[0001] 本发明涉及钙测定用干式试验片。

[0002] 钙是包括人在内的各种动物中的必需元素之一，与生物体内发生的各种反应密切相关。因此，血清或血浆中的钙浓度的测定是重要的临床检查项目之一。

[0003] 在集体诊察的现场或筛选检查等初期诊断的情况下，为了迅速地进行血中钙浓度的测定，广泛使用将与钙发生反应而显色的试剂预先涂布或浸渗到支持体上并使其干燥而成的干燥试验片。

[0004] 日本特开平5-232108号公报中公开了一种干式试验片，其具有：支持体、在支持体表面的一部分上形成的试剂层以及将试剂层的至少一部分和支持体的至少一部分覆盖的试剂保持层。该试剂保持层为使用合成纤维丝的编织物。因此，滴加到试剂保持层上的液体样品被吸收而扩散，从而与试剂层接触。在液体样品中含有测定对象物质时，该物质与试剂层中含有的试剂发生反应而显色。通过目视或使用光学测定方法对显色的有无或强度进行比较的方法(比色法)，能够迅速且简便地对测定对象物质进行检测或定量。

[0005] 作为钙测定试验的显色方法之一，已知有使钙与邻甲酚酞络合剂(OCPC)在碱性条件下发生螯合反应的OCPC法。利用该OCPC法的钙干式试验片，可以使用硼酸缓冲剂(pH9.2)等碱性缓冲剂。

[0006] 但是，利用OCPC法的钙测定用干式试验片，存在测定误差大的问题。此外，对于钙测定用干式试验片而言，因镁导致的测定误差大。因此，例如在高镁血症检样等中，频繁观测到由镁带来的高钙值。而且，干式试验片存在如下问题：一般随着保存时间的延长，会因潮解性等而导致试剂的劣化，因而测定误差增大。

[0007] 本发明鉴于上述问题而完成，其目的在于，提供测定误差小的钙测定用干式试验片。

[0008] 为了实现上述目的，本发明的观点的钙测定用干式试验片的特征在于，含有：邻甲酚酞络合剂、镁的选择性掩蔽剂以及将上述邻甲酚酞络合剂与钙的反应环境的pH缓冲至10.0～11.0的pH缓冲剂。

[0009] 上述pH缓冲剂优选为选自由N-环己基-3-氨基丙磺酸、N-甲基-D-葡糖胺及碳酸缓冲剂组成的组中的至少一种。特别优选N-环己基-3-氨基丙磺酸与N-甲基-D-葡糖胺为9比1的混合物。

[0010] 上述镁的选择性掩蔽剂优选为8-羟基喹啉。

[0011] 上述钙测定用干式试验片优选还含有表面活性剂。上述表面活性剂特别优选为对叔辛基酚聚氧乙烯醚。

[0012] 上述钙测定用干式试验片的特征在于，具备：支持体、设置在该支持体上的试剂层和设置在该试剂层上的试剂保持层，且上述邻甲酚酞络合剂、上述镁的选择性掩蔽剂以及上述pH缓冲剂各自包含在上述试剂层和上述试剂保持层中的仅任意一者的层中或者包含在两者的层中。附图说明

[0013] 图1A是表示本发明实施方式的钙测定用干式试验片的构成的立体图。

[0014] 图1B是图1A的A-A纵剖面图。

[0015] 图2A是表示本发明变形例1的钙测定用干式试验片的构成的立体图。

[0016] 图2B是图2A的B-B纵剖面图。

[0017] 图3是表示镁对本发明实施例的钙测定用干式试验片的影响的图。

[0018] 图4A是对使用本发明实施例的钙测定用干式试验片的钙浓度测定值与利用酶法的钙浓度测定值进行作图而示出的图。

[0019] 图4B是对使用比较例的钙测定用干式试验片的钙浓度测定值与利用酶法的钙浓度测定值进行作图而示出的图。

[0020] 图5A是表示将利用酶法的钙浓度测定值设为100％时使用本发明实施例的试验片的钙浓度测定值的偏离的图。

[0021] 图5B是表示将利用酶法的钙浓度测定值设为100％时使用比较例的试验片的钙浓度测定值的偏离的图。

[0022] (实施方式)

