[0001] 对相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2012年1月30日提交的美国临时申请序号No. 61/592,122的权益，其全文并入本文作为参考。

[0003] 背景

[0004] 荧光技术从在化学到许多生物学领域越来越受到关注。在某些情况中，使用荧光分子检测被分析物在食品和环境样品中的存在。一些灵敏和定量荧光检测装置对体外生化检测，如DNA测序和血糖量化是理想的。此外，某些荧光探针是追踪活细胞中的分子和生理学事件所必需的。最后，在许多高通量筛选中常使用荧光测量。

[0005] 荧光技术优于其它类型的光学测量的主要优点包括灵敏度、简单性和大量分子信息。由于在大多数化学和生物样品中通常低水平的荧光背景，荧光测量非常灵敏。随着荧光仪器，如共焦和多光子(multi-photo)荧光显微术中的进步，细胞事件和生物物种动力学的三维成像有可能实时实现。

[0006] 特别地，荧光在生物科学中通常通过记录或成像相应生物分子的某些荧光探针在特定波长（在此没有由激发光引起的细胞固有荧光）下的荧光发射而用作追踪或分析生物分子，如蛋白质、金属离子、活性氧物质（ROS）/活性氮物质（RNS）等的非破坏性途径。

[0007] 在生命系统的这些令人感兴趣的生物分子中，活性氧物质（ROS）和活性氮物质（RNS）在荧光探针的发展中因其在生物样品中的检测而受到科学界的大量关注。活性氧物质（ROS）和活性氮物质（RNS）被科学家公认为是在生命系统中具有高反应性的极小无机或有机分子。有各种形式的ROS和RNS，包括自由基，如超氧自由基、羟基自由基、一氧化氮、二氧化氮和有机过氧自由基；以及非自由基物类，如过氧化氢、单线态氧、臭氧、亚硝酸、过氧亚硝酸盐和次氯酸盐。ROS和RNS是细胞呼吸的副产物。在正常条件下，ROS和RNS以极低量存在并在细胞信号传导中起到重要作用；而在氧化应激过程中，ROS和RNS水平显著提高，这可以对各种生物分子如蛋白质、脂质和DNA造成严重损害。在许多人类疾病，如心血管疾病、炎性疾病、代谢疾病、癌症和中枢神经系统疾病中涉及ROS和RNS的过度生成。因此，非常需要可灵敏和选择性地测量、检测或筛选某些ROS和RNS以研究它们在体外和体内的生理作用的化学品。

[0008] 过氧亚硝酸盐在各种形式的ROS和RNS中具有最强的氧化力，它们的选择性检测非常适用于清楚解释它们在生物活体中的关键作用。过氧亚硝酸盐（ONOO-）是通过一氧化氮（NO）和超氧化物（O2•-）在1比1化学计量下的扩散控制反应（k = 0.4−1.9×1010 M-1s-1）体内形成的短寿命氧化剂物类。过氧亚硝酸盐的氧化剂反应性非常依赖于pH且过氧亚硝酸根阴离子及其质子化形式过氧亚硝酸都可直接参与与生物分子的一电子和二电子氧化反应。ONOO-的病理学活性也与其与生物学上普遍存在的CO2的反应相关联，由此以大约35%收率产生高反应性自由基CO3-•和NO2•。因此，过氧亚硝酸盐可将酪氨酸硝酸化并将蛋白质、脂质和生物分子的铁和硫物质氧化。类似于生物活体中的其它氧化剂，过氧亚硝酸盐及其质子化形式与有益和有害效应都相关联。但是，若干研究已暗示，过氧亚硝酸盐促成许多人类疾病如缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、脓毒性休克、多发性硬化症、动脉粥样硬化、中风、炎性肠病、癌症和若干神经退行性疾病中的组织损伤（MacMillan-Crow, L. A.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11853–11858；Rodenas, J.等人, Free Radical. 
Biol. & Med. 2000, 28, 374；Cuzzocrea, S.等人, Pharmacol Rev. 2001, 53, 135–
159；Szabo, C. Toxicol. Lett. 2003, 140, 105–112；White, C. R.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 1044–1048；Lipton, S. A.等人, Nature 1993, 364, 626–
632；Pappolla, M. A.等人, J. Neural Transm. 2000, 107, 203–231；Beal, M. F., Free Radical Biol. & Med. 2002, 32, 797–803）。

[0009] 目前，具有绿色荧光色的过氧亚硝酸盐探针可得（美国专利申请序号No. 12/417,672）；但是，现有的绿色荧光探针在细胞测定中表现出有限的细胞内保留。此外，具有其它荧光色或具有定位在所需胞内隔室中的能力的过氧亚硝酸盐探针少见。长波长荧光探针，如黄色、红色、远红或近红外（NIR）荧光探针在生物样品中提供可靠成像方面比绿色探针更有吸引力和更有利，因为它们有效避免来自在绿色区中的细胞自发荧光的干扰并具有能够更深入渗透细胞和组织的更长激发/发射波长。因此，需要具有合意和可靠得多的过氧亚硝酸盐检测和成像的新一代荧光探针。

[0010] 概述

[0011] 本发明提供用于灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐的改进的荧光（fluorogenic）或荧光(fluorescent)化合物和探针。在一个实施方案中，在本文中提供了产生荧光色，如绿色、黄色、红色或远红色的荧光化合物。在本文中还提供了用于选择性染色活细胞的线粒体中的过氧亚硝酸盐的荧光化合物。

[0012] 一方面，本发明提供式(I)或(II)所示的荧光化合物：

[0013]

[0014]

[0015] 或其互变异构体；

[0016] 其中N是氮原子并经由单共价键连接到Q和R1上；

[0017] R1是H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基氨基、烷氧基氨基、烷基酰胺基、烷氧基酰胺基或酰基；

[0018] R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰胺基、羟基、巯基、硫代烷基(thioalkyl)、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、硝基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO3H)、磺酸酯、磺酰胺、−C(=O)−P1或−C(=O)−M−P2；

[0019] P1和P2各自独立地为氢、卤素、烷氧基、羟基、巯基、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、杂烷基、烷基三苯基鏻或具有3至7个环原子的杂环基；M是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳烷基或亚烷芳基；

[0020] A是OR10或NR11R12；

[0021] 其中R10是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、酰基或氨基羰基；

[0022] 其中R11和R12各自独立地为H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷氧基、酰基、羧基烷基、磺基烷基、羧基烷基的盐、磺基烷基的盐、或羧基烷基或磺基烷基的酯或酰胺；或R11与R12结合形成饱和5-或6-元杂环，其是哌啶、吗啉、吡咯烷或哌嗪，它们各自任选被烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯取代；或R11与R4结合，或R12与R3结合，或这两者形成饱和或不饱和或进一步与芳基或杂芳基环稠合并任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸(-SO3H)或它们的盐、酯或酰胺衍生物取代的5-或6-元环；

[0023] B是O或N+R11R12；

[0024] Z是O、S、NR13、CR13R14、SiR13R14、GeR13R14或SnR13R14；

[0025] 其中R13和R14各自独立地为H、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟烷基、氨基烷基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO3H)、磺酸酯、磺酰胺、羧酸、羧酸酯或羧酰胺；或R13与R14结合形成任选被烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯取代的饱和5-或6-元杂环；

[0026] R8是H、CF3、CN、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯；或R8是任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代的饱和或不饱和烷基，其中R15和R16各自代表任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或烷基三苯基鏻取代的饱和或不饱和的环烷基或非环烷基；或R8具有式

[0027]

[0028] 其中R17、R18、R19、R20和R21各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、羧酸、羧酸盐、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)、磺酰胺(-SO2NR15R16)、羟基、叠氮化物、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、烷基羰基烷基、卤代烷基羰基烷基，如三氟甲基羰基烷基、氨基烷基、羧基烷基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基酰胺基，其烷基或芳基任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代；或R17和R18一起、R18和R19一起、R19和R20一起、或R20和R21一起形成式(III)的与苯基环稠合的5-或6-元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环部分，其任选进一步被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代；

[0029] R9是H、羟基、CN或烷氧基；或R9与R8结合形成5-元螺内酯或螺内酰胺环或5-元螺磺内酰胺环；或R9与R17或R21结合形成5-或6-元螺内酯或螺内酰胺环或5-或6-元螺磺内酯或螺9 8
磺内酰胺环，其任选并独立地被H、F或CH3取代；具体而言，R ，在与R结合形成5-元螺内酯或螺内酰胺环或5-元螺磺内酰胺环时，是氧或取代氮；且

[0030] Q是具有式(IV)的取代苯基：

[0031]

[0032] 其中R22、R23、R24、R25和R26各自独立地为H、羟基、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、烷基羰基烷基、卤代烷基羰基烷基，如三氟甲基羰基烷基、氨基烷基、羧基烷基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基羧酰胺基，其烷基或芳基任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代；或R22和R23一起、R23和R24一起、R24和R25一起、或R25和R26一起形成与式(IV)的苯基环稠合的5-或6-元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环的一部分，式(IV)的苯基环任选进一步被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代。

[0033] 本发明还提供荧光探针组合物，其包含本发明的荧光化合物和任选载体、溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。

[0034] 在本文中还提供了检测样品中过氧亚硝酸盐的存在或测量样品中的过氧亚硝酸盐含量的方法。在一些实施方案中，该方法包括步骤(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与样品接触以形成荧光化合物；和(b) 测定或测量所述荧光化合物的荧光性质。

[0035] 在本文中还提供了用于检测样品中的过氧亚硝酸盐的高通量筛选方法。在一些实施方案中，该高通量筛选荧光法包括步骤(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与样品接触以形成荧光化合物；和(b) 测量所述荧光化合物的荧光性质。

[0036] 在本文中还提供了用于筛选一种或多种可提高或降低过氧亚硝酸盐含量的靶标化合物的高通量方法。在一些实施方案中，该用于检测过氧亚硝酸盐的高通量筛选方法包括以下步骤：(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与样品接触以形成一种或多种荧光化合物；和(b) 测量所述荧光化合物的荧光性质以测定样品中过氧亚硝酸盐的量。

[0037] 附图简述

[0038] 图1A描绘了显示用不同量的过氧亚硝酸盐处理后的化合物2的荧光强度的荧光光谱。图1B显示用不同的活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)处理后化合物2的荧光强度的提高。通过将化合物2溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成1 µM溶液，获取光谱，其中激发和发射光谱分别在510纳米和530纳米下。高活性氧物质羟基自由基(•OH)、次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根(ONOO−)的浓度为1 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为10 µM。

