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新的肽酶底物
申请号	CN201080034026.8	申请日	2010-07-28	公开(公告)号	CN102482709B	公开(公告)日	2016-02-10
申请人	生物梅里埃公司;			发明人	O·法布雷加; A·詹姆斯; S·欧伦加; J·佩里; V·L·萨尔瓦图拉; S·斯坦福斯;
摘要	本发明涉及式(I)的化合物及其盐作为检测肽酶活性的酶底物或者pH指示剂的用途：其中：●Y1是肽、H或者烷基；●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合；●n＝0、1或者2；●U是N或N+R并且V是CZ6、N或N+R，或者V是N或N+R并且U是CZ6；●R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基；●Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺。
权利要求	1.式(I)的化合物及其盐作为检测肽酶活性的酶底物的用途：其中： ·Y1是肽，其中所述肽为包含1-10个氨基酸的肽链； ·W1、W2、W3和W4为H； ·n＝1； ·U是N或N+R并且V是CZ6，或者V是N或N+R并且U是CZ6； ·R是H或C1-C6烷基； ·Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6为H。 2.如权利要求1所述的式I的化合物的用途，其中Y1选自丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。 3.如权利要求1或2所述的式I的化合物的用途，其中U是CH，并且V是N或N+R。 4.如权利要求3所述的式I的化合物的用途，其中V是N+CH3。 5.如权利要求1或2所述的式I的化合物的用途，其中V是CH，并且U是N或N+R。 6.如权利要求5所述的式I的化合物的用途，其中U是N+CH3。 7.式(I)的化合物及其盐用于检测pH变化的用途：其中： ·Y1是H； ·W1、W2、W3和W4为H； ·n＝1； ·U是N并且V是CZ6，或者V是N并且U是CZ6； ·Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6为H。 8.如权利要求7所述的式I的化合物的用途，其中U是CH，并且V是N。 9.如权利要求7所述的式I的化合物的用途，其中V是CH，并且U是N。 10.如权利要求1或7所述的式I的化合物的用途，其中所述化合物选自：L-丙氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓TFA、D-丙氨酸-N-甲基-4-4’-氨基苯乙烯基喹啉鎓二氯化物、L-丙氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓、Z-丙氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、γ-氨基丁酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-天冬酰胺酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓-双TFA、α-天冬氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、β-天冬氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、甘氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-γ-谷氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、甘氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓氯化物、L-亮氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-甲硫氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二氯化物、焦谷氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓碘化物、L-色氨酰基-4-4-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-酪氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、β-丙氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓TFA、L-脯氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓HBr、Z-精氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓、L-焦谷氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉TFA、β-丙氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉、L-谷氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉TFA、甘氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉TFA、焦谷氨酰基-4-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉、L-丙氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉、β-丙氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉、甘氨酰基-2-4’-酰氨基苯乙烯基喹啉TFA和L-丙氨酰基-2-2’-吡啶基-4-4”-酰氨基苯乙烯基喹啉。 11.检测微生物中的肽酶活性的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐：其中： ·Y1是肽，其中所述肽为包含1-10个氨基酸的肽链； ·W1、W2、W3和W4为H； ·n＝1； + + ·U是N或NR并且V是CZ6，或者V是N或NR并且U是CZ6； ·R是H或C1-C6烷基； ·Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6为H； b)用要测试的生物学样品接种所述培养基； c)进行温育；以及 d)显示至少一种肽酶活性的存在。 12.检测pH变化的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐：其中： ·Y1是H； ·W1、W2、W3和W4为H； ·n＝1； ·U是N并且V是CZ6，或者V是N并且U是CZ6； ·Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6为H； b)用要测试的生物学样品接种所述培养基； c)进行温育；以及 d)显示pH变化的存在。 13.用于检测和/或鉴定微生物的培养基，其包含用于检测肽酶活性的式(I)的化合物及其盐：其中： ·Y1是肽，其中所述肽为包含1-10个氨基酸的肽链； ·W1、W2、W3和W4为H； ·n＝1； + + ·U是N或NR并且V是CZ6，或者V是N或NR并且U是CZ6； ·R是H或C1-C6烷基； ·Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6为H。 14.用于检测和/或鉴定微生物的培养基，其包含用于检测pH变化的式(I)的化合物及其盐：其中： ·Y1是H； ·W1、W2、W3和W4为H； ·n＝1； ·U是N并且V是CZ6，或者V是N并且U是CZ6； ·Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6为H。
