生物标记是可用作生物状态指示剂的物质。例如，生物标记可为在存在时可指示 疾病存在的物质。其特征为可进行客观的测量并且可作为以下过程的指示剂加以评估： 正常生物过程、发病过程、或对治疗干预的药理学反应。在临床环境中，生物标记是 与疾病状态或治疗结果密切相关的可观察特征或可检测物质，并且因此可用于测量疾 病进程或治疗效果。
发明内容
本文阐述使用钙流动作为生物标记。本文也阐述快速评价药剂引发细胞凋亡的能 力的方法。本文另外阐述使用钙流动作为生物标记来选择和预测可能对凋亡剂疗法有 反应的患者的方法。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的方法，其包含以 下步骤：使来自个体的生物样品接触凋亡剂；测量生物样品中的钙流动水平，并且若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋亡剂前 的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若在接触 凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的生物样 品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，用钙检测试剂来 测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中，荧光团 选自由以下组成的群组：美拉-2(Fura-2)、吲哚-1(Indo-1)、氟-3(Fluo-3)、钙黄绿素、 罗丹-2(Rhod-2)、罗丹-4、和其衍生物。在某些实施例中，凋亡剂选自由以下组成的 群组：泛HDAC抑制剂和HDAC8抑制剂。在某些实施例中，病况选自由以下组成的 群组：乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前 列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、 神经母细胞瘤、肥大细胞增多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑 色素瘤、骨髓瘤、急性粒细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异 常综合症、慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、慢性髓性白血病、 头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡 细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤细胞。在某些实施例中，生物样品 为血样。在某些实施例中，生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的方法，其包含以 下步骤：使来自个体的生物样品接触泛HDAC抑制剂；测量生物样品中的钙流动水平； 并且若在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋 亡剂前的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的 生物样品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，用钙检测 试剂来测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中， 荧光团选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、 和其衍生物。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃 癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增 多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细 胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、 伯基特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细 胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤 细胞。在某些实施例中，生物样品包含自血样获得的循环肿瘤细胞。在某些实施例中， 生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的方法，其包含以 下步骤：使来自个体的生物样品接触HDAC8抑制剂；测量生物样品中的钙流动水平； 并且若在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋 亡剂前的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的 生物样品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，用钙检测 试剂来测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中， 荧光团选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、 和其衍生物。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃 癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增 多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细 胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、 伯基特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细 胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤 细胞。在某些实施例中，生物样品包含自血样获得的循环肿瘤细胞。在某些实施例中， 生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患者参与临床试验来评估凋亡剂治疗病况的效能的方法，其 包含以下步骤：使来自个体的生物样品接触凋亡剂；测量生物样品中的钙流动水平； 并且若在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋 亡剂前的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的 生物样品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，凋亡剂选 自由以下组成的群组：泛HDAC抑制剂和HDAC8抑制剂。在某些实施例中，用钙检 测试剂来测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中， 荧光团选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、 和其衍生物。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃 癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增 多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细 胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、 伯基特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细 胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤 细胞。在某些实施例中，生物样品包含自血样获得的循环肿瘤细胞。在某些实施例中， 生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的系统，其包含： (a)凋亡剂；(b)测量生物样品中的钙流动水平的构件；其中所述生物样品、凋亡剂与 测量钙流动水平的构件都流体连通。在某些实施例中，凋亡剂选自由以下组成的群组： 泛HDAC抑制剂和HDAC8抑制剂。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤细胞。在某 些实施例中，测量钙流动水平的构件包含钙检测试剂。