[0039] 图2A描绘了显示用不同量的过氧亚硝酸盐处理后的化合物11的荧光强度的荧光光谱。图2B显示用不同的ROS和RNS处理后化合物11的荧光强度的提高。通过将化合物7溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成2 µM溶液，获取光谱，其中激发和发射光谱分别在
547纳米和570纳米下。高活性氧物质羟基自由基(•OH)、次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根(ONOO−)的浓度为2 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为20 µM。

[0040] 图3A描绘了显示用不同量的过氧亚硝酸盐处理后的化合物22的荧光强度的荧光光谱。图3B显示用不同的ROS和RNS处理后化合物22的荧光强度的提高。通过将化合物22溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成5 µM溶液，获取光谱，其中激发和发射光谱分别在600纳米和617纳米下。高活性氧物质羟基自由基(•OH)、次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根(ONOO−)的浓度为5 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为50 µM。

[0041] 图4A描绘了显示用不同量的过氧亚硝酸盐处理后的化合物25的荧光强度的荧光光谱。图4B显示用不同的ROS和RNS处理后化合物25的荧光强度的提高。通过将化合物25溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成5 µM溶液，获取光谱，其中激发和发射光谱分别在650纳米和665纳米下。高活性氧物质羟基自由基(•OH)、次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根(ONOO−)的浓度为5 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为50 µM。

[0042] 图5A描绘了显示用不同量的过氧亚硝酸盐处理后的化合物30的荧光强度的荧光光谱。图5B显示用不同的ROS和RNS处理后化合物30在540纳米最大发射下的荧光强度的提高。通过将化合物30溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中并在515纳米下激发，获取光谱。
高活性氧物质次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根(ONOO−)的浓度为1 µM。羟基自由基(•OH)的浓度为1 µM或10 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为10 µM或100 µM（关于某些ROS和RNS的确切浓度，见图中）。

[0043] 图6显示在存在或不存在SIN-1（过氧亚硝酸盐发生剂）的情况下使用化合物6、7和8处理后的SH-SY5Y细胞的荧光显微术结果。SH-SY5Y细胞在存在或不存在SIN-1的情况下用不同化合物共染色1小时，然后迅速用PBS洗涤3次，并保存在无酚红色培养基中。左：无SIN-
1处理；右：存在SIN-1处理。

[0044] 图7显示在存在或不存在SIN-1（过氧亚硝酸盐发生剂）的情况下使用化合物14处理后的SH-SY5Y细胞的荧光显微术结果。SH-SY5Y细胞在存在或不存在SIN-1的情况下用不同化合物共染色1小时，然后迅速用PBS洗涤3次，并保存在无酚红色培养基中。左：无SIN-1处理；中：存在1 mM SIN-1处理；右：存在100 µM SIN-1处理。

[0045] 图8显示在SIN-1（过氧亚硝酸盐发生剂）存在下使用化合物20和21处理后的C17.2细胞的荧光显微术结果。细胞用化合物20或21以1 µM的浓度孵育，然后用（下方）或不用（上方）SIN-1处理。

[0046] 图9显示在存在或不存在SIN-1（过氧亚硝酸盐发生剂）的情况下使用化合物24处理后的SH-SY5Y细胞的荧光显微术结果。SH-SY5Y细胞在存在或不存在SIN-1的情况下用不同化合物共染色1小时，然后迅速用PBS洗涤3次，并保存在无酚红色培养基中。左：无SIN-1处理；中：存在100 µM SIN-1处理；右：存在200 µM SIN-1处理。

[0047] 图10显示Raw 264.7巨噬细胞在刺激条件下的荧光显微术结果。巨噬细胞用化合物27以500 nM的浓度孵育。上方：对照；下方：巨噬细胞用LPS和IFN-γ刺激14小时。左：用Hoechst核染色；中：化合物27；右：合并的。

[0048] 图11显示在SIN-1（过氧亚硝酸盐发生剂）存在下使用化合物32处理后的C17.2细胞的荧光显微术结果。细胞用化合物32以5 µM的浓度孵育。来自化合物32的红色信号和来自Mitotracker-Green的绿色信号的共定位表明化合物32选择性定位到细胞的线粒体中。

[0049] 图12显示筛选用化合物14清除过氧亚硝酸盐的药物的代表图。将SH-SY5Y细胞接种在96孔黑板中并用化合物14孵育。细胞然后在不同候选药物存在下用SIN-1处理。记录各孔的荧光强度并用于测定候选药物的清除活性。

[0050] 图13显示先体外后体内大鼠脑切片在SIN-1（过氧亚硝酸盐发生剂）存在的情况下使用化合物14处理后的荧光显微术结果。

[0051] 图14显示来自使用化合物14的乙醇处理或未处理小鼠（分别为乙醇组或假处理组）的肝样品切片的荧光显微术结果。

[0052] 定义

[0053] 为了利于理解本文中公开的主题，下面定义如本文中所用的许多术语、缩写或其它简写。没有定义的任何术语、缩写或简写被理解为具有技术人员在本申请提交同时使用的普通含义。

[0054] “氨基”是指可任选取代的伯、仲或叔胺。尤其包括作为杂环的成员的仲或叔胺氮原子。还尤其包括例如被酰基取代的仲或叔氨基。氨基的一些非限制性实例包括–NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H、烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、酰基、杂烷基、杂芳基或杂环基。

[0055] “烷基”是指含有碳和氢并可以是直链或支链的完全饱和非环一价基团。在一些实施方案中，烷基含有大约1至大约25个碳原子。烷基的实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正庚基、正己基、正辛基和正癸基。“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异戊基（isoamyl）、正戊基和异戊基（isopentyl）。

[0056] “杂烷基”是指烷基内的一个或多个碳原子被杂原子如O、S和N取代的烷基。在一些实施方案中，杂烷基包含一个或多个O原子。在另一些实施方案中，杂烷基包含一个或多个S原子。在另一些实施方案中，杂烷基包含一个或多个亚氨基（aminylene）。在某些实施方案中，杂烷基包含两个或更多个O、S、亚氨基（aminylene）或其组合。

[0057] “烯基”或“亚烯基”分别是指具有至少一个双键的一价或二价烃基。该烯基或亚烯基可以是环状、支链非环或直链非环的。在一些实施方案中，该烯基或亚烯基仅含一个双键。在另一些实施方案中，该烯基或亚烯基含有两个或更多个双键。在另一些实施方案中，该烯基或亚烯基可以是在主链中含有2至8个碳原子的低级烯基或亚烯基。在另一些实施方案中，该烯基或亚烯基可具有一个双键和最多25个碳原子，例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、己烯基等。

[0058] “炔基”或“亚炔基”分别是指具有至少三键的一价或二价烃基。在一些实施方案中，该炔基或亚炔基仅含一个三键。在另一些实施方案中，该炔基或亚炔基含有两个或更多个三键。在另一些实施方案中，该炔基或亚炔基可以是在主链中含有2至8个碳原子的低级炔基或亚炔基。在另一些实施方案中，该炔基或亚炔基可具有一个三键和最多20个碳原子，例如乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、己炔基等。

[0059] “芳族”或“芳族基团”是指芳基或杂芳基。

[0060] “芳基”是指任选取代的碳环芳基。在一些实施方案中，该芳基包括在环部分中含有6至12个碳原子的单环或双环基团，如苯基、联苯基、萘基、取代苯基、取代联苯基或取代萘基。在另一些实施方案中，该芳基是苯基或取代苯基。

[0061] “芳烷基”是指被芳基取代的烷基。芳烷基的一些非限制性实例包括苄基和苯乙基。

[0062] “烷芳基”是指被烷基取代的芳基。烷芳基的一些非限制性实例包括甲基苯基和甲基萘基。

[0063] “酰基”是指式−C(=O)H、−C(=O)−烷基、−C(=O)−芳基、−C(=O)−芳烷基或−C(=O)−烷芳基的一价基团。

[0064] “卤素”是指氟、氯、溴和碘。

[0065] “卤代”是指氟代、氯代、溴代和碘代。

[0066] “杂原子”是指非碳和氢的原子。

[0067] “杂环”或“杂环基”是指在至少一个环中具有至少一个杂原子，如O、S、N、B和P的任选取代的、完全饱和或不饱和的、单环或双环的、芳族或非芳族基团。芳族杂环基（即杂芳基）可以在环中具有1或2个氧原子、1或2个硫原子和/或1至4个氮原子，并可经由碳或杂原子键合到该分子的其余部分上。杂芳基的一些非限制性实例包括呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、噁唑基、吡咯基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基等。

[0068] “烃”或“烃基”是指完全由元素碳和氢构成的有机化合物或基团。烃基包括烷基、烯基、炔基和芳基。烃基还包括被其它脂族、环状或芳基烃基取代的烷基、烯基、炔基和芳基，如烷芳基、烯芳基和炔芳基。在一些实施方案中，“烃”或“烃基”包含1至30个碳原子。

[0069] “亚烃基”是指通过从烃中除去两个氢原子形成的二价基团，其自由价不接在双键中，例如亚芳基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳烷基或亚烷芳基。

[0070] 本文中用于描述化合物或化学基团的“取代”是指该化合物或化学基团的至少一个氢原子被第二个化学基团替代。取代基的非限制性实例是在本文中公开的示例性化合物和实施方案中发现的那些，以及卤素；烷基；杂烷基；烯基；炔基；芳基、杂芳基、羟基；烷氧基；氨基；硝基；巯基；硫醚；亚胺；氰基；酰胺基；膦酸根合(phosphonato)；膦；羧基；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；酮；醛；酯；氧代；卤代烷基（例如三氟甲基）；碳环环烷基，其可以是单环或稠合或非稠合多环（例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基），或杂环烷基，其可以是单环或稠合或非稠合多环（例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或噻嗪基）；碳环或杂环的、单环或稠合或非稠合多环芳基（例如苯基、萘基、吡咯基、吲哚基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、苯并咪唑基、苯并噻吩基或苯并呋喃基）；氨基（伯、仲或叔）；邻低级烷基；邻芳基、芳基；芳基-低级烷基；−CO2CH3；−CONH2；−OCH2CONH2；−NH2；−SO2NH2；−OCHF2；−CF3；−OCF3；–NH(烷基)；–N(烷基)2；–NH(芳基)；–N(烷基)(芳基)；–N(芳基)2；–CHO；–CO(烷基)；−CO(芳基)；−CO2(烷基)；和–CO2(芳基)；此类基团也可任选被稠环结构或桥例如−OCH2O−取代。这些取代基可任选被选自此类基团的取代基进一步取代。除非另行规定，本文中公开的所有化学基团都可被取代。例如，本文所述的“取代”烷基、烯基、炔基、芳基、烃基或杂环基是被烃基、取代烃基、杂原子或杂环取代的基团。此外，取代基可包括其中碳原子被杂原子如氮、氧、硅、磷、硼、硫或卤素原子取代的基团。这些取代基可包括卤素、杂环、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、羟基、保护的羟基、酮基、酰基、酰氧基、硝基、氨基、酰胺基、氰基、巯基、缩酮、缩醛、酯和醚。

