在生物体内，存在各种各样的金属，发挥着多种多样的功能。因 此，可以认为对生物体样品中的金属的测定是很重要的。例如，锌是 广泛分布于生物体内用于维持生命所不可缺少的金属元素之一，一旦 得了锌缺乏症，就会引起发育障碍、味觉障碍等症状，这是众所周知 的。因此，样品中的锌的测定，就成为在这些疾病的诊断和治疗等中 不可缺乏的检查。
作为该金属的测定方法，可以采用原子吸收光谱分析法、ICP发 射光谱分析法、比色测定法等。其中，作为比色测定法中使用的螯合 发色剂，可举出例如2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-磺丙 基氨基)苯酚钠(以下有时简写为5-Br-PAPS)、2-(5-硝基-2-吡啶 偶氮基)-5-(N-丙基-N-磺丙基氨基)苯酚钠(以下有时简写为硝基 -PAPS)等。
已知这些螯合发色剂通常与很多种金属进行反应。因此，在测定 某种特定的金属时，来自生物体样品、测定试剂、器具等的测定对象 金属以外的金属杂质混入到测定反应液中，该混入的金属杂质与螯合 发色剂发生反应，因此造成测定对象金属的测定值产生正误差，这是 存在的问题。因此，在使用螯合发色剂测定金属的过程中，必须使用 一种用于将测定对象金属以外的金属掩蔽的掩蔽剂。
例如，在使用5-Br-PAPS测定锌时，该5-Br-PAPS也会与作为锌 以外的金属的铁、铜、镍发生反应，因此必须使用能够将铁、铜、镍 掩蔽的掩蔽剂(例如特开昭60-120249号公报)。过去，作为铁的掩 蔽剂使用的化合物，已知有例如柠檬酸、氟化钠、次氮基乙酸等；作 为铜的掩蔽剂使用的化合物，已知有例如水杨醛肟、二硫代甲酰甘氨 酸、二硫代甲酰肌氨酸等；作为镍的掩蔽剂，已知有例如丁二酮肟等。
然而，在这些掩蔽剂中，还存在最终将作为测定对象金属的锌掩 蔽的化合物，还存在稳定性差的化合物。
另外，许多金属通过与蛋白质等生物体高分子结合而存在于生物 体内，从而发挥各种功能。因此，在测定生物体样品中的金属时，必 须进行使金属从蛋白质中游离出来，并将蛋白质除去的预处理。另外， 在传统的预处理中，必须进行向样品中添加三氯乙酸等除蛋白剂，以 便使金属从蛋白质中游离出来，然后对沉淀的蛋白质进行离心分离而 将其分离除去的除蛋白操作。
但是，该除蛋白操作复杂而且花费时间，而且样品的回收和再现 性存在问题。

因此，本发明的课题在于，提供一种通过共存或者含有作为测定 对象金属以外的金属的铁、铜和/或镍的掩蔽剂来正确地测定样品中的 金属浓度的测定方法和测定试剂。
另外，本发明的课题还在于，提供一种铁、铜和/或镍的掩蔽剂， 并提供一种可以抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误差的方法。
进而，本发明的课题还在于，提供一种在对样品中的金属进行测 定时不需要对样品进行除蛋白操作的测定方法和测定试剂。
本发明者为了解决上述的课题而进行了精心的研究，结果发现， 在使用螯合发色剂对样品中的金属进行比色测定的方法以及试剂中， 通过共存或者含有铁、铜和/或镍的掩蔽剂，可以正确地测定样品中的 金属浓度，至此完成本发明。
即，本发明提供以下的发明。
(1)样品中的金属的比色测定方法，该方法是使用螯合发色剂 对样品中的金属进行比色测定的方法，其特征在于，使铁、铜和/或镍 的掩蔽剂共存。
(2)上述(1)所述的样品中的金属的比色测定方法，其特征 在于，螯合发色剂为2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3-磺 丙基氨基)苯酚或其盐。
(3)上述(1)所述的样品中的金属的比色测定方法，其特征 在于，螯合发色剂为2-(5-硝基-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3- 磺丙基氨基)苯酚或其盐。
(4)上述(1)～(3)任一项所述的样品中的金属的比色测定 试剂，其中，使用表面活性剂。
(5)上述(2)～(4)任一项所述的样品中的金属的比色测定 方法，其中，不需要对样品进行除蛋白操作。
(6)上述(1)～(5)任一项所述的样品中的金属的比色测定 方法，其中，铁、铜和/或镍的掩蔽剂为选自Bis-tris Propane(1，3- 双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷)、TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3- 氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)、 TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、Tricine(N-[三(羟甲 基)甲基]甘氨酸)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或者Bicine(N，N- 双(2-羟乙基)甘氨酸]中的1种以上的掩蔽剂。
(7)上述(1)～(5)任一项所述的样品中的金属的比色测定 方法，其中，铁、铜和/或镍的掩蔽剂为下述通式(I)表示的化合物：