任选地，自取自患者的肿瘤或血液获得活检样品。肿瘤样品包括所有肿瘤，包括 实体肿瘤和液体肿瘤二者。在某些实施例中，用自患有实体肿瘤的患者血液分离的循 环肿瘤细胞(CTC)获得活检样品。在某些实施例中，用至少约102个肿瘤细胞实施活检。
任选地，用通过细针抽吸(FNA)、打孔活检获得的临床样品来实施钙流动分析工 作；自活体组织、细胞或流体获得活检样品；或通过活检针或通过开放式外科切口来 实施活检。在某些实施例中，在活体外或在体外用足够大浓度的凋亡剂处理活检样品。
定义：
除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中所用的以下术语是出于本申请案的 目的来定义并且具有以下含义：
本文所用“凋亡剂”是可在细胞中直接或间接诱导细胞凋亡的任何药剂。凋亡剂 的非限制性实例可为HDAC抑制剂、细胞毒性剂、激酶抑制剂、或抗体。在某些实施 例中，凋亡剂选自泛HDAC抑制剂或HDAC8抑制剂。
本文所用“钙检测试剂”意指任何可单独或与一或多种药剂组合用于指示细胞内 钙含量的化学或生物药剂。钙检测试剂的非限制性实例可为标记、染料、光交联剂、 细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、 生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、 与其它分子共价或非共价交互作用的基团、光锁定部分、光化辐射可激发部分、配体、 光可异构化部分、生物素、生物素类似物、纳入重原子的部分、可化学裂解基团、可 光裂解基团、氧化还原活性剂、同位素标记部分、生物物理学探针、磷光基团、化学 发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、生色团、能量转移剂、生物活性剂、 可检测标记、或其组合。
本文所用“钙流动”意指钙离子跨越细胞膜的移动、在细胞器之间的移动、或穿 过细胞质的移动。
本文所用“衍生物”意指通过用一种原子、分子或基团替代或取代另一种原子、 分子或基团自一种化合物或类似结构产生的另一种化合物。作为非限制性实例，若泛 HDAC抑制剂或HDAC8抑制剂含有可氧化氮原子，则可通过已知方法将氮原子转化 为N-氧化物以产生N-氧化物衍生物。作为另一非限制性实例，若泛HDAC抑制剂或 HDAC8抑制剂含有羟基、羧基、硫醇基、或含有一或多个氮原子的任何基团，则可 用适宜保护基团来保护这些基团以产生经保护衍生物。多种适宜保护基团阐述于T.W. 格林(T.W.Greene)，有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)， 约翰威利国际出版(John Wiley & Sons)公司，1981中，其是以引用方式并入本文中。
本文所用“有效量”或“治疗有效量”意指药剂可对个体产生药理学效应或治疗 效应而无过度不良副作用的量。应理解有效量或治疗有效量可随个体不同而变，其取 决于个体的年龄、体重和一般情况、所治疗病况、所治疗病况的严重度、以及处方医 师的判断。
本文所用“荧光团”意指在激发后发射光子的分子。荧光团的非限制性实例可为 美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、和其衍生物。
本文所用“组蛋白脱乙酰基酶”和“HDAC”是指可自组蛋白N-末端赖氨酸残基 的ε-胺基移除乙酰基的酶家族中的任一者。除非另外说明，否则术语“组蛋白”意指 任何组蛋白，包括来自任一物种的H1、H2A、H2B、H3、H4、和H5。人类HDAC 蛋白或基因产物包括(但不限于)HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC4、HDAC-5、 HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。在某些实施例中， HDAC也可得自原生动物或真菌来源。
本文所用“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”、“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”、“HDAC 抑制剂”和“HDAC抑制剂”可交换使用，其是指能与HDAC交互作用并抑制其活性、 更具体来说抑制其酶活性的化合物。抑制HDAC的酶活性意指降低HDAC自组蛋白 移除乙酰基的能力。在某些实施例中，所述抑制具有特异性，即HDAC抑制剂降低 HDAC自组蛋白移除乙酰基的能力时的浓度低于产生某些其它无关生物效应所需的抑 制剂浓度。
本文所用“HDAC8抑制剂”和“HDAC8抑制剂”可互换使用，其是指能与HDAC8 交互作用并抑制其活性、更具体来说抑制其酶活性的化合物。抑制HDAC8酶活性意 指降低HDAC8自蛋白质或其它大分子移除乙酰基的能力。
本文所用“泛HDAC”抑制剂是(a)抑制I类和II类酶的所有11种HDAC亚型 的化学或生物药剂，或(b)显著抑制I类或II类HDAC的不止一种亚型的化学或生物 药剂，其Ki小于1μM。
本文所用“前药”意指药理作用得自体内代谢过程转化的药物或化合物。前药一 般是药物前体，其在投与个体和随后的吸收后通过某种过程(例如通过代谢途径来转 化)转化为活性物质或活性更强的物质。某些前药具有存于所述前药上的化学基团， 其可使所述前药活性降低和/或赋予所述药物以溶解性或某些其它特性。一旦所述化学 基团发生裂解和/或自前药发生改变，立即生成活性药物。
本文所用“治疗(treat、treating或treatment”是指(但不限于)抑制病症或疾病 的进展，例如阻止疾病或病症发展。癌症治疗的非限制性实例包括在恶性细胞中诱导 细胞凋亡，或任何导致抑制恶性细胞生长和/或抑制恶性细胞转移能力的效应。
附图说明
图1展示通过外部药剂诱导细胞凋亡的示意图，其涉及PLCγ1和下游的钙信号 转导。
图2展示在朱卡特(Jurkat)细胞中通过不同HDAC抑制剂快速诱导钙流动：(A)对 照；(B)0.2μM泛HDAC抑制剂PCI-24781，并且在用PCI-24781处理2天后通过膜 联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比为80％；(C)10μM HDAC8抑制剂PCI-34051，并且 在用PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比为60％；(D)1μM MS-275；(E)1mM丁酸Na；和(F)2μM SAHA。钙流动反应与高细胞凋亡百分比相关。