[0071] “荧光”是指其中光子的分子吸收触发波长更长的另一光子的发射的发冷光。在一些实施方案中，吸收的光子在紫外线范围内，发射的光在可见光范围内。

[0072] “绿色荧光”是指其中光子的分子吸收触发具有在大约520纳米至大约570纳米范围内的更长波长的另一光子的发射的发冷光。

[0073] “黄色荧光”是指其中光子的分子吸收触发具有在大约570纳米至大约590纳米范围内的更长波长的另一光子的发射的发冷光。

[0074] “橙色荧光”是指其中光子的分子吸收触发具有在大约585纳米至大约620纳米范围内的更长波长的另一光子的发射的发冷光。

[0075] “红色荧光”是指其中光子的分子吸收触发具有在大约620纳米至大约740纳米范围内的更长波长的另一光子的发射的发冷光。

[0076] “远红荧光”是指其中光子的分子吸收触发具有在大约650纳米至大约740纳米范围内的更长波长的另一光子的发射的发冷光。

[0077] “荧光团”是指可以被光激发以发出荧光的小分子或大分子的一部分。在一些实施方案中，荧光团在被波长大约200纳米至大约1000纳米，或大约500纳米至大约800纳米的光激发时有效产生荧光。发射辐射的强度和波长通常取决于荧光团和荧光团的化学环境。荧光团可选自吖啶橙、蒽环、别藻蓝素、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙红、赤藓红、荧光胺、荧光素、FAM（羧基荧光素）、HEX（六氯荧光素）、JOE（6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素）、俄勒冈绿、藻青蛋白、藻红蛋白、若丹明、ROX（羧基-X-若丹明）、TAMRA（羧基四甲基若丹明）、TET（四氯-荧光素）、德克萨斯红、四甲基若丹明和黄嘌呤。另一些非限制性实例可见于The Handbook: a Guide to Fluorogenic Probes and Labeling Technologies（第10版, Molecular Probes, Eugene, Orgeon, 2006），其并入本文作为参考。

[0078] “反应性基团”或“Rg”是指对胺、硫化物(thio)、醇、醛或酮具有高反应性的基团。反应性基团的一些非限制性实例包括亚磷酰胺、羧酸的琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、全氟苯甲酰胺基和叠氮基全氟苯甲酰胺基。

[0079] “缀合物质”或“Cg”是指需要缀合并通常具有适合与各自的反应性基团Rg共价反应的官能团的所需物质。缀合物质的一些非限制性实例包括抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质等的缀合物。

[0080] “活性氧物质”或ROS是指含氧离子、自由基以及非自由基物类。活性氧物质的一些非限制性实例包括1O2、O2•−­、ROO­•、•OH­、OCl−­和H2O2。

[0081] “活性氮物质”或RNS是指含氮离子、自由基以及非自由基物类。活性氮物质的一些非限制性实例包括一氧化氮（NO•）、二氧化氮（NO2•）、亚硝酸根（NO2-）和过氧亚硝酸根（ONOO−）。

[0082] “荧光探针（Fluorogenic probe）”是指潜在荧光（Fluorogenic）分子，其荧光在与靶标反应之前保持“关闭”状态并可以在与靶标反应后切换至“打开”状态。

[0083] “过氧亚硝酸盐荧光（fluorogenic）化合物”是指可与过氧亚硝酸盐反应产生荧光信号的化合物。在某些实施方案中，本发明的过氧亚硝酸盐荧光化合物与过氧亚硝酸盐基本反应。

[0084] “过氧亚硝酸盐特异性的荧光化合物”或“特异性检测过氧亚硝酸盐的荧光化合物”是指以比任何其它ROS和RNS高大约10%、高大约15%、高大约20%、高大约25%、高大约30%、高大约35%、高大约40%、高大约45%、高大约50%、高大约55%、高大约60%、高大约65%、高大约70%、高大约75%、高大约80%、高大约85%、高大约90%、高大约95%、高大约100%、高大约200%、高大约300%或高大约500%的收率与过氧亚硝酸盐反应的荧光化合物。

[0085] “反应”、“添加”等是指使一种反应物、试剂、溶剂、催化剂、反应性基团等与另一反应物、试剂、溶剂、催化剂、反应性基团等接触。反应物、试剂、溶剂、催化剂、反应性基团等可以单独、同时或分开添加并可以以任何次序添加。它们可以在存在或不存在热的情况下添加并可任选在惰性气氛下添加。在一些实施方案中，“反应”是指原位形成或分子内反应，其中反应性基团在相同分子中。

[0086] “基本反应”是指反应的反应物至少消耗大于大约75摩尔%、大于大约80摩尔%、大于大约85摩尔%或大于大约90摩尔%的量。在一些实施方案中，“基本反应”是指反应物消耗大于大约95摩尔%。在另一些实施方案中，“基本反应”是指反应物消耗大于大约97摩尔%。在另一些实施方案中，“基本反应”是指反应物消耗大于大约99摩尔%。

[0087] “高通量方法”是指可以自主处理或评估大量样品的方法。在一些实施方案中，在高通量方法中可以使用并执行信息学系统。该信息学系统可提供用于该高通量方法的物理装置的软件控制，以及组织并存储该高通量方法生成的电子数据。

[0088] 详述

[0089] 本发明提供了用于灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐的一类荧光化合物和探针。本发明的示例性的荧光化合物和探针利用二芳基胺笼的荧光化合物与过氧亚硝酸盐之间的N-脱芳基反应实现用于检测水溶液中的过氧亚硝酸盐（超过其它活性氧和氮物质（ROS/
RNS））的高灵敏度和选择性。示例性的荧光化合物包括产生荧光色，如绿色、黄色、红色或远红色的化合物。在本文中还提供了用于选择性染色活细胞的线粒体中的过氧亚硝酸盐的荧光化合物。

[0090] 本发明的荧光化合物可用于直接或间接测量化学和生物样品，如生物活体中的细胞和组织中的过氧亚硝酸盐的量，因此充当用于研究细胞过氧亚硝酸盐的生理学和病理学作用的有力工具。

[0091] 化合物

[0092] 一般方面

[0093] 一方面，本发明提供荧光化合物。在一个实施方案中，本发明的荧光化合物由式(I)或(II)表示：

[0094]

[0095]

[0096] 或其互变异构体；

[0097] 其中N是氮原子并经由单共价键连接到Q和R1上；

[0098] R1是H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基氨基、烷氧基氨基、烷基酰胺基、烷氧基酰胺基或酰基；

[0099] R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰胺基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、硝基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO3H)、磺酸酯、磺酰胺、−C(=O)−P1或−C(=O)−M−P2；

[0100] P1和P2各自独立地为氢、卤素、烷氧基、羟基、巯基、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、杂烷基、烷基三苯基鏻或具有3至7个环原子的杂环基；M是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳烷基或亚烷芳基；

[0101] A是OR10或NR11R12；

[0102] 其中R10是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、酰基或氨基羰基；

[0103] 其中R11和R12各自独立地为H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷氧基、酰基、羧基烷基、磺基烷基、羧基烷基的盐、磺基烷基的盐、或羧基烷基或磺基烷基的酯或酰胺；或R11与R12结合形成饱和5-或6-元杂环，其是哌啶、吗啉、吡咯烷或哌嗪，它们各自任选被烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯取代；或R11与R4结合，或R12与R3结合，或这两者形成饱和或不饱和或进一步与芳基或杂芳基环稠合并任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸(-SO3H)或它们的盐、酯或酰胺衍生物取代的5-或6-元环；

[0104] B是O或N+R11R12；

[0105] Z是O、S、NR13、CR13R14、SiR13R14、GeR13R14或SnR13R14；

[0106] 其中R13和R14各自独立地为H、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟烷基、氨基烷基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO3H)、磺酸酯、磺酰胺、羧酸、羧酸酯或羧酰胺；或R13与R14结合形成任选被烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯取代的饱和5-或6-元杂环；

[0107] R8是H、CF3、CN、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯；或R8是任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代的饱和或不饱和烷基，其中R15和R16各自代表任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或烷基三苯基鏻取代的饱和或不饱和的环烷基或非环烷基；或R8具有式

[0108]

[0109] 其中R17、R18、R19、R20和R21各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、羧酸、羧酸盐、磺酸15 15 16
(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R )、磺酰胺(-SO2NR R )、羟基、叠氮化物、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、烷基羰基烷基、卤代烷基羰基烷基，如三氟甲基羰基烷基、氨基烷基、羧基烷基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基酰胺基，其烷基或芳基任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代；或R17和R18一起、R18和R19一起、R19和R20一起、或R20和R21一起形成式(III)的与苯基环稠合的5-或6-元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环部分，其任选进一步被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代；

[0110] R9是H、羟基、CN或烷氧基；或R8与R9结合形成5-元螺内酯或螺内酰胺环或5-元螺磺内酰胺环；或R9与R17或R21结合形成5-或6-元螺内酯或螺内酰胺环或5-或6-元螺磺内酯或螺磺内酰胺环，其任选并独立地被H、F或CH3取代；具体而言，R9，在与R8结合形成5-元螺内酯或螺内酰胺环或5-元螺磺内酰胺环时，是氧或取代氮；且

[0111] Q是具有式(IV)的取代苯基：

[0112]

[0113] 其中R22、R23、R24、R25和R26各自独立地为H、羟基、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、烷基羰基烷基、卤代烷基羰基烷基，如三氟甲基羰基烷基、氨基烷基、羧基烷基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基酰胺基，其烷基或芳基任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代；或R22和R23一起、R23和R24一起、R24和R25一起、或R25和R26一起形成式(IV)的与苯基环稠合的5-或6-元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环部分，其任选进一步被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO3H)、磺酸酯(-SO3R15)或磺酰胺(-SO2NR15R16)取代。