说明书全文	新的肽酶底物技术领域 [0001] 本发明涉及新的化合物，其可用作pH指示剂和/或用作检测肽酶活性的酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶促水解步骤的应用中，特别用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。本发明还涉及包含所述底物的反应培养基、所述底物或者所述培养基用于检测肽酶活性和/或区分革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的用途，还涉及使用方法。背景技术 [0002] 目前已有大量用于检测微生物的培养基。这种检测具体地可基于使用对期望检测的微生物的酶具有特异性的特定底物。一般而言，制备酶的合成底物以使该底物与其靶酶代谢的产物具有不同的物理化学性质，从而可区分它们，并且评价是否全部或者部分的底物已被酶转化成产物。水解酶底物通常由对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分(通常是发色或者发荧光的)组成。因此，在细菌的情况中，通过选择底物，根据是否存在反应，可表征微生物的性质。肽酶活性可具体用来显示细菌的群、属或者种。因此，例如，丙氨酸-氨肽酶活性使得可以区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌。 [0003] 用于检测肽酶活性的酶发色底物是本领域已知的。可具体提及的是Manafi的文章(Manafi等人，Microbiol Rev 55(3)：335-348，1991)，这是关于用于微生物学的酶底物的综述。但是，所述的氨肽酶底物通过水解释放扩散于培养基中的化合物(β-萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。因此，在非均相反应培养基(培养皿上的菌落、组织切片等)中，不可能准确定位水解的位置。还可提及由本申请人提交的专利申请WO 98/04735和WO 99/38995中所述的底物。但是，虽然这些底物少量扩散于培养基中，但是它们具有某些缺点：它们难以合成，纯度低，收率低，并且它们对某些微生物具有毒性。发明内容 [0004] 因此，本发明提出新的化合物的用途，其用作pH指示剂，或者用作肽酶底物，能够用来检测微生物。较之现有的底物，这些新的化合物易于合成，并且可具体地用于凝胶化的培养基中来检测微生物，因为它们产生的显色在反应培养基中少量或者根本不扩散。在用作酶底物的情况中，这使得能够在不表达肽酶活性的其他菌落或细胞器中准确地定位表达肽酶活性的菌落或者细胞器。 [0005] 在进一步描述本发明之前，为了便于公开本发明而作出以下定义。 [0006] 术语“酶底物”是指这样底物，其可被酶水解成允许直接或间接地检测微生物、细胞或细胞器的产物。所述底物具体地包含对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分。 [0007] 本发明的用作底物的化合物适合用于流式细胞术，由于水解的产物主要保持位于表达酶活性的细胞中，因此可特异性地对表达此活性的细胞进行计数，乃至将它们从样品的其余部分分离。 [0008] 本发明的用作底物的化合物还非常适合用于组织酶学，由于水解的产物主要保持在水解的位置处，因此可特异性地鉴定在组织内表达此活性的细胞或者细胞器。 [0009] 本发明的化合物由于它们的低毒性而非常适合分别用作pH指示剂，或者监测细胞培养物中的肽酶活性。 [0010] 本发明的化合物特别适合用于检测和/或鉴定培养基，因为它们产生不扩散于反应培养基中的显色或者荧光。 [0011] 在本发明中，术语“显色”涵盖染色、吸收可见光谱的光或者荧光，以及在一种波长吸收(λex)并在更高的波长发射(λem，λem＞λex)。 [0012] 本发明的化合物可成盐，即为盐的形式，例如，氯化物、溴化物、碘化物或者三氟乙酸盐。 [0013] 术语“pH指示剂”是指颜色和/或荧光随着培养基的pH改变而改变的化学物质，其中所述pH改变任选地与在所述培养基上生长的微生物的代谢相关。 [0014] 术语“肽酶”是指能够通过水解切割肽的酰基残基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。术语“氨肽酶”是指能够通过水解切割氨基酸的酰基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。在本申请中，术语“肽酶”可适当地表示以上定义的肽酶和氨肽酶。 [0015] 术语“肽”是指包含1-10个氨基酸，优选1-4个氨基酸的肽链。优选地，所述肽是二丙氨酸或者三丙氨酸。术语“氨基酸”是指本领域技术人员已知的任何天然的或者非天然的氨基酸。根据本发明的一具体实施方案，所述氨基酸是β-丙氨酸或L-丙氨酸或D-丙氨酸，或者甘氨酸、焦谷氨酰基等。 [0016] 所述肽可包含在其N末端的封端剂。本发明的封端剂包括本领域技术人员已知的能够保护胺的任何封端剂。作为实例，可提及叔丁氧羰基(N-tBOC)、9-芴基氧基羰基、增溶剂如琥珀酰基，或者不可代谢的氨基酸，即非天然的氨基酸如2-哌啶酸，或者氨基酸的D形式如D-苯丙氨酸。封端剂并非系统地存在于本发明的化合物中。 [0017] 术语“烷基基团”是指基于饱和烃基团的链，具体而言，例如，C1-C6烷基，即含有1-6个碳原子的直链或支链的烷基。作为实例，可提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。 [0018] 术语“芳基基团”是指衍生自芳香族核，具体而言，例如C6-C10芳香族核的官能团(或取代基)，特别是苯基、苄基、1-萘基或者2-萘基。 [0019] 术语“羧基基团”是指，具体而言，由通过双键与第一氧原子键合并通过单键与第二氧原子键合的碳原子组成的官能团，其本身带负电荷或者与氢原子相连。取决于分子的pKa和培养基的pH，羧基基团可以是电离的形式，即不含有与第二氧原子相连的H，由此带负电荷。 [0020] 术语“反应培养基”是指这样的培养基，其包含微生物、细胞或者细胞器的代谢表达和/或生长所需的所有组分。反应培养基可用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或者用作检测和/或鉴定微生物的培养基。 [0021] 所述反应培养基可包含一种或者多种组分的组合，例如，氨基酸、胨、糖、核苷酸、矿物质、维生素、抗生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐或者金属盐。 [0022] 所述培养基还可包含染料。作为染料的实例，可提及伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀石绿、亮绿等。 [0023] 所述反应培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体培养基”是指，例如凝胶化的培养基。琼脂是常规的凝胶剂，在微生物学中用于培养微生物，但是可使用明胶或者琼脂糖。可商购获得某些配制品，例如，Columbia琼脂、Trypcase-soy琼脂、MacConkey琼脂、Sabouraud琼脂，或者，更概括地，Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中所述的那些。 [0024] 所述反应培养基可以是检测和/或鉴定培养基，即，显示培养基或者培养且显示的培养基。在第一种情况中，微生物的培养在接种之前进行；在第二种情况中，检测和/或鉴定培养基也构成培养基。 [0025] 术语“生物学样品”是指临床样品，其来源于生物学流体的样本或者食物样品，来源于任何类型的食物，或者来源于任何化妆品或药物制剂的化妆品或药物样品。因此，样品可以是液体或者固体，并且可非限制性地提及，血液、血浆、尿液或粪便的临床样品，鼻、咽喉、皮肤、伤口或者脑脊髓流体样本的临床样品，来自水、饮料如乳品或果汁、酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼类等的食物样品；来源于动物饲料的食物样品，具体而言，例如来源于动物食物的样品。所述样品还可来源于临床环境样本、家畜样本，或者食物、化妆品或药物生产的样本。术语“环境样本”具体是指表面、液体、原料或者产品的样本。因此，术语“样品”是指样本本身(拭子、粪便、食物等)和由所述样本而得的微生物菌落(例如在凝胶化的培养基上分离后，或者用所述样本接种的富集培养液)。 [0026] 对于本发明，术语“微生物”涵盖细菌、酵母、霉菌，更概括而言，有机体，其通常是单细胞的有机体，并且是裸眼不可见的，可在实验室中对其进行倍增或者操作。 [0027] 作为革兰氏阴性细菌，可提及以下属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、博德特氏菌属(Bordetella)、西地西菌属(Cedecea)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和军团菌属(Legionella)。 [0028] 作为革兰氏阳性细菌，可提及以下属的细菌：气球菌属(Aerococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、库克菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、Falkamia、孪生球菌属(Gemella)、片球菌属(Pediococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)和棒杆菌属(Corynebacterium)。 [0029] 作为酵母，可提及以下属的酵母：假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、酵母属(Saccharomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)。 [0030] 优选地，所述微生物选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、单核细胞增生利斯特氏杆菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。 [0031] 在此方面，本发明涉及式(I)的化合物及其盐作为检测肽酶活性和/或pH变化的酶底物的用途： [0032] [0033] 其中： [0034] ●Y1是肽、H或者烷基； [0035] ●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合； [0036] ●n＝0、1或者2；+ + + [0037] ●U是N或NR并且V是CZ6、N或NR，或者V是N或NR并且U是CZ6； [0038] ●R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基； [0039] ●Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺。 [0040] 当所述式(I)的化合物仅用于检测pH变化时，Y1是H或者烷基。 [0041] 当所述式(I)的化合物用于检测肽酶活性时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0042] 当所述式(I)的化合物用于检测肽酶活性和pH变化时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0043] 根据本发明的一优选实施方案，Y1是肽，优选选自丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和三丙氨酰基。 [0044] 根据本发明的一优选实施方案，n＝1。 [0045] 根据本发明的一优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地为H。+ + [0046] 根据本发明的一优选实施方案，U是CH，并且V是N或NR，优选NCH3。 [0047] 根据本发明的一优选实施方案，V是CH，并且U是N或N+R，优选N+CH3。 [0048] 根据本发明的一优选实施方案，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6独立地为H。 [0049] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯基)-2-甲基喹啉、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、D-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、Z-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、γ-氨基丁酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双TFA、α-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、β-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓氯化物、L-亮氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-甲硫氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓碘化物、肌氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-色氨酰基-4-(4-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、L-脯氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(HBr)、Z-精氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-焦谷氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、甘氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA和L-丙氨酰基-2-(2’-吡啶基)-4-(4”-酰氨基苯乙烯基)喹啉。 [0050] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉(β-Ala-ASQ)、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓+二盐酸盐(Tyr-ASQM)、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双+ TFA(Asn-ASQM)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)+ (λ-Glu-ASQM)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲+ 基喹啉鎓(二氯化物)(Tri-Ala-ASQM)。 [0051] 本发明还涉及检测微生物中的肽酶活性和/或pH变化的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤，或者由以下步骤组成： [0052] a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐： [0053] [0054] 其中： [0055] ●Y1是肽、H或者烷基； [0056] ●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合； [0057] ●n＝0、1或者2； [0058] ●U是N或N+R并且V是CZ6、N或N+R，或者V是N或N+R并且U是CZ6； [0059] ●R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基； [0060] ●Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺； [0061] b)用要测试的生物学样品接种所述培养基； [0062] c)进行温育；以及 [0063] d)显示至少一种肽酶活性或者pH变化的存在。 [0064] 当所述方法是仅用于检测pH变化的方法时，Y1是H或烷基。 [0065] 当所述方法是用于检测微生物中的肽酶活性的方法时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0066] 当所述方法是用于检测微生物中的肽酶活性和pH变化的方法时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0067] 根据本发明的一优选实施方案，Y1是肽，优选选自丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。 [0068] 根据本发明的一优选实施方案，n＝1。 [0069] 根据本发明的一优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地为H。 [0070] 根据本发明的一优选实施方案，U是CH，并且V是N或N+R，优选N+CH3。 [0071] 根据本发明的一优选实施方案，V是CH，并且U是N或N+R，优选N+CH3。 [0072] 根据本发明的一优选实施方案，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6独立地为H。 [0073] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯基)-2-甲基喹啉、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、D-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、Z-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、γ-氨基丁酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双TFA、α-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、β-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓氯化物、L-亮氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-甲硫氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓碘化物、肌氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-色氨酰基-4-(4-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、L-脯氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(HBr)、Z-精氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-焦谷氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、甘氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、L-丙氨酰基-2-(2’-吡啶基)-4-(4”-酰氨基苯乙烯基)喹啉。 [0074] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉(β-Ala-ASQ)、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓+二盐酸盐(Tyr-ASQM)、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双+ TFA(Asn-ASQM)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)+ (λ-Glu-ASQM)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲+ 基喹啉鎓(二氯化物)(Tri-Ala-ASQM)。 [0075] 所述微生物的接种可按照本领域技术人员已知的任何接种技术进行。温育步骤可在期望检测的酶活性最佳的温度下进行，本领域技术人员可容易地根据要检测的酶活性进行选择。步骤d)可通过视觉检查或者比色法或者荧光测定法进行。在步骤d)中，可显示肽酶活性或者pH变化的存在，单独或者与至少一种其他酶活性组合。 [0076] 优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、雷氏普罗威登斯菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、单核细胞增生利斯特氏杆菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌和粪肠球菌。 [0077] 本发明还涉及区分细菌属于革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： [0078] a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐作为检测肽酶活性和/或pH变化的酶底物： [0079] [0080] 其中： [0081] ●Y1是肽、H或者烷基； [0082] ●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合； [0083] ●n＝0、1或者2； [0084] ●U是N或N+R并且V是CZ6、N或N+R，或者V是N或N+R并且U是CZ6； [0085] ●R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基； [0086] ●Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺； [0087] b)用要测试的生物学样品接种所述培养基； [0088] c)进行温育；以及 [0089] d)显示至少一种肽酶活性的存在。 [0090] 当所述培养基是仅用于检测pH变化的培养基时，Y1是H或烷基。 [0091] 当所述培养基是用于检测肽酶活性的培养基时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0092] 当所述培养基是用于检测肽酶活性和pH变化的培养基时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0093] 如上所述，所述微生物的接种可按照本领域技术人员已知的任何接种技术进行。温育步骤可在期望检测的酶活性最佳的温度下进行，本领域技术人员可容易地根据要检测的酶活性进行选择。步骤d)可通过视觉检查或者比色法或者荧光测定法进行。在步骤d)中，可显示肽酶活性的存在，单独或者与其他酶活性组合。在某些情况中，可有利地在酸如乙酸的存在下进行步骤d)。 [0094] 根据本发明的一优选实施方案，Y1是肽，优选选自丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。 [0095] 根据本发明的一优选实施方案，n＝1。 [0096] 根据本发明的一优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地为H。 [0097] 根据本发明的一优选实施方案，U是CH，并且V是N或N+R，优选N+CH3。 [0098] 根据本发明的一优选实施方案，V是CH，并且U是N或N+R，优选N+CH3。 [0099] 根据本发明的一优选实施方案，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6独立地为H。 [0100] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯基)-2-甲基喹啉、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、D-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、Z-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、γ-氨基丁酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双TFA、α-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、β-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓氯化物、L-亮氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-甲硫氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓碘化物、肌氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-色氨酰基-4-(4-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、L-脯氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(HBr)、Z-精氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-焦谷氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、甘氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、L-丙氨酰基-2-(2’-吡啶基)-4-(4”-酰氨基苯乙烯基)喹啉。 [0101] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉(β-Ala-ASQ)、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓+二盐酸盐(Tyr-ASQM)、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双+ TFA(Asn-ASQM)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)+ (λ-Glu-ASQM)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲+ 基喹啉鎓(二氯化物)(Tri-Ala-ASQM)。 [0102] 优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、雷氏普罗威登斯菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、单核细胞增生利斯特氏杆菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌和粪肠球菌。 [0103] 本发明还涉及用于检测和/或鉴定微生物的培养基，其包含用于检测肽酶活性和/或pH变化的式(I)的化合物及其盐： [0104] [0105] 其中： [0106] ●Y1是肽、H或者烷基； [0107] ●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合； [0108] ●n＝0、1或者2；+ + + [0109] ●U是N或NR并且V是CZ6、N或NR，或者V是N或NR并且U是CZ6； [0110] ●R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基； [0111] ●Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺。 [0112] 当所述培养基是仅用于检测pH变化的培养基时，Y1是H或烷基。 [0113] 当所述培养基是用于检测肽酶活性并任选地检测pH变化的培养基时，Y1是肽。优选地U或V是N。 [0114] 根据本发明的一优选实施方案，Y1是肽，优选选自丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。 [0115] 根据本发明的一优选实施方案，n＝1。 [0116] 根据本发明的一优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地为H。+ + [0117] 根据本发明的一优选实施方案，U是CH，并且V是N或NR，优选NCH3。+ + [0118] 根据本发明的一优选实施方案，V是CH，并且U是N或NR，优选NCH3。 [0119] 根据本发明的一优选实施方案，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6独立地为H。 [0120] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯基)-2-甲基喹啉、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-苄基喹啉鎓TFA、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、D-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、Z-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、γ-氨基丁酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双TFA、α-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、β-天冬氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓氯化物、L-亮氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-甲硫氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二Cl、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓碘化物、肌氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二氯化物、L-色氨酰基-4-(4-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸盐、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓TFA、L-脯氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(HBr)、Z-精氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-焦谷氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉、甘氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉TFA、L-丙氨酰基-2-(2’-吡啶基)-4-(4”-酰氨基苯乙烯基)喹啉。 [0121] 根据本发明的一优选实施方案，所述化合物选自：β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉(β-Ala-ASQ)、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓+二盐酸盐(Tyr-ASQM)、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双+ TFA(Asn-ASQM)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)+ (λ-Glu-ASQM)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲+ 基喹啉鎓(二氯化物)(Tri-Ala-ASQM)。 [0122] 优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、雷氏普罗威登斯菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、单核细胞增生利斯特氏杆菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌和粪肠球菌。 [0123] 优选地，所述反应培养基是用于检测和/或鉴定微生物的培养基，所述培养基包含至少一种如上定义的用作酶底物或者pH指示剂的分子。 [0124] 优选地，所述化合物、酶底物或者pH指示剂的浓度为1-1000mg/l，优选10-500mg/l。 [0125] 根据本发明的一具体实施方案，本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种其他酶底物，所述其他酶底物对除了由本发明的分子检测的肽酶活性之外的酶活性具有特异性。 [0126] 根据本发明的另一具体实施方案，本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种对除了由pH变化证实的酶活性之外的酶活性具有特异性的底物。 [0127] 所述其他底物的酶促代谢产生可检测的信号，该信号不同于由本发明的用作酶底物或者pH指示剂的化合物产生的信号，例如，不同的显色产物或者荧光产物，由此能够证实(例如检测和/或鉴定和/或量化)一种或多种微生物。作为其他特异性底物，可使用常规用于检测微生物的任何其他底物。所述其他特异性酶底物的浓度通常为0.01-1g/l。本领域技术人员能够容易地根据所用的底物确定这样的浓度。作为示例，可将本发明的化合物与肽酶、糖苷酶、酯酶或者还原酶的酶底物组合。具体地，可将本发明的底物(其中所述肽是β-丙氨酸)与糖苷酶底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷或者茜素-β-半乳糖苷)组合。还可将本发明的底物(其中所述肽是L-丙氨酸)与酯酶底物(如5-溴-6-氯-3-吲哚氧基辛酸酯或者5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯)组合。 [0128] 根据本发明的一具体实施方案，本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种对所述肽酶活性具有特异性或者对由本发明的用作pH指示剂的化合物检测的酶活性具有特异性的其他酶底物。因此，通过特别地选择底物，可鉴定表达相同酶活性的微生物群。所述其他特异性酶底物的浓度通常是0.01-1g/l。本领域技术人员能够容易地根据所用的底物确定这样的浓度。具体地，可将本发明的底物(其中所述肽是L-丙氨酸)与申请WO2006030119中所述的L-丙氨酸-氨肽酶底物(如L-丙氨酸-戊基-resorufamine)组合。 [0129] 根据本发明的一具体实施方案，本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种代谢指示剂，所述代谢指示剂对除了由本发明的用作底物或者pH指示剂的化合物检测的代谢活性之外的代谢活性具有特异性。 [0130] 此代谢指示剂具体地可以是任选地与显示其代谢的试剂组合的碳源或氮源。根据一具体实施方案，所述碳源或者氮源与除了本发明的用于此方面的化合物之外的pH指示剂组合。根据另一具体实施方案，所述碳源或者氮源与阳离子组合。根据另一具体实施方案，所述代谢指示剂使得可以检测色氨酸酶活性，并且将色氨酸与使得可以检测吲哚的产生的试剂组合。实施例 [0131] 作为实例给出以下实施例。 [0132] 实施例1底物合成 [0133] 4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉按照Bahner等人的方法(C.T.Bahner，C.Cook，J.Dale，J.Fain，F.Hannan，P.Smith和J.Wilson，JournaL-of Organic Chemistry，1958，23，1060-1062)制得。 [0134] 作为示例，给出4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉用t-BOC-β-丙氨酸的氨酰化，以相同的方法用另一种被保护的氨基酸进行其他氨酰化。 [0135] 按照混合酸酐法从4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉和t-BOC-β-丙氨酸合成t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉： [0136] 首先，小心地确保使用的所有玻璃器具完全干燥，因为水气的存在可能阻止反应正确发生。将0.50g(0.00266mol)的t-Boc-L-丙氨酸溶于10mL无水四氢呋喃(THF)中并将CaCl2阱安置于圆底烧瓶的颈部以确保其密封。磁力搅拌混合物，并使用冰与NaCl盐混合的冰浴使反应混合物的温度降至-15℃。一旦达到此温度，再另外搅拌5分钟。然后加入0.34g(0.0033mol)的N-甲基吗啉，并且非常小心地确保温度再降至-15℃，接着进行下一步骤。然后极小心地滴加0.36g(0.00266mol)甲酸异氯丁基酯，正如预期，随着每滴的加入，反应介质变得混浊。数分钟后，将0.49g(0.002mol)的4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉溶于最低量的无水THF中，并加入至反应介质中。2小时后，除去冰浴，并过夜搅拌反应介质。过滤溶液，用普通THF漂洗圆底烧瓶，并保留滤液。存在少量沉淀，因此进行下一步骤，否则需要将溶液置于干净圆底烧瓶中，并且蒸发除去适量的溶剂。使用Pasteur吸管将溶液转移至含有冰、水和碳酸钠(Na2CO3)的400mL烧杯中。搅拌整个混合物数小时，直至获得澄清的溶液。在小布氏漏斗中过滤溶液，然后将沉淀溶于乙醇中来进行重结晶。由此获得0.76g黄色固体状t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉，收率90％，m.p.160-162℃。 + HRMS(EI)为C25H25N3O3。分子离子的理论质量为418.2125(M+H)。实测质量：418.2123。 1 H-NMR：(DMSO)δ1.34(9H，s，C(CH3)3)，3.19(2H，q，J＝5.94Hz，＞CH2)，3.38(2H，m，＞CH2)， 6.88(1H，t，J＝5.69Hz，NH)，7.50(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，7.61(1H，m，Ph-H)，7.64(2H，d，J＝8.66Hz，C6′-H和C2′-H)，7.73(1H，m，Ph-H)，7.74(2H，d，J＝8.91Hz，C5′-H和C3′-H)，7.79(1H，d，J＝4.70Hz，C3-H)，7.96(1H，d，J＝6.33Hz，＝CH)，7.99(1H，d，J＝ 8.16Hz，C5-H)，8.48(1H，d，J＝8.41Hz，C8-H)，8.82(1H，d，J＝4.70Hz，C2-H)，10.09(1H，-1 s，NH).IR：υmax cm 3380(CO)，3307(CONH)，1693(CONH)，1673(CONH)，1365(C(CH3)3)， 754(CH2)。 [0137] 通过与HCl反应(产生盐酸盐)或与TFA酸反应(产生三氟乙酸盐)进行t-BOC-氨基酸化合物的脱保护。作为示例，给出用HCl脱保护t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉，其他脱保护以相同的方法进行。对于用TFA脱保护，将要脱保护的化合物置于配有CaCl2阱的圆底烧瓶中。然后加入三氟乙酸，并过夜磁力搅拌混合物。为了获得三氟乙酸盐形式的产物，蒸发除去TFA。 [0138] 从t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉合成β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉： [0139] 在配有CaCl2阱的圆底烧瓶中，将t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉溶于最低量的乙酸乙酯中。然后加入HCl在乙酸乙酯中的饱和溶液。过夜搅拌混合物，其后蒸发除去溶剂。由此获得褐色固体状的β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉二氯化物，+收率77％，m.p.176-178℃。HRMS(EI)为C20H19N3O。分子离子的理论质量318.1601(M+H)。 1 实测质量：318.1601。H-NMR：(DMSO)δ2.50(2H，t，J＝6.19Hz，＞CH2)，3.15(2H，m，＞CH2)， 7.27(1H，d，J＝2.72Hz，Ph-H)，7.30(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，7.57(2H，d，J＝8.41Hz，Ph-H)，7.63(1H，d，J＝16.08Hz，-CH)，7.64(2H，d，J＝8.91Hz，Ph-H)，7.74(2H，m，Ph-H)， 8.12(1H，d，J＝8.66Hz，Ph-H)，8.23(1H，d，J＝7.42Hz，C8-H)，8.88(1H，d，J＝4.45Hz，-1 C2-H)，10.43(1H，s，NH).IR：υmax cm 2852(NH盐)，1674(C＝O)，1584(NH)，1379(NH)。 [0140] 通过与卤代烷基反应进行t-BOC-氨基酸化合物的烷基化。如上所述，用HCl或TFA酸脱保护由此获得的盐。作为示例，给出t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉与碘代甲烷的甲基化和脱保护。 [0141] 从t-BOC-β-丙氨酸-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉合成β-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物： [0142] 将10mL乙腈中的0.42g(0.001mol)的t-Boc-β-丙氨酰基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉和2.21g(0.0155mol)碘代甲烷的混合物过夜搅拌。过滤混合物，获得0.38g橙色固体状的t-Boc-β-丙氨酰基-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓碘化物，收率+70％，180-182℃。HRMS(EI)是C26H29N3O3。分子离子的理论质量432.2282(M+H)。实测质量： 1 432.2280。H-NMR：(DMSO)δ1.39(9H，s，-C(CH3)3)，3.24(2H，四重峰，J＝6.19Hz，＞CH2)， 3.37(2H，m，＞CH2)，4.54(3H，s，-CH3)，6.95(1H，t，J＝6.19Hz，NH)，7.75(2H，d，J＝8.66Hz，C6′-H和C2′-H)，7.96(2H，d，J＝8.66Hz，C5′-H和C3′-H)，8.05(1H，t，J＝7.42Hz，C7-H)，8.08(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，8.24(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，8.27(1H，t，J＝ 6.93Hz，C6-H)，8.44(1H，d，J＝8.91Hz，C5-H)，8.48(1H，d，J＝6.68Hz，C3-H)，9.05(1H，d，J-1 ＝8.66Hz，C8-H)，9.32(1H，d，J＝6.68Hz，C2-H)，10.26(1H，s，NH).IR：υmax cm 3368(NH)， 3276(NH)，1674(CO)，1617(CO)，1592(CONH)，1571(CONH)，1365(CCH3)3)，1395(CH3)。 [0143] 用HCl脱保护0.54g(0.0013mol)此化合物，获得0.39g褐色固体状的β-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物，收率77％，m.p.176-178℃。+ 1 HRMS(EI)是C20H19N3O。分子离子的理论质量318.1601(M+H)。实测质量：318.1601。H-NMR： (DMSO)δ2.50(2H，t，J＝6.19Hz，＞CH2)，3.15(2H，m，＞CH2)，7.27(1H，d，J＝2.72Hz，Ph-H)，7.30(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，7.57(2H，d，J＝8.41Hz，Ph-H)，7.63(1H，d，J＝ 16.08Hz，-CH)，7.64(2H，d，J＝8.91Hz，Ph-H)，7.74(2H，m，Ph-H)，8.12(1H，d，J＝8.66Hz，Ph-H)，8.23(1H，d，J＝7.42Hz，C8-H)，8.88(1H，d，J＝4.45Hz，C2-H)，10.43(1H，s，NH).-1 IR：υmax cm 2852(NH盐)，1674(C＝O)，1584(NH)，1379(NH)。 [0144] 以与上述相似的方式获得典型底物的其他实例： [0145] L-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物，红色固体，+ m.p.244-246℃。HRMS(EI)为C21H23N3O。分子离子的理论质量332.1757(M-2HCl+H)。实测 1 质量：332.1756。H-NMR：(DMSO)δ1.51(3H，d，J＝6.93Hz，-CH3)，4.19(1H，q，J＝6.93Hz，ala-H)，4.55(3H，s，-CH3)，7.86(2H，d，J＝8.66Hz，C6′-H和C2′-H)，8.01(2H，d，J＝8.66Hz，C5′-H和C3′-H)，8.05(1H，m，Ph-H)，8.28(1H，m，Ph-H)，8.16(1H，d，J＝ 16.08Hz，＝CH)，8.29(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，8.44(1H，d，J＝8.91Hz，C5-H)，8.51(1H，d，J＝6.68Hz，C3-H)，9.06(1H，d，J＝8.41Hz，C8-H)，9.40(1H，d，J＝6.68Hz，C2-H)，-1 11.49(1H，s，NH).IR：υmax cm 1693(C＝O)，1597(NH)，1533(NH)，1324(NH)，1369(CH3)。 [0146] L-γ-谷氨酰基-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物。 [0147] 1H-NMR：(DMSO)δ2.05(2H，m，＞CH2)，2.55(2H，m，＞CH2)，3.87(1H，m，＞CH-)，4.49(3H，s，N-CH3)，7.70(2H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.90(2H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.90-8.50(6H，m，Ar-H，-CH＝)，8.60(1H，宽s，＞NH)，8.97(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，9.29(1H，d，J＝5Hz，Ar-H)。 [0148] L-酪氨酰基-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物。 [0149] 1H-NMR：(DMSO)δ3.10(2H，m，＞CH2)，4.30(1H，m，＞CH-)，4.52(3H，s，N-CH3)，6.70(2H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.12(2H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.79(2H，d，J＝7Hz，Ar-H)， 7.98(2H，d，J＝7Hz，Ar-H)，8.00-8.60(6H，m，Ar-H和-CH＝)，9.04(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)， 9.38(1H，d，J＝5Hz，Ar-H)，9.46(1H，宽s，＞OH)。 [0150] L-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物和D-丙氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉鎓二氯化物。 [0151] 1H-NMR：(DMSO)δ1.51(3H，d，J＝6.93Hz，-CH3)，4.19(1H，q，J＝6.93Hz，ala-H)，4.55(3H，s，-CH3)，7.86(2H，d，J＝8.66Hz，C6′-H和C2′-H)，8.01(2H，d，J＝8.66Hz，C5′-H和C3′-H)，8.05(1H，m，Ph-H)，8.28(1H，m，Ph-H)，8.16(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)， 8.29(1H，d，J＝16.08Hz，＝CH)，8.44(1H，d，J＝8.91Hz，C5-H)，8.51(1H，d，J＝6.68Hz，C3-H)，9.06(1H，d，J＝8.41Hz，C8-H)，9.40(1H，d，J＝6.68Hz，C2-H)，11.49(1H，s，NH)。 [0152] 实施例2使用本发明的式I的底物检测肽酶活性 [0153] a)肽酶底物 [0154] 按照实施例1中所述合成化合物β-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)喹啉(β-Ala-ASQ)、L-酪氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓二盐酸 + 盐(Tyr-ASQM)、L-天冬酰胺酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓-双 + TFA(Asn-ASQM)、L-γ-谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)+ (γ-Glu-ASQM)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲+ 基喹啉鎓(二氯化物)(Tri-Ala-ASQM)。 [0155] b)配制培养基 [0156] 将40mg的每种底物溶于4ml二甲亚砜(80mg，对于Asn-ASQM+)中，然后加入至400ml的预先高压灭菌的Columbia培养基中。将6份培养基以20ml/培养皿的比例分配入直径90mm的培养皿中。 [0157] c)接种和温育 [0158] 将来源于保藏中心并属于不同细菌和酵母菌种的17种微生物菌株以约10000菌落形成单位多点接种。 [0159] 通过四区划线法，将10μl大肠杆菌NCTC 10 418和小肠结肠炎耶尔森氏菌NCTC11 176菌株的混合物(在等份的悬浮液中以0.5McFarland稀释至1/20)接种在培养基上。 [0160] 使培养基在37℃下温育24小时，然后在添加或未添加酸的情况下，在365nm的UV灯下视觉检查形成的菌落。 [0161] d)读取的结果 [0162] 所得的结果示于下表1中 [0163] [0164] [0165] NG：无生长；0.5：弱生长；1：中等生长；2：良好生长；-：无颜色 [0166] 在接种有2种菌株(大肠杆菌(E.coli)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica))的混合物的培养皿上，显现两种类型的菌落：大肠杆菌菌株的橙色菌落和小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株的无色菌落。 [0167] e)结论 [0168] 在本发明的培养基上，可借助于菌落的荧光或显色检测微生物的肽酶活性。