式中，X1～X6为氢原子、未取代或取代的羟基、羧基、SH基或者 氨基。
(8)上述(1)～(7)任一项所述的样品中的金属的比色测定 方法，其中，用于进行比色测定的样品中的金属为锌。
(9)上述(1)～(8)任一项所述的样品中的金属的比色测定 方法，该方法是能够抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误差的 比色测定方法。
(10)样品中的锌的比色测定方法，其中，不需要对样品进行 除蛋白操作，使用2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3-磺丙 基氨基)苯酚或其盐。
(11)样品中的金属的比色测定试剂，它是使用螯合发色剂对 样品中的金属进行比色测定的试剂，其特征在于，其中含有铁、铜和/ 或镍的掩蔽剂。
(12)上述(11)所述的样品中的金属的比色测定试剂，其特 征在于，螯合发色剂为2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3- 磺丙基氨基)苯酚或其盐。
(13)上述(11)所述的样品中的金属的比色测定试剂，其特 征在于，螯合发色剂为2-(5-硝基-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3- 磺丙基氨基)苯酚或其盐。
(14)上述(11)～(13)任一项所述的样品中的金属的比色 测定试剂，其中还含有表面活性剂。
(15)上述(12)～(14)任一项所述的样品中的金属的比色 测定试剂，其中，不需要对样品进行除蛋白操作。
(16)上述(11)～(15)任一项所述的样品中的金属的比色 测定试剂，其中，铁、铜和/或镍的掩蔽剂选自Bis-tris Propane、 TAPS、TAPSO、TES、Tricine、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或者Bicine。
(17)上述(11)～(15)任一项所述的样品中的金属的比色 测定试剂，其中，铁、铜和/或镍的掩蔽剂为下述通式(I)表示的化 合物：

式中，X1～X6为氢原子、未取代或取代的羟基、羧基、SH基或者 氨基。
(18)上述(11)～(17)任一项所述的样品中的金属的比色 测定试剂，该试剂是能够抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误 差的比色测定试剂。
(19)铁、铜和/或镍的掩蔽剂，选自Bis-trisPropane、TAPS、 TAPSO、TES、Tricine、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或者Bicine。
(20)铁、铜和/或镍的掩蔽剂，由下述通式(I)表示的化合 物组成：

式中，X1～X6为氢原子、未取代或取代的羟基、羧基、SH基或者 氨基。
(21)抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误差的方法， 其中，在使用螯合发色剂对样品中的金属进行比色测定的方法中，使 铁、铜和/或镍的掩蔽剂共存。
(22)上述(21)所述的抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起 的正误差的方法，其中，螯合发色剂为2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5- (N-丙基-N-3-磺丙基氨基)苯酚或其盐。
(23)上述(21)所述的抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起 的正误差的方法，其中，螯合发色剂为2-(5-硝基-2-吡啶偶氮基) -5-(N-丙基-N-3-磺丙基氨基)苯酚或其盐。
(24)上述(21)～(23)任一项所述的抑制由样品中所含的 铁、铜或镍引起的正误差的方法，其中，铁、铜和/或镍的掩蔽剂选自 Bis-tris Propane、TAPS、TAPSO、TES、Tricine、三(羟甲基)氨 基甲烷(Tris)或者Bicine。
(25)上述(21)～(24)任一项所述的抑制由样品中所含的 铁、铜或镍引起的正误差的方法，其特征在于，铁、铜和/或镍的掩蔽 剂为下述通式(I)表示的化合物：

式中，X1～X6为氢原子、未取代或取代的羟基、羧基、SH基或者 氨基。
根据本发明，在使用螯合发色剂对样品中的金属进行比色测定时， 通过共存或者含有作为测定对象金属以外的金属的铁、铜和/或镍的掩 蔽剂，即使样品中混杂有铁、铜或镍，也可以正确地测定作为测定对 象的金属浓度。
另外，根据本发明，在使用螯合发色剂对样品中的金属进行测定 时，不需要对样品进行除蛋白操作。