[0114] 在某些实施方案中，Q是取代苯基，其可以被某些活性氧或氮物质，如过氧亚硝酸盐和次氯酸氧化，以释放高荧光的荧光团。在一个实施方案中，R22、R24或R26之一是可以有效22 24 26 27
和选择性地与过氧亚硝酸盐反应的基团。在某些具体实施方案中，R 、R 或R 之一是OR 、CH2CH2COR28或NR29R30；其中R27是氢或选自烷基、烷氧基烷基、烷酰基和聚醚的基团；R28是选自CF3、卤素取代的低级烷基（例如CFnH3-n，其中n是1、2或3）或(C=O)–O–W1的吸电子基团，其中W1是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳基烷基的基团；R29
30
和R 独立地为氢或选自如下的基团：氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、芳酰基或聚醚的基团。R24优选是可以有效和选择性地与过氧亚硝酸盐反应的基团，如OR27、CH2CH2COR28或NR29R30。在一个优选实施方案中，R24是CH2CH2CF3、CH2CH2COCOOMe或OH。

[0115] 在一个优选实施方案中，式(I)或(II)的R1是CH3。

[0116] 在一个实施方案中，本发明的荧光化合物与过氧亚硝酸盐基本反应以生成如下所示的高荧光N -脱芳基产物(I’)或(II’)以及，随之荧光提高。

[0117]

[0118]

[0119] 具有改进的细胞内保留的绿色荧光探针

[0120] 在某些实施方案中，本发明提供具有改进的细胞内保留、保持用于过氧亚硝酸盐检测的灵敏度和选择性的绿色荧光化合物。在具体实施方案中，本发明提供的具有改进的细胞内保留的绿色荧光探针具有下式(V)

[0121]

[0122] 其中R1 – R7、R17 – R21和Q如式(I)或(II)中所定义。在某些实施方案中，R17、R18、R19和R20的至少一个是羧基。在某些实施方案中，R21是H、CH3、OMe或COOH。在某些实施方案中，式(V)的顶部苯基环上的羧基进一步经酰胺键与亚氨基二烷基羧酸（HN((CH2)nCOOH)2，n = 1、2或3）缀合。

[0123] 在某些实施方案中，当式(V)的R21是COOH时，该化合物具有式(V’)，并在式(V’)和式(VI)之间存在如下所示的互变异构化。

[0124]

[0125] 式(V’)和(VI)中的取代基（R1 – R7、R17 – R20和Q）的定义与式(V)的那些相同。

[0126] 在某些实施方案中，式(V)、(V’)和(VI)中的游离羧基任选用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM）酯化以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。在某些实施方案中，式(V)、(V’)和(VI)中的游离酚基任选被乙酰基、丙酰基或丁酰基酰化或被乙酰氧基甲基（AM）保护以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。

[0127] 在某些实施方案中，式(V)、(V’)和(VI)的R2 – R7独立地为H。在某些实施方案中，4 7
式(V)、(V’)和(VI)的R和R是F或Cl。

[0128] 在某些实施方案中，式(V)、(V’)和(VI)的R19是羧基或羧酸甲酯或乙酯。在某些实施方案中，式(V)、(V’)和(VI)的R19是进一步经酰胺键与亚氨基二烷基羧酸（HN((CH2)nCOOH)2，n = 1、2或3）或亚氨基二烷基羧酸二甲酯或二乙酯缀合的羧基。

[0129] 在具体实施方案中，绿色荧光化合物1-10的示例性物类显示在图式1中。

[0130] 图式1 - 用于过氧亚硝酸盐检测的绿色荧光化合物

[0131]

[0132]

[0133] 在一个具体实施方案中，本发明提供用于检测化学（非生物）系统中的过氧亚硝酸盐的绿色荧光化合物，其中该化合物包含一个或多个游离羧酸基。在另一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的绿色荧光化合物，其中该化合物包含羧酸基的一种或多种酯衍生物。

[0134] 例如，包含游离羧酸的化合物1-5优选用于化学的非生物系统，而它们相应的酯衍生物6-10优选用于生物学测定。

[0135] 黄色荧光探针及其线粒体-靶向类似物

[0136] 在某些实施方案中，本发明提供用于过氧亚硝酸盐检测的黄色荧光化合物。

[0137] 在具体实施方案中，本发明提供的具有黄色荧光色的荧光探针具有下式(VII)

[0138]

[0139] 其中R1 – R7、R11 – R12、R17 – R21和Q如式(I)或(II)中所定义。

[0140] 在某些实施方案中，R21是H、CH3、OMe或COOH。

[0141] 在某些实施方案中，当式(VII)的R21是COOH时，该化合物具有式(VII’)，并在式(VII’)和式(VIII)之间存在如下所示的互变异构化。

[0142]

[0143] 式(VII’)和(VIII)中的取代基（R1 – R7、R11 – R12、R17 – R20和Q）的定义与式(VII)的那些相同。

[0144] 在某些实施方案中，R11与R4结合，或R12与R3结合，或这两者形成饱和或不饱和或可以进一步与芳基或杂芳基环稠合并可以任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸(-SO3H)或它们的盐、酯或酰胺衍生物取代的5-或6-元环。

[0145] 在某些实施方案中，式(VII)、(VII’)和(VIII)中的游离羧基任选用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM）酯化以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。

[0146] 在某些实施方案中，本发明提供的具有式(VII)的具有黄色荧光色的荧光探针可选择性定位到活细胞的线粒体中，其中具有式(VII)的探针的净电荷为正。在这些实施方案
21
中，式(VII)的R 优选为H、CH3或OMe。

[0147] 在某些实施方案中，当具有式(VII)的探针的净电荷为正时，通过由符号Ω表示的生物相容的抗衡离子的存在平衡探针的正电荷。生物相容的抗衡离子是本领域中公知的并在本文中被称作对生物分子无毒无害的阴离子。Ω的非限制性实例包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、烷磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、四苯基硼离子、硝酸根和芳族或脂族羧酸的阴离子。本文所用的优选抗衡离子Ω是氯离子、碘离子和高氯酸根。

[0148] 在某些实施方案中，具有式(VII)的线粒体定位探针可以不可逆地将活细胞的线粒体染色，其中R17 – R20的至少一个是烷基化基团（AG）。AG是可以直接或通过酶的催化与细胞内亲核体，如谷胱甘肽或含半胱氨酸的蛋白质反应形成大分子缀合物的反应性位点。
AG优选具有式CR31R32X，其中R31和R32独立地为H和CH3，且X是Cl、Br或I。

[0149] 在某些实施方案中，本发明提供的具有黄色荧光色的荧光探针具有下式(IX)或(X)

[0150]

[0151] 其中R1 – R3、R5 – R7、R11 – R12、R17 – R21和Q如式(I)或(II)中所定义。

[0152] 在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R12是C1-10烷基或烯烃。在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R12是在末端位置被羧基取代的C1-10烷基或烯烃。在优选实施方案中，R12是乙基、羧基甲基、羧基乙基或羧基丙基。在某些实施方案中，式(IX)和(X)的R12中的末端羧基用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM）酯化以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。

[0153] 在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R2、R3、R5、R6和R7独立地为H。在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R7是F或Cl。

[0154] 在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R21是COOH、H、CH3或OMe。

[0155] 在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R17、R18、R19和R20独立地为H。在某些实施方案中，式(IX)和(X)中的R17、R18、R19和R20的至少一个是烷基化基团，优选氯甲基（CH2Cl）。

[0156] 在具体实施方案中，黄色荧光化合物11-21的示例性物类显示在图式2中。

[0157] 图式2 - 用于过氧亚硝酸盐检测的黄色荧光化合物

[0158]

[0159]

[0160]

[0161]

[0162] 化合物11-13与过氧亚硝酸盐反应产生具有在大约570纳米的最大发射的强黄色荧光信号，并在化学（非生物）系统中表现出对过氧亚硝酸盐强于对其它ROS和RNS的高选择性。

[0163] 在一个具体实施方案中，本发明提供用于检测化学（非生物）系统中的过氧亚硝酸盐的黄色荧光化合物，其中该化合物包含一个或多个游离羧酸基。在另一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的黄色荧光化合物，其中该化合物包含羧酸基的一种或多种内酯和酯衍生物。

[0164] 在再一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的选择性定位在活细胞的线粒体中的黄色荧光化合物，其中该化合物包含至少一个正净电荷。

[0165] 例如，化合物11-13优选用于化学的非生物系统中的过氧亚硝酸盐的检测；而相应的内酯和酯衍生物14-19优选用于生物学测定。带正电荷的荧光探针20-21用于非生物和生物系统中的过氧亚硝酸盐的检测。在应用于生物系统以检测过氧亚硝酸盐时，带正电荷的荧光探针20-21选择性定位到活细胞的线粒体中。

[0166] 红色荧光探针

[0167] 在某些实施方案中，本发明提供了用于过氧亚硝酸盐检测的红色荧光化合物。基于Si-荧光素支架的红色荧光化合物有效地与过氧亚硝酸盐反应以提供具有在大约620纳米的最大发射的强红色荧光信号。该红色荧光化合物还表现出对过氧亚硝酸盐强于对其它ROS和RNS的高选择性。

[0168] 在具体实施方案中，本发明提供的具有红色荧光色的荧光探针具有下式(XI)

[0169]

[0170] 其中R1 – R7、R13 – R14、R17 – R21和Q如式(I)或(II)中所定义；且其中在某些实施方案中，Y是Si、Ge或Sn。R13和R14优选独立地为CH3或苯基。

[0171] 在某些实施方案中，R17、R18、R19和R20的至少一个是羧基。在某些实施方案中，R21是H、CH3、OMe或COOH。在某些实施方案中，式(XI)的顶部苯基环上的羧基进一步经酰胺键与亚氨基二烷基羧酸（HN((CH2)nCOOH)2，n = 1、2或3）缀合。

[0172] 在某些实施方案中，当式(XI)的R21是COOH时，该化合物具有式(XI’)，并在式(XI’)和式(XII)之间存在如下所示的互变异构化。

[0173]

[0174] 式(XI’)和(XII)中的取代基（R1 – R7、R13 – R14、R17 – R20、Y和Q）的定义与式(XI)的那些相同。

[0175] 在某些实施方案中，式(XI)、(XI’)和(XII)中的游离羧基任选用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM）酯化以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。在某些实施方案中，式(XI)、(XI’)和(XII)中的游离酚基任选被乙酰基、丙酰基或丁酰基酰化或被乙酰氧基甲基（AM）保护以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。

[0176] 在某些实施方案中，式(XI)、(XI’)和(XII)的R2 – R7独立地为H。在某些实施方案中，式(XI)、(XI’)和(XII)的R4和R7是F或Cl。