使用本发明的某些底物，菌落看起来在酸性条件下显色，此实施例中的β-Ala-ASQ正是如此。使用此实施例的其他底物，不需要酸化步骤。 [0169] 最常见地，本发明的底物允许任何类型的微生物生长：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母等，但是一些可能对某些菌群具有毒性，此实施例中的β-Ala-ASQ正是如此。 [0170] 借助于本发明的肽酶底物的各种结构变化，可区分不同的微生物群。此外，因为颜色不在反应培养基中扩散，所以可区分表达所述肽酶活性的细胞或菌落与不表达的那些细胞或菌落，并且可对所述细胞或者菌落进行计数。 [0171] 实施例3使用本发明的式I的底物检测肽酶活性 [0172] a)肽酶底物 [0173] 按照实施例1中所述合成焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹哪啶鎓碘化物化合物。 [0174] b)配制培养基 [0175] 在DMSO型溶剂中配制含有50g/l焦谷氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹哪啶鎓碘化物的贮藏溶液，然后以75mg/l的比例加入至预先高压灭菌并保持熔化的Columbia培养基中。均匀化后，将此培养基分配入120-mm方形培养皿中。还倾倒用作生长对照并表示为C的培养基(Columbia)。 [0176] c)接种和温育4 [0177] 将22种微生物菌株接种在测试点：使用细菌悬浮液以0.5McFarland(15×10CFU/点)沉积1μl。 [0178] 在37℃下温育培养基48小时，然后视觉检查形成的点。 [0179] d)读取的结果 [0180] 所得的结果示于下表中。 [0181] [0182] [0183] 注释： [0184] +++：良好生长/高显色强度；++：中等生长/中等显色强度 [0185] +：弱生长/弱显色强度；-：无生长/无显色 [0186] 实施例4使用本发明的式I的底物检测肽酶活性 [0187] a.肽酶底物 [0188] 按照实施例1中所述合成化合物L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)。 [0189] b.配制培养基 [0190] 在DMSO型溶剂中配制含有50g/l这三种底物的每一种的贮藏溶液，然后以75mg/l的比例加入至预先高压灭菌并保持熔化的Columbia培养基中。均匀化后，将培养基分配入120-mm方形培养皿中。还倾倒用作生长对照并表示为C的培养基(Columbia)。 [0191] c.接种和温育 [0192] 将22 种微生物菌株接种在测试点：使用细菌悬浮液以4 0.5McFarland(15×10CFU/点)沉积1μl。 [0193] 在37℃下温育培养基48小时，然后视觉检查形成的点。 [0194] d.结果 [0195] 所得的结果报告在下表中。 [0196] [0197] [0198] NB：菌株的内部参考号与实施例3中相同。 [0199] 注释： [0200] ++：中等生长/中等显色强度；+：弱生长/弱显色强度； [0201] -：无生长/无显色 [0202] e.结论 [0203] L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)和L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)，这三种底物可检测肽酶活性。氨基酸的数目使得可调整检测特异性。 [0204] 实施例5使用本发明的式I的底物检测肽酶活性 [0205] a)肽酶底物 [0206] 按照实施例1中所述合成化合物L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)和L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)。 [0207] b)配制培养基 [0208] 在DMSO型溶剂中配制含有50g/l这两种底物的每一种的贮藏溶液，然后以75mg/l的比例加入至预先高压灭菌并保持熔化的Columbia培养基中。均匀化后，将培养基分配入直径55mm的培养皿中。还倾倒用作生长对照并表示为C的培养基(Columbia)。 [0209] c)接种和温育 [0210] 按照四分之三区划线法，利用10μl已校正的环，以0.5McFarland用细菌悬浮液接种22种微生物菌株。 [0211] 在37℃下温育培养基48小时，然后视觉检查形成的点。 [0212] d)结果 [0213] 所得的结果报告在下表中。 [0214] [0215] [0216] NB：菌株的内部参考号与实施例3中相同。 [0217] 注释： [0218] ++：中等生长/中等显色强度；+：弱生长/弱显色强度； [0219] -：无生长/无显色 [0220] e)结论 [0221] 化合物L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)和L-丙氨酰基-2-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基喹啉鎓(二氯化物)可检测丙氨酸氨肽酶活性。 [0222] 实施例6使用本发明的式I的底物检测pH变化 [0223] a)pH指示剂 [0224] 按照实施例1中所述合成4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉化合物。 [0225] b)配制培养基 [0226] 在DMSO型溶剂中配制含有50g/l的4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉的贮藏溶液，然后以50mg/l的比例加入至预先高压灭菌并保持熔化的改良的chromID coli 培养基中。均匀化后，将培养基分配入120mm方形的培养皿中。还倾倒用作生长对照并表示为C的培养基(改良的chromID coli )。 [0227] 改良的chromID coli 培养基的组成(g/l)： [0228] 胨：5.5 [0229] 酵母提取物：8 [0230] 氯化钠：5 [0231] 胆汁盐：0.7 [0232] 葡萄糖：10 [0233] 琼脂：12.5 [0234] c)接种和温育 [0235] 在测试点接种44种微生物菌株(详见下表)：使用细菌悬浮液以4 0.5McFarland(15×10CFU/点)沉积1μl。 [0236] 在37℃下温育培养基24小时，然后视觉检查形成的点。 [0237] [0238] [0239] d)读取的结果 [0240] 所得的结果示于下表中： [0241] [0242] [0243] e)结论 [0244] 4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉未表现出任何特别的毒性。 [0245] 它的使用可通过出现在温育24h后仅少量扩散的亮橙色的出现显示酸化。 [0246] 在测试条件下，使用4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉可检测能够使葡萄糖发酵的菌株。 [0247] 实施例7使用本发明的式I的底物检测pH变化 [0248] a)pH指示剂 [0249] 按照实施例1中所述合成4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉化合物。 [0250] b)配制培养基 [0251] 在DMSO型溶剂中配制含有50g/l的4-(4’-氨基苯乙烯基)喹啉的贮藏溶液和含有40g/l的蓝色-b-D-GUR(即5-溴-3-吲哚氧基-b-D-葡糖醛酸)的贮藏溶液，然后分别以50mg/l和200mg/l的比例加入至预先高压灭菌并保持熔化的改良的chromID coli 培养基中。均匀化后，将培养基分配入120mm方形的培养皿中。还倾倒用作生长对照并表示为C的培养基(改良的chromID coli )。 [0252] 改良的chromID coli 培养基的组成(g/l)： [0253] 胨：5.5 [0254] 酵母提取物：8 [0255] 氯化钠：5 [0256] 胆汁盐：0.7 [0257] 葡萄糖：10 [0258] 激活剂：0.2 [0259] 琼脂：12.5 [0260] c)接种和温育 [0261] 在测试点接种43种微生物菌株(详见下表)：使用细菌悬浮液以4 0.5McFarland(15×10CFU/点)沉积1μl。 [0262] 在37℃下温育培养基48小时，然后视觉检查形成的点。 [0263] [0264] [0265] d)读取的结果 [0266] 所得的结果示于下表中。 [0267]

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