图3显示在HH细胞(缺少活性PLCγ酶)中通过泛HDAC抑制剂化合物PCI-24781 和HDAC8抑制剂化合物PCI-34051中的任一者都不诱导钙流动。图中也展示在用 PCI-24781和PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比。钙流动 反应与高细胞凋亡百分比相关。(A)对照；(B)10μM HDAC8抑制剂PCI-34051；(C)0.2 μM泛HDAC抑制剂PCI-24781。
图4是展示HDAC8抑制剂化合物(PCI-34051；5μM)在野生型朱卡特细胞(朱卡 特)、磷脂酶C-γ1缺陷型细胞(J.γ)、T受体缺陷型细胞(P116)、或ZAP-70缺陷型细胞 (JRT3-T.5)中实现细胞凋亡的能力的条形图。朱卡特细胞是自患有急性淋巴细胞性白血 病的14岁龄男童的外周血建立的人类T细胞白血病细胞。
图5展示当将磷脂酶C抑制剂添加至具有或不具有HDAC抑制剂的朱卡特细胞 中时的钙动员效应。(A)对照。(B)HDAC8抑制剂PCI-34051。(C)显示在添加磷脂酶 C抑制剂(U-73122：1-[6-((17b-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)胺基)己基]-1H-吡咯 -2，5-二酮)时抑制朱卡特细胞中通过PCI-34051快速诱导的钙动员。(D)PLC的无活性 类似物抑制剂(U-73343：1-[6-((17b-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)胺基)己基]-2，5- 吡咯烷二酮)对PCI-34051诱导的钙动员无效应。(E-F)PLCγ抑制剂(U-73343、 U-73122)二者都不单独诱导钙流动。
图6是展示PLC抑制剂在朱卡特细胞中调节PCI-34051诱导细胞凋亡的条形图。 在2天后测量在存在或不存在PCI-34051和膜联蛋白-V的情况下经PLC抑制剂 U-73122和无活性类似物U-73343处理的朱卡特细胞和J.γ细胞。
图7是展示在野生型(朱卡特)细胞与J.γ1(J.γ)朱卡特细胞中钙效应物(毒胡萝 卜内酯；0.2μM)对PCI-34051(10μM)诱导细胞凋亡的效应的条形图。
图8(A)是展示在野生型(朱卡特)细胞与J.γ1(J.γ)朱卡特细胞中钙螯合剂 (BAPTA-AM；0.5μM)对PCI-34051(10μM)诱导细胞凋亡的效应的条形图。(B)是展示 在朱卡特细胞中通过细胞可渗透钙螯合剂BAPTA-AM阻断PCI-34051诱导钙流动的 线形图。
图9展示一系列免疫印迹图像，其显示在野生型(朱卡特)细胞与J.γ1(J.γ)朱卡 特细胞中细胞色素C氧化酶于用凋亡前体药剂处理后的不同时间点自线粒体易位至胞 质溶胶。
图10是展示在朱卡特细胞中由HDAC8敏感抑制剂化合物(PCI-34051)诱导的剂 量依赖性细胞内钙反应的线形图。
图11是展示在朱卡特细胞中由泛HDAC抑制剂化合物(PCI-24781)诱导的剂量依 赖性细胞内钙反应的线形图。
图12(A)显示在拉莫斯(Ramos)细胞中PCI-24781诱导钙流动，但PCI-34051不诱 导钙流动。也展示在用PCI-24781和PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细 胞凋亡百分比；(B)显示在J.γ细胞中PCI-24781或PCI-34051都不诱导钙流动。也展 示在用PCI-24781和PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比； (C)显示在HCT-116结肠细胞中PCI-24781诱导钙流动，但PCI-34051不诱导钙流动。 也展示在用PCI-24781和PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分 比；(D)在PC3前列腺细胞中显示PCI-24781或PCI-34051都不诱导钙流动。也展示 那些细胞系中在用PCI-24781和PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V染色测量的细 胞凋亡百分比。在所有图中钙流动反应都与高细胞凋亡百分比相关。
图13显示在A549细胞中PCI-24781诱导钙流动，但PCI-34051不诱导钙流动。 肺肿瘤细胞系A549是上皮实体肿瘤细胞系的代表，其通过可用钙流动预测的细胞凋 亡诱导对泛HDAC抑制剂PCI-24781发生反应，而T细胞特异性HDAC8选择性抑制 剂PCI-34051在这些细胞中既不诱导细胞凋亡也不诱导钙流动。也展示在用PCI-24781 和PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比；
图14显示在THP-1细胞中PCI-24781诱导钙流动，但PCI-34051不诱导钙流动。 THP-1是单核细胞性白血病细胞系，其中泛HDAC抑制剂PCI-24781可诱导细胞凋亡 和钙流动，而HDAAC8选择性抑制剂PCI-34051不诱导。也展示在用PCI-24781和 PCI-34051处理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比；
图15展示在朱卡特细胞中通过PCI-24781快速诱导钙动员。PCI-24781的两种主 要代谢产物羧酸代谢产物PCI-27789和酰胺代谢产物PCI-27787不具有组蛋白脱乙酰 基酶活性。PCI-27789和PCI-27787不能在朱卡特细胞中引发钙流动诱导。
图16显示在朱卡特细胞中PCI-24781诱导细胞凋亡，而PCI-24781、PCI-27789 和PCI-27787的无活性代谢产物没有细胞凋亡诱导效应。用PCI-24781、PCI-27789或 PCI-27787(0.2μM)处理朱卡特细胞并在2天后通过膜联蛋白-V染色测量细胞凋亡。
图17显示在皮肤T细胞淋巴瘤患者活检(SF-03)中PCI-24781和PCI-34051快速 诱导钙流动。(A)对照；(B)0.2μM PCI-24781；(C)10μM PCI-34051。
图18显示在皮肤T细胞淋巴瘤患者活检(SF-06)PCI-24781或PCI-34051中不诱导 钙流动。(A)对照；(B)0.2μM PCI-24781；(C)10μM PCI-34051。

某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的方法，其包含以 下步骤：使来自个体的生物样品接触凋亡剂；测量生物样品中的钙流动水平，并且若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋亡剂前 的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若在接触 凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的生物样 品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，用钙检测试剂来 测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中，荧光团 选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、和其衍 生物。在某些实施例中，凋亡剂选自由以下组成的群组：泛HDAC抑制剂和HDAC8 抑制剂。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、 非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌、胃 肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增多症、 睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细胞白血 病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、伯基 特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细胞淋 巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤细胞。 