本发明提供一种金属的测定方法，该方法是使用螯合发色剂对样 品中的金属进行比色测定的方法，其特征在于，使铁、铜或镍的掩蔽 剂共存；本发明还提供一种金属的测定试剂，该试剂是在使用螯合发 色剂对样品中的金属进行比色测定时使用的试剂，其特征在于，该试 剂中含有铁、铜或镍的掩蔽剂；并且本发明还提供铁、铜和/或镍的掩 蔽剂，以及用于抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误差的方法。
(1) 螯合发色剂
在本发明中，使用螯合发色剂来对样品中的金属进行比色测定。
此处，螯合发色剂是指适用于金属的比色测定的试剂，而且是在 测定铁、铜或镍以外的金属(测定对象金属)时，由于与测定对象金 属接触、结合而在色调或者吸收波长方面发生变化的试剂。
另外，本发明适合于那些在与混杂在样品中的铁、铜或镍反应后 有可能给作为测定对象的金属的测定值带来正误差的螯合发色剂。
可举出例如2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3-磺丙基 氨基)苯酚(以下有时简写为5-Br-PAPS)、2-(5-硝基-2-吡啶偶氮 基)-5-(N-丙基-N-3-磺丙基氨基)苯酚(以下有时简写为硝基-PAPS)、 2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-3-磺丙基氨基)苯胺(以下 有时简写为5-Br-PSAA)、铋试剂(Bismuthiol)II、BPA、钙黄绿素、 钙黄绿素蓝、变色酸(chromotropicacid)、Cu-PAN、二安替比林甲烷、 紫脲酸铵(Murexide)、亚硝基-PSAP、o-菲绕啉、PAN、PAR、PDTS、 PR、SATP、钛试剂、TPPS、TPTZ、XO或者锌试剂(Zincon)等。
应予说明，在本发明中，螯合发色剂优选为5-Br-PAPS或者硝基 -PAPS。
另外，螯合发色剂的浓度依赖于测定对象金属的浓度，当该测定 对象金属的浓度较高时，螯合发色剂的浓度必须根据测定对象的浓度 而提高。通常情况下，在样品与测定试剂混合后的测定反应液中，优 选处于10～500μM的范围内，特别优选为10～50μM的范围。
(2) 铁、铜和/或镍的掩蔽剂
在本发明中，通过共存或者含有铁、铜和/或镍的掩蔽剂来对样品 中的金属进行比色测定。
此处，作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂，可举出例如Bis-tris Propane、Bis-tris(双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷)、TAPS、 TAPSO、TES、Tricine、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、BES(N，N-双 (2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)或者Bicine等。另外，在本发明中，作 为铁、铜和/或镍的掩蔽剂，优选使用Bis-tris Propane、TAPS、TAPSO、 TES、Tricine、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或者Bicine。
应予说明，在本发明中，优选使用能够将铁、铜和镍掩蔽的、由 下述通式(I)表示的化合物。

