织目的且不应被视为以任何方式限制所需的主题。本说明书中所引用的所有文献，包括(但不限于)专利、专利申请案、文章、书籍和条约明确地以全文引用的方式结合以达成任何目的。如果任何结合的文献与本说明书中定义的任何术语相悖，那么以本说明书为准。虽然本发明教示与各种实施例结合描述，但本发明教示不打算限于所述实施例。相反，本发明教示涵盖各种替代、修改和等效物，如所属领域技术人员应了解。 [0217] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。以下术语是为了达成如本文所述的教示的目的而定义。 [0218] “烷基”是指具有1到10个碳原子且优选地1到6个碳原子，例如1、2、3、4、5或6个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。这一术语包括例如直链和分支链烃基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)和新戊基((CH3)3CCH2-)。 [0219] “经取代的烷基”是指具有1到5个、优选地1到3个或更优选地1到2个选自由以下组成的群组的取代基的烷基：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基氨基、氨基羰氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳氧基、经取代的芳氧基、芳硫基、经取代的芳硫基、羧基、羧基烷基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷氧基、经取代的环烷氧基、环烷硫基、经取代的环烷硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯氧基、经取代的环烯氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳氧基、经取代的杂芳氧基、杂芳硫基、经取代的杂芳硫基、杂环基、经取代的杂环基、杂环氧基、经取代的杂环氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、SO3H、经取代的磺酰基、磺酰氧基、硫酰基、硫醇、烷硫基和经取代的烷硫基，其中所述取代基在本文中定义。特定经取代的烷基包含用于直接或间接键联于载体分子或固体支撑物的反应性基团，作为实例可提到经羧基或羧基酯(例如，活化酯，例如N-羟基丁二酰亚胺酯)取代的烷基和经氨基羰基-CONHR(其中R为如下文参考术语“氨基羰基”定义的有机部分)取代的烷基，例如末端经包括(但不限于)羧基、羧基酯、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖和DIBO-胺的反应性基团(Rx)取代的C1-C10(例如C1-C6)烷基。 [0220] “烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基在本文中定义。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基和正戊氧基。 [0221] “经取代的烷氧基”是指基团-O-(经取代的烷基)，其中经取代的烷基在本文中定义。 [0222] “酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、经取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、经取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、经取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、经取代的环烷基-C(O)-、环烯基-C(O)-、经取代的环烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、经取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、经取代的杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-和经取代的杂环基-C(O)-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。酰基包括“乙酰基”CH3C(O)-。 [0223] “酰基氨基”是指基团-NRC(O)烷基、-NRC(O)经取代的烷基、-NRC(O)环烷基、-NRC(O)经取代的环烷基、-NRC(O)环烯基、-NRC(O)经取代的环烯基、-NRC(O)烯基、-NRC(O)经取代的烯基、-NRC(O)炔基、-NRC(O)经取代的炔基、-NRC(O)芳基、-NRC(O)经取代的芳基、-NRC(O)杂芳基、-NRC(O)经取代的杂芳基、-NRC(O)杂环基和-NRC(O)经取代的杂环基，其中R为氢或烷基且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0224] “酰氧基”是指基团烷基-C(O)O-、经取代的烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、经取代的烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、经取代的炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、经取代的芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、经取代的环烷基-C(O)O-、环烯基-C(O)O-、经取代的环烯基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、经取代的杂芳基-C(O)O-、杂环基-C(O)O-和经取代的杂环基-C(O)O-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0225] “氨基”是指基团-NH2。 [0226] “经取代的氨基”是指基团-NR′R″，其中R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基、经取代的杂环基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-烯基、-SO2-经取代的烯基、-SO2-环烷基、-SO2-经取代的环烷基、-SO2-环烯基、-SO2-经取代的环烯基、-SO2-芳基、-SO2-经取代的芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-经取代的杂芳基、-SO2-杂环基和-SO2-经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，限制条件是R′和R″不同时为氢且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。当R′为氢且R″为烷基时，经取代的氨基在本文中有时称为烷基氨基。当R′和R″为烷基时，经取代的氨基在本文中有时称为二烷基氨基。当称为经单取代的氨基时，意指R′或R″为氢，但不同时为氢。当称为经二取代的氨基时，意指R′和R″均不为氢。 [0227] “氨基羰基”是指基团-C(O)NR′R″，其中R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0228] “氨基硫羰基”是指基团-C(S)NR′R″，其中R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0229] “氨基羰基氨基”是指基团-NRC(O)NR′R″，其中R为氢或烷基且R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0230] “氨基硫羰基氨基”是指基团-NRC(S)NR′R″，其中R为氢或烷基且R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0231] “氨基羰氧基”是指基团-O-C(O)NR′R″，其中R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0232] “氨基磺酰基”是指基团-SO2NR′R″，其中R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0233] “氨基磺酰氧基”是指基团-O-SO2NR′R″，其中R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0234] “氨基磺酰基氨基”是指基团-NR-SO2NR′R″，其中R为氢或烷基且R′和R″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0235] “脒基”是指基团-C(＝NR′″)R′R″，其中R′、R″和R′″独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基且其中R′和R″任选地连同其所结合的氮一起接合形成杂环基或经取代的杂环基，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0236] “苯胺”是指C6H5NH2且由连接于氨基的苯基环组成。如本文所用，氨基在荧光团的对位，如以下所说明： [0237] [0238] 其中X为荧光团，优选地为氧杂蒽衍生物，最优选地为若丹明或对甲氨基酚。 [0239] “芳基”或“Ar”是指具有单环(例如苯基)或多个稠环(例如萘基或蒽基)的6到14个碳原子的单价芳香族碳环基团，所述稠环可能是或可能不是芳香族的(例如2-苯并噁唑啉酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，限制条件是连接点处于芳香族碳原子处。优选的芳基包括苯基和萘基。 [0240] “经取代的芳基”是指经1到5个、优选地1到3个或更优选地1到2个选自由以下组成的群组的取代基取代的芳基：烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基氨基、氨基羰氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳氧基、经取代的芳氧基、芳硫基、经取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷氧基、经取代的环烷氧基、环烷硫基、经取代的环烷硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯氧基、经取代的环烯氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳氧基、经取代的杂芳氧基、杂芳硫基、经取代的杂芳硫基、杂环基、经取代的杂环基、杂环氧基、经取代的杂环氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、SO3H、经取代的磺酰基、磺酰氧基、硫酰基、硫醇、烷硫基和经取代的烷硫基，其中所述取代基在本文中定义。 [0241] “芳氧基”是指基团-O-芳基，其中芳基如本文中定义，其包括例如苯氧基和萘氧基。 [0242] “经取代的芳氧基”是指基团-O-(经取代的芳基)，其中经取代的芳基如本文中定义。 [0243] “芳硫基”是指基团-S-芳基，其中芳基如本文中定义。 [0244] “经取代的芳硫基”是指基团-S-(经取代的芳基)，其中经取代的芳基如本文中定义。 [0245] “烯基”是指具有2到6个碳原子且优选地2到4个碳原子且具有至少1个且优选地1到2个烯基不饱和位点的烯基。所述基团例如由乙烯基、烯丙基、丁-3-烯-1-基和丙烯基例示。 [0246] “经取代的烯基”是指具有1到3个取代基且优选地1到2个取代基的烯基，所述取代基选自由以下组成的群组：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基氨基、氨基羰氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳氧基、经取代的芳氧基、芳硫基、经取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷氧基、经取代的环烷氧基、环烷硫基、经取代的环烷硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯氧基、经取代的环烯氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳氧基、经取代的杂芳氧基、杂芳硫基、经取代的杂芳硫基、杂环基、经取代的杂环基、杂环氧基、经取代的杂环氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、SO3H、经取代的磺酰基、磺酰氧基、硫酰基、硫醇、烷硫基和经取代的烷硫基，其中所述取代基在本文中定义且限制条件是任何羟基取代均不连接于乙烯基(不饱和)碳原子。 [0247] “炔基”是指具有2到6个碳原子且优选地2到3个碳原子且具有至少1个且优选地1到2个炔基不饱和位点的炔基。 [0248] “经取代的炔基”是指具有1到3个取代基且优选地1到2个取代基的炔基，所述取代基选自由以下组成的群组：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基氨基、氨基羰氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳氧基、经取代的芳氧基、芳硫基、经取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷氧基、经取代的环烷氧基、环烷硫基、经取代的环烷硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯氧基、经取代的环烯氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳氧基、经取代的杂芳氧基、杂芳硫基、经取代的杂芳硫基、杂环基、经取代的杂环基、杂环氧基、经取代的杂环氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、SO3H、经取代的磺酰基、磺酰氧基、硫酰基、硫醇、烷硫基和经取代的烷硫基，其中所述取代基在本文中定义且限制条件是任何羟基取代均不连接于炔属碳原子。 [0249] “羰基”是指二价基团-C(O)-，其等效于-C(＝O)-。 [0250] “羧基(Carboxyl)”或“羧基(carboxy)”是指-COOH或其盐。 [0251] “羧基烷基(Carboxyl alkyl)”或“羧基烷基(carboxyalkyl)”是指基团-(CH2)nCOOH，其中n为1到6的整数。 [0252] “羧基酯(Carboxyl ester)”或“羧基酯(carboxy ester)”是指基团-C(O)O-烷基、-C(O)O-经取代的烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-经取代的烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-经取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-经取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-经取代的环烷基、-C(O)O-环烯基、-C(O)O-经取代的环烯基、-C(O)O-杂芳基、-C(O)O-经取代的杂芳基、-C(O)O-杂环基和-C(O)O-经取代的杂环基，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0253] “(羧基酯)氨基((Carboxyl ester)amino)”是指基团-NR-C(O)O-烷基、经取代的-NR-C(O)O-烷基、-NR-C(O)O-烯基、-NR-C(O)O-经取代的烯基、-NR-C(O)O-炔基、-NR-C(O)O-经取代的炔基、-NR-C(O)O-芳基、-NR-C(O)O-经取代的芳基、-NR-C(O)O-环烷基、-NR-C(O)O-经取代的环烷基、-NR-C(O)O-环烯基、-NR-C(O)O-经取代的环烯基、-NR-C(O)O-杂芳基、-NR-C(O)O-经取代的杂芳基、-NR-C(O)O-杂环基和-NR-C(O)O-经取代的杂环基，其中R为烷基或氢，且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0254] “(羧基酯)氧基((Carboxyl ester)oxy)”是指基团-O-C(O)O-烷基、经取代的-O-C(O)O-烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-经取代的烯基、-O-C(O)O-炔基、-O-C(O)O-经取代的炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-经取代的芳基、-O-C(O)O-环烷基、-O-C(O)O-经取代的环烷基、-O-C(O)O-环烯基、-O-C(O)O-经取代的环烯基、-O-C(O)O-杂芳基、-O-C(O)O-经取代的杂芳基、-O-C(O)O-杂环基和-O-C(O)O-经取代的杂环基，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0255] “氰基”是指基团-CN。 [0256] “环烷基”是指具有单一或多个环(包括稠环、桥环和螺环系统)的3到10个碳原子的环状烷基。合适的环烷基的实例包括例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基和环辛基。 [0257] “环烯基”是指具有单一或多个环且具有至少一个＞C＝C＜环不饱和且优选地1到2个＞C＝C＜环不饱和位点的3到10个碳原子的非芳香族环状烷基。 [0258] “经取代的环烷基”和“经取代的环烯基”是指具有1到5个或优选地1到3个选自由以下组成的群组的取代基的环烷基或环烯基：氧代、硫酮、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基氨基、氨基羰氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳氧基、经取代的芳氧基、芳硫基、经取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷氧基、经取代的环烷氧基、环烷硫基、经取代的环烷硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯氧基、经取代的环烯氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳氧基、经取代的杂芳氧基、杂芳硫基、经取代的杂芳硫基、杂环基、经取代的杂环基、杂环氧基、经取代的杂环氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、SO3H、经取代的磺酰基、磺酰氧基、硫酰基、硫醇、烷硫基和经取代的烷硫基，其中所述取代基在本文中定义。 [0259] “环烷氧基”是指-O-环烷基。 [0260] “经取代的环烷氧基”是指-O-(经取代的环烷基)。 [0261] “环烷硫基”是指-S-环烷基。 [0262] “经取代的环烷硫基”是指-S-(经取代的环烷基)。 [0263] “环烯氧基”是指-O-环烯基。 [0264] “经取代的环烯氧基”是指-O-(经取代的环烯基)。 [0265] “环烯基硫基”是指-S-环烯基。 [0266] “经取代的环烯基硫基”是指-S-(经取代的环烯基)。 [0267] “胍基”是指基团-NHC(＝NH)NH2。 [0268] “经取代的胍基”是指-NR13C(＝NR13)N(R13)2，其中各R13独立地选自由氢、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基组13 成的群组且连接于共同的胍基氮原子的两个R 基团任选地与其所结合的氮一起接合形成 13 杂环基或经取代的杂环基，限制条件是至少一个R 不为氢，且其中所述取代基如本文所定义。 [0269] “H”指示氢。 [0270] “卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。 [0271] “羟基(Hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指基团-OH。 [0272] “杂芳基”是指环内具有1到10个碳原子和1到4个选自由氧、氮和硫组成的群组的杂原子的芳香族基团。所述杂芳基可具有单环(例如吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如吲嗪基或苯并噻吩基)，其中所述稠环可能是或可能不是芳香族的和/或可能含有或可能不含有杂原子，限制条件是连接点是通过芳香族杂芳基的原子。在一个实施例中，杂芳基的氮和/或硫环原子任选地氧化以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。 [0273] “经取代的杂芳基”是指经1到5个、优选地1到3个或更优选地1到2个取代基取代的杂芳基，所述取代基选自由关于经取代的芳基所定义的相同取代基群组组成的群组。 [0274] “杂芳氧基”是指-O-杂芳基。 [0275] “经取代的杂芳氧基”是指基团-O-(经取代的杂芳基)。 [0276] “杂芳硫基”是指基团-S-杂芳基。 [0277] “经取代的杂芳硫基”是指基团-S-(经取代的杂芳基)。 [0278] “杂环(Heterocycle)”或“杂环(heterocyclic)”或“杂环烷基”或“杂环基”是指具有单环或多个稠环(包括稠环、桥环和螺环系统)且环内具有1到10个碳原子和1到4个选自由氮、硫或氧组成的群组的杂原子的饱和或不饱和基团，其中在稠环系统中，一或多个环可为环烷基、芳基或杂芳基，限制条件是连接点是通过非芳香族环。在一个实施例中，杂环基的氮和/或硫原子任选地氧化以提供N-氧化物、亚硫酰基和磺酰基部分。 [0279] “经取代的杂环”或“经取代的杂环烷基”或“经取代的杂环基”是指经1到5个或优选地1到3个如关于经取代的环烷基所定义的相同取代基取代的杂环基。 [0280] “杂环氧基”是指基团-O-杂环基。 [0281] “经取代的杂环氧基”是指基团-O-(经取代的杂环基)。 [0282] “杂环基硫基”是指基团-S-杂环基。 [0283] “经取代的杂环基硫基”是指基团-S-(经取代的杂环基)。 [0284] 杂环和杂芳基的实例包括(但不限于)氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1，2，3，4-四氢异喹啉、4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫吗啉基(也称为硫杂吗啉基)、1，1-二氧代硫吗啉基、哌啶基、吡咯烷和四氢呋喃基。 [0285] “肼基”是指基团-NHNH2-或＝NNH-。 [0286] “经取代的肼基”是指肼基，其中非氢原子(例如烷基)附接于一个或两个肼基胺+基。经取代的肼基的实例为-N(烷基)-NH2或＝N (烷基)-NH2。 [0287] “硝基”是指基团-NO2。 [0288] “氧代”是指原子(＝O)或(-O-)。 [0289] “螺环基”是指具有环烷基或杂环基环且具有螺接(由作为所述环的唯一共同成员的单一原子形成的连接)的3到10个碳原子的二价饱和环状基团，如由以下结构例示： [0290] [0291] “磺酰基”是指二价基团-S(O)2-。 [0292] “经取代的磺酰基”是指基团-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-烯基、-SO2-经取代的烯基、-SO2-环烷基、-SO2-经取代的环烷基、-SO2-环烯基、-SO2-经取代的环烯基、-SO2-芳基、-SO2-经取代的芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-经取代的杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-经取代的杂环基，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。经取代的磺酰基包括例如甲基-SO2-、苯基-SO2-和4-甲基苯基-SO2-的基团。 [0293] “磺酰氧基”是指基团-OSO2-烷基、-OSO2-经取代的烷基、-OSO2-烯基、-OSO2-经取代的烯基、-OSO2-环烷基、-OSO2-经取代的环烷基、-OSO2-环烯基、-OSO2-经取代的环烯基、-OSO2-芳基、-OSO2-经取代的芳基、-OSO2-杂芳基、-OSO2-经取代的杂芳基、-OSO2-杂环基、-OSO2-经取代的杂环基，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0294] “硫酰基”是指基团H-C(S)-、烷基-C(S)-、经取代的烷基-C(S)-、烯基-C(S)-、经取代的烯基-C(S)-、炔基-C(S)-、经取代的炔基-C(S)-、环烷基-C(S)-、经取代的环烷基-C(S)-、环烯基-C(S)-、经取代的环烯基-C(S)-、芳基-C(S)-、经取代的芳基-C(S)-、杂芳基-C(S)-、经取代的杂芳基-C(S)-、杂环基-C(S)-和经取代的杂环基-C(S)-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基如本文中所定义。 [0295] “硫醇”是指基团-SH。 [0296] “硫羰基”是指二价基团-C(S)-，其等效于-C(＝S)-。 [0297] “硫酮”是指原子(＝S)。 [0298] “烷硫基”是指基团-S-烷基，其中烷基如本文中所定义。 [0299] “经取代的烷硫基”是指基团-S-(经取代的烷基)，其中经取代的烷基如本文中所定义。 [0300] 从取代基伸出的虚线，例如： [0301] [0302] 指示与基础分子的连接点。对于稠环，虚线指示基础分子中连接所述稠环的部分，例如： [0303] [0304] 其中完整分子可能具有如下结构： [0305] [0306] 除非另外指示，否则本文中未明确定义的取代基的命名是通过对所述官能团的末端部分命名，随后对朝向连接点的相邻官能团命名来获得。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。 [0307] 应了解，在上文定义的所有经取代的基团中，通过用取代基本身的进一步取代基(例如，经取代的芳基具有经取代的芳基作为取代基，所述取代基本身被经取代的芳基取代，所述经取代的芳基进一步被经取代的芳基取代等)来定义取代基所获得的聚合物不打算包括在本文中。在所述情形下，所述取代的最大数目为3。例如，经取代的芳基经另外两个经取代的芳基连续取代是限于-经取代的芳基-(经取代的芳基)-经取代的芳基。 [0308] 同样，应了解上述定义不打算包括不许可的取代模式(例如，经5个氟基经取代的甲基)。所述不许可的取代模式是熟练技术人员众所周知的。 [0309] 本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物可以未溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。这些化合物可以多种结晶或非晶形式存在。一般来说，所有物理形式对于本文所述的用途来说是等效的且打算在本发明的范围内。本文所揭示的染料化合物可具有不对称碳原子(即，手性中心)或双键；本文所述化合物的外消旋体、非对映异构体、几何异构体和个别异构体在本发明的范围内。本文所述的染料化合物可以单一异构体形式或以异构体混合物形式制备。 [0310] 在取代基由其常规化学式规定且从左向右书写时，其相等地涵盖将由于从右向左书写所述结构而产生的化学上相同的取代基，例如-CH2O-意欲也陈述-OCH2-。 [0311] 应了解，用于定义本文所揭示的染料化合物的化学结构各自表示可表示各给定结构的可能的共振结构之一。此外，应了解根据定义，共振结构仅为所属领域技术人员用于表示电子离域的图形表示，且本发明不会由于展示任何给定结构的一种特定的共振结构而以任何方式受限。 [0312] 在所揭示的化合物包括共轭环系统时，共振稳定化可允许形式上的电子电荷分布在整个分子上。虽然特定电荷可描绘为在特定环系统上或特定杂原子上定域，但通常应了解可画出其中所述电荷可在形式上在所述化合物的替代部分上定域的相当的共振结构。 [0313] 如本文所用，术语“载体分子”是指共价键结于或变得共价键结于本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的生物或非生物组分。所述组分包括(但不限于)氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装、合成聚合物、聚合物微粒、生物细胞、病毒和其组合。包括一个实施例，其中载体分子包含具有至少4个多价原子且通常超过10个多价原子(即，除氢和卤基外的原子)，例如至少15个所述原子的有机部分，如在具有至少20个所述原子的部分的情况下。 [0314] 术语“结合物质”或“Sc”是指载体分子或固体支撑物。 [0315] 如本文所用，术语“可检测的反应”是指可通过观测或通过仪器直接地或间接地检测的信号的存在或改变。典型地，可检测的反应是光学反应，导致波长分布模式或吸光度或荧光强度改变或光散射、荧光寿命、荧光偏振或上述参数的组合改变。 [0316] 如本文所用，术语“染料”是指发光以产生可观测的可检测信号的化合物。 [0317] 术语“给电子基团”或“EDG”是指具有孤对电子的取代基，其邻近于芳香族环(例如苯基)且通过共振给予效应增加所述环上的电子密度。本发明的给电子基团包括例如烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、卤素、烷硫基、酰基氨基和(羧基酯)氧基。烷氧基为特定EDG。经取代的烷氧基为另一特定EDG。还要提到二烷基氨基。另一个实例是具有经取代的烷基的二烷基氨基。优选的EDG为-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2和-N(CH2CH3)2，尤其-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2和-N(CH2CH3)2。还要提到烷氧基、烷硫基和二烷基氨基，在这些情形中的任一者中均具有烷基取代基，其中所述烷基部分经部分-L-Rx或-LR-Sc取代。本说明书还揭示特定化合物或化合物类别，其包括除邻近芳香族环具有孤对电子的那些EDG以外的其它EDG。 [0318] “荧光pH敏感性染料”、“pH敏感性荧光染料”和“荧光pH传感器染料”是等效的且可互换使用以指代荧光光谱或强度受pH影响的化合物。 [0319] 如本文所用，术语“荧光团”或“荧光(fluorogenic)”是指固有地发荧光或证实在质子化时发生荧光改变，或结合于生物化合物或金属离子，或由酶代谢的组合物。本发明的优选荧光团包括在水性介质中具有高量子产率的荧光染料。例示性荧光团包括氧杂蒽衍生物，优选地包括若丹明和对甲氨基酚。本文所揭示的荧光团可经取代以改变所述荧光团的溶解性、光谱特性或物理特性。 [0320] 如本文所用，术语“键联基团”或“L”是指单一共价键或包含稳定共价键系列的部分，所述部分通常并有1-40个多价原子，所述原子选自由C、N、O、S和P组成的群组且共价地将所述荧光化合物连接于另一个部分(例如化学反应性基团或生物和非生物组分)。键联基团中多价原子的数目可为例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30或更大数目，多达40或更多。键联基团可为线性或非线性的；一些键联基团具有侧位侧链或侧位官能团，- 或这两者。所述侧位部分的实例为亲水性改质剂，例如增溶基团，如磺基(-SO3H或-SO3)。在某些实施例中，L由单键、双键、三键或芳香族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合构成。例示性键联成员包括如下部分，其包括-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等。键联基团可例如由选自以下的部分的组合组成：烷基；-C(O)NH-；-C(O)O-；-NH-；-S-；-O-；-C(O)-；-S(O)n-，其中n为0、1或2；-O-；5或6元单环；和任选的侧位官能团，例如磺基、羟基和羧基。由键结于反应性基团(Rx)的键联基团形成的部分可指定为-L-Rx。所述反应性基团可与能和其反应的物质反应，由此所述键联基团变得键结于结合物质(Sc)；在这种情形下，所述键联基团典型地含有反应性基团的残基(例如酯的羰基)且可指定为“-LR”。“可裂解的键联基团”为具有一或多个可由于反应或条件的结果而断裂的可裂解基团的键联基团。术语“可裂解的基团”是指允许通过裂解将所释放的部分键联于结合物的其余部分的键而从所述结合物的其余部分释放所述结合物的一部分(例如荧光部分)的部分。所述裂解为化学性质的，或为酶介导的。例示性酶可裂解基团包括以天然氨基酸结束的天然氨基酸或肽序列。 [0321] 除了酶可裂解基团以外，在本发明的范围内还包括一或多个通过除酶以外的试剂的作用而裂解的位点。例示性非酶裂解剂包括(但不限于)酸、碱、光(例如，硝基苯甲基衍生物、苯甲酰甲基、安息香酯)和热。多种可裂解基团为所属领域中已知的。参看例如荣格(Jung)等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)，761：152-162(1983)；乔石(Joshi)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，265：14518-14525(1990)；扎林(Zarling)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，124：913-920(1980)；博威扎(Bouizar)等人，欧洲生物化学杂质(Eur.J.Biochem.)，155：141-147(1986)；帕克(Park)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，261：205-210(1986)；布朗宁(Browning)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，143：1859-1867(1989)。此外，多种可裂解、双官能(同型和异型双官能)间隔臂为市面上有售的。 [0322] 例示性可裂解基团(例如酯)为可由例如氢氧化钠的试剂裂解的可裂解基团，产生含羧酸酯的片段和含羟基的产物。 [0323] 键联基团可用于将所述pH敏感性荧光染料化合物连接于结合物的另一个组分，例如靶向部分(例如抗体、配体、非共价蛋白质结合基团等)、分析物、生物分子、药物等。 [0324] 在某些实施例中，-L-具有式-L1-(L2)p-(L3)r-，其中： [0325] p为0或1；r为0或1；L1为一键、-CONH-、-COO-或包含至少两个氨基酸的部分；L2为-(CH2)-、-CH2CH2O-(CH2CH2O)s-CH2CH2-或具有1到30个碳原子且未取代或经至少一个a a R(例如1、2、3、4、5或6个R)取代的亚烷基；L3为-CONH-(CH2)t-、-COO-(CH2)t-或包含至少两个氨基酸的部分，其中： [0326] r为1到30，例如1到20，如在1到10的情形中，例如1、2、3、4、5或6；s为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如1到7；t为1到30，例如1到20，如在1到10的情形中，例如a - 1、2、3、4、5或6；R为磺基(-SO3H和/或-SO3)、羟基、羧基或氨基，尤其磺基。 [0327] 在某些实施例中，L中的亚烷基部分中所包含的碳原子的总数为不超过40，例如高达35、30、25、20、15或10。在某些实施例中，仅存在L1和L3中的一个，其包含有包含至少两个氨基酸的部分。 [0328] 在某些实施例中，p和r同时为0。在某些实施例中，p为1且r为0。在某些实施例中，p和r同时为1。 [0329] 在某些实施例中，L1为一键、-CONH-或-COO-。在某些化合物中，L1为一键。在某些其它化合物中，L1为-CONH-。 [0330] 在某些实施例中，L2为-(CH2)u-，其中u为1到10，例如1、2、3、4、5或6。在某些实施例中，L2为-CH2CH2O-(CH2CH2O)s-CH2CH2-，其中s为1到7。在某些实施例中，L2为具有1到10个碳原子，例如1、2、3、4、5或6个碳原子且未取代或经1、2、3、4、5或6个磺基(例如1到4个磺基)取代的亚烷基。对于这一段中所提到的所有L2部分，在一类特定化合物中L1为-CONH-。对于这一段中所提到的所有L2部分和这一段中所提到的所有-L1-L2-组合，在一类化合物中r为0。 [0331] 在某些实施例中，(r+t)为1到30，例如1到20，如在1到10的情形中，例如1、2、3、4、5或6。 [0332] 例示性键联基团包括(但不限于)以下：单一共价键(例如在烷基与羧基或羧基的酯或其它反应性基团之间)；氨基羰基(例如将烷基键联于结合的亲脂性部分)；PEG-NH-CO-部分(例如将烷基键联于NHS-酯或其它反应性基团)；烷基氨基羰基(例如将烷基键联于NHS-酯、胺或其它反应性基团)；具有包含磺基的侧基(例如侧位磺基烷基)的烷基氨基羰基(例如将烷基键联于NHS-酯或其它反应性基团或亲脂性基团)；或将烷基键联于反应性基团(例如羧基或其酯)的单一共价键。 [0333] 术语“患者”、“受检者(subject)”或“个体(individual)”是指哺乳动物且包括人类和非人类哺乳动物，例如猴、狗、猫、宠物、马、母牛、猪或大鼠。 [0334] 术语“蛋白质”和“多肽”在本文中以一般含义使用以包括任何长度的氨基酸残基的聚合物。术语“肽”在本文中用于指代具有少于250个氨基酸残基、典型地少于100个氨基酸残基的多肽。所述术语适用于其中一或多个氨基酸残基为对应天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。 [0335] 如本文所用，术语“反应性基团”(或“Rx”)是指能够与另一个化学基团反应形成共价键，即在合适反应条件下可共价反应的基团，且一般表示针对另一物质的连接点。所述反应性基团为本发明化合物上能够与不同化合物上的官能团发生化学反应以形成共价键联的部分，例如羧酸或丁二酰亚胺酯。反应性基团一般包括亲核试剂、亲电子试剂和光可活化基团。 [0336] 例示性反应性基团包括(但不限于)烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸盐、次磺酸、异腈、脒、酰亚胺、酰亚胺酯、硝酮、羟胺、肟、氧肟酸、硫氧肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳化二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物结合物的官能团，例如N-羟基丁二酰亚胺酯、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺等。制备这些官能团中的每一者的方法为所属领域中众所周知的且其针对特定目的的应用或修改在所属领域技术人员的能力内(参看例如桑德勒(Sandler)和卡罗(Karo)编，有机官能团制备(Organic Functional Group Preparations)，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，1989)。 [0337] 术语“盐”是指化合物的可接受的盐，所述盐衍生自所属领域中众所周知的多种有机和无机反离子且包括(仅举例来说)钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵；且当所述分子含有碱性官能团时，包括有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、顺丁烯二酸盐和草酸盐。 [0338] 如本文所用，术语“样品”是指可含有所关注的分析物或细胞的任何材料。典型地，样品为活细胞或包含内源性宿主细胞的生物流体。或者，样品可为需要pH测定的缓冲溶液或环境样品。样品可处于水溶液、活细胞培养物中或固定于固体或半固体表面上(例如聚丙烯酰胺凝胶、膜印迹)或微阵列上。 [0339] 如本文所用，术语“固体支撑物”是指实质上不溶于液相中且能够结合所关注的分子或粒子的基质或介质。适合本文中使用的固体支撑物包括半固体支撑物且不限于特定类型的支撑物。适用的固体支撑物包括固体和半固体基质，例如气凝胶和水凝胶、树脂、珠粒、生物芯片(包括薄膜涂布的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也称为微量滴定板或微孔板)、膜、导电和非导电金属、玻璃(包括显微镜载片)和磁性支撑物。适用的固体支撑物的更特定实例包括硅胶、聚合物膜、粒子、衍生化塑料膜、玻璃珠粒、棉花、塑料珠粒、氧化铝凝胶、多糖(例如 )、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、硝化纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇))、尼龙、乳胶珠粒、磁性珠粒、顺磁珠粒、超顺磁珠粒、淀粉等。 [0340] 术语“立体异构体”是指区别在于一或多个立构中心的手性的化合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体。 [0341] 术语“互变异构体”是指区别在于质子位置的化合物的交替形式，例如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体，或含有连接于环-NH-部分和环＝N-部分的环原子的杂芳基的互变异构体形式，例如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。 [0342] 术语患者的疾病的“治疗”是指1)预防易感染或尚未呈现所述疾病的症状的患者中出现所述疾病；2)抑制所述疾病或遏制其发展；或3)改善所述疾病或引起所述疾病消退。 [0343] 染料化合物和组合物： [0344] 一般来说，为了便于理解本发明，将首先详细描述所述pH敏感性荧光染料化合物和对应取代基，接着描述其中本发明揭示的pH敏感性荧光染料化合物适用的各种方法，随后为尤其有利的与本文所提供的方法一起使用的某些新颖染料化合物的例示性使用和合成方法。 [0345] 本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物适用于监测或检测样品pH。例如，已经发现通过将给电子基团(EDG)引入荧光pH敏感性染料化合物的4-氨基-2-羟基苯基环中，我们能够调整所述pH敏感性荧光染料化合物的荧光特性(参看结构式I和II)。具体说来，我们能够调整pKa值且获得具有可与活细胞细胞内应用一致的pKa值的pH敏感性化合物。1 我们还发现，用烷氧基或硫烷基部分置换位置R处的羟基不仅会增加所述染料化合物在水性环境中的稳定性，而且还产生具有pH敏感性的化合物，就史密斯等人(上文)的教示来 3 看这是一个意外的优点。有利的是，将二烷基氨基添加到苯胺部分中的位置R处会产生意外优点，即产生在生理学范围内的pKa值。在某些实施例中，二烷基氨基为二乙基氨基。在某些实施例中，二烷基氨基为二甲基氨基。 [0346] 在某些实施例中，pKa值为约6到约7。不希望受理论束缚，结构式I和II的化合物的苯胺部分的氨基的pKa似乎取决于所述芳香族系统共享氧原子上的孤对电子的能力。这种能力受引入到所述芳香族系统中的额外官能团影响且因此，通过将EDG基团添加到包含富电子苯胺部分的pH敏感性染料中来调整pKa。 [0347] 在某些实施例中，待分析的样品包括活细胞或生物流体(包括包含内源性宿主细胞蛋白质的细胞溶质)、缓冲溶液和环境样品。因此，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物适用于监测或测定pH改变和与pH改变直接和间接有关的那些事件。监测pH还可在活细胞中实现，其中本发明的pH敏感性荧光染料化合物由活细胞通过多种不同机制，包括被动和细胞介导的机制来内化。例如，本发明的pH敏感性荧光染料化合物可包含允许跨过活细胞膜进入的亲脂性基团，例如乙酰氧基甲氧基(AM)或乙酸酯。一旦进入细胞内部，非特异性酯酶即裂解AM或乙酸酯，产生充分保留于细胞内的带电分子。或者，本发明的pH敏感性荧光染料化合物可结合于允许所述染料化合物被活细胞吸收的载体分子。实例包括吞噬作用期间的内化，其中所述pH敏感性荧光染料化合物结合于诱导吞噬细胞或单核细胞的吞噬作用的细菌粒子或其它蛋白质(或肽)；或当本发明的pH敏感性荧光染料化合物结合于结合受体且因此诱导内化的载体分子时，通过受体内化实现的摄取。 [0348] 本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物充当报告分子以由于pH改变而直接地或间接地向样品赋予可检测信号。这使得可测量且监测样品中的pH改变以直接地和间接地检测与pH改变有关的特定事件。 [0349] 在可检测反应为荧光反应时，其典型地为荧光改变，例如荧光的强度、激发或发射波长、分布、荧光寿命、荧光偏振或其组合的改变。在某些实施例中，在质子化后的可检测光学反应为荧光强度的改变，其相对于其中苯胺部分未在氮上质子化的相同染料化合物大于约150％。优选地，荧光强度的改变大于5倍，且更优选地大于10倍。 [0350] 本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物可包含所属领域技术人员已知的荧光团，其可为任何若丹明或对甲氨基酚荧光团，其在UV/VIS光谱的红色部分中发荧光。优选地，所述荧光团在苯胺部分上的氮经质子化以前是淬灭的或实质上无荧光的。 [0351] 在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物独立地经选自由以下组成的群组的取代基取代：氢、卤素、氨基、经取代的氨基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、磺基、反应性基团、固体支撑物和载体分子。在另一个实施例中，本文所揭示的若丹明和对甲氨基酚荧光团包含在氧杂蒽的中心环的碳原子上经典型地发现于基于氧杂蒽的染料中的取代基取代的部分和未经取代的部分(例如苯基和经取代的苯基部分)。最优选的染料为若丹明、对甲氨基酚和其衍生物。连接于苯胺部分的荧光团的选择将决定pH敏感性化合物的吸收和荧光发射特性以及其活细胞特性，即在细胞内定域的能力。 [0352] 在某些实施例中，所述荧光团(例如若丹明或对甲氨基酚)经由键联基团连接于苯胺部分。在某些实施例中，所述荧光团(和反应性基团、载体分子和固体支撑物)包含用于将取代基共价连接于本文所揭示的苯胺部分的键联基团。所述荧光团(和固体支撑物、载体分子或反应性基团)可直接地连接于所述部分(其中键联基团为单键)或通过一系列稳定键连接。优选地，所述荧光团直接地由单一共价键连接于苯胺部分，但也可经由如下文关于反应性基团、载体分子和固体支撑物所述的键联基团连接。当键联基团为一系列稳定共价键时，所述键联基团典型地结合1-30个选自由C、N、O、S和P组成的群组的非氢原子。当键联基团并非单一共价键时，所述键联基团可为稳定化学键(任选地包括单键、双键、三键或芳香族碳-碳键，以及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、硫-硫键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键和氮-铂键)的任何组合。典型地，所述键联基团结合少于15个非氢原子且由醚、硫醚、硫脲、胺、酯、羧酰胺、磺酰胺、酰肼键和芳香族或杂芳香族键的任何组合构成。典型地，所述键联基团为单一碳-碳键和羧酰胺、磺酰胺或硫醚键的组合。所述键联基团的键典型地产生可发现于所述键联基团中的以下部分：醚、硫醚、羧酰胺、硫脲、磺酰胺、脲、氨基甲酸酯、肼、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和胺部分。键联基团的实例包括(但不限于)经取代或未经取代的聚亚甲基、亚芳基、烷基亚芳基、亚芳基烷基或芳硫基。 [0353] 在某些实施例中，键联基团含有1-6个碳原子。在某些实施例中，键联基团包含硫醚键联。例示性键联成员包括如下部分，其包括(但不限于)-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等。在某些实施例中，键联基团是或结合式-(CH2)d(CONH(CH2)e)z-，或其中d为0到5的整数，e为1到5的整数且z为0或1。在某些实施例中，键联基团是或结合式-O(CH2)-。在某些实施例中，键联基团是或结合亚苯基或2-羧基取代的亚苯基。 [0354] 键联基团的任何组合均可用于将载体分子、固体支撑物或反应性基团与本发明的pH敏感性荧光染料化合物连接在一起。键联基团也可经取代以改变荧光团或苯胺部分的物理特性，例如所述pH敏感性荧光染料化合物的光谱特性。 [0355] 键联基团的另一个重要特征是在载体分子、反应性基团或固体支撑物与苯胺部分或荧光团之间提供适当间隔以防止位阻。因此，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的键联基团对于以下是重要的：(1)将载体分子、反应性基团或固体支撑物连接于所述染料化合物和将荧光团连接于苯胺部分；(2)在载体分子、反应性基团或固体支撑物与所述染料化合物之间提供适当间隔以便不会对所述化合物的作用产生位阻；和(3)改变本文所揭示的染料化合物的物理特性。 [0356] 本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的pH感测或富电子苯胺部分是在质子化时使得所述化合物具有荧光的任何部分，不过在所述苯胺部分不处于质子化状态时，所述染料化合物淬灭。所述pH敏感性荧光染料化合物通常具有在约2到约10范围内的pKa值。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约3到约10。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约5到约8。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6到约8。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6到约7。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6.5。优选地，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6到约7。 [0357] 为了将pKa调整到约6到约7，将给电子基团(EDG)引入到芳基上的苯胺部分中。与当-OH或-SH不存在时在所述芳基上存在烷氧基或其它类似取代基相组合，这意外地产生在水性环境中稳定且提供在所需范围内的pKa的pH敏感性荧光染料化合物。如本文中各式所揭示且参考本文中各式，苯胺部分的氨基可由较高pKa的另一个碱性部分取代或置换。有利的是，将二烷基氨基(其中各烷基可为相同或不同的，独立地为烷基或经取代的烷 3 基)添加到苯胺基团的位置R处会产生意外优点，即产生在生理学范围内的pKa值。在某些实施例中，二烷基氨基为二甲基氨基。在某些实施例中，二烷基氨基为二乙基氨基。 [0358] 在某些实施例中，不希望受理论束缚，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物作为pH指示剂发挥功能在以下方案2中加以说明： [0359] 方案2 [0360] [0361] 其中X为荧光团且R4和R5如本文中先前所述。 [0362] EDG典型地位于R3处，但可位于芳基上的任何位置处。本发明的给电子基团包括例如烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、二烷基氨基、卤素、烷硫基、酰基氨基和(羧基酯)氧基。优选的EDG为-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、磺基四氟苯酚(STP)酯、磺基二氯苯酚(SDP)酯、丁二酰亚胺(SE)酯和四氟苯酚(TFP)酯。在某些实施例中，Z为O-烷基。在某些实施例中，Z为硫烷基。 [0363] 在某些实施例中，提供新颖染料化合物用作荧光pH传感器，所述染料化合物具有结构式(I)： [0364] [0365] 其中 [0366] R1为烷氧基或硫烷基； [0367] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、卤素、-ORa、-SRa、-NRaRb或给电子基团； [0368] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基； [0369] R4是选自由烷基和经取代的烷基组成的群组； [0370] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质； [0371] Ra为H、烷基或经取代的烷基； [0372] Rb为烷基或经取代的烷基；且 [0373] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0374] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0375] R1为烷氧基或硫烷基； [0376] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H或卤素； [0377] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0378] R4为烷基； [0379] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0380] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0381] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0382] R1为烷氧基或硫烷基； [0383] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、Cl或F； [0384] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0385] R4为烷基； [0386] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0387] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0388] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0389] R1为烷氧基或硫烷基； [0390] R2和R6各自为H； [0391] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0392] R4为烷基； [0393] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0394] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0395] 在某些实施例中，R1-R10如下： [0396] R1为甲氧基； [0397] R2和R6各自为H； [0398] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为甲基或乙基； [0399] R4为甲基或乙基； [0400] R5为甲基；乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)c cnC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡d d 聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc；且 [0401] R7、R8、R9和R10可相同或不同，各自独立地为甲基或丙烯基。 [0402] 在某些实施例中，提供新颖染料化合物用作荧光pH传感器，所述染料化合物具有结构式(II)： [0403] [0404] 其中 [0405] R1为烷氧基或硫烷基； [0406] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、卤素、-ORa、-SRa、-NRaRb或给电子基团； [0407] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基或经取代的烷基； [0408] R4是选自由烷基和经取代的烷基组成的群组； [0409] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc，其中L为键联基团，Rx为反应性基团，且Sc为结合的物质； [0410] Ra为H、烷基或经取代的烷基； [0411] Rb为烷基或经取代的烷基；且 [0412] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0413] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0414] R1为烷氧基或硫烷基； [0415] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H或卤素； [0416] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0417] R4为烷基； [0418] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0419] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0420] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0421] R1为烷氧基或硫烷基； [0422] R2和R6可相同或不同，各自独立地为H、Cl或F； [0423] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0424] R4为烷基； [0425] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0426] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0427] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0428] R1为烷氧基或硫烷基； [0429] R2和R6各自为H； [0430] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为烷基； [0431] R4为烷基； [0432] R5是选自由以下组成的群组：烷基；经取代的烷基；烯基；经取代的烯基；酰基；芳基；经取代的芳基；羧基烷基；杂芳基；经取代的杂芳基；杂环基；经取代的杂环基；烷基羧基；烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基杂芳基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)c c nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取d d 代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为反应性基团；-L-Rx；和-L-Sc；且 [0433] R7和R8可相同或不同，各自独立地为烷基或烯基。 [0434] 在某些实施例中，R1-R8如下： [0435] R1为甲氧基； [0436] R2和R6各自为H； [0437] R3为-NR′R″，其中R′和R″可相同或不同，各自独立地为甲基或乙基； [0438] R4为甲基或乙基； [0439] R5为甲基；乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)c cnC(O)NRR；其中n为1到6的整数，且R和R 可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡d d 聚糖、酰胺、蛋白质、亲脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc； [0440] R7和R8可相同或不同，各自独立地为甲基或丙烯基。 [0441] 在某些实施例中，EDG是选自由烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、卤素、烷硫基、酰基氨基和(羧基酯)氧基组成的群组。在某些实施例中，EDG不为羟基或硫醇。在某些实施例中，EDG为二烷基氨基。在某些实施例中，二烷基氨基为二甲基氨基或二乙基氨基。 [0442] 在某些实施例中，R1为-OCH3且R3为-N(CH3)2或-N(CH2CH3)2。 [0443] 在某些实施例中，R4和R5为烷基或经取代的烷基。在某些实施例中，R5为甲基；c 乙基；羧基烷基；(CH2)nCO(O)R；(CH2)nC(O)R；(CH2)nC(O)NHR；(CH2)nC(O)NRR；其中n为1到c 6的整数，且R和R可相同或不同，各自独立地为H、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、经取代的氨基、烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白质、亲d d 脂性基团或R，其中R为(CH2)nC(O)NHRx，其中n为1到6的整数，且Rx为选自羧基、羧基酯、酰胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺酯(SE)、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、四氟苯酚(TFP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺的反应性基团；-L-Rx；或-L-Sc。 [0444] 在前述实施例中任一者的某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约5到约8。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6到约8。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6到约7。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约6.5。在某些实施例中，所述pH敏感性荧光染料化合物的pKa为约3到约10。 [0445] 本文所揭示的化合物的苯胺或苯胺样环的4位氮当然总是具有可允许的化合价。 [0446] 反应性基团： [0447] 在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物具有化学反应性，且由至少一个反应性基团(Rx)取代。所述反应性基团充当与另一个部分(例如载体分子或固体支撑物)的连接位点，其中所述反应性基团与所述载体分子或固体支撑物上的适当反应性基团或官能团化学反应。因此，在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物包含苯胺部分、键联基团、荧光团、反应性基团部分和任选的载体分子和/或固体支撑物。 [0448] 在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物进一步包含作为选自以下的成员的反应性基团：丙烯酰胺、羧酸的活化酯、羧酸酯、酰基叠氮、酰基腈、醛、烷基卤化物、酸酐、苯胺、胺、芳基卤化物、叠氮化物、氮丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤基乙酰胺、卤烷基、卤基三嗪、肼、亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、亚磷酰胺、光可活化基团、反应性铂络合物、硅烷基卤、磺酰卤和硫醇。在某些实施例中，所述反应性基团是选自由羧酸、羧酸的丁二酰亚胺酯、酰肼、胺和顺丁烯二酰亚胺组成的群组。所述反应性基团可连接1 2 3 4 5 6 于报告分子或苯胺部分上的任何适当位点。在某些实施例中，选自R、R、R、R、R和R 的 3 4 5 6 至少一个成员为反应性基团。优选地，R、R、R和R 的至少一者为反应性基团，最优选为 4 5 R或R 中的至少一者。或者，如果本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物包含载体分子或固体支撑物，那么反应性基团可独立地共价连接于那些取代基，从而允许进一步结合于荧光团、载体分子或固体支撑物。 [0449] 这些反应系基团是在本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物和含载体分子和/或固体支撑物的化合物形成期间合成以提供化学反应性pH敏感性荧光染料化合物。以这种方式，结合反应性基团的pH敏感性荧光染料化合物可共价连接于多种含有或经改质成含有具有合适反应性的官能团的载体分子或固体支撑物，从而产生所述组分的化学连接。在某些实施例中，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的反应性基团和所述载体分子或固体支撑物的官能团包含可在其间产生共价键联的亲电子试剂和亲核试剂。在某些实施例中，所述反应性基团包含光可活化基团，其仅在用适当波长的光照射后才变得具化学反应性。典型地，所述反应性基团与所述载体分子或固体支撑物之间的结合反应导致所述反应性基团的一或多个原子结合到将本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物连接于所述载体分子或固体支撑物的新的键联中。表2中展示官能团和键联的所选实例，其中亲电子基团与亲核基团的反应产生共价键联。 [0450] 表2：产生可用的共价键联的一些途径的实例 [0451]亲电子基团亲核基团所得共价键联活化酯* 胺/苯胺羧酰胺丙烯酰胺硫醇硫醚酰基叠氮** 胺/苯胺羧酰胺酰基卤胺/苯胺羧酰胺酰基卤醇/酚酯酰基腈醇/酚酯酰基腈胺/苯胺羧酰胺醛胺/苯胺亚胺醛或酮肼腙醛或酮羟胺肟烷基卤胺/苯胺烷基胺烷基卤羧酸酯烷基卤硫醇硫醚烷基卤醇/酚醚烷基磺酸酯硫醇硫醚烷基磺酸酯羧酸酯烷基磺酸酯醇/酚醚酸酐醇/酚酯酸酐胺/苯胺羧酰胺芳基卤硫醇苯硫酚芳基卤胺芳基胺氮丙啶硫醇硫醚硼酸盐二醇硼酸酯碳化二亚胺羧酸 N-酰基脲或酸酐重氮烷羧酸酯环氧化物硫醇硫醚卤基乙酰胺硫醇硫醚卤基铂酸盐氨基铂络合物卤基铂酸盐杂环铂络合物 [0452]亲电子基团亲核基团所得共价键联卤基铂酸盐硫醇铂络合物卤基三嗪胺/苯胺氨基三嗪卤基三嗪醇/酚三嗪基醚卤基三嗪硫醇三嗪基硫醚亚胺酯胺/苯胺脒异氰酸酯胺/苯胺脲异氰酸酯醇/酚氨基甲酸酯异硫氰酸酯胺/苯胺硫脲顺丁烯二酰亚胺硫醇硫醚亚磷酰胺醇亚磷酸酯硅烷基卤醇硅烷基醚磺酸酯胺/苯胺烷基胺磺酸酯硫醇硫醚磺酸酯羧酸酯磺酸酯醇醚磺酰卤胺/苯胺磺酰胺磺酰卤酚/醇磺酸酯 [0453] 活化酯，如所属领域中所了解，一般具有式-COΩ，其中Ω为合适离去基(例如，丁二酰亚胺基氧基(-OC4H4O2)、磺基丁二酰亚胺基氧基(-OC4H3O2-SO3H)、-1-氧基苯并三唑基(-OC6H4N3)；或芳氧基或经例如硝基、氟、氯、氰基或三氟甲基或其组合的吸电子取代基取代一或多次的芳氧基，用以形成活化的芳基酯；或由碳化二亚胺活化的羧酸以形成羧酐x x y x y或混合羧酐-OCOR或NR NHR，其中R和R 可相同或不同，为C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或C1-C6烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉基乙基)。 [0454] 酰基叠氮也可重排为异氰酸酯。 [0455] 用于将本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物连接于待结合的物质的反应性基团的选择典型地取决于待结合的物质上的反应性基团或官能团和所需的共价键联的类型或长度。典型地存在于有机或无机物质(生物分子或非生物分子)上的官能团的类型包括(但不限于)胺、酰胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、磷酸酯、咪唑、肼、羟胺、经二取代的胺、卤化物、环氧化物、硅烷基卤、羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯键或这些基团的组合。可在所述物质(典型地，对于多糖或硅石)上获得单一类型的反应性位点，或可存在多种位点(例如胺、硫醇、醇、酚)，这对于蛋白质而言是典型的。 [0456] 典型地，反应性基团将与胺、硫醇、醇、醛、酮或与硅石反应。优选地，反应性基团与胺或硫醇官能团或与硅石反应。在某些实施例中，反应性基团为丙烯酰胺、羧酸的活化酯、酰基叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、硅烷基卤、酸酐、苯胺、芳基卤化物、叠氮化物、氮丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤基乙酰胺、卤基三嗪、肼(包括酰肼)、亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、亚磷酰胺、反应性铂络合物、磺酰卤或硫醇基团。如本文所用，“反应性铂络合物”是指化学反应性铂络合物，例如以全文引用的方式结合到本文中的美国专利第5,714,327号中所述。 [0457] 在某些实施例中，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物包含至少一个选择性地与胺基反应的反应性基团。这个胺反应性基团是选自由以下组成的群组：丁二酰亚胺酯(SE)、磺酰卤、四氟苯基(TFP)酯、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺和异硫氰酸酯。因此，在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物与样品中的含胺分子形成共价键。在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物包含至少一个选择性地与硫醇基团反应的反应性基团。这个硫醇反应性基团是选自由顺丁烯二酰亚胺、卤烷基和卤基乙酰胺组成的群组(包括美国专利第5,362,628号、第5,352,803号和第5,573,904号中揭示的任何反应性基团，这些专利均以全文引用的方式结合到本文中)。 [0458] 在反应性基团为羧酸的活化酯(例如羧酸的丁二酰亚胺酯)、磺酰卤、四氟苯基(TFP)酯、磺基二氯苯酚(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、乙酰氧基甲氧基(AM)酯、氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、DIBO-胺或异硫氰酸酯时，所得的pH敏感性荧光染料化合物尤其适用于制备载体分子的结合物，例如蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或半抗原。