在某些实施例中，生物样品为血样。在某些实施例中，生物样品包含至少约100个肿 瘤细胞。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的方法，其包含以 下步骤：使来自个体的生物样品接触泛HDAC抑制剂；测量生物样品中的钙流动水平； 并且若在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋 亡剂前的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的 生物样品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，用钙检测 试剂来测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中， 荧光团选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、 和其衍生物。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃 癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增 多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细 胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、 伯基特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细 胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤 细胞。在某些实施例中，生物样品包含自血样获得的循环肿瘤细胞。在某些实施例中， 生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的方法，其包含以 下步骤：使来自个体的生物样品接触HDAC8抑制剂；测量生物样品中的钙流动水平； 并且若在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋 亡剂前的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的 生物样品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，用钙检测 试剂来测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中， 荧光团选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、 和其衍生物。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃 癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增 多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细 胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、 伯基特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细 胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤 细胞。在某些实施例中，生物样品包含自血样获得的循环肿瘤细胞。在某些实施例中， 生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患者参与临床试验来评估凋亡剂治疗病况的效能的方法，其 包含以下步骤：使来自个体的生物样品接触凋亡剂；测量生物样品中的钙流动水平； 并且若在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平超过在对照中或在接触凋 亡剂前的生物样品中观察到的钙流动水平，则选定所述患者用凋亡剂进行治疗；或若 在接触凋亡剂后的生物样品中所观察到的钙流动水平未超过在对照或接触凋亡剂前的 生物样品中所观察到的钙流动水平，则选择替代性治疗。在某些实施例中，凋亡剂选 自由以下组成的群组：泛HDAC抑制剂和HDAC8抑制剂。在某些实施例中，用钙检 测试剂来测量钙流动水平。在某些实施例中，钙检测试剂是荧光团。在某些实施例中， 荧光团选自由以下组成的群组：美拉-2、吲哚-1、氟-3、钙黄绿素、罗丹-2、罗丹-4、 和其衍生物。在某些实施例中，病况选自由以下组成的群组：乳腺癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、胃 癌、胃肠道间质肿瘤、胰腺癌、胚细胞瘤、肥大细胞瘤、神经母细胞瘤、肥大细胞增 多症、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、急性粒细 胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症、慢性髓性白血病、 伯基特淋巴瘤、慢性髓性白血病、头颈淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、CLL淋巴瘤、B细 胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤与滤泡细胞淋巴瘤。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤 细胞。在某些实施例中，生物样品包含自血样获得的循环肿瘤细胞。在某些实施例中， 生物样品包含至少约100个肿瘤细胞。
某些实施例包含选择患有对用凋亡剂治疗有反应的病况的患者的系统，其包含： (a)凋亡剂；(b)测量生物样品中的钙流动水平的构件；其中所述生物样品、凋亡剂与 测量钙流动水平的构件都流体连通。在某些实施例中，凋亡剂选自由以下组成的群组： 泛HDAC抑制剂和HDAC8抑制剂。在某些实施例中，生物样品包含肿瘤细胞。在某 些实施例中，测量钙流动水平的构件包含钙检测试剂。
磷酸肌醇磷脂酶C(PLC)家族和Ca介导信号转导
磷酸肌醇磷脂酶C(PLC)家族是参与信号转导的真核细胞酶家族。PLC由6个子 家族组成其总共包含13种单独的亚型。PLCγ参与针对外部刺激素(例如生长因子、 神经递质)和内部刺激素(例如PI3K)的T细胞反应。
已显示磷脂酶C(PLC)家族的成员可催化磷脂酰肌醇PIP2的水解，从而生成两种 第二信使肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)。PIP2的水解是以两个连续步骤来进行。 第一个反应是磷酸转移酶步骤，其涉及肌醇环2′位上的羟基与磷酸酯基团之间的分子 内攻击，从而产生环状IP3中间体。此时生成DAG。然而，在第二磷酸二酯酶步骤中， 若环状中间体在活性位点内保持足够长时间，则可被水分子攻击，从而生成最终非环 状IP3产物。
IP3和DAG调节对细胞信号转导具有重要作用的下游蛋白的活性。IP3是可溶的 并通过细胞质扩散并且与内质网(ER)上的IP3受体交互作用，从而导致释放钙并提高 细胞内钙含量(钙流动的一个来源)。DAG因其疏水特征而保持束缚在质膜内叶上， 其中DAG募集蛋白激酶C(PKC)。PKC在与钙离子结合时活化。PKC的活化通过刺 激钙敏感蛋白引发多种细胞反应。