式中，X1～X6为氢原子、未取代或取代的羟基、羧基、SH基或者 氨基。
此处，作为上述通式(I)表示的化合物，可举出例如Bis-tris Propane。
另外，铁、铜和/或镍的掩蔽剂的浓度依赖于样品中的铁、铜或镍 的浓度，当铁、铜或镍的浓度较高时，掩蔽剂的浓度必须根据铁、铜 或镍的浓度而提高。通常情况下，例如，在将样品与测定试剂混合后 的测定反应液中，掩蔽剂的浓度优选处于5～150mM的范围内，特别优 选为5～50mM的范围。另外，即使掩蔽剂的浓度超过150mM也没有问 题，但是当达到上述量时就已经可以获得充分的效果。
另外，在本发明的测定方法和测定试剂为1步法(1试剂系)时， 掩蔽剂的浓度只要在上述的范围内即可，而在为2步法(2试剂系) 时，只要使第1试剂或者第2试剂任一个中按照下述条件含有掩蔽剂 即可，也就是当将样品与第1试剂按照测定样品中的金属时各添加量 之比进行混合时、以及当将样品与第1试剂和第2试剂按照测定样品 中的金属时的各添加量之比进行混合时，该混合后的测定反应液中的 掩蔽剂的浓度成为上述的范围。
另外，只要混合后的测定反应液中的掩蔽剂浓度处于上述浓度范 围内，也可以使第1试剂和第2试剂双方都含有掩蔽剂。
这种情况与测定方法和测定试剂为多步法(3试剂以上)的情况 相同。
(3) 表面活性剂
在本发明中，通过共存或者含有表面活性剂，也可以对样品中的 金属进行比色测定。在本发明中，对共存或者含有的表面活性剂的种 类没有特殊限定，可以使用例如非离子型表面活性剂、阴离子型表面 活性剂、阳离子型表面活性剂、或者两性表面活性剂中的任一种。
另外，在本发明中，优选使用非离子型表面活性剂。
此处，作为非离子型表面活性剂，可举出例如以下的表面活性剂。
(a)聚氧乙烯烷基醚、聚氧丙烯烷基醚、聚氧丙烯烷基苯基醚、 聚氧乙烯聚苯乙烯基苯基醚、或者聚氧乙烯聚氧丙烯二醇等聚氧亚烷 基醚化合物。
(b)甘油脂肪酸部分酯、脱水山梨糖醇脂肪酸部分酯、季戊四 醇脂肪酸部分酯、丙二醇单脂肪酸酯、或者蔗糖脂肪酸部分酯等多元 醇部分酯化合物。
(c)聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸部分酯、聚氧乙烯山梨糖醇 脂肪酸部分酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸部分酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚 甘油脂肪酸部分酯、或者聚氧乙烯化蓖麻油等聚氧乙烯化多元醇脂肪 酸酯。
(d)脂肪酸二乙醇酰胺、N，N-双-2-羟基烷基胺、聚氧乙烯烷 基胺、三乙醇胺脂肪酸酯、或者三烷基胺氧化物等酰胺或者胺化合物。
在本发明中，可以只使用1种表面活性剂，也可以将2种以上的 表面活性剂组合使用。
另外，表面活性剂的浓度，在样品与测定试剂混合后的测定反应 液中，优选处于0.01～10％的范围内，特别优选处于0.1～5％的范围 内。
另外，在本发明的测定方法和测定试剂为1步法(1试剂系)时， 表面活性剂的浓度只要在上述的范围内即可，而在为2步法(2试剂 系)时，只要使第1试剂或者第2试剂任一个中按照下述条件含有表 面活性剂即可，也就是当将样品与第1试剂按照测定样品中的金属时 的各添加量之比进行混合时、以及当将样品与第1试剂和第2试剂按 照测定样品中的金属时的各添加量之比进行混合时，该混合后的测定 反应液中的表面活性剂的浓度成为上述的范围。
另外，只要混合后的测定反应液中的表面活性剂浓度处于上述浓 度范围内，优选使第1试剂和第2试剂双方都含有表面活性剂。
这种情况与测定方法和测定试剂为多步法(3试剂以上)的情况 相同。
(4) 蛋白质改性剂
在本发明中，通过共存或者含有蛋白质改性剂，也可以对样品中 的金属进行比色测定。
在本发明中，作为所共存或者含有的蛋白质改性剂，可举出例如 十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂；以及尿素、盐酸胍等公知的蛋 白质改性剂。
另外，蛋白质改性剂的浓度，在样品与测定试剂混合后的测定反 应液中，优选处于0.2～6M的范围内，特别优选处于0.4～3M的范围 内。另外，即使所含的蛋白质改性剂的浓度超过6M也没有问题，但是 当达到该量时就已经可以获得充分的效果。
在本发明中，可以只使用1种蛋白质改性剂，也可以将2种以上 的蛋白质改性剂组合使用。
另外，在本发明的测定方法和测定试剂为1步法(1试剂系)时， 蛋白质改性剂的浓度只要在上述的范围内即可，而在为2步法(2试 剂系)时，只要使第1试剂或者第2试剂任一个中按照下述条件含有 蛋白质改性剂即可，也就是当将样品与第1试剂按照测定样品中的金 属时的各添加量之比进行混合时、以及当将样品与第1试剂和第2试 剂按照测定样品中的金属时的各添加量之比进行混合时，该混合后的 测定反应液中的蛋白质改性剂的浓度成为上述的范围。
另外，只要混合后的测定反应液中蛋白质改性剂的浓度处于上述 浓度范围内，也可以使第1试剂和第2试剂双方都含有蛋白质改性剂。
这种情况与测定方法和测定试剂为多步法(3试剂以上)的情况 相同。
(5) 测定中的其他构成成分
在本发明中，除了上述的成分以外，也可以根据需要适宜地共存 或者含有公知的防腐剂、或者稳定化剂等。
(6) 测定金属时的pH
在本发明中，由于在测定样品中的金属时的pH根据测定所使用的 螯合发色剂的不同而异，因此，只要适宜地设定测定金属时的pH即可。 通常情况下，优选处于pH5～11的范围内。
另外，当测定样品中的锌时，优选pH7以上，特别优选pH8～10 的范围。
另外，作为用于将pH值调节至上述范围内的缓冲液，可以适宜地 使用在上述pH范围内具有缓冲能力的以往公知的缓冲液。
作为可以使用的这种缓冲液，可举出例如碳酸、硼酸、磷酸、三 (羟甲基)氨基甲烷(Tris)、咪唑、甘氨酰甘氨酸、MES、Bis-tris、 ADA、ACES、Bis-tris Propane、PIPES、MOPSO、MOPS、BES、HEPES、 TES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPS、HEPPSO、Tricine、Bicine、TAPS、 CHES、CAPSO、或者CAPS或者它们的盐等各缓冲剂。
(7) 试剂等的构成以及构成成分的浓度等
本发明的测定方法和测定试剂可以按照1步法(1试剂系)来实 施和构成，也可以按照2步法(2试剂系)等多步法(多试剂系)来 实施和构成。
另外，本发明的测定方法和测定试剂为1步法(1试剂系)时， 只要上述各构成成分的浓度以及pH等处于上述的范围内即可，在为多 步法(多试剂系)时，只要按照下述条件确定各试剂的构成成分的浓 度等即可，也就是当将上述各测定试剂按照测定金属时的各添加量之 比进行混合时，使上述各构成成分的浓度及pH处于上述范围内等。
(8) 样品
在本发明中，用于进行金属测定的样品没有特殊限定。
作为这种样品，可举出例如生物体样品、食物、饮料、饮用水、 药剂、试剂、河水、湖水、海水、土壤等。
对生物体样品没有特殊限定，可举出例如人或者动物的血液、血 清、血浆、尿、大便、精液、髓液、唾液、汗、泪、腹水、羊水、脑 等脏器、毛发、皮肤、指甲、肌肉或者神经等组织和细胞等。