[0177] 在某些实施方案中，式(XI)、(XI’)和(XII)的R19是羧基或羧酸甲酯或乙酯。在某些实施方案中，式(XI)、(XI’)和(XII)的R19是进一步经酰胺键与亚氨基二烷基羧酸（HN((CH2)nCOOH)2，n = 1、2或3）或亚氨基二烷基羧酸二甲酯或二乙酯缀合的羧基。

[0178] 在具体实施方案中，红色荧光化合物22-24的示例性物类显示在图式3中。

[0179] 图式3 - 用于过氧亚硝酸盐检测的红色荧光化合物

[0180]

[0181] 在一个具体实施方案中，本发明提供用于检测化学（非生物）系统中的过氧亚硝酸盐的红色荧光化合物，其中该化合物包含一个或多个游离羧酸基。在另一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的红色荧光化合物，其中该化合物包含羧酸基的一种或多种酯衍生物。

[0182] 例如，包含游离羧酸的化合物22-23优选用于化学的非生物系统，而它们相应的酯衍生物24优选用于生物学测定。

[0183] 远红荧光探针及其线粒体-靶向类似物

[0184] 在某些实施方案中，本发明提供用于过氧亚硝酸盐检测的远红荧光化合物。

[0185] 在具体实施方案中，本发明提供的具有远红荧光色的荧光探针具有下式(XIII)

[0186]

[0187] 其中R1 – R7、R11 – R14、R17 – R21和Q如式(I)或(II)中所定义；且其中在某些实施方案中，Y是Si、Ge或Sn。R13和R14优选独立地为CH3或苯基。

[0188] 在某些实施方案中，R21是H、CH3、OMe或COOH。

[0189] 在某些实施方案中，当式(XIII)的R21是COOH时，该化合物具有式(XIII’)，并在式(XIII’)和式(XIV)之间存在如下所示的互变异构化。

[0190]

[0191] 式(XIII’)和(XIV)中的取代基（R1 – R7、R11 – R14、R17 – R20、Y和Q）的定义与式(XIII)的那些相同。

[0192] 在某些实施方案中，R11与R4结合，或R12与R3结合，或这两者形成饱和或不饱和或可以进一步与芳基或杂芳基环稠合并可以任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸(-SO3H)或它们的盐、酯或酰胺衍生物取代的5-或6-元环。

[0193] 在某些实施方案中，式(XIII)、(XIII’)和(XIV)中的游离羧基任选用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM）酯化以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。

[0194] 在某些实施方案中，当具有式(XIII)的探针的净电荷为正时，本发明提供的具有式(XIII)的具有远红荧光色的荧光探针可选择性定位到活细胞的线粒体中。在进一步实施方案中，式(XIII)的R21优选为H、CH3或OMe。在某些实施方案中，当具有式(XIII)的探针的净电荷为正时，通过由符号Ω表示的生物相容的抗衡离子的存在平衡探针的正电荷。生物相容的抗衡离子是本领域中公知的并在本文中被称作对生物分子无毒无害的阴离子。Ω的非限制性实例包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、烷磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、四苯基硼离子、硝酸根和芳族或脂族羧酸的阴离子。本文所用的优选抗衡离子Ω是氯离子、碘离子和高氯酸根。

[0195] 在某些实施方案中，具有式(XIII)的线粒体定位探针可以不可逆地将活细胞的线粒体染色，其中R17 – R20的至少一个是烷基化基团（AG）。AG是可以直接或通过酶的催化与细胞内亲核体，如谷胱甘肽或含半胱氨酸的蛋白质反应形成大分子缀合物的反应性位点。AG优选具有式CR31R32X，其中R31和R32独立地为H和CH3，且X是Cl、Br或I。

[0196] 在某些实施方案中，本发明提供的具有远红荧光色的荧光探针具有下式(XV)或(XVI)

[0197]

[0198] 其中R1 – R3、R5 – R7、R13 – R14、R17 – R21和Q如式(I)或(II)中所定义，且其中在某些实施方案中，Y是Si、Ge或Sn。

[0199] 在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R12是C1-10烷基或烯烃。在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R12是在末端位置被羧基取代的C1-10烷基或烯烃。在优选实施方案中，R12是乙基、羧基甲基、羧基乙基或羧基丙基。在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)的R12中的末端羧基用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM）酯化以赋予带负电荷的荧光探针细胞膜渗透性。

[0200] 在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R2、R3、R5、R6和R7独立地为H。在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R7是F或Cl。

[0201] 在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R21是COOH、H、CH3或OMe。

[0202] 在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R17、R18、R19和R20独立地为H。在某些实施方案中，式(XV)和(XVI)中的R17、R18、R19和R20的至少一个是烷基化基团，优选氯甲基（CH2Cl）。

[0203] 在具体实施方案中，远红荧光化合物25-29的示例性物类显示在图式4中。

[0204] 图式4 - 用于过氧亚硝酸盐检测的远红荧光化合物

[0205]

[0206]

[0207] 在一个具体实施方案中，本发明提供用于检测化学（非生物）系统中的过氧亚硝酸盐的远红荧光化合物，其中该化合物包含一个或多个游离羧酸基。在另一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的远红荧光化合物，其中该化合物包含羧酸基的一种或多种内酯和酯衍生物。

[0208] 在再一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的选择性定位在活细胞的线粒体中的远红荧光化合物，其中该化合物包含至少一个正净电荷。

[0209] 例如，图式4中所示的荧光化合物25-26可用于检测过氧亚硝酸盐的化学（非生物）系统。在另一具体实施方案中，带正电荷的荧光化合物27-29可用于体外或体内生物学测定中的过氧亚硝酸盐检测。在再一具体实施方案中，本发明提供用于在体外或体内生物学测定中检测过氧亚硝酸盐的选择性定位在活细胞的线粒体中的远红荧光化合物28-29，其中该化合物在进入细胞后包含至少一个正净电荷。

[0210] 线粒体-靶向荧光探针

[0211] 线粒体是活性氧物质（ROS），包括过氧亚硝酸盐的主要发生器和靶标。用于过氧亚硝酸盐检测的线粒体-靶向荧光探针的发展因此对阐明和理解过氧亚硝酸盐的生成、代谢和生物效应是重要的。此外，线粒体-靶向探针促进探针积聚在线粒体中，因此有效避免探针泄漏问题。

[0212] 使分子靶向活细胞的线粒体的一种方法是使该分子与具有一个正电荷和大的疏水表面积的三苯基鏻（TPP）头基缀合。所得缀合物被负电势吸引穿过内线粒体膜，因此数百倍积聚到线粒体中。

[0213] 在某些实施方案中，本发明提供用于靶向线粒体并同时检测过氧亚硝酸盐的荧光化合物。该线粒体-靶向化合物保持对过氧亚硝酸盐检测的灵敏度和选择性，并将活细胞的线粒体中的过氧亚硝酸盐选择性染色。

[0214] 在某些实施方案中，通过经简单的酰胺键连接使探针在探针的游离羧基处与带正电荷的三苯基鏻基团缀合，可以使用于检测过氧亚硝酸盐的上述荧光探针选择性靶向活细胞的线粒体。在某些实施方案中，探针与三苯基鏻基团之间的连接具有下式(XVII)或(XVIII)

[0215]

[0216] 其中n = 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

[0217] 在某些实施方案中，三苯基鏻基团可以在探针的任何游离羧基处缀合到该荧光探针上。在具体实施方案中，用于过氧亚硝酸盐检测的线粒体-靶向的荧光化合物30-33的一些非限制性实例显示在图式5中。

[0218] 图式5 - 用于过氧亚硝酸盐检测的线粒体-靶向的荧光化合物

[0219]

[0220]

[0221] 在一个实施方案中，本发明不包括美国专利申请序列号No. 12/417,672中描述的化合物或荧光化合物和探针。

[0222] 探针缀合物

[0223] 在一些实施方案中，式(I)或(II)的化合物组中的至少一种被反应性基团(Rg)或缀合基团(Cg)取代，其中Rg或Cg任选经连接基团–L–连接到本文中公开的芳胺化合物上。在另一些实施方案中，本文中公开的化合物组的至少一种被–L–Rg或–L–Cg基团取代。

[0224] 在一些实施方案中，L是或包含键或连接基团，如O、S、亚氨基（例如NR基团，其中R是H、烷基、烯基、炔基、羧基、酰基、芳基或杂环基）、磺酰基、有机连接基团或其组合。本文中公开的有机连接基团可以是连接任何两个片段的二价有机连接基团。

[0225] 二价有机连接基团的一些非限制性实例包括羰基、亚烷基、亚芳基、二价杂环基团及其组合。二价有机连接基团的另一非限制性实例包括-(CH2)m-基团，其中m是1至50的整数，包括1和50在内，一个或多个亚甲基任选被O、S、N、C、B、Si、P、C=O、O=S=O、杂环基、芳基、NRa基团、CRb基团、CRcRd基团、SiReRf基团、BRg基团或P(=O)Rh基团替代，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、Rg和Rh各自独立地为键、H、羟基、巯基、羧基、氨基、卤素、酰基、烷氧基、烷基硫烷基、烯基如乙烯基、烯丙基和2-苯基乙烯基、炔基、杂环基、芳基、环基团如环烷基、杂环基和苯并基团的一部分，或烷基，其中该烷基的一个或多个氢任选被芳基、羟基、巯基、羧基、氨基或卤素替代。亚氨基的非限制性实例包括NR基团，其中R是H、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基和杂环基。

[0226] 在某些实施方案中，该有机连接基团可具有3或更大的化合价，因此可连接任何3个或更多个片段。具有3的化合价的有机连接基团的一个非限制性实例是通过用CRb基团替代-(CH2)m-基团中的亚甲基而制成的三价有机连接基团。化合价为4的有机连接基团的另一非限制性实例是通过用碳原子替代-(CH2)m-基团中的亚甲基而制成的四价有机连接基团。

[0227] 化合价为3的有机连接基团的另一非限制性实例是通过用N、P或B替代-(CH2)m-基团中的亚甲基而制成的三价有机连接基团。化合价为4的有机连接基团的另一非限制性实例是通过用两个CRb基团替代-(CH2)m-基团中的两个亚甲基而制成的四价有机连接基团。基于本文中的公开，本领域技术人员可通过至少用具有3或更大的化合价的原子或基团，如N、P、B、C、Si、CRb基团、化合价大于2的芳基和化合价大于2的杂环基替代-(CH2)m-基团中的至少一个亚甲基而制造化合价大于2的有机连接基团。