在反应性基团为顺丁烯二酰亚胺、卤烷基或卤基乙酰胺(包括美国专利第5,362,628号、第5,352,803号和第5,573,904号中揭示的任何反应性基团，这些专利均以全文引用的方式结合到本文中)时，所得的化合物尤其适用于结合于含硫醇物质。在反应性基团为酰肼时，所得的化合物尤其适用于结合于高碘酸盐氧化的碳水化合物和糖蛋白，且另外为用于细胞微量注射的醛可固定极性示踪剂。在反应性基团为硅烷基卤时，所得的化合物尤其适用于结合于硅石表面，尤其在所述硅石表面结合到随后用于远程离子检测或定量的纤维光探针中的情况下。 [0459] 在某些实施例中，反应性基团为光可活化基团，使得所述基团仅在用适当波长照射后才转化为反应性物质。适当波长一般为小于400nm的UV波长。这种方法提供仅对溶液中或固定于固体或半固体基质上的目标分子的特定连接。光可活化反应性基团包括(但不限于)二苯甲酮、芳基叠氮和双吖丙啶。 [0460] 优选地，反应性基团为光可活化基团、羧酸的丁二酰亚胺酯、卤基乙酰胺、卤烷基、肼、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、脂肪族胺、硅烷基卤、尸胺或补骨脂素。更优选地，反应性基团为羧酸的丁二酰亚胺酯、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或硅烷基卤。在某些实施例中，反应性基团为羧酸的丁二酰亚胺酯、磺酰卤、四氟苯基酯、异硫氰酸酯或顺丁烯二酰亚胺。在某些实施例中，反应性基团是选自磺基二氯苯基(SDP)酯、磺基四氟苯酚(STP)酯、丁二酰亚胺(SE)酯和四氟苯酚(TFP)酯。 [0461] 载体分子： [0462] 在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物共价结合于载体分子。如果所述pH敏感性荧光染料化合物具有反应性基团，那么所述载体分子可替代地通过所述反应性基团键联于所述pH敏感性荧光染料化合物。所述反应性基团可含有反应性官能部分和键联基团，或仅含有反应性官能部分。 [0463] 多种载体分子可用于本文中。例示性载体分子包括抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核酸聚合物、碳水化合物、脂质、1 2 3 4 5 6 聚合物和细菌粒子。在某些实施例中，选自R、R、R、R、R和R 的至少一个成员为载体分 3 4 5 6 4 5 子。优选地，R、R、R和R 的至少一者为载体分子，最优选为R 或R 中的至少一者。 [0464] 在某些实施例中，载体分子包含氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装、合成聚合物、聚合物微粒、生物分子、病毒和其组合。在某些实施例中，载体分子是选自半抗原、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、蛋白质、肽或多糖。在某些实施例中，载体分子为氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装、酪胺、合成聚合物、聚合物微粒、生物分子、细胞组分、离子螯合部分、酶底物或病毒。在某些实施例中，载体分子为抗体或其片段、抗原、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、生物素、葡聚糖、IgG结合蛋白、荧光蛋白、琼脂糖和非生物微粒。在某些实施例中，载体分子可包含标记或荧光染料或淬灭剂。 [0465] 在某些实施例中，载体分子为氨基酸(包括经磷酸酯、碳水化合物或C1-C22羧酸保护或取代的那些氨基酸)或氨基酸聚合物(例如肽或蛋白质)。在某些实施例中，载体分子含有至少5个氨基酸，更优选地5-36个氨基酸。例示性肽包括(但不限于)神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物和蛋白激酶底物。其它例示性肽可充当细胞器定域肽，即用于靶向结合的化合物以使其通过细胞运输机制在特定细胞子结构内定域的肽。优选的蛋白质载体分子包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、蛋白A、蛋白G、藻胆蛋白和其它荧光蛋白、激素、毒素和生长因子。典型地，蛋白质载体分子为抗体、抗体片段、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、毒素、凝集素、生长因子、细菌粒子或细胞受体的结合搭配物。 [0466] 在某些实施例中，载体分子包含核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，任选地含有用于连接荧光团或其它配体的额外键联基团或间隔基，例如炔基键联(美国专利第5,047,519号)、氨基烯丙基键联(美国专利第4,711,955号)或其它键联。在某些实施例中，核苷酸载体分子为核苷酸或脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸。 [0467] 例示性核酸聚合物载体分子为单股或多股、天然或合成DNA或RNA寡核苷酸或DNA/RNA杂合物，或结合特殊键联基团，例如吗啉衍生的磷酸酯(抗病毒有限公司(Anti Virals，Inc.)，俄勒冈州科瓦利斯市(Corvallis OR))，或肽核酸(例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元)，其中所述核酸含有少于50个核苷酸，更典型地少于25个核苷酸。 [0468] 在某些实施例中，载体分子包含碳水化合物或多元醇，其典型地为多糖，例如葡聚糖、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、淀粉、琼脂糖和纤维素，或为聚合物，例如聚(乙二醇)。在某些实施例中，多糖载体分子包括葡聚糖、琼脂糖或 [0469] 在某些实施例中，载体分子包含脂质(典型地具有6-25个碳)，包括糖脂、磷脂和鞘脂。在某些实施例中，载体分子包含脂质囊泡，例如脂质体，或为脂蛋白。所述亲脂性取代基适用于促进将结合的染料运输到细胞或细胞器中。 [0470] 在某些实施例中，载体分子为细胞、细胞系统、细胞片段，或亚细胞粒子，包括病毒粒子、细菌粒子、病毒组分、生物细胞(例如动物细胞、植物细胞、细菌或酵母)或细胞组分。适用作载体分子的细胞组分的实例包括溶酶体、核内体、细胞质、细胞核、组蛋白、线粒体、高尔基体、内质网和液泡。 [0471] 在某些实施例中，载体分子与有机或无机材料非共价缔合。具有亲脂性取代基的载体分子的例示性实施例可用于通过所述pH敏感性荧光染料化合物非共价结合到膜内而靶向脂质组装(例如生物膜或脂质体)，例如用作膜结构的探针或用于结合到脂质体、脂蛋白、薄膜、塑料、亲脂性微球或类似材料中。 [0472] 在某些实施例中，载体分子包含特异性结合对成员，其中本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物结合于特异性结合对成员且用于形成所述结合对。或者，经标记的特异性结合对成员的存在指示这个特异性结合对的互补成员的位置；各特异性结合对成员在表面上或在空腔中具有特异性结合于另一者的特定空间和极性组织且与所述组织互补的区域。在这种情况下，本文所揭示的染料化合物充当所述特异性结合对的报告分子。例示性结合对陈述于表3中。 [0473] 表3：代表性特异性结合对 [0474] [0475] IgG为免疫球蛋白 [0476] cDNA和cRNA为用于杂交的互补股。 [0477] 固体支撑物： [0478] 在某些实施例中，本文所揭示的pH敏感性染料化合物共价键结于固体支撑物。所述固体支撑物可通过苯胺部分、荧光团或通过反应性基团(如果存在的话)或通过载体分子(如果存在的话)连接于所述染料化合物。即使反应性基团和/或载体分子存在，所述1 2 3 4 5 6 固体支撑物也可通过苯胺部分或荧光团连接。在某些实施例中，选自R、R、R、R、R和R 3 4 5 6 的至少一个成员为固体支撑物。优选地，R、R、R和R 中的至少一者为固体支撑物，最优 4 5 选为R或R 中的至少一者。 [0479] 适合本文中使用的固体支撑物典型地实质上不溶于液相中。本文中使用的固体支撑物不限于特定类型的支撑物。而事实上，大量支撑物为可用的且为所属领域技术人员已知。因此，适用的固体支撑物包括固体和半固体基质，例如气凝胶和水凝胶、树脂、珠粒、生物芯片(包括薄膜涂布的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也称为微量滴定板或微孔板)、膜、导电和非导电金属、玻璃(包括显微镜载片)和磁性支撑物。适用的固体支撑物的更特定实例包括硅胶、聚合物膜、粒子、衍生化塑料膜、玻璃珠粒、棉花、塑料珠粒、氧化铝凝胶、多糖(例如 )、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、硝化纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇))、尼龙、乳胶珠粒、磁性珠粒、顺磁珠粒、超顺磁珠粒、淀粉等。 [0480] 在某些实施例中，固体支撑物可包括固体支撑物反应性官能团，包括(但不限于)羟基、羧基、氨基、硫醇、醛、卤素、硝基、氰基、酰胺基、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、异氰酸酯、砜、磺酸酯、磺酰胺、亚砜等，用于连接本文所揭示的染料化合物。可用的反应性基团揭示于上文中且同样适用于本文中的固体支撑物反应性官能团。 [0481] 合适的固相支撑物可基于所需最终用途和针对各种合成方案的适用性来选择。例如，在需要酰胺键形成以将本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物连接于固体支撑物时，可采用一般适用于肽合成的树脂，例如聚苯乙烯(例如，获自巴亨有限公司(Bachem TM Inc.)、半岛实验室(Peninsula Laboratories)等的PAM-树脂)、POLYHIPE 树脂(获自艾珉泰克公司(Aminotech)，加拿大(Canada))、聚酰胺树脂(获自半岛实验室)、接枝有聚乙TM 二醇的聚苯乙烯树脂(TentaGel ，来普普利莫公司(Rapp Polymere)，图宾根(Tubingen)，德国(Germany))、聚二甲基-丙烯酰胺树脂(可获自密立根/生物搜索公司(Milligen/Biosearch)，加利福尼亚(California))或PEGA珠粒(获自聚合物实验室(Polymer Laboratories))。 [0482] 制备结合物： [0483] 在某些实施例中，提供本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的结合物。各组分(载体分子或固体支撑物)的结合物，例如药物、肽、毒素、核苷酸、磷脂、蛋白质和其它有机分子是通过有机合成方法使用本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物来制备，一般通过所属领域中充分认可的方式来制备(豪格兰(Haugland)，分子探针手册(MOLECULAR PROBES HANDBOOK)，上文，(2002))。优选地，结合形成共价键是由将本文所揭示的反应性荧光染料化合物混入合适溶剂中组成，所述pH敏感性荧光染料化合物和待结合的物质均可溶于所述溶剂中。所述反应优选地在室温或低于室温下自发进行，而无需添加试剂。对于那些光活化的反应性化合物，通过照射反应混合物以活化所述反应性化合物来促进结合。优选地在质子惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺、二甲亚砜、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或氯仿)中对水不溶性物质进行化学改质，使得可制备所需的化合物-结合物。水溶性材料的类似改质容易地通过使用本发明反应性化合物来实现以使其更容易地溶于有机溶剂中。 [0484] 肽或蛋白质结合物的制备典型地包含首先在室温或低于室温下将待结合的蛋白质以约1-10mg/mL溶解于水性缓冲液中。碳酸氢盐缓冲液(约pH 8.3)尤其适合与丁二酰亚胺酯反应，磷酸盐缓冲液(约pH7.2-8)尤其适合与硫醇反应性官能团反应且碳酸盐或硼酸盐缓冲液(约pH 9)尤其适合与异硫氰酸酯和二氯三嗪反应。适当反应性化合物接着以足以在添加到待结合的蛋白质的溶液中时产生合适的结合程度的量溶解于非羟基溶剂(通常为DMSO或DMF)中。用于任何蛋白质或其它组分的化合物的适当量宜通过实验预先确定，其中将可变量的化合物添加到所述蛋白质中，用色谱法纯化所述结合物以分离未结合的化合物且化合物-蛋白质结合物在其所需的应用中加以测试。 [0485] 在将所述pH敏感性荧光染料化合物添加到组分溶液中之后，将所述混合物培育合适的一段时间(典型地在室温下约1小时到在冰上数小时)，通过凝胶过滤、透析、HPLC、吸附于离子交换或疏水性聚合物上或其它合适方式来去除过量pH敏感性荧光染料化合物。pH敏感性荧光染料化合物-结合物可用于溶液中或冻干。以这种方式，合适结合物可由抗体、抗体片段、抗生物素蛋白、凝集素、酶、蛋白A和G、细胞蛋白、白蛋白、组蛋白、生长因子、激素和其它蛋白质制备。 [0486] 聚合物的结合物(包括生物聚合物和其它较高分子量聚合物)典型地通过所属领域中充分认可的方式来制备(例如布林克利(Brinkley)等人，生物结合物化学(Bioconjugate Chem.)，3：2(1992))。在这些实施例中，单一类型的反应性位点可用(这对于多糖而言为典型的)，或多种类型的反应性位点(例如，胺、硫醇、醇、酚)可用(这对于蛋白质而言为典型的)。标记的选择性最佳通过选择适当反应性染料化合物来获得。例如，用硫醇反应性试剂(例如卤基乙酰胺或顺丁烯二酰亚胺)对硫醇改质，或用胺反应性试剂(例如活化酯、酰基叠氮、异硫氰酸酯或3，5-二氯-2，4，6-三嗪)对胺改质。部分选择性也可通过小心控制反应条件来获得。 [0487] 当用本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物对聚合物改质时，相对于预期程度的pH敏感性荧光染料化合物取代，典型地使用过量的pH敏感性荧光染料化合物。典型地通过透析、色谱法或沉淀来去除任何残留、未反应的pH敏感性荧光染料化合物或pH敏感性荧光染料化合物水解产物。残留、未结合染料的存在可通过薄层色谱法使用将染料从其结合物洗脱的溶剂来检测。在所有情形下，通常优选的是所述试剂尽可能保持浓缩以便获得适当结合速率。 [0488] 在某些实施例中，本文所揭示的结合物与通过非共价相互作用结合于荧光团或结合的物质(载体分子或固体支撑物)的额外物质缔合。在另一个例示性实施例中，所述额外物质为抗体、酶、半抗原、凝集素、受体、寡核苷酸、核酸、脂质体或聚合物。任选地使用所述额外物质来探查染料-结合物的位置，例如作为增强染料-结合物的信号的手段。 [0489] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的组合物，所述组合物包含： [0490] a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物；和 [0491] b)载体， [0492] 其中所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物以有效检测样品pH的量存在。 [0493] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的组合物，所述组合物包含： [0494] (a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物；和 [0495] (b)分析物， [0496] 其中所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物以有效检测样品pH的量存在。 [0497] 在某些实施例中，分析物为细胞且pH敏感性荧光染料化合物位于所述细胞内部。在某些实施例中，分析物为蛋白质、脂质或核酸。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于载体分子。 [0498] 方法： [0499] 在某些实施例中，本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物、染料-结合物和组合物可用于如下方法，包括(但不限于)测定活细胞或细胞区室的pH、测定由细胞引起的局部环境的pH改变的方法，且直接地且间接地检测与pH改变有关的特定细胞事件。在某些实施例中，所述方法涉及检测细胞培养物中或琼脂板上的污染。为简洁起见，样品也可包括除活细胞和细胞区室以外的材料，例如(但不限于)细胞培养基、生物流体、诊断材料和细菌介质(例如琼脂板)。如本文所用，术语“细胞区室”是指悬浮于细胞质中的多种细胞器之一。细胞或细胞区室的pH可通过将一或多种本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物或组合物引入到细胞或细胞区室中，用合适光源照射染料或染料结合物，且观测染料或结合物的荧光强度来测量。所观测的荧光强度可接着用于通过所属领域中已知的根据染料或染料结合物的积聚方法所选择的多种方法来测定pH。例如，所观测的荧光可与已知标准(例如荧光强度对pH的校准曲线)或与指示所存在的全部pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物或组合物的荧光强度测量值相比。任何常规荧光测定设备均可用于照射样品和测量所产生的荧光反应。 [0500] 如上文所述，样品可包含活细胞、细胞内流体、细胞外流体、生物流体、血清、生物发酵培养基、环境样品、工业样品、蛋白质、肽、缓冲溶液、生物流体或化学反应器、血细胞、免疫细胞、培养的细胞、肌肉组织、神经元、细胞外囊泡、维管组织、血液流体、唾液、尿、水、土壤、废水、海水、医药品、食物或饮料。在某些实施例中，样品固定于聚合物膜上、聚合物凝胶内、微粒上、微阵列上、硅芯片上、玻璃载片上、微孔板上和微流体芯片上。 [0501] 本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物因此可用作与包含或怀疑包含生物实体或生物物质的样品有关的pH传感器。本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物可用于涉及生物实体或生物物质的分析中。在某些实施例中，本发明教示提供所述pH敏感性荧光染料化合物用于生物分析中以达成本文所述的目的，尤其用作pH传感器的用途。 [0502] 因此，在某些实施例中，本文所揭示的方法包含测定样品pH，其中所述方法包含： [0503] (a)使样品与一或多种本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物接触以形成接触的样品； [0504] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0505] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0506] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0507] 其中所述荧光发射用于测定样品pH。 [0508] 在某些实施例中，本文所揭示的方法包含测定样品pH，其中所述方法包含： [0509] (a)使样品与一或多种本文所提供的组合物接触以形成接触的样品； [0510] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0511] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0512] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0513] 其中所述荧光发射用于测定样品pH。 [0514] 在某些实施例中，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物用于细胞培养物中以检测污染。在某些实施例中，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物用于琼脂板中或琼脂板上以检测污染。 [0515] 在某些实施例中，细胞内部的pH改变对应于细胞过程。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于蛋白质、核酸或脂质。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于转铁蛋白。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物通过丁二酰亚胺酯结合于载体分子。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于上皮生长因子(EGF)或EGF受体(EGFR)。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物在进入细胞之前为无荧光的。更特定地，pH敏感性荧光染料化合物在进入细胞之后变得有荧光。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物通过吞噬作用进入细胞。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物通过受体介导的内吞作用进入细胞。 [0516] 在某些实施例中，提供用于监测活细胞内部的pH的方法，所述方法包含： [0517] (a)使细胞与一或多种本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物接触以形成接触的细胞； [0518] (b)使接触的细胞培育足以使所述一或多种pH敏感性荧光染料化合物进入所述细胞的时间长度以形成标记的细胞； [0519] (c)用适当波长照射标记的细胞以形成照射的细胞；和 [0520] (d)检测来自照射的细胞的荧光发射； [0521] 其中所述荧光发射用于监测所述细胞内部的pH。 [0522] 在某些实施例中，提供用于监测活细胞内部的pH的方法，所述方法包含： [0523] (a)使细胞与一或多种本文所提供的组合物接触以形成接触的细胞； [0524] (b)使接触的细胞培育足以使所述一或多种组合物进入所述细胞的时间长度以形成标记的细胞； [0525] (c)用适当波长照射标记的细胞以形成照射的细胞；和 [0526] (d)检测来自照射的细胞的荧光发射； [0527] 其中所述荧光发射用于监测所述细胞内部的pH。 [0528] 典型地，本文所揭示的pH敏感性荧光染料和/或染料结合物和/或组合物通过与包含细胞或细胞区室的样品混合，接着使所述混合物培育足以允许所述pH敏感性荧光染料、染料结合物或组合物进入所述细胞或细胞区室的时程而引入到活细胞或细胞区室中。在这一时程期间，所述pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物或组合物被动地跨质膜扩散，或通过细胞介导的机制由所述细胞或细胞区室吸收。 [0529] 在结合物的情况下，典型地目标分子(包括诱导吞噬作用的细菌粒子和结合细胞受体且诱导受体内化的特异性结合模式)一般为细胞或细胞区室特异性的，因此特异性结合物一般仅连接于一种细胞或细胞区室。一旦连接于细胞或细胞区室，所述pH敏感性荧光染料结合物可扩散通过这个细胞或细胞区室的膜，或通过受体介导的内吞作用被运输到特异性细胞区室，因此使自身暴露于所述细胞或细胞区室的内部pH。 [0530] 有利的是，本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物和组合物允许相比于现有pH传感器染料更精确地测定pH，因为本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物和组合物的pKa可有意地通过取代而调节为多种pKa值。此举通过在苯胺部分上1 6 添加EDG基团且通过用非-OH或-SH的基团在其余R-R之一处进行取代而实现。因此，一些被调整到所关注的细胞或细胞区室的pH，且因而当通过受体介导的内吞作用或任何非被动积聚机制以及通过被动积聚而积聚时将理想地用于测量细胞或细胞区室的pH。其它将具有与细胞培养基或细胞外基质的pH相差甚远的pKa。本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物经调整以匹配所选择的样品，应了解当所述样品的pH降到低于本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的pKa时，所述化合物变得有荧光。在某些实施例中，所述pH敏感性荧 3 光染料化合物的pKa可通过在位置R处添加二烷基氨基而经调节，有利地产生生理学pKa。在某些实施例中，二烷基氨基为二乙基氨基。在某些实施例中，二烷基氨基为二甲基氨基。 [0531] 当所述pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物和组合物关于pH的一种形式(未带电形式)自由地穿透所关注的细胞或细胞区室且另一种形式(带电形式)不能穿透时，将被动地发生积聚。荧光性将接近其平衡位置，限制条件是积聚的染料的形式为荧光形式且已发生积聚到平衡。所观测的荧光强度可接着用于根据任何已知方法，例如通过参考校准数据，或通过将所观测的荧光强度与在酸化测试样品使得所有染料或结合物均发荧光时所观测的荧光强度相比来测定pH，两种荧光强度的比率外加已知pKa允许测定pH。被动积聚可通过使用未连接于载体分子或固体支撑物的pH敏感性荧光染料化合物或连接于能够扩散通过细胞膜的小型相对疏水性目标分子(例如一或多个乙酰氧基甲氧基(AM)酯基)的pH敏感性荧光染料化合物来实现。然而，已经发现包含反应性基团(例如丁二酰亚胺酯)的pH敏感性荧光染料化合物看起来也被动地在细胞中积聚。 [0532] 在某些实施例中，提供用于鉴别细胞群体内的目标细胞的方法，其中所述目标细胞相对于所述群体内的相邻细胞经差异性标记，所述方法包含： [0533] (a)使一或多种本文所揭示的pH敏感性染料化合物与细胞群体接触以形成接触的细胞群体； [0534] (b)使接触的细胞群体培育足以使所述一或多种pH敏感性染料化合物进入所述靶细胞的一段时间，由此形成培育的细胞群体；和 [0535] (c)照射培育的细胞群体，其中所述目标细胞通过相对于所述群体内的相邻细胞的差异标记来鉴别。 [0536] 在某些实施例中，提供用于鉴别细胞群体内的目标细胞的方法，其中所述目标细胞相对于所述群体内的相邻细胞经差异性标记，所述方法包含： [0537] (a)使一或多种本文所揭示的组合物与细胞群体接触以形成接触的细胞群体； [0538] (b)使接触的细胞群体培育足以使所述一或多种组合物进入所述目标细胞的一段时间，由此形成培育的细胞群体；和 [0539] (c)照射培育的细胞群体，其中所述目标细胞通过相对于所述群体内的相邻细胞的差异标记来鉴别。 [0540] 在某些实施例中，目标细胞为神经元细胞。在某些实施例中，神经元细胞是通过如与相邻细胞相比增加的荧光来鉴别。在某些实施例中，细胞群体是组织的一部分。更特定地，所述组织是选自由肿瘤组织、表皮组织、肌肉组织、骨髓组织、神经组织、脑组织、器官组织和人类活检组织组成的群组。 [0541] 在某些实施例中，提供用于鉴别神经组织切片中的第一神经元或多个神经元的方法，或神经元细胞是包含神经元和非神经元细胞类型的非均匀混合物。还提供用于检测神经调节物质对神经元之间或形成回路的多个神经元之间的连接的影响；用于鉴别神经元之间或神经元上的抑制连接的方法；和用于活体内或活体外鉴别神经元的方法。 [0542] 在某些实施例中，在活细胞的混合培养物或细胞制剂(例如组织切片或整体封装标本)中鉴别健康神经元。活体内鉴别神经元或其它代谢活性细胞(例如心脏和骨骼肌细胞)是采用本文所揭示的pH敏感性染料化合物的尤其优选方法。 [0543] 典型地当本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物包含由细胞受体结合的载体分子或固体支撑物时，可通过细胞介导的机制，例如吞噬作用和内吞作用发生非被动积聚。在这种情况下，只要本文所提供的染料化合物通过不仅仅依赖于被动积聚的机制在细胞或细胞区室内积聚，当所述染料化合物的pKa接近待测量的pH时，pH测量的精确性将最高。在这种情形下，不希望受理论束缚，用本文所揭示的pH敏感性染料化合物获得的精确性增加可能是因为以下事实，即所述pKa是含有50％质子化的物质的水性介质的pH且在这个pH下，质子强度的改变将对所述物质的特性具有最大影响。因此，在所述pH敏感性荧光染料的pKa下发生荧光强度的最大改变，且测量这一pH下的绝对荧光强度使得用于分析特定细胞或细胞区室的pH敏感性荧光染料化合物涵盖这个细胞或细胞区室的pH一般为足够的。 [0544] 在某些实施例中，提供用于检测pH相关的细胞内过程的方法，所述方法包含： [0545] (a)使一或多种本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0546] (b)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0547] (c)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0548] (d)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0549] 其中增加的荧光发射指示所述细胞内过程的活化。 [0550] 在某些实施例中，提供用于检测pH相关的细胞内过程的方法，所述方法包含： [0551] (a)使一或多种本文所提供的组合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0552] (b)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0553] (c)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0554] (d)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0555] 其中增加的荧光发射指示所述细胞内过程的活化。 [0556] 在某些实施例中，细胞内过程是离子通道的打开。更特定地，所述离子通道是钙。 [0557] 在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物在用细胞的细胞溶质培育之后内化。 [0558] 某些实施例提供基于包含本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物的荧光生物粒子的针对吞噬作用的不用洗、不用淬灭的分析。当前使用荧光生物粒子来测量吞噬作用的方案需要锥虫蓝淬灭步骤和数个洗涤步骤。这些步骤会在所述分析中引入显著变异性。为了解决这个问题，本文中提供一种不用洗的吞噬作用试剂盒，其使用结合于如本文所述的pH敏感性荧光染料的大肠杆菌生物粒子。这些生物粒子结合物在细胞外pH下具有微弱荧光。然而，当添加到吞噬细胞性J774.2鼠类巨噬细胞中时，其被摄取到酸性区室中且从细TM胞内发荧光，从而产生满足或超过Vybrant 吞噬作用分析试剂盒(生命技术公司(Life Technologies Corporation))的亮度的特异性信号。用这些结合物定量吞噬指数不需要洗涤或淬灭步骤，且生物粒子的摄取强烈地受细胞松驰素D(一种已知的吞噬作用阻断剂)抑制。本文所述的pH敏感性荧光生物粒子可用于吞噬作用的基于板的以及成像和流式细胞测量术分析。 [0559] 在某些实施例中，提供用于检测溶液中载体分子的吞噬作用的方法，所述方法包含： [0560] (a)使载体分子与一或多种本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物结合以形成载体-染料结合物； [0561] (b)使载体-染料结合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0562] (c)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0563] (d)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0564] (e)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0565] 其中荧光发射指示载体分子的吞噬作用。 [0566] 在某些实施例中，提供用于检测溶液中载体分子的吞噬作用的方法，所述方法包含： [0567] (a)使载体分子与一或多种本文所揭示的组合物结合以形成载体-染料结合物； [0568] (b)使载体-染料结合物与细胞接触以形成接触的细胞； [0569] (c)培育接触的细胞以形成培育的溶液； [0570] (d)照射培育的溶液以形成照射的溶液；和 [0571] (e)检测来自照射的溶液的荧光发射； [0572] 其中荧光发射指示载体分子的吞噬作用。 [0573] 在特定实施例中，所述载体分子是大肠杆菌生物粒子。 [0574] 在某些实施例中，提供用于诊断或检测受检者的疾病的方法，所述方法包含： [0575] (a)使从怀疑患有所述疾病的受检者获得的样品与一或多种本文所揭示的pH敏感性染料化合物接触以形成接触的样品； [0576] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0577] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0578] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0579] 其中所述荧光发射用于诊断或检测所述疾病。 [0580] 在某些实施例中，提供用于诊断或检测受检者的疾病的方法，所述方法包含： [0581] (a)使从怀疑患有所述疾病的受检者获得的样品与一或多种本文所揭示的组合物接触以形成接触的样品； [0582] (b)使接触的样品培育适当长的时间以形成培育的样品； [0583] (c)用适当波长照射培育的样品以形成照射的样品；和 [0584] (d)检测来自照射的样品的荧光发射； [0585] 其中所述荧光发射用于诊断或检测所述疾病。 [0586] 在某些实施例中，所述疾病与中枢神经系统有关。在某些实施例中，所述疾病是阿尔茨海默病(AD)。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于与所述疾病有关的载体分子。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于β-淀粉状蛋白或其片段。相应地，某些实施例提供针对阿尔茨海默病的基于血液的分析，所述分析是基于结合于β-淀粉状蛋白的本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物的吞噬作用。 [0587] 在某些实施例中，所述疾病与免疫系统有关。在某些实施例中，所述疾病与发炎有关。在某些实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，所述疾病与氧化应激有关。在某些实施例中，pH敏感性荧光染料化合物结合于与所述疾病有关的载体分子。 [0588] 在某些实施例中，提供用于检测能够调节影响pH或直接地影响细胞pH的细胞过程的目标分子的方法。在某些实施例中，目标分子为小分子。在某些实施例中，所述细胞为神经元细胞。在某些实施例中，所述细胞为癌细胞。在某些实施例中，所述细胞为免疫细胞。 [0589] 在某些实施例中，提供用如本文所述的pH敏感性荧光染料化合物检测以下任一者的方法：抗体、蛋白质、肽、酶底物、激素、淋巴因子、代谢物、受体、抗原、半抗原、凝集素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、毒素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、衍生化脱氧核酸、DNA片段、RNA片段、衍生化DNA片段、衍生化RNA片段、核苷、核苷酸、天然药物、合成药物、病毒粒子、细菌粒子、病毒组分、酵母组分、血细胞、血细胞组分、血浆组分、血清组分、生物细胞、神经元细胞、非细胞血液组分、细菌、细菌组分、天然或合成脂质囊泡、毒物、环境污染物、聚合物、聚合物粒子、玻璃粒子、玻璃表面、塑料粒子、塑料表面、聚合物膜、导体或半导体，所述方法包含检测结合于所述抗体、蛋白质、肽、酶底物、激素、淋巴因子、代谢物、受体、抗原、半抗原、凝集素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、毒素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、衍生化脱氧核酸、DNA片段、RNA片段、衍生化DNA片段、衍生化RNA片段、核苷、核苷酸、天然药物、合成药物、病毒粒子、细菌粒子、病毒组分、酵母组分、血细胞、血细胞组分、血浆组分、血清组分、生物细胞、非细胞血液组分、细菌、细菌组分、天然或合成脂质囊泡、毒物、环境污染物、聚合物、聚合物粒子、玻璃粒子、玻璃表面、塑料粒子、塑料表面、聚合物膜、导体或半导体的本文所揭示的化合物。 [0590] 在某些实施例中，提供用于检测酸性或碱性条件的方法，所述方法包含使如本文所述的pH敏感性荧光染料化合物与怀疑呈酸性或碱性的组合物接触和检测所述pH敏感性荧光染料化合物的荧光作为所述酸性或碱性条件的指示剂。在某些实施例中，所测试的组合物包含细胞内环境。 [0591] 测量pH的一般方法的精确性可通过使用多种具有不同荧光反应的本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物而进一步增加。在某些实施例中，可使用根据本发明的两种或两种以上pH敏感性荧光染料化合物，所述化合物任选地键结于相同载体分子或固体支撑物，或可使用如本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物和另一种不同染料。在某些实施例中，第二种荧光染料随着pH增加具有正荧光反应(即，由所述染料或络合物展现的荧光强度随pH增加而增加)。优选的是所述两种或两种以上染料具有重叠滴定范围，且更优选地所述不同染料或结合物具有在彼此的约1个单位内的pKa值。接着测量各染料或结合物的荧光强度，且通过计算第一种化合物的荧光强度与第二种化合物的荧光强度的比率且将所获得的值与校准曲线相比较来测定pH。 [0592] 在某些实施例中，所述pH敏感性染料化合物可用于分析物质迁移到或通过细胞或细胞区室的动力学。此举可通过经过一段时程监测pH敏感性染料化合物的荧光强度来进行。在已知pH时，应选择所述pH敏感性染料化合物以使其具有在待分析的路径的起点处的pH与在所述路径的终点处的pH之间范围内的pKa。在一些情况下，可能需要使用具有多种pKa值的多种pH敏感性染料化合物，其中各染料或络合物针对待分析的路径的不同部分进行调整。 [0593] 在某些实施例中，提供使用本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物或组合物进行分析或检测的方法。更特定地，所述检测可通过光学方法进行。在某些实施例中，荧光发射任选地通过目视检查，或通过使用任何以下装置：CCD相机、摄影机、胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微孔板读数器，或通过用于扩增信号的方法(例如光电倍增管)来检测。 [0594] 在某些实施例中，其中存在本文所提供的pH敏感性荧光染料化合物的样品或介质用所选波长的光照射以产生可检测的光学反应，且用检测所述光学反应的方法来观测。适用于照射本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物和组合物的设备包括(但不限于)手持式紫外线灯、水银弧光灯、氙气灯、激光和激光二极管。这些照射源在光学上整合到激光扫描器、荧光微孔板读数器或标准或测微荧光计中。 [0595] 本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物、染料结合物和组合物可在分析后或分析期间的任何时间用产生可检测的光学反应的波长的光照射，且用检测所述光学反应的方法观测。在例如通过紫外线或可见光波长发射灯、弧光灯、激光或甚至目光或普通室内光照射后，所述荧光化合物(包括结合于互补特异性结合对成员的那些化合物)呈现强烈可见光吸收以及荧光发射。适用于照射本文所揭示的荧光pH敏感性荧光染料化合物的所选设备包括(但不限于)手持式紫外线灯、水银弧光灯、氙气灯、氩激光器、激光二极管和YAG激光器。这些照射源任选地整合到激光扫描器、荧光微孔板读数器、标准或微型荧光计或色谱检测器中。这种荧光发射任选地通过目视检查，或通过使用任何以下装置：CCD相机、摄影机、胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微孔板读数器，或通过用于扩增信号的方法(例如光电倍增管)来检测。在使用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光计检查样品时，所述仪器任选地用于典型地通过区别本发明荧光化合物的荧光反应和可检测到不同光学特性的第二种荧光团的荧光反应而在本文所揭示的荧光化合物与第二种荧光团之间进行区别和辨别。在使用流式细胞仪检查样品时，所述样品的检查任选地包括通过使用分类装置基于荧光反应来分离样品内的粒子。在某些实施例中，照射源用于在本发明的pH敏感性荧光染料化合物与所关注的分析物之间形成共价键。在这种情况下，所述pH敏感性荧光染料包含光可活化的反应性基团，例如上文所讨论的那些基团。 [0596] 试剂盒： [0597] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的试剂盒，所述试剂盒包含： [0598] (a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物； [0599] (b)一或多个容器；和任选地， [0600] (c)用于测定样品pH的说明书。 [0601] 在某些实施例中，提供用于测定样品pH的试剂盒，所述试剂盒包含： [0602] (a)一或多种本文所述的pH敏感性荧光染料化合物； [0603] (b)一或多个容器；和任选地， [0604] (c)用于测定样品pH的说明书。 [0605] 在某些实施例中，所述试剂盒进一步包含以下一或多者：缓冲剂、纯化介质、包含样品的小瓶或有机溶剂。 [0606] 如本文所用，术语“试剂盒”是指已包装的一组相关组分，典型地为一或多种pH敏感性荧光染料化合物或组合物。在某些实施例中，本文所揭示的试剂盒包含以下一或多者：本文所述的pH敏感性荧光染料化合物、适合活体外或活体内应用的一或多种载体以及其中存储所述一或多种pH敏感性荧光染料和/或一或多种载体(例如溶剂、缓冲液、稳定剂、pH调节剂等)的一或多个容器。所述试剂盒任选地含有关于如何制备所述一或多种pH敏感性荧光染料或如何制备含有所述一或多种pH敏感性荧光染料的组合物和如何投予所述染料或含有所述染料的组合物的说明书。在某些实施例中，所述试剂盒包含关于执行检测样品pH或pH改变的分析的说明书。在某些实施例中，所述分析为活体外分析。在某些实施例中，所述分析为活体内分析。所述试剂盒可进一步包含一或多件设备以投予所述染料化合物或包含所述pH敏感性荧光染料化合物的组合物，包括(但不限于)注射器、吸液管、吸液球、抹刀、小瓶、注射器针头和其各种组合。 [0607] 在某些实施例中，本文所提供的试剂盒包含指示剂溶液或指示剂“试纸条”、吸液纸、培养基、比色皿等。在某些实施例中，本文所提供的试剂盒包含用于自动化检测器中的指示剂筒(其中试剂盒组分结合于固体支撑物)。在某些实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包含分子量标记，其中所述标记是选自磷酸化和非磷酸化多肽、钙结合和非钙结合多肽、磺化和非磺化多肽和唾液酸化和非唾液酸化多肽。在某些实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包含选自固定溶液、检测试剂、标准物、洗涤溶液和其组合的成员。 [0608] 所述pH敏感性荧光染料化合物的合成和制备方法： [0609] 在某些实施例中，提供用于合成结构式(I)的化合物的方法： [0610] [0611] 所述方法包含： [0612] 使结构式(III)的化合物： [0613] [0614] 与结构式(IV)的化合物接触： [0615] [0616] 以形成结构式(I)的化合物， [0617] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如先前所定义。 [0618] 下文详细展示例示性反应方案： [0619] [0620] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10如本文中所描述。 [0621] 在某些实施例中，任一种上述合成方法均进一步包含纯化步骤。在某些更特定实施例中，所述纯化步骤包含以下至少一者：柱色谱法、湿磨、重结晶、过滤或水性分离。 [0622] 上文已经提供了本发明教示的详细描述，以下实例是出于说明本发明的目的而给出且不应被视为对本发明或权利要求书的范围的限制。 [0623] 实例 [0624] 参考以下实例，使用本文所述的方法或所属领域中已知的其它方法合成本文所揭示的pH敏感性荧光染料化合物。 [0625] 应了解，根据本发明的有机化合物可展现互变异构现象。由于本说明书内的化学结构可仅表示一种可能的互变异构体形式，应了解本发明涵盖所绘结构的任何互变异构体形式。 [0626] 本文所揭示的荧光pH敏感性染料化合物的化学合成： [0627] 实例1：化合物(3)的制备： [0628] [0629] 2-(双(羧甲基)氨基)-6-(4-((2-(二甲基氨基)-4-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-氧杂蒽-9-基)-5-甲氧基苯基)(乙基)氨基)丁酰胺基)己酸酯(化合物3)：向化合物(2)(24.0mg，0.065mmol)和三乙胺(45μL，0.325mmol)于DMSO(1mL)中的溶液中添加溶解于DMF(1mL)中的化合物(1)(40mg，0.059mmol)且混合物在室温下搅拌18小时。用真空泵去除所有挥发性物质。粗混合物用1mL 水处理，且通过C-18色谱法(拜太齐(Biotage)SNAP 12g，MeOH∶H2O＝0∶100到30∶70)纯化以得到呈暗紫 1 色粉末状的化合物(3)(38mg，81％)。H NMR(MeOD)：7.40(d，2H)，7.10(m，4H)，6.91(2H，s)，3.75(s，3H)，3.65(q，4H)，3.43(m，2H)，3.40(m，2H)，3.30(s，12H)，3.18(m，2H)，2.75(s， 6H)，2.23(m，2H)，1.90(b，4H)，1.55(m，4H)，1.23(t，2H，)，1.10(t，3H)。 [0630] 实例2：化合物(4)的制备： [0631] [0632] N-(9-(4-((8-(2-(乙酰氧基甲氧基)-2-氧代乙基)-9-((乙酰氧基甲氧基)羰基)-2，6，15-三氧代-3，5-二氧杂-8，14-二氮杂十八烷-18-基)(乙基)氨基)-5-(二甲基氨基)-2-甲氧基苯基)-6-(二甲基氨基)-3H-氧杂蒽-3-亚基)-N-甲基甲铵(化合物4)：将化合物(3)(38mg，0.048mmol)溶解于DMF(2mL)中。向溶液中添加三乙胺(50μL，0.336mmol)。逐滴添加溴乙酸甲酯(0.05mL，0.48mmol)，在添加期间形成白烟。混合物在室温下搅拌1小时。用真空泵去除所有挥发性物质并干燥残余物。将所得残余物溶解于氯仿(20mL)中且用1∶1饱和NaHCO3-水洗涤，将有机层干燥并浓缩，且通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 25g，MeOH∶氯仿＝0-10％)纯化以得到呈暗紫色固体 1 状的化合物(4)(40mg，77％)。H NMR(d6-DMSO)7.80(t，1H)，7.30(d，2H)，7.15(d，2H)， 6.89(s，2H)，6.75(d，2H)，5.60(m，6H)，4.00(s，4H)，3.62(s，3H)，3.60(q，4H)，3.40(m，2H)， 3.20(s，12H)，3.00(m，2H)，2.60(s，6H)，2.10(m，2H)，2.00(s，9H)，1.70(s，2H)，1.70(m， 2H)，1.50(m，2H)，1.30(m，2H)，1.10(m，2H)，1.0(t，3H).LCMS：1007.1(M+1)。 [0633] 实例3：化合物(7)和(8)的制备： [0634] [0635] 化合物(6)(9.00g，18.3mmol，参看吴(Wu)等人，有机化学通讯(Org.Lett.)10：1779-1782(2008)，以全文引用的方式结合到本文中)在室温下用DMSO(56mL)和二烯丙基胺(21.2g，219mmol)处理，且混合物加热到90℃持续36小时。所述混合物冷却到室温且通过添加水(250mL)淬灭。产物用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并的有机层由水(200mL×2)、盐水(300mL)洗涤，由MgSO4干燥，且蒸发。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 340g，6.5×18cm，乙酸乙酯∶己烷＝1∶2)纯化，生成化合物(7)(3.30g，47％，白色固体)和化合物(8)(1.10g，20％，浅黄色固体)。 [0636] 实例4：化合物(9)的制备： [0637] [0638] 化合物(7)(149mg，0.386mmol)用无水DCM(5mL)和Tf2O(80μL，0.476mmol)处理，且混合物在室温下搅拌。在搅拌30分钟之后，添加含化合物(5)(150mg，0.486mmol)的DCM(2mL)和DIEA(120μL，0.689mmol)。反应物在室温下搅拌16小时。蒸发产生粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 25g，2.5×8cm，MeOH∶CHCl3＝1∶10到1∶4)纯化，生成呈紫色粘性材料的化合物(9)(200mg，62％)。 [0639] 实例5：化合物(14)和(15)的制备： [0640] [0641] 4-甲氧基苯胺 (13)(10.0g，81.2mmol)于DMF(100mL)中的溶液用60 ％NaH(8.10g，203mmol)和碘乙烷(26.0mL，235mmol)处理。在最初3小时搅拌中，所述混合物的温度用冰浴保持在0℃。去除冰浴且所述混合物在室温下再搅拌12小时。添加水(200mL)以淬灭这一反应。产物用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并的有机层用水(200mL×5)、盐水(200mL)洗涤，且经硫酸钠干燥。过滤并蒸发产生呈暗绿色油状的化合物(14)(16.2g，约100％)。 [0642] 在室温下，在30分钟内向N，N-二乙基-4-甲氧基苯胺(14)(6.0g，27mmol)于水(500mL)和乙酸(50mL)中的溶液中逐滴添加NaNO2(3.8g，55mmol)于水(70mL)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌3小时。产物用乙酸乙酯(150mL×3)萃取。合并的有机层用1M KOH(100mL×4)、盐水(100mL)洗涤，且经无水硫酸钠干燥。过滤并蒸发产生呈暗红色油状的粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 100g，3.5×16cm，15％CHCl3/己烷到100％CHCl3)纯化，生成呈暗红色油状的化合物(15)(4.90g，81％)。 [0643] 实例6：化合物(16)和(17)的制备： [0644] [0645] 在氩气下小心地向钯/活性炭(650mg)中添加乙醇(15mL)。化合物(15)(5.30g，23.6mmol)于乙醇(75mL)中的溶液通过吸液管用钯悬浮溶液处理。所述溶液配备有由填充氢气的约3L气球连接的三通活栓。将所述溶液抽空且用氢气小心地再填充3次。所述溶液在氢气氛围下搅拌18小时。通过硅藻土垫过滤以去除钯，且滤液浓缩到干燥，获得粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 100g，3.5×16cm，乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)纯化，生成化合物(16)(4.14g，90％，呈浅褐色油状)。 [0646] 化合物(16)(4.14g，21.3mmol)于DCM(60mL)中的溶液在0℃下用乙酰氯(1.80mL，25.6mmol)和三乙胺(4.44mL，32.0mmol)处理。所述混合物在0℃下搅拌30分钟，且通过添加MeOH(1mL)淬灭。所述混合物用乙酸乙酯(300mL)稀释且所述溶液用水(200mL)、盐水(150mL)洗涤，且经无水硫酸钠干燥。蒸发产生呈浅褐色油状的纯粗产物化合物(17)(4.73g，94％)。无需进一步纯化。 [0647] 实例7：化合物(18)和(19)的制备： [0648] [0649] 化合物(17)(4.73g，20.0mmol)于无水THF(15mL)中的溶液用BH3-THF(60mL 1M THF溶液，60mmol)小心地处理。所述混合物加热到回流持续2小时且冷却到室温。在室温下缓慢地添加MeOH(60mL)到所述溶液中以淬灭额外量的硼烷络合物，且所述混合物加热到回流持续10分钟。所述溶液冷却到室温，且蒸发到干燥。残留物溶解于300mL乙酸乙酯中，且用饱和碳酸氢钠(150mL×2)、盐水(100mL)洗涤，且经无水硫酸钠干燥。蒸发产生呈浅褐色油状的纯粗产物化合物(18)(4.12g，93％)。