对食物没有特殊限定，可举出例如食用肉、蔬菜、谷物、果物、 水产品、加工食品等。
对饮料没有特殊限定，可举出例如果汁、茶、咖啡、酒精类、牛 奶等。
对药剂没有特殊限定，可举出例如输液、注射液、散剂、片剂等。
应予说明，样品的形态优选为液体，在不为液体时，优选按照已 知的方法进行提取处理或可熔化处理等预处理来制成液体样品。
(9) 金属的比色测定方法以及比色测定试剂
下面具体地说明使用本发明的螯合发色剂对样品中的金属进行比 色测定的方法以及比色测定试剂。
在对样品中的金属进行测定时，将例如样品与含有铁、铜和/或镍 的掩蔽剂的试剂进行混合。将该样品与试剂的混合物与含有螯合发色 剂的试剂混合，使样品中的金属与螯合发色剂进行发色反应。通过测 定该发色前后的测定反应液的吸光度，求出由于螯合发色所造成的吸 光度的变化等，可以测定样品中的金属浓度。
进而，以作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂使Bis-tris Propane共存 来对样品中的锌进行比色测定的情况为例进行具体说明。
在对样品中的锌进行测定时，例如将样品与含有Bis-tris Propane的第1试剂进行混合。将该样品与第1试剂的混合物与含有 螯合发色剂(例如，5-Br-PAPS)的第2试剂混合，使样品中的锌与螯 合发色剂进行发色反应。通过测定该发色前后的测定反应液的吸光度， 求出由于螯合发色所造成的吸光度的变化等，可以测定样品中的锌的 浓度。
应予说明，本发明中，金属的测定也可以按照终点(end point) 法或者速率测定(rate assay)法中任一种方法来进行，在本发明中， 优选按照终点法进行金属的测定。
(10) 抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误差的方法
本发明中的、抑制由样品中所含的铁、铜或镍引起的正误差的方 法，在使用螯合发色剂进行金属测定的比色测定方法和比色测定试剂 时，通过共存或者含有铁、铜和/或镍的掩蔽剂来进行测定。
在使用这种螯合发色剂进行金属测定的比色测定方法或者比色测 定试剂时，通过共存或者含有铁、铜和/或镍的掩蔽剂进行金属的测定， 即使样品中混杂有作为测定对象金属以外的金属的铁、铜或镍，也可 以抑制由该铁、铜或镍所产生的对于测定对象金属的测定值的正误差， 可以获得精度高的金属的测定值。
另外，在实施本发明中的抑制由铁、铜或镍引起的正误差的方法 时的试剂的构成成分、样品和条件等，如上所述。
下面，用实施例具体地说明本发明，但本发明并不局限于此。
〔实施例1〕
(对铁、铜和/或镍的掩蔽效果的确认-1)
作为对铁、铜和/或镍的掩蔽剂，使用Bis-tris Propane、TAPS、 TAPSO、TES、Tricine、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或者Bicine， 确认了对铁、铜和/或镍的掩蔽效果。
1.试剂的配制
(1)锌测定用第1试剂A的配制
将Bis-tris Propane溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节 至pH7.0、8.6、或者9.3(均为20℃)，配制成本发明的第1试剂A。
(2)锌测定用第1试剂B的配制
将TES溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节至pH7.0、8.2、 或者9.4(均为20℃)，配制成本发明的第1试剂B。
(3)锌测定用第1试剂C的配制
将三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶解于纯水中，使其浓度成为 50mM，调节至pH7.0、8.4、或者9.8(均为20℃)，配制成本发明的 第1试剂C。
(4)锌测定用第1试剂D的配制
将TAPS溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节至pH7.5、8.6、 或者9.5-(均为20℃)，配制成本发明的第1试剂D。
(5)锌测定用第1试剂E的配制
将Tricine溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节至pH8.0、 8.7、或者9.4(均为20℃)，配制成本发明的第1试剂E。
(6)锌测定用第1试剂F的配制
将Bicine溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节至pH8.4、8.8、 或者9.5-(均为20℃)，配制成本发明的第1试剂F。
(7)锌测定用第2试剂的配制
按照各自记载的浓度将下述的试剂成分溶解于纯水中，配制成第 2试剂。
5-Br-PAPS        0.2mM
Triton X-100     0.05％
2.样品的配制
(1)样品A的配制
将1g/L的锌标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至锌浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品A。
(2)样品B的配制
将1g/L的铁标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至铁浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品B。
(3)样品C的配制
将1g/L的铜标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至铜浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品C。
(4)样品D的配制
将1g/L的镍标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至镍浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品D。
3.样品的测定
使用上述1中配制的锌测定用第1试剂和锌测定用第2试剂，测 定上述2的样品A～D中的锌的浓度。
本发明的测定试剂中的锌的测定，使用日立制作所社制7180型自 动分析装置来进行，分别向上述2中配制的样品A～D各10μL中添加 上述1之(1)中配制的本发明的第1试剂A150μL，混合后，使其 在37℃下反应5分钟，然后，添加第1试剂，随后添加上述1之(7) 中配制的第2试剂50μL，使其在37℃下反应5分钟。测定添加第1 试剂后第4分30秒(第16点)和添加第2试剂后第5分8秒(第34 点)在主波长546nm和副波长700nm处的吸光度，求出其差值。
另外，对已知锌浓度的样品进行如上所述的测定，通过将该测定 值与上述4种样品的测定值进行比较，求出上述4种样品中的锌的浓 度。
另外，将第1试剂变更为在上述1之(2)～(6)中配制的锌测 定用第1试剂(B～F)，进行同样的测定。
4.测定结果
样品的测定结果示于表1中。
表1
锌测定用第1试剂A