[0023] 如图1A及图1B所示，本发明的实施方式的钙测定用干式试验片1由支持体2和负载在支持体2上的试剂部3构成。试剂部3由形成在支持体2上的试剂层4和以覆盖该试剂层4的方式形成的试剂保持层5构成。

[0024] 支持体2优选不具有液体渗透性。由此，在使用本实施方式的钙测定用干式试验片1来测定钙时，滴加到试剂层4、试剂保持层5上的液态样品停留在试剂层4及试剂保持层5内，因此，能够高精度地进行测定。作为支持体2，可以使用纸片、塑料(合成树脂)片、金属片等。从批量生产率、低成本、保存性和耐水性等观点出发，优选使用合成树脂片。

[0025] 此外，在滴加液态样品而发生检测反应之后的光学分析中，使光从支持体侧照射时，需要支持体2具有透光性。与此相对，使光从试剂保持层5侧照射时，不要求透光性。

[0026] 试剂层4含有邻甲酚酞络合剂(OCPC)及镁的选择性掩蔽剂。镁的选择性掩蔽剂可以使用例如8-羟基喹啉等。

[0027] 试剂层4以具有液体渗透性的材质为主体而构成。特别优选以水溶性材质为主体、并且其中分散有试剂。由此，在测定时，试剂层4中所含的试剂可进入到滴加在位于上层的试剂保持层5上的液态样品中。作为水溶性材质，可以使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等水溶性高分子化合物等。此外，试剂层4可以为在具有液体渗透性的纸、编织物或机织物等布帛材料中分散有试剂的构成。

[0028] 试剂保持层5含有pH缓冲剂。pH缓冲剂优选将OCPC与钙的反应环境的pH调节至10.0～11.0的范围内、并且即使干燥后成分也不挥发的pH缓冲剂。从保存性的观点出发，更优选兼具低潮解性和高溶解性。作为pH缓冲剂，可以使用例如：N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-甲基-D-葡糖胺(MEG)或碳酸缓冲剂等。就潮解性和溶解性方面而言，特别优选使用将CAPS与MEG以9∶1混合而成的混合缓冲剂。这样，通过使用兼具低潮解性和高溶解性的缓冲剂，能制成即使在长期保存后测定误差也不易扩大的钙测定用干式试验片1。

[0029] 试剂保持层5以具有液体渗透性的材质为主体而构成。特别优选以水溶性材质为主体、并且其中分散有试剂。由此，在测定时，滴加到试剂保持层5上的液态样品在试剂保持层5中迅速且均匀地扩散。作为水溶性材质，可以使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等水溶性高分子化合物等。此外，试剂保持层5可以为在具有液体渗透性的纸、编织物或机织物等布帛材料中分散有试剂的构成。

[0030] 试剂保持层5可以直接形成在试剂层4上。或者，也可以通过中间夹着具有液体渗透性的层而配置在试剂层4上。

[0031] 在打算作为钙测定用干式试验片1的测定对象的液态样品为微量(例如约5μl)的情况下，试剂层4及试剂保持层5只要是数毫米×数毫米左右的面积即可。这种情况下，难以用手等来握住这些层。因此，优选将支持体2设置成宽度为约数毫米至约1厘米的细长片，以使其能够作为把手使用。

[0032] 本发明实施方式的钙测定用干式试验片1可以如下制作。

[0033] 首先，将用于制作支持体2的预定材质且具有预定厚度的片材切割成具有预定尺寸的细长片。对该细长片进行清洗并干燥，由此制作支持体2。

[0034] 接着，制作试剂层4。首先，使邻甲酚酞络合剂(OCPC)及镁的选择性掩蔽剂分散在具有液体渗透性的材质中。

[0035] 在具有液体渗透性的材质为水溶性高分子化合物等水溶性材质的情况下，首先，使其溶解于纯水中而制成水溶液。然后，使上述各试剂溶解在水溶液中并搅拌，由此使上述各试剂分散。然后，涂布到支持体2的预定部位处并进行干燥，制成试剂层4。