无需进一步纯化。 [0650] 化合物(18)(4.06g，18.3mmol)于40mL DMF中的溶液用4-溴丁酸甲酯(9.23mL，73.1mmol)、NaI(1.36g，9.07mmol)和DIEA(9.44mL，54.2mmol)处理，且所述混合物加热到 100℃持续22小时。反应物冷却到室温，添加200mL水，且用乙酸乙酯(150mL×3)萃取。合并的有机层由水(150mL×3)、盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥且蒸发，生成粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 100g，3.5×16cm，乙酸乙酯∶己烷＝ 1∶4)纯化，生成呈浅褐色油状的化合物(19)(4.60g，79％)。 [0651] 实例8：化合物(20)的制备： [0652] [0653] 化合物(7)(2.15g，5.54mmol)用无水DCM(5mL)和Tf2O(0.94mL，0.5.60mmol)处理，且混合物在室温下搅拌。在搅拌30分钟之后，添加含化合物(19)(2.13g，6.65mmol)的DCM(15mL)和DIEA(1.25mL，7.18mmol)。反应物在室温下搅拌22小时。蒸发产生粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 100g，3.5×16cm，H2O∶MeCN∶HOAc＝1∶10∶0.1到1∶6∶0.1)纯化，生成呈紫色粘性材料的化合物(20)(2.58g，62％)。 [0654] 实例9：化合物(25)的制备： [0655] [0656] 化合物(8)(170mg，0.553mmol)于DMF(5mL) 中的溶液在 0 ℃下用 60 ％NaH(33.0mg，0.825mmol)和烯丙基溴(134mg，1.11mmol)处理。使所述混合物温到室温且搅拌过夜(约16小时)。反应用水(20mL)淬灭。所述溶液用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并的有机层用水(30mL×3)、盐水(50mL)洗涤，经硫酸镁干燥且蒸发，生成呈浅黄色固体状的化合物(25)(210mg，约100％)。无需进一步纯化。 [0657] 实例10：化合物(29)的制备： [0658] [0659] 化合物(25)(210mg，0.605mmol)用无水DCM(8mL)和Tf2O(121μL，0.719mmol)处理，且混合物在室温下搅拌。在搅拌30分钟之后，添加含化合物(5)(239mg，0.774mmol)的DCM(6mL)和DIEA(160μL，0.910mmol)。反应物在室温下搅拌20小时。蒸发产生粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 50g，3.5×8.5cm，MeOH∶CHCl3＝1∶10到1∶4)纯化，生成呈灰色粘性材料的化合物(29)(412mg，87％)。 [0660] 实例11：化合物(4)的EGF结合物的制备： [0661] 将0.6mg的5mg/ml EGF储备溶液(120μL，0.098μmol)添加到2mL小瓶中。将0.6mg化合物(4)(0.88μmol)溶解于100μL DMSO中，且将23μL所述溶液添加到所述具有EGF的小瓶中。染料与蛋白质摩尔比为约2。将50μL三乙胺溶解于0.5mL DMSO中。将 6μL三乙胺溶液添加到所述EGF溶液中，且搅拌，加盖，持续约24小时。添加约1/10体积的 1.5M羟胺(pH 8.0)以终止反应且在室温下搅拌约30分钟。结合物在P-2F柱(15×1cm)上用PBS(pH 7.2)纯化。收集各含有1-2mL的3-6个洗脱份且在TLC上用CMA(70∶25∶5)展开以确证不存在游离染料，且通过HPLC处理以检查未结合的EGF。弃去含有游离染料的溶离份和含有未结合EGF的溶离份。不含有游离染料且不含有未结合EGF的溶离份经确证为最终产物。测量A566nm/A280nm且测定所述结合物的浓度(80μg/ml)且由吸光度测定取代程度(DOS＝1)。将BSA粉末添加到所述结合物溶液中(1％最终浓度)且搅拌以使其缓和地溶解。所述EGF结合物在干冰中冷冻至少1小时且冻干持续至少18小时。 [0662] 所述荧光pH敏感性染料化合物的生物应用实例 [0663] 实例12：pH与本文所提供的pH敏感性染料化合物的荧光之间的关系： [0664] 本文所述的pH敏感性荧光染料化合物的荧光性质使其极其适用于研究细胞中发生的多种内化过程，例如吞噬作用和内吞作用。这是因为在内化后，吞噬体或核内体内部的pH降低，这导致来自所述pH敏感性荧光染料化合物的荧光增加。所述pH敏感性荧光染料化合物与所关注的生物分子的结合提供这些分子的内化的便利分析。实例包括用于研究受体介导的内吞作用的转铁蛋白、EGF和低密度脂蛋白(LDL)，和用于研究吞噬作用的经标记的生物粒子，例如大肠杆菌、葡萄球菌以及酵母聚糖。使用这些荧光生物结合物的分析由于以下事实而提供优于现有技术的显著优点：所述pH敏感性荧光染料化合物在细胞外部的中性pH下为相对无荧光的。这减少或消除了对于洗涤步骤和降低来自细胞外部的生物结合物的背景信号通常所需要的淬灭剂染料的需要。 [0665] 所述pH敏感性荧光染料化合物对于pH改变的荧光反应的研究是在水性缓冲液(约10μmol/mL的浓度)中执行。对于化合物(1)的滴定结果展示于图3中。 [0666] 实例13：所述pH敏感性荧光染料化合物的细胞内摄取： [0667] 图2的图B展示了化合物(1)的细胞内化。细胞使用标准荧光照射和显微术成像。 [0668] 实例14：在pH敏感性荧光染料结合物的情况下活细胞吞噬作用/内吞作用： [0669] A 431细胞在来自马泰克(MatTek)的35mm聚-D-赖氨酸涂布的玻璃底培养皿上的完全培养基中生长。在分析当天，细胞用LCIS+1％BSA(活细胞成像溶液(Live Cell imaging solution)，目录号A14291DJ，生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚(CA))冲洗一次且在37℃下放置。对照皿接受LCIS；EGF预处理皿接受含于LCIS中的10μg/mL未标记的EGF。细胞在37℃下培育30分钟。细胞接着在冰上冷却到4℃持续10分钟。化合物(4)标记的EGF从LCIS中的50μg/mL储备液以1∶105μg/mL添加到皿中。这些皿在冰上培育30分钟，接着用冷LCIS洗涤2次，且使其温到37℃持续60分钟，接着在DeltaVision Core显微镜上用标准TRITC和FITC滤光片组成像。用未标记的EGF预处理的细胞由于染料标记的EGF结合位点阻塞和过量未标记的EGF对EGF受体的内化而不展示信号。来自未处理的板的特异性信号是来自染料标记的EGF内化。所有图像均关于增益和曝光时间相匹配。图4展示结合化合物(1)的EGF的内化。左图展示用EGF预处理的细胞且右图展示周染料结合的EGF处理的细胞。 [0670] pH敏感性荧光染料化合物分别在LCIS中由5和10mM DMSO储备液配成，且如下加载以供成像： [0671] 10mL加载缓冲液，化合物(4)：来自5mM DMSO储备液的10μL化合物(4)添加到100μL Powerload中且混合。10mL LCIS添加到这一溶液中以达成5μM的化合物(4)最终浓度。细胞在35mm马泰克(MatTek)玻璃底皿上培养。为了进行加载，细胞用LCIS冲洗 1次且用上述加载缓冲液更换。细胞在37℃下培育60分钟，接着用LCIS冲洗2次且用标准TRITC或FITC滤光片组成像(参看图5)。 [0672] 培养细胞且如上文所述向其中加载化合物(4)。从细胞中去除这一溶液且用钾LCIS pH 7.4标准物更换，且成像实验以处于由pH 7.4、7.2、6.5和6.0的钾LCIS pH标准物引起的恒定灌注下的细胞开始。随着外部pH变化，来自细胞内部染料的信号变化以反映质子通过膜中的尼日利亚菌素孔的平衡。(尼目利亚菌素和缬氨霉素各自以10μM从DMSO储备液添加。)图6中展示在pH 7.4和6.0下化合物(4)AM加载的细胞的图像。图7中展示随着pH从7.4变化到6.0再变回去，样品中来自个别所选细胞的功能性动力学反应。 [0673] 实例15：使用pH敏感性荧光染料进行抗体标记： [0674] 新鲜制备的化合物(1)-顺丁烯二酰亚胺的10mM DMSO溶液以针对每种IgG分子足以产生10-20摩尔化合物(1)的量添加到PBS缓冲液(pH 7.0-7.5)中的IgG溶液(6mg/mL)中。使所述反应继续进行约2小时，此时将反应混合物倾倒于预充填的Sephadex G-25柱上。所述柱用PBS缓冲液洗脱以收集纯化的结合IgG。纯化的IgG的小等分试样(约5μL)的TLC分析指示在结合物溶液中无游离染料。标记度(DOL)通过典型吸光度读数来测定。 [0675] 表4：染料标记的IgG [0676]化合物染料摩尔数/IgG分子测得的DOL 4 10 2.7 4 20 2.93 [0677] 从所述柱收集经标记的IgG且经由薄层色谱法检查纯度，以确保所有游离染料均与经标记的IgG分离。这些样品以1∶10稀释到从pH 4到pH 9的一系列pH标准溶液中10-100μg/mL的最终浓度且转移到96孔微孔板中且在分子装置公司(Molecular Devices)FlexStation 384板式读数器中扫描荧光。如图8中可见，y轴上的相对荧光单位(RFU)证实来自IgG结合物的荧光信号的pH活化，使得信号随着pH降低而增加。结合的抗体的接近6.8的pKa(中点)值密切地追随来自所述pH敏感性荧光染料的信号。 [0678] 实例16：用pH传感染料标记转铁蛋白： [0679] 除非另外陈述，否则所有材料均来自生命技术公司(Life Technologies Corp.)(卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚(CA))。将来自人类血清的转铁蛋白(西格玛(Sigma)，T4132)溶解于0.1M NaHCO3(pH 8.3)中，得到10mg/mL的浓度。制备所述pH敏感性荧光染料化合物的丁二酸亚胺酯于无水DMSO中的10mg/mL溶液且短暂地作声波处理以辅助所述染料的溶解。将10至30倍摩尔过量的所述反应性染料溶液逐滴添加到所述转铁蛋白溶液中，同时搅拌。注意所添加的染料的体积取决于所述特异性染料和待标记的转铁蛋白的量。使反应容器避光且在室温下搅拌约1小时。在P-30M凝胶过滤柱(伯乐公司(BioRad)，150-4150)上用PBS(pH 7.2)纯化所述结合物。使所述结合物在19,000rpm下离心20分钟以去除聚集物(如果有的话)。通过测量A560nm/A280nm来测定标记度。 [0680] 实例17：监测与离子通道或转运体活化有关的细胞溶质酸化： [0681] 所述pH敏感性荧光染料化合物的细胞溶质定域型式为通过离子通道或转运体的质子流入的有效指示。这种型式可用于筛选拮抗剂、激动剂和其它通道/转运体功能调节剂。 [0682] 实例18：受体内化分析： [0683] β-2-肾上腺素能受体(β2AR)经修饰以在N端结合表位标签(VSV-G标签)。产生表达这一受体的克隆性、稳定HEK 293细胞系(约1.8pmol/mg细胞匀浆)。用本文所述的pH敏感性荧光染料化合物标记的抗-VSV-G抗体用于监测这些活细胞中激动剂介导的受体内化。所述分析在特异性激动剂异丙基肾上腺素存在和不存在下执行。 [0684] a)VSV-G-B2肾上腺素能细胞中异丙基肾上腺素诱导的受体内化。对于HEK 293细胞，优选地在接种所述细胞之前用聚-D-赖氨酸(西格玛(Sigma P-6407)，5mg于50ml无菌PBS中)涂布板。添加30-80μl/孔且在室温下维持45分钟。接着抽吸所述涂布溶液，用100μl无菌PBS洗涤4次(或更多次)。板可预先处理且在4℃下存储长达1周(最终PBS洗涤液仍在所述孔中)。培养的细胞可直接接种到所述孔中，而无需首先干燥所述板。培养的细胞在含有200μg/ml G418的完全MEM培养基(西格玛(Sigma)M2279)中 5 稀释到约1.6×10个细胞/ml。将100μl细胞悬浮液吸移到聚-D-赖氨酸处理的96孔 Packard Viewplate的各分析孔中(细胞密度＝16000个细胞/孔)。板接着在37℃下与 5％CO2一起培育24-48小时。250μg冻干的pH敏感性荧光染料化合物标记的抗-VSV-G抗体(PA45407)用无菌去离子水重构且充分混合(储备液浓度0.5mg/ml)。所述混合物离心以去除任何沉淀物。所述化合物标记的抗-VSV-G抗体进一步使用无血清、无酚红MEM培养基稀释到2.5-5μg/ml的浓度。可将Hoechst 33342核染剂添加到2.5-5μg/ml抗体溶液中，得到5μM的最终浓度。随后从所述细胞去除培养基且将100μl抗体和Hoechst溶液添加到各孔中。所述溶液接着在室温下培育15分钟。将异丙基肾上腺素激动剂的3μM工作稀释液(来自无菌水中的10mM储备液；西格玛(Sigma)I5627)添加到所述溶液中且接着将50μl添加到所需的孔中，产生1μM最终浓度。所述孔在37℃下培育30分钟(在CO2培育箱中或在IN细胞分析仪3000上)。所述细胞在IN细胞分析仪3000、IN细胞分析仪1000或共焦显微镜上成像。 [0685] b)染料化合物标记的抗-VSV-G抗体的内化。表达VSV-G-β2-肾上腺素能受体的HEK 293细胞用抗-VSV-G抗体-染料化合物结合物预培育且用1μM异丙基肾上腺素刺激。所述细胞使用IN细胞分析仪1000成像。使用粒度算法实现激动剂介导的反应的定量，所述算法将颗粒定义为细胞内的不同聚焦区，所述聚焦区与紧靠在所述颗粒周围的细胞区域具有显著强度差异。操作者可调节多种参数来控制将计数且分析颗粒的何种尺寸和强度。 [0686] c)染料化合物标记的抗-VSV-G抗体的内化。HEK VSV-G-β2-肾上腺素能受体细胞用pH敏感性荧光染料化合物标记的抗-VSV-G抗体预培育且接着将递增浓度的异丙基肾上腺素(0-1μM)添加到所述细胞中。在37℃下30分钟之后，通过使用IN细胞分析仪1000和粒度分析算法测量pH敏感性荧光染料化合物荧光的增加来分析激动剂介导的内化。 [0687] 实例19：用pH敏感性荧光染料化合物检测神经元细胞： [0688] 在35mm直径的涂布有聚-L-赖氨酸的玻璃底培养皿上在培养物中产生星形胶质细胞饲养层持续一周。来自胚胎第18天大鼠海马区的神经元在培养基中分离，且以25-35,000个细胞/ml(每个皿2ml)的密度接种于所述饲养层上，且使其在神经元培养基加上分裂抑制剂中生长以预防神经胶质增殖。 [0689] 细胞用200ng/mL Hoescht预染色持续15分钟以显现细胞核中的DNA，且用钙黄绿素(calcien)AM酯预染色以通过将这些化合物的1000×DMSO储备液添加到完全培养基中的细胞中且接着在37℃下使其返回细胞培育箱中持续15分钟来显现细胞溶质。移出细胞，且轻轻地倒出培养基。细胞立即放置于5μM pH敏感性荧光染料化合物中，从1mM DMSO储备液稀释到生理盐水加上20mM HEPES和20mM 葡萄糖(用NaOH将最终pH设定为7.4)中。细胞在室温下在标记溶液中培育10分钟，且接着用不含染料的生理盐水(上述)轻轻地洗涤两次以供成像。 [0690] 实例20：β1淀粉状蛋白结合物的吞噬作用： [0691] 1mg β淀粉状蛋白1-42用pH敏感性荧光染料化合物标记以生成染料-β淀粉状蛋白结合物，所述结合物通过凝胶过滤纯化以产生约200ng/mL的溶液，其中标记度在1个与2个染料分子/β淀粉状蛋白分子之间。 [0692] 2mL J774A.1细胞在研究前一天以35,000个细胞/mL的密度接种于35mm聚-D-赖氨酸涂布的玻璃底培养皿上的无血清OptiMem培养基中。所述染料-β淀粉状蛋白结合物通过0.2微米针筒过滤器过滤，且将20微升所述溶液添加到所述细胞中。将所述培养物返回培育箱(37℃，5％CO2)中过夜培育，且在次日成像。 [0693] 实例37：使用含DIBO的pH敏感性荧光染料化合物的无铜点击反应： [0694] a)制备DIBO标记的染料化合物：pH敏感性染料化合物STP酯(10mg，0.0134mmol)和DIBO胺(目录号C10411，分子探针公司(Molecular Probes)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚(CA))(5.0mg，0.0156mmol)于DMF(1mL)中的溶液用10μl三乙胺(0.072mmol)处理且混合物在室温下搅拌1小时。用真空泵去除所有挥发性物质过夜。粗反应混合物用真空泵小心地干燥且通过硅胶柱色谱法(拜太齐(Biotage)，SNAP 10g MeOH∶CHCl3＝1∶10到1∶6)纯化得到DIBO-染料结合物。 [0695] a)活细胞标记：哺乳动物细胞在适当培养基中在37℃下在5％CO2中生长。用叠氮化物衍生的代谢物(例如， ManNAz，生命技术公司(Life Technologies)，目录号C33366)补充生长培养基且使细胞生长2到3天。用含有1％胎牛血清(FBS)的D-PBS(生命技术公司(Life Technologies)，目录号14190-144)洗涤所述细胞两次。在室温下在暗处用含1％FBS的D-PBS中的约5到30μM含有DIBO的pH敏感性染料化合物标记所述叠氮化物修饰的大分子持续1小时。用含1％FBS的D-PBS洗涤所述细胞四次。在室温下用D-PBS中的4％甲醛固定所述细胞持续15分钟。用D-PBS洗涤所述细胞。任选地，用适当复染剂(例如Hoechst 33342)对所述细胞进行复染且洗涤所述细胞。使所述细胞成像。 [0696] b)蛋白质标记：将叠氮化物引入到蛋白质中，例如使用抗体中的GalNAz使用O-GlcNAc酶促标记系统(生命技术公司(Life Technologies)，目录号C33368)。用含有DIBO的pH敏感性染料化合物修饰蛋白质结合的叠氮化物。在室温下在具有约5到10μM含有DIBO的pH敏感性染料化合物的TBS中培育所述蛋白质持续至少1小时。去除过量标记。分析经修饰的蛋白质。

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