锌测定用第1试剂B

锌测定用第1试剂C

锌测定用第1试剂D


锌测定用第1试剂F

从表1可看出，当使用第1试剂中含有Bis-tris Propane作为铁、 铜和/或镍的掩蔽剂的锌测定用第1试剂A时，不与作为测定对象金属 (锌)以外的金属的铁和铜发生反应。另外还可看出，对于镍，在pH7.0 时，反应被抑制。
进而可以看出，当使用第1试剂中含有TES作为铁、铜和/或镍的 掩蔽剂的锌测定用第1试剂B、含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)作 为铁、铜和/或镍的掩蔽剂的锌测定用第1试剂C、以及含有TAPS作 为铁、铜和/或镍的掩蔽剂的锌测定用第1试剂D时，与作为测定对象 金属(锌)以外的金属的铁和铜的反应被抑制，而与镍发生反应。进 而可以看出，当使用第1试剂中含有Tricine作为铁、铜和/或镍的掩 蔽剂的锌测定用第1试剂E、以及含有Bicine作为铁、铜和/或镍的 掩蔽剂的锌测定用第1试剂F时，与作为测定对象金属(锌)以外的 金属的铁和镍的反应被抑制，而与铜发生反应。
由此可以确认，对于使用5-Br-PAPS作为螯合发色剂来测定样品 中的锌的方法而言，其中含有Bis-tris Propane、TAPS、TES、Tricine、 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或者Bicine的本发明的测定方法和测定 试剂，具有抑制5-Br-PAPS对样品中所含的铁、铜和/或镍进行发色的 效果。
也就是说，即使是混杂有测定对象金属以外的金属(铁、铜和/ 或镍)的样品，也可以正确地测定其中的测定对象金属(锌)的浓度。
另外，从这些结果可以确认，通过适宜调节pH值，Bis-tris Propane可以掩蔽全部的铁、铜和镍。
〔实施例2〕
(对铁、铜和/或镍的掩蔽效果的确认-2)
作为对铁、铜和/或镍的掩蔽剂，使用Bis-tris Propane、TES 或者三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，确认了对铁、铜或镍的掩蔽效果。
1.试剂的配制
(1)锌测定用第1试剂A的配制
将Bis-tris Propane溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节 至pH7.0、8.6、或者9.3(均为20℃)，配制成锌测定用第1试剂A。
(2)锌测定用第1试剂B的配制
将TES溶解于纯水中，使其浓度成为50mM，调节至pH7.0、7.8、 或者8.2(均为20℃)，配制成锌测定用第1试剂B。
(3)锌测定用第1试剂C的配制
将三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶解于纯水中，使其浓度成为 50mM，调节至pH7.0、8.4、或者9.8(均为20℃)，配制成锌测定用 第1试剂C。
(4)锌测定用第2试剂的配制
按照各自记载的浓度将下述的试剂成分溶解于纯水中，配制成锌 测定用第2试剂。
硝基-PAPS     0.2mM
Triton X-100  0.05％
2.样品的配制
直接使用在实施例1之2的(1)～(4)中配制的样品A～D。
3.样品的测定
使用上述1中配制的锌测定用第1试剂和锌测定用第2试剂，与 实施例1之3同样地测定上述2的样品A～D中的锌的浓度。
4.测定结果
样品的测定结果示于表2中。
表2
锌测定用第1试剂A