[0036] 在具有液体渗透性的材质为纸、编织物或机织物等布帛材料的情况下，使上述各试剂溶解在纯水中并搅拌而形成水溶液，并使该水溶液被预定尺寸的布帛材料吸收，由此使其分散。然后，进行干燥而除去水分，制成试剂层4。然后，将试剂层4层叠到支持体2上。作为该方法，在该试剂层4为以水溶性材质为主体的试剂层的情况下，用纯水润湿底面并压接在支持体2的预定位置处。由此，底面的水溶性材质发生溶解而发挥出胶粘剂的作用。作为其他方法，也可以利用胶粘剂将试剂层4胶粘在支持体2上。

[0037] 接着，制作试剂保持层5。首先，对于试剂保持层5而言，使pH缓冲剂分散在具有液体渗透性的材质中。

[0038] 在具有液体渗透性的材质为水溶性高分子化合物等水溶性材质的情况下，使其溶解于纯水中而制成水溶液，使pH缓冲剂溶解在该水溶液中并搅拌，由此使其分散。然后，涂布到平坦的基材上并进行干燥，之后从基材上剥离而制成试剂保持层5。

[0039] 在具有液体渗透性的材质为纸、编织物或机织物等布帛材料的情况下，使pH缓冲剂溶解在纯水中并搅拌而形成水溶液，并使该水溶液被预定尺寸的布帛材料吸收，由此使其分散。然后，进行干燥而除去水分，制成试剂保持层5。

[0040] 制成试剂保持层5之后，将试剂保持层5层叠到试剂层4上。

[0041] 例如，可以将试剂保持层5借助由胶粘剂构成的胶粘层(未示出)而层叠在试剂层4上。胶粘层需要具有液体渗透性。在通过将胶粘剂涂布到试剂层4的几乎整个表面上来形成胶粘层时，优选胶粘剂具有液体渗透性。此外，也可以不将胶粘剂涂布到试剂层4的几乎整个表面上，而是以在试药层4上涂布成具有液体渗透性的方式，由此使胶粘层具有液体渗透性。

[0042] 作为其他方法，在试剂保持层5为以水溶性材质为主体的试剂保持层的情况下，用纯水润湿底面并压接在试剂层4的预定位置处。由此，底面的水溶性材质发生溶解而发挥出胶粘剂的作用。

[0043] 这样，可以制作本发明实施方式的钙测定用干式试验片1。

[0044] 使用本发明实施方式的钙测定用干式试验片1的钙的测定可以如下进行。

[0045] 将预先确定的一定量的液态样品(血清或血浆)滴加到试剂保持层5上。液态样品立即扩散到整个试剂保持层5。而且也渗透到其下方的试剂层4中，使所有的试剂形成一体，从而形成pH为10.0～11.0的反应液。在碱性反应液中，OCPC与液态样品中的钙形成络合物。一般而言，与白蛋白等蛋白质结合的钙与OCPC的反应性差，但由于反应液的pH高达10.0～
11.0，因此，对于本实施方式的试验片而言，OCPC也与这样的与蛋白质结合的钙发生反应，从而形成络合物。

[0046] 此外，虽然OCPC可以与液态样品中的镁形成络合物，但由于存在与OCPC相比更牢固地与镁发生螯合反应的掩蔽剂，因此，OCPC与镁的络合物形成受到阻碍。特别是，在使用8-羟基喹啉作为掩蔽剂时，在pH为10.0～11.0的反应环境中，与以往的pH为9.2的反应环境相比，8-羟基喹啉以更高的特异性与镁结合，因此，可以期待高的掩蔽效果。

[0047] 由上，能够选择性地检测钙。OCPC与钙的络合物的吸收峰位于570nm附近，因此，试剂层4显色呈紫红色。反应结束后，通过对试剂保持层5照射可见光并接收反射光，计算出其显色程度(K/S值)。K/S值是表示显色程度的数值，可以利用对象的显色程度(浓度)越高则反射光的强度越大来算出。即，将可见光的反射率设为R时，K/S值可以通过下式来算出。