[0228] 在另一些相关实施方案中，该有机连接基团可包含至少不饱和键，如-CRb=N-键、双键或三键。具有双键的有机连接基团的一个非限制性实例是通过用两个CRb基团替代-(CH2)m-基团中的两个相邻亚甲基而制成的不饱和有机连接基团。该双键位于两个相邻CRb基团之间。具有三键的有机连接基团的另一非限制性实例是通过用两个碳原子分别替代-(CH2)m-基团中的两个相邻亚甲基而制成的不饱和有机连接基团。该三键位于两个相邻碳原子之间。具有-CRb=N-键的有机连接基团的另一非限制性实例是通过用一个CRb基团和N原子替代-(CH2)m-基团中的两个相邻亚甲基而制成的不饱和有机连接基团。基于本文中的公开，本领域技术人员可通过各自独立地用选自N、P、B、C、Si、CRb基团、化合价大于2的芳基和化合价大于2的杂环基的原子或基团替代-(CH2)m-基团中的至少一对相邻亚甲基而制造具有至少不饱和键的有机连接基团。

[0229] 具有反应性基团(Rg)的化合物可包含多种多样的有机或无机物质，其含有或被改性为含有至少一个对Rg基团具有合适的反应性的官能团，其产生由–Cv-Rg表示的反应性基团(Rg)的化学连接。在一些实施方案中，反应性基团(Rg)和官能团分别是可反应生成共价连接的亲电体和亲核体。反应性基团(Rg)与缀合物质(Cg)处的官能团之间的缀合反应导致反应性基团(Rg)的一个或多个原子并入将具有反应性基团(Rg)的化合物与缀合物质(Cg)连接的连接基Cv中。反应性基团(Rg)和各自的官能团的一些非限制性实例列在表1中。该制表无意包括化学反应性，因为在溶剂、助溶剂、化学计量比、温度、压力、反应时间、pH、催化剂等的适当选择下，可以使其它官能团与本文中公开的反应性位点反应，并可以使本文中公开的官能团与其它反应性位点反应。合适的反应性基团(Rg)的一些非限制性实例包括丙烯酰胺、酰基叠氮化物、酰基卤化物、腈、醛、酮、烷基卤化物、烷基磺酸酯、酐、芳基卤化物、炔烃、醇、胺、羧酸、碳二亚胺、重氮烷烃、环氧化物、卤代乙酰胺、羟胺、肼、酰亚氨基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酸酯或磺酰卤。

[0230] 表1.

[0231]

[0232]

[0233] 本文中公开的化合物中的反应性基团可用于制备带有适合共价连接两者的官能团的任何缀合物质。合适的缀合物的一些非限制性实例包括抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质等的缀合物。用于将本文中公开的化合物连接到要缀合的物质上的反应性基团的选择取决于要缀合的物
质上的官能团和所需共价连接的类型或长度。通常存在于该物质上的官能团的类型包括，但不限于，胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、磷酸酯、咪唑、肼、羟胺或这些基团的组合。

[0234] 化合物的合成

[0235] 本发明的荧光化合物可以由本领域技术人员用已知的有机合成法以及本文中和美国专利申请US 8,148,423和US 8,114,904（全文并入本文作为参考）中公开的各种通用或具体合成程序制造。

[0236] 通常，用于合成本化合物(I)和(II)的关键步骤包括如下列图式6中所示的酚的活化，通常三氟甲磺酸化，和随后胺化。

[0237] 图式6 – 化合物(I)和(II)的通用合成策略

[0238]

[0239]

[0240] 其中R1 – R9、A、B、Z和Q如上定义；Tf是三氟甲磺酰基；Pd-cat.是用于形成C-N键的钯-配体催化体系。首先，通过与三氟甲磺酰基给体试剂，通常三氟甲磺酸酐反应，活化(I’’)或(II’’)的酚式OH基团，以形成三氟甲磺酸酯基团。然后该三氟甲磺酸酯基团与具有式HNR1Q的胺在催化剂，如Pd催化剂存在下发生交联反应，以形成具有式( )或(II)的本化合物。

[0241] 探针用于灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐的用途

[0242] 本发明还提供该化合物作为用于体外和/或体内检测、测量和筛选过氧亚硝酸盐的荧光探针的用途。在一个实施方案中，相对于任何其它活性氧物质和活性氮物质，本发明特异性检测过氧亚硝酸盐。

[0243] 在一个实施方案中，本发明的荧光化合物灵敏地检测以低于10 μM的浓度或低于10 μM，如低于8 μM、低于6 μM、低于4 μM、低于2 μM、低于1.6 μM、低于1.2 μM、低于0.8 μM、低于0.4 μM、低于0.2 μM、低于0.1 μM、低于0.05 μM或低于0.01 μM的任何浓度存在于含水样品中的过氧亚硝酸盐。

[0244] 在某些实施方案中，本发明提供荧光探针组合物，其包含本发明的荧光化合物和任选载体、溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。

[0245] 该荧光化合物和探针组合物可配制成用于直接或间接测量化学或生物样品中的过氧亚硝酸盐的试剂组合物。在一个具体实施方案中，该荧光化合物和探针配制成荧光细胞检测试剂盒。

[0246] 在本文中还提供了检测样品中过氧亚硝酸盐的存在或测量样品中的过氧亚硝酸盐含量的方法。在一些实施方案中，该方法包括步骤(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与样品接触以形成荧光化合物；和(b) 测量所述荧光化合物的荧光性质。在一些实施方案中，用本文中公开的方法或本领域技术人员已知的任何方法测量荧光性质。

[0247] 在本文中还提供了用于检测样品中的过氧亚硝酸盐的高通量筛选荧光法。在一些实施方案中，该高通量筛选荧光法包括步骤(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与样品接触以形成一种或多种荧光化合物；和(b) 测量所述荧光化合物的荧光性质。

[0248] 在本文中还提供了用于筛选一种或多种可提高或降低过氧亚硝酸盐含量的目标化合物的高通量方法。在一些实施方案中，该用于检测过氧亚硝酸盐的高通量筛选方法包括步骤：(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与样品接触以形成一种或多种荧光化合
物；和(b) 测量所述荧光化合物的荧光性质以测定样品中过氧亚硝酸盐的量。

[0249] 合适的样品包括，但不限于，化学（非生物）样品和生物样品。合适的生物样品包括，但不限于，含有单细胞或单细胞生物、微生物、细胞、组织和活体（优选动物，包括人类）器官的样品。

[0250] 在一些实施方案中，该高通量方法包括步骤(a) 使本文中公开的荧光化合物或探针与一种或多种靶标化合物接触以形成一种或多种荧光化合物；和(b) 测量所述荧光化合物的荧光性质以定量或定性测定该靶标化合物。在另一些实施方案中，用本文中公开的方法或本领域技术人员已知的任何方法测量荧光性质。

[0251] 在一些实施方案中，在本文中公开的高通量方法中可以使用并执行信息学系统。在另一些实施方案中，该信息学系统提供用于该高通量方法的物理装置的软件控制。在另一些实施方案中，该信息学系统组织该高通量方法生成的电子数据。在另一些实施方案中，该信息学系统存储该高通量方法生成的电子数据。

[0252] 在某些实施方案中，线粒体-靶向的荧光化合物用于将细胞线粒体中的过氧亚硝酸盐选择性染色。此外，用于检测、测量和/或筛选过氧亚硝酸盐的方法可以体外或体内进行以研究过氧亚硝酸盐的生理效应。

[0253] 荧光化合物的用途还包括各种有据可查的用途，如缀合物质的量热标签（calorimetric labels），或用于荧光共振能量转移（FRET）技术。此类用途的一些非限制性实例描述在美国专利No. 6,399,392；和The Handbook: a Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版, Molecular Probes, 2006中，两者都并入本文作为参考。
实施例

[0254] 下面是例示实施本发明的实施方案的实施例。该详细公开落在本文中公开的合成图式或程序的范围内并用于示例本文中公开的合成图式或程序，后者构成本公开的一部分。这些实施例、附图和图式仅用于示例目的，并且无意限制本公开的范围。除非另行指明，所有百分比按重量计，所有溶剂混合物比例按体积计。

[0255] 实施例1 – 绿色荧光化合物1、2和10的合成

[0256]

[0257] 在氩气下在室温下向原料酚（4.3克，10.6毫摩尔）在DMF（30毫升）中的溶液中加入Et3N（7.5毫升，53.1毫摩尔）和N -苯基-双(三氟甲磺酰亚胺（) 4克，11.7毫摩尔）。将该混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯（300毫升）稀释。该有机溶液用HCl溶液、水洗涤并经无水硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以产生34（5.4克，95%收率）。

[0258]

[0259]

[0260] 在烘干的Schlenk管中装入Pd(OAc)（2 135毫克，0.60毫摩尔）、BINAP（751毫克，1.21毫摩尔）和Cs2CO（3 1.44克，4.42毫摩尔）并用氩气吹扫5分钟。加入34（2.16克，4.02毫摩尔）和4-(甲氧基甲氧基)-N -甲基苯胺（705毫克，4.22毫摩尔）在甲苯（20毫升）中的溶液，所得混合物首先在氩气下在室温下搅拌30分钟，然后在100℃下搅拌20小时。使反应混合物冷却至室温，用CH2Cl2稀释并经硅藻土垫过滤。滤饼用CH2Cl（2 3 × 30毫升）洗涤。然后浓缩滤液，残留物通过硅胶柱层析法提纯以产生35（2.13克，96%收率）。

[0261]

[0262]

[0263] 在室温下向35（2.13克，3.85毫摩尔）在MeOH（30毫升）中的溶液中加入NaOH（1.54克，38.5毫摩尔）在H2O（15毫升）中的溶液。所得溶液在室温下搅拌2小时，然后在真空中浓缩。残留物用浓HCl酸化。过滤收集沉淀物并在减压下干燥以提供红色固体状的产物36（2.0克，99%收率）。粗产物通常纯净到足以用于下一步骤，也可通过硅胶柱层析法提纯。

[0264]

[0265]

[0266] 在0℃下在氩气下向36（2.0克，3.73毫摩尔）在CH2Cl（2 50毫升）中的悬浮液中相继加入Et3N（2.6毫升，18.7毫摩尔）和乙酰氯（0.53毫升，7.46毫摩尔）。所得溶液在室温下搅拌整夜。该反应混合物用水猝灭并用乙酸乙酯稀释。该有机溶液用稀HCl溶液和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物37 (1.55克，72%收率）。