锌测定用第1试剂B

锌测定用第1试剂C

从表2可看出，当使用第1试剂中含有Bis-tris Propane作为铁、 铜和/或镍的掩蔽剂的锌测定用第1试剂A时，不与作为测定对象金属 (锌)以外的金属的铁和铜发生反应。另外还可看出，对于镍，在pH7.0 时，反应被抑制。
进而可以看出，当使用第1试剂中含有TES作为铁、铜和/或镍的 掩蔽剂的锌测定用第1试剂B、以及含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris) 作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂的锌测定用第1试剂C时，与作为测定对 象金属(锌)以外的金属的铁和铜的反应被抑制，但是与镍发生反应。
由此可以确认，对于使用硝基-PAPS测定样品中的锌的方法和试 剂而言，其中含有Bis-tris Propane、TES或者三(羟甲基)氨基甲 烷(Tris)的本发明的比色测定方法和比色测定试剂，具有抑制硝基 -PAPS对样品中所含的铁、铜和/或镍进行发色的效果。也就是说，即 使是混杂有测定对象金属以外的金属(铁、铜和/或镍)的样品，也可 以正确地测定其中的测定对象金属(锌)的浓度。
另外，从这些结果可以确认，通过适宜调节pH值，Bis-tris Propane可以掩蔽全部的铁、铜和镍。
〔实施例3〕
(对铁、铜和/或镍的掩蔽效果的确认-3)
作为对铁、铜和/或镍的掩蔽剂，使用Bis-tris Propane，确认 了对铁、铜或镍的掩蔽效果。
1.测定试剂的配制
(1)锌测定用第1试剂的配制
按照各自记载的浓度将下述的试剂成分溶解于纯水中，将pH值调 节至9.5-(20℃)，配制成Bridge-35(非离子型表面活性剂)浓度 不同的8种锌测定用第1试剂。
其中，Bridge-35的浓度分别为0％、0.1％、0.7％、1.1％、 1.3％、1.6％、2.0％或者6.7％
Bis-tris Propane 30mM
(2)锌测定用第2试剂的配制
按照各自记载的浓度将下述的试剂成分溶解于纯水中，配制成锌 测定用第2试剂。
5-Br-PAPS        0.13mM
Triton X-100     0.05％
2.样品的配制
(1)样品A的配制
将1g/L的锌标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至锌浓度为500μg/dL，将该稀释液作为样品A。
(2)样品B的配制
将1g/L的锌标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至锌浓度为1000μg/dL，将该稀释液作为样品B。
(3)样品C的配制
将1g/L的铁标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至铁浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品C。
(4)样品D的配制
将1g/L的铜标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至铜浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品D。
(5)样品E的配制
将1g/L的镍标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释至镍浓度为200μg/dL，将该稀释液作为样品E。
3.样品的测定
使用上述1中配制的8种锌测定用第1试剂和锌测定用第2试剂， 与实施例1之3同样地测定上述2的样品A～E中的锌的浓度。
4.测定结果
样品的测定结果示于表3中。
表3

从表3可看出，当锌测定用第1试剂中不含Bridge-35时，不与 作为测定对象金属(锌)以外的金属的铁和铜发生反应，但是与镍发 生反应。由此可以看出，通过使第1试剂中含有Bridge-35，可以抑 制与镍的反应。
由此可以确认，对于使用5-Br-PAPS测定样品中的锌的方法和试 剂而言，在含有Bis-tris Propane作为铁、铜或镍的掩蔽剂的本发明 的锌测定用第1试剂中还含有非离子型表面活性剂时，与不含非离子 型表面活性剂时相比，具有进一步抑制5-Br-PAPS对样品中所含的镍 进行发色的效果。
即，可以确认，即使是混杂有测定对象金属(锌)以外的金属(铁、 铜和/或镍)的样品，也可以正确地测定其中的测定对象金属(锌)的 浓度。
〔实施例4〕
(对铁、铜和/或镍的掩蔽效果的确认-4)
使用Bis-tris Propane作为对铁、铜和/或镍的掩蔽剂，确认了 对铁、铜和/或镍的掩蔽效果。
1.测定试剂的配制
(1)本发明的锌测定用第1试剂的配制
按照各自记载的浓度将下述的试剂成分溶解于纯水中，将pH值调 节至9.5-(20℃)，配制成Bis-tris Propane浓度不同的7种本发 明的锌测定用第1试剂。
Bis-tris Propane的浓度分别为3mM、15mM、24mM、30mM、36mM、 45mM或者150mM
Bridge-35      1.33％
(2)对照用的锌测定用第1试剂的配制
除了不含有上述(1)所述的本发明的锌测定用第1试剂的 Bis-tris Propane以外，其余与上述(1)同样地进行对照用的锌测 定用第1试剂的配制。
(3)锌测定用第2试剂的配制
直接使用在实施例3之1的(2)中配制的锌测定用第2试剂。
2.样品的配制
直接使用在实施例3之2的(1)～(5)中配制的样品A～E。
3.样品的测定
使用上述1中配制的锌测定用第1试剂和锌测定用第2试剂，与 实施例1之3同样地测定上述2的样品A～E中的锌的浓度。
4.测定结果
样品的测定结果示于表4中。
表4