[0048] K/S＝(1-R)2/2R

[0049] 作为应用这种分析方法的光学分析装置，有例如：富士胶片株式会社的富士ドライケム(注册商标)7000、柯尼卡美能达株式会社的コレステツクLDX(注册商标)KM、爱科来株式会社的スポツトケム(注册商标)EZ等。

[0050] 由这样得到的K/S值可以获知液态样品中的准确的LDH浓度。

[0051] (变形例1)

[0052] 实施方式的钙测定用干式试验片中，试剂层4含有邻甲酚酞络合剂(OCPC)及镁的选择性掩蔽剂，试剂保持层5含有pH缓冲剂。但是，这些试剂可以包含在试剂层4及试剂保持层5中的任意一者中。这是因为，这些试剂包含在试剂层4中和包含在试剂保持层5中时，这些试剂都能混合到滴加液态样品后形成的反应液中，这一点是不变的。这些试剂仅包含在试剂层4或试剂保持层5的任意一者中时，也可以省略不含试剂的层。省略试剂层4时，试剂保持层5配置在支持体2上。将省略试剂层4时的钙测定用干式试验片10示于图2A及图2B中。变形例1的钙测定用干式试验片10中，试剂保持层5可以借助胶粘层6配置在支持体2上。或者，可以通过涂布等直接形成在支持体2上。

[0053] (变形例2)

[0054] 变形例2的钙测定用干式试验片中，在实施方式的试验片的基础上，试剂层4或试剂保持层5进一步含有表面活性剂。

[0055] 已知在使用含有OCPC的普通金属螯合反应体系来测定血清或血浆中的钙浓度时，会受到样品中的蛋白质、特别是白蛋白的影响。正常人的情况下，血清或血浆中的钙中，吸附于白蛋白的钙的比例大致恒定在约40％，因此，测定时可以通过适当的数值补正来消除影响。因此，实际应用中，即使是实施方式的试验片也通常不会成为问题。但是，在极少存在的极端的白蛋白高浓度的样品的情况下，有时也不能通过单纯的数值补正来消除白蛋白的影响。

[0056] 变形例1的钙测定用干式试验片中，包含在试剂层4或试剂保持层5中的表面活性剂在测定时会使样品中含有的蛋白质溶解。溶解后的白蛋白与钙的结合性降低，因此，即使对于极端的白蛋白高浓度的样品而言，也可以不受钙吸附于白蛋白的影响地测定钙浓度。作为非离子型表面活性剂，可以列举对叔辛基酚聚氧乙烯醚(曲拉通X-45，曲拉通X-100，曲拉通X-114或曲拉通X-305等)等作为具体例。作为离子型表面活性剂的例子，阴离子型表面活性剂中可以列举十二烷基硫酸钠作为具体例，阳离子型表面活性剂中可以列举十四烷基三甲基溴化铵作为具体例。但是，只要是具有相同作用的表面活性剂则可以使用任意的化合物，这对本领域技术人员来说是显而易见的。

[0057] (实施例)

[0058] 以下，示出实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定在以下的实施例的范围内。需要说明的是，在没有特别说明的情况下，纯水使用去离子水。

[0059] 首先，从厚度为0.2mm的白色聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)片上切下尺寸为长度70mm×宽度5mm的细长片，制成支持体。

[0060] 接着，制备N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)(同仁化学研究所株式会社制造)与N-甲基-D-葡糖胺(MEG)(和光纯药工业株式会社制造)的混合缓冲液。混合缓冲液如下制备：将0.89g CAPS和3.12g MEG溶解在蒸馏水中，并加入4N-NaOH溶液，使37℃下的pH达到10.5。
然后，定容至25ml。