钙流动似乎具有至少两个组份：首先自ER释放细胞内钙，并且随后通过细胞色 素C引发钙释放。细胞色素C因线粒体外膜渗透性提高而自线粒体释放，并且在与细 胞凋亡相关的形态改变之前发挥调控功能。在细胞色素C释放后其立即结合Apaf-1 和ATP，然后其与半胱天冬酶-9前体结合产生称作凋亡体的蛋白质复合物。凋亡体将 半胱天冬酶前体裂解为其活性形式半胱天冬酶-9，其继而激活其它半胱天冬酶并引发 导致细胞凋亡的级联事件。所提出的钙流动与细胞凋亡之间的机制展示于图1中。
HDAC抑制剂
在真核细胞中，染色质与组蛋白连接以形成核小体。每个核小体都是由蛋白质八 聚体构成，所述八聚体由每种组蛋白H2A、H2B、H3和H4的两份拷贝构成。DNA 缠绕此蛋白核心，其中组蛋白的碱性氨基酸与DNA中带负电荷的磷酸酯基交互作用。 这些核心组蛋白最常见的翻译后修饰是保守高碱性N-末端赖氨酸残基中ε-胺基的可逆 乙酰化。组蛋白的可逆乙酰化是基因表达的主要调节因素。可通过改变转录因子的可 达性来调节DNA的基因表达。
在正常细胞中，组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)和组蛋白乙酰基转移酶(HAT)控制组蛋 白的乙酰化程度。抑制HDAC可导致高乙酰化组蛋白的积累，此可引起多种细胞反应。
人们早已发现组蛋白乙酰化和去乙酰化与转录控制相关。在某些实施例中，HDAC 抑制剂(尤其包括曲古抑菌素(trichostatin)A、丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、 缩酚酸肽(depsipeptide)、MS-275、和制蚜菌素(aphicidin))可促进组蛋白乙酰化，从而 导致染色质结构的松弛。染色质松弛和解螺旋容许并增强多种基因的表达，包括那些 在分化过程中涉及的基因，例如p21CIP1。实际上，已显示HDAC抑制剂(例如SAHA、 丁酸钠)可在多种人类白血病细胞系中诱导成熟。
根据与三种独特酵母HDAC的结构或序列同源性可将哺乳动物HDAC分为三个 主要类别：Rpd3(I类)、Hdal(II类)、和Sir2/Hst(III类)。Rpd3同源性I类包 括HDAC 1、2、3、8和11；Hdal同源II类包括HDAC 4、5、6、7、9(9a和9b)和 10；Sir2/Hst同源III类包括SIR T1、2、3、4、5、6和7。近期研究揭示另一具有固 有HAT或HDAC活性的细胞因子家族。这些细胞因子似乎是参与调节细胞周期、DNA 修复和转录的非组蛋白蛋白质。多种转录辅激活因子(包括但不限于p400AF、BRCA2 和ATM样蛋白)可用作HAT。某些转录阻遏物在染色质环境下通过募集常见染色质 修饰复合物来表现HDAC活性。例如，Mas蛋白家族(Mas1、Mxi1、Mad3和Mad4) 包含碱性螺旋-环-螺旋-环-螺旋-拉链类转录因子，其与Max在其DNA结合位点处异 二聚化。Mad:Max异二聚体可在其DNA结合位点处通过募集“阻遏复合物”而用作 转录阻遏物。阻止与Max或msin3辅阻遏复合物交互作用的突变不能阻止细胞生长。 因此，本文所用HDAC抑制剂是指任何能抑制任一上述蛋白质HDAC活性的药剂。
人们已研究了HDAC抑制剂对癌细胞的治疗效应。已报导丁酸和其衍生物(包括 苯基丁酸钠)可在体外诱导人类结肠癌、白血病和视网膜母细胞瘤细胞系的细胞凋亡。 其它已广泛研究抗癌活性的HDAC抑制剂包括曲古抑菌素A和车迫辛(trapoxin)。
泛HDAC抑制剂
泛HDAC抑制剂的非限制性实例包括短链脂肪酸，例如丁酸酯、4-苯基丁酸酯或 丙戊酸；异羟肟酸，例如辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、二芳基异羟肟酸酯A-161906、 二环芳基-N-羟基甲酰胺、CG-1521、PXD-101、磺酰胺异羟肟酸、LAQ-824、恶弗莱 汀(oxamflatin)、斯科肽(scriptaid)、间羧基肉桂酸双异羟肟酸、车迫辛-异羟肟酸类似物、 曲古抑菌素A、曲古抑菌素C、间羧基肉桂酸双羟酰胺恶弗莱汀(CBHA)、ABHA、斯 科肽、吡咯酰胺(pyroxamide)、和丙烯酰胺；含环氧酮环状四肽，例如车迫辛、阿皮德 森(apidicin)、缩酚酸肽、HC毒素、克拉霉多素(chlamydocin)、二异肽素(diheteropeptin)、 WF-3161、Cyl-1和Cyl-2；苯甲酰胺或非含环氧酮环状四肽，例如FR901228、阿皮斯 丁(apicidin)、含异羟肟酸环肽(CHAP)、苯甲酰胺、MS-275(MS-27-275)、和CI-994； 德普德辛(depudecin)；PXD101；有机硫化合物；和芳酰基-吡咯羟基-酰胺(APHA)。
在某些实施例中，泛HDAC抑制剂为PCI-24781、SAHA(Zolinza)、曲古抑菌素 A、MS-275、LBH-589、PXD-101、MGCD-0103、JNJ-26481585、R306465(J&J)、或 丁酸钠。
在某些实施例中，泛HDAC抑制剂是选自以下文献中所揭示化合物或化学式的化 合物：美国专利申请案第10/818,755号；第10/537,115号；第10/922,119号；第11/100,781 号；第11/779,743号；PCT专利申请案第PCT/US2005/046255号或美国专利第7,276,612 号；这些参考文献的揭示内容是全文并入本文中。
在某些实施例中，泛HDAC抑制剂具有式(I)结构：

式(I)，
其中：
R1为氢或烷基；
X为-O-、-NR2-、或-S(O)n，其中n为0-2并且R2为氢或烷基；
Y为任选地经环烷基取代的伸烷基、任选地经取代的苯基、烷硫基、烷基亚磺酰 基、烷基磺酰基、任选地经取代的苯基烷硫基、任选地经取代的苯基烷基磺酰基、羟 基、或任选地经取代的苯氧基；
Ar1是亚苯基或杂亚芳基，其中所述Ar1任选地经一个或两个独立选自以下的基团 取代：烷基、卤基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基、或卤代烷基；
R3为氢、烷基、羟基烷基或任选地经取代的苯基；并且
Ar2为芳基、芳烷基、芳烯基、杂芳基、杂芳烷基、杂芳烯基、环烷基、环烷基 烷基、杂环烷基、或杂环烷基烷基；
以及其各立体异构体、各几何异构体、或混合物；或其医药上可接受的盐。
HDAC8和HDAC8抑删
HDAC8是具有377个残基的42kDa蛋白质，其定位于众多种组织的细胞核中、 以及若干种人类肿瘤细胞系的细胞核中。全长HDAC8的野生型形式阐述于基因库登 录号(GenBank Accession Number)NP 060956中。经解析，HDAC8结构可结合四种不 同的异羟肟酸酯抑制剂。
HDAC8是具有体外脱乙酰基酶活性的HDAC亚型，其在多种组织类型和肿瘤细 胞系中表达。基于序列同源性，可将HDAC8视为I类酶，但系统发育分析已显示其 位于I类酶与II类酶的分界附近。HDAC8在若干个方面与原型I类酶有所不同，包括 其所报导的细胞质——与细胞核相反——亚细胞定位；其活性位点结合各种金属，包 括Fe(II)和K+；以及可通过环状AMP依赖性蛋白激酶(PKA)20-22磷酸化Ser39对其 催化活性进行负向调控。最近已解析出人类HDAC8的三维晶体结构并揭示了HDAC8 的独特特征，包括由L1活性位点环介导的结合位点袋近端的构象柔性，以及Ser39磷 酸化对活性位点抑制的独特影响。
HDAC8主要在胰腺兰格汉斯(Langerhans)岛中的δ细胞、小肠上皮细胞和神经内 分泌细胞中表达。值得注意的是，δ细胞表达并分泌促生长素抑制素，其为抑制胰岛 素和生长激素分泌的肽类激素。不受限于理论，据信HDAC8活性可促使δ细胞表达 促生长素抑制素。因此，预期抑制HDAC8活性可降低促生长素抑制素自δ细胞的表 达和分泌，并因此提高全身胰岛素和生长激素水平。