[0267]

[0268]

[0269] 向37（170毫克，0.3毫摩尔）在无水THF（5毫升）和t-BuOH（1毫升）中的溶液中加入DMAP（96毫克，0.45毫摩尔），接着在0 °C下在氩气下逐滴加入Boc2O（0.34毫升，1.5毫摩尔）。将所得混合物加热至回流，持续2小时。在冷却至室温后，该混合物用乙酸乙酯（50毫升）稀释，用稀HCl、H2O和盐水洗涤。该有机溶液经无水硫酸钠干燥并浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以产生1:1比率的 5’-异构体和6’-异构体38。

[0270]

[0271] 向38（50毫克，0.08毫摩尔）在THF（2毫升）中的溶液中逐滴加入氨溶液（28%，5滴）。该反应在室温下搅拌半小时，然后用稀HCl酸化。反应混合物用乙酸乙酯萃取。该有机溶液经无水硫酸钠干燥并浓缩。将所得残留物再溶解在DCM（2毫升）中并在室温下用TFA（2毫升）处理2小时。浓缩该混合物，然后用饱和NaHCO3稀释。该混合物用含10%异丙醇的氯仿萃取三次。合并有机溶液，浓缩，然后通过硅胶柱层析法提纯以提供产物1（1:1比率的5’-异构体和
6’-异构体，32毫克，0.067毫摩尔，82%收率）。

[0272]

[0273] 在氩气下向37（405毫克，0.71毫摩尔）在DMF中的溶液中相继加入亚氨基二乙酸二叔丁酯（524毫克，2.14毫摩尔）、1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt）（116毫克，0.86毫摩尔）和N -(3-二甲基氨基丙基)-N ’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）（164毫克，0.86毫摩尔）。将反应混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。有机层用饱和NaHCO3溶液、接着0.1 N HCl和盐水洗涤。萃取物经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱层析法提纯以分别产生5’-异构体 39（203毫克，0.26毫摩尔，36%收率）和6’-异构体（186毫克，0.23毫摩尔，33%收率）。

[0274]

[0275] 向39（25毫克，0.031毫摩尔）在THF（2毫升）中的溶液中加入氨溶液（28%，5滴）。该反应在室温下搅拌半小时，然后用稀HCl酸化。反应混合物用乙酸乙酯萃取。该有机溶液经无水硫酸钠干燥并浓缩。将所得残留物再溶解在DCM（2毫升）中并在室温下用TFA（2毫升）处理2小时。浓缩该溶液，然后用饱和NaHCO3稀释。该混合物用含10%异丙醇的氯仿萃取三次。合并有机溶液，浓缩，然后通过硅胶柱层析法提纯以提供产物2（14毫克，0.023毫摩尔，76%收率）。

[0276]

[0277]

[0278] 在氩气下在室温下向40（500毫克，1.24毫摩尔）在DMF（10毫升）中的溶液中加入Et3N（0.52毫升，3.72毫摩尔）和N -苯基-双(三氟甲磺酰亚胺)（487毫克，1.36毫摩尔）。将该混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯（50毫升）稀释。该有机溶液用HCl溶液、水洗涤并经无水硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物41（630毫克，95%收率）。

[0279]

[0280]

[0281] 在烘干的Schlenk管中装入Pd(OAc)（2 24毫克，0.11毫摩尔）、BINAP（134毫克，0.21毫摩尔）和Cs2CO（3 257毫克，0.79毫摩尔）并用氩气吹扫5分钟。加入41（383毫克，0.72毫摩尔）和4-(甲氧基甲氧基)-N -甲基苯胺（126毫克，0.75毫摩尔）在甲苯（10毫升）中的溶液，所得混合物首先在氩气下在室温下搅拌30分钟，然后在100℃下搅拌20小时。使反应混合物冷却至室温，用CH2Cl2稀释并经硅藻土垫过滤。滤饼用 CH2Cl（2 3 × 20毫升）洗涤。然后浓缩滤液，残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物42（386毫克，0.70毫摩尔，97%收率）。

[0282]

[0283]

[0284] 向42（320毫克，0.58毫摩尔）在CH2Cl（2 3毫升）中的溶液中加入TFA（3毫升）。所得溶液在室温下搅拌2小时。浓缩该溶液，然后用饱和NaHCO3稀释。该混合物用含10%异丙醇的氯仿萃取三次。合并有机溶液，经无水硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物43（236毫克，0.52毫摩尔，90%收率）。

[0285]

[0286]

[0287] 在氩气下向43（140毫克，0.31毫摩尔）在DMF（4毫升）中的溶液中相继加入3,3'-亚氨基二丙酸二甲酯（176毫克，0.93毫摩尔）、1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt）（70毫克，0.47毫摩尔）和N -(3-二甲基氨基丙基)-N ’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）（99毫克，0.47毫摩尔）。将反应混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。有机层用饱和NaHCO3溶液、接着0.1 N HCl和盐水洗涤。萃取物经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱层析法提纯以提供产物10（116毫克，0.19毫摩尔，60%收率）。

[0288]

[0289] 实施例2 – 黄色荧光化合物11的合成

[0290]

[0291] 原材料在TFA中的悬浮液在密封管中加热至100℃，持续4小时。所得红色溶液然后在真空中浓缩并与甲苯共沸三次以提供44的粗产物，其通过硅胶柱层析法提纯以提供纯产物。

[0292]

[0293]

[0294] 在氩气下在室温下向44在DMF中的溶液中加入Et3N和N -苯基-双(三氟甲磺酰亚胺)。将该混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。该有机溶液用HCl溶液、水洗涤并经无水硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物45（95%收率）。

[0295]

[0296]

[0297] 在烘干的Schlenk管中装入Pd(OAc)2、BINAP和Cs2CO3并用氩气吹扫5分钟。加入45和4-(甲氧基甲氧基)-N -甲基苯胺在甲苯中的溶液，所得混合物首先在氩气下在室温下搅拌30分钟，然后在100℃下搅拌20小时。使反应混合物冷却至室温，用CH2Cl2稀释并经硅藻土垫过滤。滤饼用CH2Cl2洗涤。然后浓缩滤液，残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物46（72%收率）。

[0298]

[0299]

[0300] 向46在乙酸中的溶液中缓慢加入HCl水溶液。该混合物在100 °C下加热2小时。在冷却至室温后，该反应混合物用饱和NaHCO3小心碱化，然后用含10%异丙醇的CH2Cl2萃取三次。合并有机溶液，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残留物用硅胶柱层析法提纯以提供产物11。

[0301]

[0302] 实施例3 – 红色荧光化合物22的合成

[0303]

[0304] 在氩气下在室温下向47在DMF中的溶液中加入Et3N和N -苯基-双(三氟甲磺酰亚胺)。将该混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。该有机溶液用HCl溶液、水洗涤并经无水硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物48 (92%收率）。

[0305]

[0306]

[0307] 在烘干的Schlenk管中装入Pd(OAc)2、BINAP和Cs2CO3并用氩气吹扫5分钟。加入48和4-(甲氧基甲氧基)-N -甲基苯胺在甲苯中的溶液，所得混合物首先在氩气下在室温下搅拌30分钟，然后在100℃下搅拌20小时。使反应混合物冷却至室温，用CH2Cl2稀释并经硅藻土垫过滤。滤饼用CH2Cl2洗涤。然后浓缩滤液，残留物通过硅胶柱层析法提纯以提供产物49（96%收率）。

[0308]

[0309]

[0310] 在室温下向49在CH2Cl2中的溶液中缓慢加入TFA。将该混合物搅拌2小时，然后在真空中浓缩。残留物通过硅胶柱层析法提纯，从而以98%收率提供产物22。

[0311]

[0312] 实施例4 – 远红荧光化合物25和27的合成

[0313]

[0314] 在-78 oC下在氩气气氛下向4-溴-3-甲基苯甲酸叔丁酯（585毫克，2.16毫摩尔）在干燥THF（10毫升）中的溶液中逐滴加入n-BuLi（1.46毫升，2.38毫摩尔）。然后在30分钟后加入HMPA（73微升，0.431毫摩尔）。在5分钟后加入50（226毫克，0.431毫摩尔）在干燥THF（2毫升）中的溶液。所得混合物在-78 oC至室温下搅拌12小时。该反应用3N HCl猝灭10分钟并用DCM萃取3次。萃取物经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱层析法提纯以提供产物51（307毫克，96%收率）。

[0315]

[0316]

[0317] 在0 oC下向51（306毫克，2.16毫摩尔）在DCM中的溶液中逐滴加入TFA。所得混合物在室温下搅拌3小时。然后浓缩该反应混合物并与甲苯共沸3次，通过硅胶柱层析法提纯以提供产物25（236毫克，80%收率）。

[0318]

[0319]

[0320] 在室温下在氩气气氛下向25（116毫克，0.162毫摩尔）和3,3'-亚氨基二丙酸二甲酯（52毫克，0.324毫摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液中相继加入1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt）（27毫克，0.194毫摩尔）和N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC•HCl）（44毫克，0.227毫摩尔）。将反应混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。有机层用饱和NaHCO3、H2O和盐水洗涤。萃取物经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱层析法提纯以提供产物27（122毫克，88%收率）。

[0321]

[0322] 实施例5 – 线粒体-靶向的荧光化合物25的合成

[0323]

[0324] 在氩气下向11在DMF中的溶液中相继加入三乙胺、1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt）、N -(3-二甲基氨基丙基)-N ’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N -甲基哌嗪。将反应混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。有机层用饱和NaHCO3溶液、接着0.1 N HCl和盐水洗涤。萃取物经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱层析法提纯以提供产物52（56%收率）。

[0325]

[0326]

[0327] 在室温下向52在CH2Cl2中的溶液中缓慢加入TFA。将该混合物搅拌2小时，然后在真空中浓缩。将残留物再溶解在无水DMF中。在氩气下向这种溶液中相继加入三乙胺、1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt）、N -(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和(4-羧基丁基)三苯基溴化鏻。将反应混合物搅拌整夜，然后用乙酸乙酯稀释。有机层用饱和NaHCO3溶液、接着0.1 N HCl和盐水洗涤。萃取物经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱层析法提纯以提供产物32 (40%收率）。

[0328]

[0329] 实施例6 – 用绿色荧光化合物2灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐

[0330] 此实施例表明绿色荧光化合物2灵敏和选择性检测过氧亚硝酸盐。具体而言，将化合物2溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成1 µM溶液，其中激发和发射光谱分别在510纳米和530纳米下。用过氧亚硝酸盐以各种浓度处理化合物2的1 µM溶液。图1A表明随过氧亚硝酸盐的浓度提高，化合物2的荧光强度提高。