从表4可看出，当使用第1试剂中不含作为铁、铜和/或镍的掩蔽 剂的Bis-tris Propane的对照用锌测定用第1试剂时，与锌、铁、铜 和镍中的任一种金属均发生反应。
与此相反，可以看出，当使用第1试剂中含有Bis-tris Propane 作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂的本发明的锌测定用第1试剂时，只与作 为测定对象金属的锌发生反应，而不与铁、铜和镍发生反应。
由此可以确认，对于使用5-Br-PAPS测定样品中的锌的方法而言， 在使用其中含有Bis-tris Propane作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂的本 发明的锌测定用第1试剂时，与使用不添加铁、铜和/或镍的掩蔽剂的 对照用锌测定用第1试剂时相比，具有抑制5-Br-PAPS对样品中所含 的铁、铜和/或镍进行发色的效果。
即，即使是混杂有测定对象金属(锌)以外的金属(铁、铜和/ 或镍)的样品，也可以正确地测定其中的测定对象金属(锌)的浓度。
〔实施例5〕
(添加回收试验)
对于使用本发明的锌比色测定方法和比色测定试剂进行的、在血 清样品中的添加回收试验进行讨论。
1.测定试剂的配制
(1)锌测定用第1试剂的配制
直接使用在实施例3之1的(1)中配制的第1试剂。
(2)锌测定用第2试剂的配制
直接使用在实施例3之1的(2)中配制的第2试剂。
2.样品
将1g/L的锌标准液(和光纯药工业社制、原子吸收光谱分析用) 用0.01N盐酸稀释，添加到人血清样品中，使锌浓度为100μg/dL， 制成样品。
3.样品的测定
用上述1中配制的锌测定用第1试剂和锌测定用第2试剂，与实 施例1之3同样地测定上述2的样品中的锌浓度。接着，从测得的锌 的测定值中减去添加锌标准液之前的人血清样品中的锌浓度，将得到 的差值除以锌标准液的添加量，如此求出添加回收率。
应予说明，在本发明的测定中，不对样品进行除蛋白操作。
样品的测定结果示于表5中。
表5

从表5可看出，当在第1试剂中不含Bridge-35时，添加回收率 停留在86.8％，而通过在第1试剂中含有Bridge-35，可以提高添加 回收率。
由此可以确认，对于使用5-Br-PAPS测定样品中的锌的方法和试 剂而言，当在作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂含有Bis-tris Propane的 锌测定用第1试剂中进一步含有非离子型表面活性剂时，与不含非离 子型表面活性剂时相比，获得平均添加回收率97.9％的 良好的添加回 收率。
即，可以确认，在本发明中，即使不对血清样品进行除蛋白操作， 也不会受到蛋白质等血中成分的影响，可以正确地测定锌浓度。
由此可以确认，本发明的锌测定试剂不需要对样品进行除蛋白操 作，而且可以正确地测定样品中的锌浓度。
〔实施例6〕
(与以往方法的比较)
用作为以往方法的ICP发射光谱分析法和本发明方法，测定同一 样品中的锌的浓度，并对测定值进行了比较。
1.测定试剂的配制
(1)锌测定用第1试剂的配制
按照记载的浓度将下述的试剂成分溶解于纯水中，配制成本发明 的锌测定用第1试剂。
Bis-tris Propane     30mM
Bridge-35            1.33％
(2)锌测定用第2试剂的配制
直接使用在实施例3之1的(2)中配制的第2试剂。
2.样品
准备43种的人血清样品(样品编号：1～43)。
3.样品的测定
(1)使用本发明的测定试剂进行的测定
用上述1中配制的锌测定用第1试剂和锌测定用第2试剂，与实 施例1之3同样地测定上述2的各种人血清样品中的锌浓度。
应予说明，在本发明的测定中，不对样品进行除蛋白操作。
(2)采用以往方法(ICP发射光谱分析法)进行的测定
用岛津制作所社制ICPS-8100(ICP发射光谱分析装置)测定上述 2的各种人血清样品中的锌浓度。应予说明，在采用ICP发射光谱分 析法进行的测定中，在向样品中添加硝酸后，采用离心分离法将蛋白 质除去，如此进行除蛋白操作。
4.测定结果
样品的测定结果示于表6中。另外，采用本发明的测定方法和测 定试剂而测得的值为对各样品分别测定2次的平均值，而采用ICP发 射光谱分析法测得的值为对各样品分别测定1次的值，表6所示的值 表示它们的体积取代补正值。
表6

从表6可看出，本发明的锌测定用试剂与采用以往方法的ICP发 射光谱分析法测得的结果非常一致。
由此可以确认，对于使用本发明的5-Br-PAPS测定样品中的锌的 方法和试剂而言，共存或者含有作为铁、铜和/或镍的掩蔽剂的 Bis-tris Propane的锌测定试剂，不需要对样品进行除蛋白操作，而 且可以正确地测定样品中的锌浓度。