在肿瘤细胞系中大量表达HDAC8。实例包括以下细胞系：朱卡特、HuT78、K562、 PC3和OVCR-3。已证实，抑制HDAC8活性可通过诱导细胞凋亡来降低T细胞衍生 肿瘤细胞(例如朱卡特细胞)的增殖。HDAC8抑制不影响非癌细胞或除T细胞衍生 细胞系以外的肿瘤细胞系的增殖。因此，选择性HDAC8抑制剂可用于减缓或阻止T 细胞衍生癌症的进展，同时对非癌细胞表现较低毒性或无毒性。
在某些实施例中使用选择性HDAC8抑制剂化合物和其组合物来治疗患有T细胞 淋巴瘤的个体，例如外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤或成 人T细胞淋巴瘤。
在某些实施例中，HDAC8抑制剂选自由以下组成的群组：吲哚-6-甲酸羟基酰胺 化合物和吲哚-5-甲酸羟基酰胺化合物、吲哚衍生物、其医药上可接受的盐、其医药上 可接受的N-氧化物、其医药活性代谢产物、其医药上可接受的前药、和其医药上可接 受的溶剂合物。
在某些实施例中，HDAC8抑制剂选自由以下组成的群组：PCI-34051、PCI-46646、 PCI-34260、PCI-34263、R306465(J&J)、和其衍生物。
在某些实施例中，HDAC8抑制剂是选自以下参考文献中所揭示化合物或化学式 的化合物：美国专利申请案第60/911,857号；第60/944,409号；第60/954,777号；第 11/779,743号；第60/865,825号；第11/940,232号；第11/687,565号；或PCT专利申 请案第PCT/US2007/073802号；第PCT/US2007/084718号；第PCT/UC2007/06714号； 这些参考文献的揭示内容是全文并入本文中。
在某些实施例中，HDAC8抑制剂是具有式(A)结构的异羟肟酸：

式(A)，
其中：
Q是任选地经取代的C5-12芳基或任选地经取代的C5-12杂芳基；
L是具有至少4个原子的连接体；
R1是H或烷基；
以及其医药上可接受的盐、医药上可接受的N-氧化物、医药活性代谢产物、医药 上可接受的前药、医药上可接受的溶剂合物。
钙流动作为HDAC抑制剂的快速药效生物标记
实验已证实，钙流动与细胞发生细胞凋亡的能力相关。在细胞凋亡前经常发生正 向钙流动，而缺少钙流动或负向钙流动通常表示细胞不会发生细胞凋亡。因此，在某 些实施例中，测量钙流动水平以确定患者是否会对凋亡剂治疗有反应。在某些实施例 中，测量钙流动水平以确定是否可将患者引入凋亡剂临床试验中。
在某些实施例中，钙流动与至少10％或更高的细胞凋亡程度％相关。在某些实施 例中，钙流动与至少15％或更高的细胞凋亡程度％相关。在某些实施例中，钙流动与 至少20％或更高的细胞凋亡程度％相关。在某些实施例中，钙流动与至少25％或更高 的细胞凋亡程度％相关。在某些实施例中，钙流动与至少30％或更高的细胞凋亡程度 ％相关。
图2展示在朱卡特细胞中钙流动与细胞凋亡之间的联系。用泛HDAC抑制剂 PCI-24781(0.2μM)处理朱卡特细胞。在添加PCI-24781后观察到细胞内钙出现可测量 的提高。此外，在用PCI-24781处理2天后通过膜联蛋白-V来测量细胞凋亡百分比。 细胞凋亡总量为80％。同样用HDAC8抑制剂PCI-34051(10μM)处理朱卡特细胞。在 添加此HDAC8抑制剂后观察到细胞内钙出现可测量的提高。在用PCI-34051再处理2 天后，通过膜联蛋白-V来测定细胞凋亡程度。细胞凋亡百分比为60％。同样用1μM MS-275、1mM丁酸Na、和2μM SAHA来实施实验。在所有情况下，发生正向钙流 动反应后都会有高百分比的细胞发生细胞凋亡。
图3展示钙流动对酶PLCγ的依赖性。用泛HDAC抑制剂PCI-24781和HDAC8 抑制剂PCI-34051来处理缺少PLCγ的肿瘤细胞系(人类肝癌(HH)细胞：T细胞淋巴 瘤)。这两种HDAC抑制剂都不诱导钙流动。也展示在用PCI-24781和PCI-34051处 理2天后通过膜联蛋白-V测量的细胞凋亡百分比。(A)对照；(B)10μM HDAC8抑制 剂PCI-34051；(C)0.2μM泛HDAC抑制剂PCI-24781。人们在理论上推测，泛HDAC 抑制剂或HDAC8抑制剂可激活PLCγ，由此引发导致细胞凋亡的钙介导下游途径。这 些实验也证实钙流动与细胞凋亡有关：PLCγ突变细胞(HH细胞)不发生细胞凋亡。
图5和6进一步展示钙流动对PLCγ的依赖性。用PLCγ抑制剂(抑制剂U-73122： 1-[6-((17b-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)胺基)己基]-1H-吡咯-2，5-二酮；抑制剂 U-73343：1-[6-((17b-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)胺基)己基]-2，5-吡咯烷二酮)单 独处理或与HDAC8抑制剂PCI-34051组合处理含有酶PLCγ的肿瘤细胞系(朱卡特细 胞)。仅用PLCγ抑制剂处理的含有酶PLCγ的肿瘤细胞系(朱卡特细胞)不发生钙流 动。(图5：(E)和(F))。然而，同时用HDAC8抑制剂和PLCγ抑制剂二者处理的相 同朱卡特细胞发生钙流动或发生延迟钙流动。(图5：(B)、(C)和(D))。这些实验也 证实钙流动与细胞凋亡有关：用PLCγ抑制剂(U-73343和U-73122)阻断钙流动可阻 断细胞凋亡(图6)。
图12表明，可使用钙流动来预测针对泛HDAC抑制剂或HDAC8抑制剂的敏感 性。图12(A)显示在拉莫斯细胞中PCI-24781诱导钙流动，但PCI-34051不诱导钙流动。 (B)显示在J.γ细胞中PCI-24781或PCI-34051都不诱导钙流动。(C)显示在HCT-116结 肠细胞中PCI-24781诱导钙流动，但PCI-34051不诱导钙流动。(D)显示在PC3前列腺 细胞中PCI-24781或PCI-34051都不诱导钙流动。在用PCI-24781或PCI-34051处理后 发生细胞凋亡的肿瘤细胞系经历钙流动。在用PCI-24781或PCI-34051处理后不发生 细胞凋亡的肿瘤细胞系不经历钙流动。
图13和14展示为将对泛HDAC抑制剂PCI-24781和HDAC8抑制剂PCI-34051 的敏感性与发生钙流动的能力相关联而实施的分析。测试两种肿瘤细胞系(A549肺肿 瘤、THP-1单核细胞性白血病)。图13显示在A549细胞中PCI-24781诱导钙流动， 但PCI-34051不诱导钙流动。A549因应PCI-24781而发生细胞凋亡。此细胞凋亡是通 过钙流动来预测。在这些细胞中T细胞特异性HDAC8选择性抑制剂PCI-34051既不 诱导细胞凋亡也不诱导钙流动。图14显示在THP-1细胞中PCI-24781诱导钙流动， 但PCI-34051不诱导钙流动。THP-1是单核细胞性白血病细胞系，其中PCI-24781诱 导细胞凋亡和钙流动，并且PCI-34051不诱导。
图15和16展示为将对泛HDAC抑制剂PCI-24781和PCI-24781的两种主要代谢 产物(PCI-27789：羧酸代谢产物和PCI-27787：酰胺代谢产物)与发生钙流动的能力 相关联而实施的分析。测试朱卡特细胞。图15显示在朱卡特细胞中PCI-24781快速诱 导钙动员。在朱卡特细胞中PCI-24781的两种代谢产物(羧酸代谢产物PCI-27789和 酰胺代谢产物PCI-27787)不具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性并且不能引发钙流动 诱导。

图16显示在朱卡特细胞中PCI-24781诱导细胞凋亡，而PCI-27789和PCI-27787 无细胞凋亡诱导效应。
两种代谢产物的化学结构与PCI-24781类似。其与PCI-24781的区别仅在于分子 的“活性”部分：PCI-27789用羧酸基团来代替PCI-24781的异羟肟酸基团；PCI-27787 用酰胺基团来代替PCI-24781的异羟肟酸基团。