[0331] 对不同活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)比较化合物2的反应性。具体而言，用–各种ROS和RNS处理化合物2的1 µM溶液。高活性氧物质（羟基自由基(•OH)、次氯酸( OCl)和过氧亚硝酸根 (ONOO−)）的浓度为1 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为10 µM。图1B表明与用其它ROS和RNS处理相比，用过氧亚硝酸盐处理导致化合物2的荧光强度的提高高得多。

[0332] 实施例7 - 用黄色荧光化合物11灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐

[0333] 此实施例表明黄色荧光化合物11灵敏和选择性检测过氧亚硝酸盐。具体而言，将化合物11溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成2 µM溶液，其中激发和发射光谱分别在547纳米和570纳米下。用过氧亚硝酸盐以各种浓度处理化合物11的2 µM溶液。图2A表明随过氧亚硝酸盐的浓度提高，化合物11的荧光强度提高。

[0334] 用不同活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)比较化合物11的反应性。具体而言，用各种ROS和RNS处理化合物11的2 µM溶液。高活性氧物质（羟基自由基(•OH)、次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根(ONOO−)）的浓度为2 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为20 µM。图2B表明与用其它ROS和RNS处理相比，用过氧亚硝酸盐处理导致化合物11的荧光强度的提高高得多。

[0335] 实施例8 - 用红色荧光化合物22灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐

[0336] 此实施例表明红色荧光化合物22灵敏和选择性检测过氧亚硝酸盐。具体而言，将化合物22溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成5 µM溶液，其中激发和发射光谱分别在600纳米和617纳米下。用过氧亚硝酸盐以各种浓度处理化合物22的5 µM溶液。图3A表明随过氧亚硝酸盐的浓度提高，化合物22的荧光强度提高。

[0337] 用不同活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)比较化合物22的反应性。具体而言，用各种ROS和RNS处理化合物22的5 µM溶液。高活性氧物质（羟基自由基(•OH)、次氯酸(–− 1 •–OCl)和过氧亚硝酸根 (ONOO )）的浓度为5 µM。O2、O2 、NO、ROO•和H2O2的浓度为50 µM。图3B表明与用其它ROS和RNS处理相比，用过氧亚硝酸盐处理导致化合物22的荧光强度的提高高得多。

[0338] 实施例9 -用深红荧光化合物25灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐

[0339] 此实施例表明深红荧光化合物25灵敏和选择性检测过氧亚硝酸盐。具体而言，将化合物25溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成5 µM溶液，其中激发和发射光谱分别在650纳米和665纳米下。用过氧亚硝酸盐以各种浓度处理化合物25的5 µM溶液。图4A表明随过氧亚硝酸盐的浓度提高，化合物25的荧光强度提高。

[0340] 用不同活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)比较化合物25的反应性。具体而言，用各种ROS和RNS处理化合物25的5 µM溶液。高活性氧物质（羟基自由基(•OH)、次氯酸(–OCl)和过氧亚硝酸根 (ONOO−)）的浓度为5 µM。1O2、O2•–、NO、ROO•和H2O2的浓度为50 µM。图4B表明与用其它ROS和RNS处理相比，用过氧亚硝酸盐处理导致化合物25的荧光强度的提高高得多。

[0341] 实施例10 - 用线粒体-靶向的荧光化合物30灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐

[0342] 此实施例表明线粒体-靶向的荧光化合物30灵敏和选择性检测过氧亚硝酸盐。具体而言，将化合物30溶解在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中以形成1 µM溶液并在515纳米下激发。用过氧亚硝酸盐以各种浓度处理化合物30的1 µM溶液。图5A表明随过氧亚硝酸盐的浓度提高，化合物30的荧光强度提高。

[0343] 用不同活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)比较化合物30的反应性。具体而言，用各种ROS和RNS处理化合物30的1 µM溶液。图5B表明与用其它ROS和RNS处理相比，用过氧亚硝酸盐处理导致化合物22的荧光强度的提高高得多。

[0344] 实施例11 – 本发明化合物在细胞检测中的应用

[0345] 人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞（ATCC, USA）保存在含有10%胎牛血清（FBS, Gibco）、1%青霉素/链霉素（PS, Gibco）和1% L-谷氨酰胺（Gibco）的高糖Dulbecco's改良伊格尔培养基（DMEM, Hyclone）中。小鼠C17.2神经前体细胞（ATCC, USA）保存在含有8%胎牛血清（Gibco）、4%马血清（Gibco）、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺的高糖Dulbecco's改良伊格尔培养基中。小鼠RAW264.7巨噬细胞（ATCC, USA）保存在含有10%胎牛血清（Gibco）、
1%青霉素/链霉素（Gibco）和1% L-谷氨酰胺的高糖Dulbecco's改良伊格尔培养基（DMEM, Hyclone）中。

[0346] 通常，细胞在实验前生长至汇合。细胞用相应的化合物（见图6-11）孵育1小时，然后用PBS缓冲液洗涤三次。在不存在刺激剂如SIN-1或LPS（脂多糖）/IFN-γ（干扰素-γ）的情况下仅观察极弱荧光。在用刺激剂，如SIN-1或LPS/ IFN-γ处理后强诱发化合物的荧光。结果显示在图6-11中，其有力地表明本发明化合物适用于检测活细胞中的过氧亚硝酸盐。

[0347] 实施例12 – 通过化合物14基平台筛选过氧亚硝酸盐清除剂

[0348] SH-SY5Y细胞以每孔5×104个细胞的密度接种到96孔板上并在含有10% FBS、1% PS + 1% L-谷氨酰胺的DMEM培养基中在37℃下在5% CO2气氛下孵育。第二天对细胞施以含有20 μM化合物14的无血清培养基。细胞然后用或不用不同浓度的候选药物（10 μM，100 μM）处理10分钟，接着添加SIN-1至1 mM的最终浓度2小时。然后在543纳米激发波长和567纳米发射波长下对板施以分光荧光法（Lambda55, PerkinElmer）。细胞既没有用候选药物也没有用SIN-1处理的组被视为“Ctrl”组；细胞用SIN-1但没有用候选药物处理的组被视为“Ctrl+SIN-1”组；且细胞用候选药物和SIN-1处理的组被视为“药物+SIN-1”组。通过{[(Actrl+SIN-1-Actrl)-(A药物+SIN-1-Actrl)]/(Actrl+SIN-1-Actrl)}*100%计算候选药物的清除活性。
使用化合物14基平台的筛选结果的代表图显示在图12中。

[0349] 实施例13 – 使用化合物14检测先体外后体内脑切片中的过氧亚硝酸盐

[0350] 将SD大鼠斩首并迅速打开颅骨。在除去额极和枕极（包括小脑）后，将分离的脑立即置于氧饱和的冰冷ACSF（人工脑脊液）中。在解剖鼠脑后，将试样置于ACSF（用95% O2至5% CO2饱和）中。试样在NVSL/NVSLM1组织切片机（World Precision Instruments Inc., USA）上切成300微米厚的切片。收集切片并置于6孔培养皿中并用由50%最小必需培养基、24%马血清和25% HBSS、1%青霉素-链霉素（都来自Invitrogen）构成并补充了36 mM葡萄糖和25 mM Hepes（Sigma, St. Louis, MO, USA）的1毫升培养基（pH 7.2）保存。在培养1天后，将培养基换成不含抗生素的新鲜培养基。在培养5天后，切片用10 μM化合物14预染色30分钟，然后用新培养基洗涤。切片然后用或不用SIN-1（200 μM）和FeTMPyP（50 μM）——过氧亚硝酸盐分解剂处理，并通过荧光显微术监测。结果显示在图13中，表明有可能用于化合物14的先体外后体内实验系统。

[0351] 实施例14 – 使用化合物14检测缺血脑组织中的内源性过氧亚硝酸盐形成

[0352] C57小鼠（8周）在实验前禁食6小时。在禁食后，以20分钟为间隔通过3等分强饲法以每千克体重5克总累积剂量给予乙醇组小鼠50%（vol/vol）乙醇。在禁食6小时后，以20分钟为间隔通过3等分强饲法以每千克体重5克总累积剂量给予乙醇组小鼠50%（vol/vol）乙醇。假处理小鼠组接收相同体积的水。在用乙醇处理3小时后，将小鼠麻醉并用化合物14（1μM，2ml/min，总共25毫升）原位再灌注。将新鲜的肝样品切成15 μM冷冻切片。用PBS洗涤5分钟，然后用DAPI孵育10分钟后，通过落射荧光显微术监测切片。结果显示在图14中。在来自醇处理小鼠的样品中观察到来自化合物14的强荧光信号，表明在急性酒精诱发的肝损伤中产生过氧亚硝酸盐。

[0353] 本文中引用的所有参考资料，包括出版物、专利申请和专利并入本文作为参考，就像逐一明确指明各参考资料并入本文作为参考并全文阐述在本文中。

[0354] 除非本文中另行指明或与上下文明显矛盾，描述本发明的上下文中所用的术语“一种”和“一个”和“该”和类似指示对象应被解释为涵盖单数和复数。

[0355] 除非本文中另行指明，本文中的数值范围的列举仅旨在充当逐一提到落在该范围内的各单独数值的简写法，各单独数值就像在本文中逐一列举那样并入本说明书。除非另行规定，本文中提供的所有确切值代表相应的近似值（例如，对于特定因素或测量提供的所有确切的示例性数值被认为也酌情提供被“大约”修饰的相应近似测量结果）。

[0356] 除非另行指明，本文中提供的任何和所有实施例或示例性措辞（例如“如”）的使用仅意在更好地阐明本发明，而非限制本发明的范围。除非明确规定，说明书中的措辞都不应被解释为指明任何要素对本发明的实施是必不可少的。

[0357] 除非另行规定或明显与上下文矛盾，在本文中对一个或多个要素使用如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”之类的术语描述本发明的任何方面或实施方案旨在提供支持“由所述特定要素构成”、“基本由所述特定要素构成”或“基本包含所述特定要素”的本发明的类似方面或实施方案（例如，除非另行规定或明显与上下文矛盾，在本文中被描述为包含特定要素的组合物应被理解为也描述由该要素构成的组合物）。

[0358] 应该理解的是，本文中描述的实施例和实施方案仅用于示例目的，本领域技术人员会想到基于其的各种修改或变动，并包括在本申请的精神和范围内。