[0061] 接着，在4ml通过上述方法制备的混合缓冲液中溶解36mg的邻甲酚酞络合剂(同仁化学研究所株式会社制造)、0.36g的8-羟基喹啉(和光纯药工业株式会社制造)。将该水溶液充分搅拌后，离心脱气，并将全部溶液以形成长度7mm×宽度5mm×厚度0.15mm的尺寸的方式涂布到支持体的一端。然后，在40℃下干燥20分钟，使水分完全蒸发，制成膜状试剂层。

[0062] 在该试剂层上层叠以布帛材料为主体而构成的试剂保持层。作为布帛材料，使用KBセ一レン株式会社的ザヴイ一ナ(注册商标)。在10mL的纯水中溶解0.1g曲拉通X-305(和光纯药工业株式会社制造)。将该水溶液充分搅拌后，脱气，并使全部溶液渗入到长度7mm×宽度5mm×厚度0.2mm的ザヴイ一ナ中。然后，在40℃下干燥20分钟，使水分蒸发。

[0063] 使用丙烯酸类胶粘剂将该试剂保持层胶粘而层叠在试剂层上。

[0064] (比较例)

[0065] 比较例中，使用硼酸钠缓冲液(pH为9.2)(和光纯药工业株式会社制造)来代替CAPS/MEG混合缓冲液，形成试剂层。其他方面与实施例同样地操作，制作试验片。

[0066] (测定操作)

[0067] 作为测定装置，使用爱科来株式会社的桌上型反射率测定装置スポツトケム(注册商标)EZ。将钙测定用干式试验片放置在温度被调整为37℃的桌台上，从上部滴加5.0μl的样品。3分钟后对波长575nm处的反射率(R)进行测定。将反射率(R)利用库伯卡-芒克(Kubelka-Munk)式(K/S＝(1-R)2/2R)换算为K/S值。通过测定已知浓度样品，预先制作“K/S值-钙浓度”之间的标准曲线。以该标准曲线为基础来计算出样品中的钙浓度。

[0068] (镁的影响的比较)

[0069] 为了比较镁对钙测定用干式试验片的影响，使用实施例及比较例的钙测定用干式试验片，将2.5～10.0mg/dL的氯化镁水溶液作为样品滴加到各试验片上，并放置在如上所述的测定装置上。图3是将钙测定用干式试验片与镁的反应(显色)程度以钙浓度的形式作图而示出的图。正常人的情况下，血清镁浓度为约2.5mg/dL。实施例的钙测定用干式试验片在该镁浓度下几乎没有表现出非特异性反应。此外，实施例的钙测定用干式试验片，在镁浓度达到10.0mg/dL之前仅表现出以钙浓度换算值计为约0.50mg/dL的非特异性反应。这是相对于正常人的血清钙浓度8.4～10.2mg/dl为约5％的足够低的值。

[0070] (相关性试验)

[0071] 为了比较钙测定用干式试验片的准确性，使用实施例及比较例的钙测定用干式试验片，对预先利用化学法测定了钙浓度的80个人的血清样品中的钙浓度进行了测定。利用化学法的钙浓度的测定使用钙E-HAテストワコ一(和光纯药工业株式会社制造)。图4A及图4B是对利用化学法的钙浓度测定值与使用钙测定用干式试验片的钙浓度测定值进行作图而示出的图。此外，图5A及图5B是表示将利用化学法的钙浓度测定值设为100％时使用钙测定用干式试验片的钙浓度测定值的偏离的图。使用实施例的钙测定用干式试验片的钙浓度测定值与使用比较例的钙测定用干式试验片的钙浓度测定值相比，显示出与利用化学法的钙浓度测定值的高相关性。此外，使用钙测定用干式试验片的钙浓度测定值相对于利用化学法的钙浓度测定值的偏离，在比较例的钙测定用干式试验片的情况下，在-20％～+15％之间较宽地波动，而且显示出具有偏移的分布。但是，在实施例的钙测定用干式试验片的情况下，在-10％～+10％之间的较窄范围内显示出均匀的分布。

[0072] 本申请基于2011年4月28日提出的日本专利申请2011-102424号提出。本说明书中，将日本专利申请2011-102424号的说明书、权利要求书和附图全部以参照的形式引入。