在某些实施例中，钙流动可用作临床生物标记来帮助确定肿瘤是否对凋亡剂敏 感。因此，在某些实施例中，使用钙流动来选择和预测可能对泛HDAC抑制剂或HDAC8 抑制剂有反应的患者。
图17展示在患有皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的患者(患者SF-03)的原发性肿瘤 活检中测量的正向钙流动。用胶原酶处理得自5mm打孔活检的细胞，并且在添加有 泛HDAC抑制剂PCI-24781或HDAC8抑制剂PCI-34051的生长培养基中进行培养。 两种化合物在其与细胞接触后5秒内都导致在统计学上显著的快速钙流动。两种化合 物在处理40小时后也都导致肿瘤细胞的细胞凋亡提高。
图18展示在第二CTCL患者(患者SF-06)的原发性肿瘤活检中测量的负向钙流 动。用胶原酶处理得自5mm打孔活检的细胞，并且在添加有泛HDAC抑制剂 PCI-24781或HDAC8抑制剂PCI-34051的生长培养基中进行培养。HDAC抑制剂既不 刺激钙流动也不导致肿瘤细胞发生细胞凋亡。
钙流动分析
来自原发性肿瘤的细胞提取物
自预定个体获得肿瘤活检样品。在切除后立即将活检样品置入50ml法肯(Falcon) 管内的RPMI 1640中并在冰上储存。尽可能快地将其运送至处理位点。保存纳入肿瘤 样品的上清液。将肿瘤切碎成＜0.3-0.5mm厚的碎片，并在37℃下于振荡器上用含有1 mg/ml胶原酶D(罗氏制药(Roche))的10ml RPMI 1640消化30min。通过添加10mM EDTA来终止消化，并将其置于冰上。用冰冷PBS/10mM EDTA 3X将所消化组织洗 涤3X，然后将其与剩余上清液合并。使经消化组织和上清液经过70-μM孔尼龙网筛 (BD生物科技公司(BD Biosciences))并在4℃下离心(300g)20min。倾倒出液体，留 下所提取的细胞。使所提取细胞于RPMI完整培养基中再悬浮至1×106细胞/mL的浓 度。在药物处理和分析中，于37℃培养箱内在RPMI+10％FBS中将细胞培养约2天。
来自血液的循环肿瘤细胞提取物
自预定个体获得血样。用红细胞溶解缓冲液溶解RBC。根据制造商说明书来施用 涂布有上皮特异性抗体的免疫原性珠粒。然后将珠粒洗涤若干次以移除任何非上皮细 胞。使所提取上皮细胞于RPMI完整培养基中再悬浮至1×106细胞/mL的浓度。在药 物处理和分析中，于37℃培养箱内在RPMI+10％FBS中将细胞培养约2天。
细胞内钙测量
为获得在添加凋亡剂之前的钙流动水平，将一等份经培养细胞(1×106细胞/mL) 在37℃和无光环境下于含有10％胎牛血清和5M吲哚-1AM(英杰公司(Invitrogen)) 的汉克斯平衡盐溶液(Hanks′Balanced Salt Solution)(HBSS；英杰公司)中培养1h。然 后收获细胞，离心(以200Xg离心5min)并用HBSS洗涤三次以移除细胞外吲哚-1， 并在HBSS中将其再调节至1×106细胞/mL。
在37℃下用荧光板读数器(福鲁森特FL(Fluoroskan Ascent FL)；赛默科技公司 (Thermo Scientific))来监测荧光。在5min的温度平衡期后，在338nm下激发样品并 经5min时间段以动态模式和6秒的间隔在405和485nm下收集发射。通过在测量结 束时添加10μM离子霉素(ionomycin)来测定最大比值。
将凋亡剂添加至第二等份经培养细胞(1×106细胞/mL)中。在37℃和无光环境 下于含有10％胎牛血清和5μM吲哚-1AM(英杰公司)的汉克斯平衡盐溶液(HBSS；英 杰公司)中将细胞培养1h。然后收获细胞，离心(以200Xg离心5min)并用HBSS 洗涤三次以移除细胞外吲哚-1AM，并在HBSS中将其再调节至1×106细胞/mL。然 后将细胞与凋亡剂一起培养5分钟。
在每个实验的全程中于37℃下用荧光板读数器(福鲁森特FL；赛默科技公司)来监 测荧光。在5min的温度平衡期后，在338nm下激发样品并经5min时间段以动态模 式和6秒的间隔在405和485nm下收集发射。通过在测量结束时添加10μM离子霉 素来测定最大比值。将细胞内[Ca2+]变化或钙流动显示为与游离钙结合的吲哚-1比率的 变化(405nm/485nm)。
实例
应将以下实例视为仅具有阐释性，并且无论如何不以任何方式限制其余揭示内 容。
自肿瘤组织提取T细胞并测量钙流动的方案
实例1：细胞内钙测量
为获得在添加凋亡剂之前的钙流动水平，将一等份经培养细胞(1×106细胞/mL) 在37℃和无光环境下于含有10％胎牛血清和5M吲哚-1AM(英杰公司)的汉克斯平衡 盐溶液(HBSS；英杰公司)中培养1h。然后收获细胞，离心(以200Xg离心5min) 并用HBSS洗涤三次以移除细胞外吲哚-1，并在HBSS中将其再调节至1×106细胞 /mL。
在37℃下用荧光板读数器(福鲁森特FL；赛默科技公司)来监测荧光。在5min的 温度平衡期后，在338nm下激发样品并经5min时间段以动态模式和6秒的间隔在 405和485nm下收集发射。通过在测量结束时添加10μM离子霉素来测定最大比值。
将凋亡剂添加至第二等份经培养细胞(1×106细胞/mL)中。在37℃和无光环境 下于含有10％胎牛血清和5μM吲哚-1AM(英杰公司)的汉克斯平衡盐溶液(HBSS；英 杰公司)中将细胞培养1h。然后收获细胞，离心(以200Xg离心5min)并用HBSS 洗涤三次以移除细胞外吲哚-1AM，并在HBSS中将其再调节至1×106细胞/mL。然 后将细胞与凋亡剂一起培养5分钟。
在每个实验的全程中于37℃下用荧光板读数器(福鲁森特FL；赛默科技公司)来监 测荧光。在5min的温度平衡期后，在338nm下激发样品并经5min时间段以动态模 式和6秒的间隔在405和485nm下收集发射。通过在测量结束时添加10μM离子霉 素来测定最大比值。将细胞内[Ca2+]变化或钙流动显示为与游离钙结合的吲哚-1比率的 变化(405nm/485nm)。
实例2：细胞凋亡测量
在单独用HDAC抑制剂处理和用HDAC抑制剂与qVD、BAPTA-AM、毒胡萝卜 内酯和/或磷脂酶C抑制剂组合处理2或3天后使用膜联蛋白-V染色来评估细胞毒性。 根据制造商方案以FACSCalibur仪器(贝迪医疗公司(Becton-Dickinson))使用得自生 物视觉公司(BioVision)的试剂来分析膜联蛋白-V结合。参见图2、3、4、6、7、12和 16。
实例3：得自原发性肿瘤的细胞提取物：
在切除后立即将肿瘤活检样品置入50ml法肯管内的RPMI 1640中并将其储存在 冰上。尽可能快地将其运送至处理位点。保存纳入肿瘤样品的上清液。将肿瘤切碎成 ＜0.3-0.5mm厚的碎片，并在37℃下于振荡器上用含有1mg/ml胶原酶D(罗氏制药) 的10ml RPMI 1640消化30min。通过添加10mM EDTA来终止消化，并将其置于冰 上。用冰冷PBS/10mM EDTA 3X将所消化组织洗涤3X，然后将其与剩余上清液合并。 使经消化组织和上清液经过70-μM孔尼龙网筛(BD生物科技公司)并在4℃下离心(300 g)20min。使所提取细胞于RPMI完整培养基中再悬浮至1×106细胞/mL的浓度。在 药物处理和分析中，于37℃培养箱内在RPMI+10％FBS中将细胞培养约2天。
实例4.HDAC抑制剂化合物诱导细胞凋亡需要磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)信号转导
为进一步表征PCI-34051的凋亡前体活性，测试其对缺少T细胞受体(TCR)信号 转导途径中不同步骤的朱卡特细胞的效应。如图4和表1中所示，在PLC-γ1缺陷型 朱卡特细胞(J.γ1)中PCI-34051(5μM)以及泛HDAC抑制剂化合物诱导细胞凋亡的程度 远低于在野生型、TCR缺陷型(J.RT3-T.5)或ZAP-70缺陷型(P116)朱卡特细胞中的程度。

此结果表明，在T细胞系中用PCI-34051诱导细胞凋亡需要PLC-γ1信号转导。 实际上，如图5-6中所示，PLC抑制剂(U-73122)以剂量依赖性方式抑制PCI-34051诱 导的细胞凋亡。相反，PLC抑制剂的无活性类似物(U-73343)不能阻断PCI-34051诱导 的细胞凋亡。
与PLC在PCI-34051诱导细胞凋亡中的作用一致，吾人发现Ca2+-效应物毒胡萝 卜内酯(0.2μM)可增强细胞凋亡，如图7中所示。相反，Ca2+-螯合剂BAPTA-AM(0.5μM) 可降低由PCI-34051诱导的细胞凋亡，如图8中所示。在朱卡特细胞中钙螯合剂BAPTA 阻断PCI-34051诱导的钙流动。
最后，检测细胞色素C因应PCI-34051或泛HDAC抑制剂化合物自线粒体易位 至胞质溶胶，此为细胞凋亡的标志。如图9中所示，在野生型朱卡特细胞中用PCI-34051 或泛HDAC化合物处理12或24小时可诱导细胞色素氧化酶自线粒体易位至胞质溶 胶。相反，在PLC缺陷型J.细胞中，相同处理不能改变细胞色素C的定位。FasL(凋 亡前体蛋白)可在WT和J.γ1朱卡特细胞二者中有效诱导细胞色素C的易位。
根据这些结果可得出结论，HDAC8选择性抑制剂化合物PCI-34051在T细胞衍 生淋巴瘤细胞中通过依赖PLC信号转导途径的方式来诱导细胞凋亡。这说明激活PLC 信号转导途径是治疗T细胞增殖性病症的有用治疗手段。因此，可单独使用HDAC抑 制剂化合物(例如HDAC8选择性抑制剂化合物)或使用其与可激活PLC依赖性信号 转导的药剂(例如受体激动剂、受体激活性抗体、毒胡萝卜内酯等)的组合来治疗T 细胞增殖性病症。相反，描绘出PLC信号转导的特征(例如PLC mRNA或蛋白质含 量、PLC酶活性、或细胞内钙含量的PLC依赖性变化)可用于确定可能对HDAC8选 择性抑制剂有反应的细胞。
实例5.HDAC抑制剂诱导PLC-γ依赖性细胞内钙动员
使用比率荧光钙成像法来评估HDAC-8选择性抑制剂化合物PCI-34051和 PCI-24781(泛HDAC抑制剂化合物)在T细胞和B细胞衍生细胞系中对细胞内钙动 员的效应。如图2中所示，将10μM PCI-34051或0.2μM PCI-24781添加至经培养朱 卡特细胞(T细胞衍生细胞系)中可导致细胞内钙的快速(约1分钟内)持续上升， 此与使用Ca2+-效应物毒胡萝卜内酯(0.2μM)所观察到的情况极为类似。如图5-6中所 示，PLC抑制剂(U-73122)可强烈抑制PCI-34051刺激的细胞内Ca2+含量提高，但PLC 抑制剂的无活性类似物(U-73343)不能抑制，此与这些化合物对细胞凋亡的效应一致 (实例5)。此外，在PLC-γ1缺陷型HH细胞中可完全消除任一种化合物对细胞内 Ca2+的效应(图3)。PCI-34051和PCI-24781在朱卡特细胞中的钙动员具有剂量依赖 性，分别如图10和11中所示。令人感兴趣的是，在B细胞衍生的拉莫斯细胞中，HDAC8 选择性化合物PCI-34051不改变静息钙含量(图12(A))。此结果与此化合物不能在此 细胞系中诱导细胞凋亡一致。相反，泛HDAC抑制剂化合物PCI-24781在此细胞系中 诱导细胞内钙含量稳定上升(图12(A))。重要的是，拉莫斯细胞不表达PLC-γ1。类 似地，如通过诱导细胞凋亡来测量，诸如结肠肿瘤细胞系HCT-116(其如B细胞一样 也含有活性PLC-γ2)等对PCI-24781敏感的实体肿瘤细胞系也表现钙流动(图12 (C))，但PCI-34051不诱导细胞凋亡或钙流动。最后，诸如PC3等显示不受任一化合 物诱导细胞凋亡的其它实体肿瘤细胞系同样不显示钙流动(图12(D))。
测试两种肿瘤细胞系(A549肺肿瘤、THP-1单核细胞性白血病)以将其对泛HDAC 抑制剂PCI-24781和HDAC8抑制剂PCI-34051的敏感性与发生钙流动的能力相关联。 (图13和14)。肺肿瘤细胞系A549是上皮实体肿瘤细胞系的代表，其通过可用钙流 动预测的诱导细胞凋亡对泛HDAC抑制剂发生反应，而T细胞特异性HDAC8选择性 抑制剂PCI-34051在这些细胞中既不诱导细胞凋亡也不诱导钙流动。类似地，THP-1 是单核细胞性白血病细胞系，其中泛HDAC抑制剂PCI-24781可诱导细胞凋亡和钙流 动，而HDAC8选择性抑制剂PCI-34051不能诱导。
基于这些数据可以得出结论，PCI-34051可能通过PLC-γ1依赖性途径来作用而选 择性地对T细胞衍生细胞发挥其效应(钙动员和细胞凋亡)，同时PCI-24781可在含 有PLC-γ1或PLC-γ2的肿瘤细胞中诱导细胞凋亡。在这些HDAC抑制剂中任一种(或 任何其它HDAC抑制剂)的情况下，早期钙流动是所述化合物诱导的细胞凋亡的可靠 预测因子。
实例6.HDAC抑制剂的代谢产物不诱导PLC-γ依赖性细胞内钙动员
测试朱卡特细胞以将其对泛HDAC抑制剂PCI-24781和PCI-24781的两种主要代 谢产物(PCI-27789：羧酸代谢产物和PCI-27787：酰胺代谢产物)的敏感性与发生钙 流动的能力相关联。(图15)代谢产物PCI-27789和PCI-27787不具有组蛋白脱乙酰 基酶活性。PCI-27789和PCI-27787在朱卡特细胞中不引发钙流动诱导。如上文实例1 中所述来测量钙流动。

两种代谢产物具有与PCI-24781几乎完全相同的化学结构并且与PCI-24781的区 别仅在于分子的“活性”部分：PCI-27789用羧酸基团来代替PCI-24781中的异羟肟酸 基团；PCI-27787用酰胺基团来代替PCI-24781中的异羟肟酸基团。细胞可很快区分出 这些结构差异(以钙流动方式)以及是否会发生细胞凋亡的信号。
图16显示PCI-24781诱导细胞凋亡，而PCI-24781的无活性代谢产物PCI-27789 和PCI-27787在朱卡特细胞中不具有细胞凋亡诱导效应。用PCI-24781、PCI-27789或 PCI-27787(0.2μM)处理朱卡特细胞并且在2天后通过膜联蛋白-V染色测量细胞凋亡 (如上文实例2中所述)。因此，这些图对于进一步确立钙流动与细胞凋亡之间的联 系很重要。
实例7.在CTCL患者活检中的正向和负向钙流动
图17展示在来自患有皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的患者(患者SF-03)的原发性 肿瘤活检样品中测量的正向钙流动。用胶原酶处理5mm打孔活检样品，并且在添加 有泛HDAC抑制剂PCI-24781或HDAC8抑制剂PCI-34051的生长培养基中进行培养。 (根据实例3来实施活检，即自原发性肿瘤提取细胞)。两种化合物都在添加药物后 5秒内导致快速并且显著的钙流动。两种化合物也都在处理40小时后导致肿瘤细胞的 细胞凋亡增强。
相反，图18展示在来自另一CTCL患者(患者SF-06)的原发性肿瘤活检样品中 测量的负向钙流动。在此情况下，两种HDAC抑制剂都不刺激钙流动，并且两种HDAC 抑制剂都不导致肿瘤细胞的细胞凋亡。因此，证实钙流动是在临床试验中选择和划分 对治疗有反应的患者的快速生物标记方法。
尽管已在本文中展示并阐述了本发明的优选实施例，但所属领域技术人员应了解 所述实施例仅作为实例来提供。熟习此项技术者现可构想出许多变更、改变和替代而 并不背离本发明。应了解，在实践本发明时可采用本文所述本发明实施例的各种替代 形式。以下权利要求书意欲界定本发明的范围，并且由此意欲涵盖这些技术方案范围 内的方法和结构以及其等效内容。
相关申请案交叉参考
本申请案主张以下专利的利益：于2007年4月13日申请的美国临时专利申请案 第60/911,857号、于2007年6月15日申请的美国临时专利申请案第60/944,409号、 于2007年8月8日申请的美国临时专利申请案第60/954,777号，于2008年2月4日 申请的美国临时专利申请案第61/026,023号、和于2007年7月18日申请的美国正式 专利申请案第11/779,743号；这些参考文献的揭示内容是全文并入本文中。