颗粒凝集由于其简单性、快速性和相对敏感性，是用于检测和显 示抗原-抗体相互作用的广泛采用的免疫方法(Riochet 1993)。一般来 说细胞，特别是红细胞，是可经受多种凝集方法作用的颗粒。因而， 将红细胞凝集(血凝集)用于在血型鉴定或相配中作为预输血检测过 程中的重要成分而检测其表面的抗原和针对这种抗原的抗体(Rouger 1993；Brecher 2002)。血液的预输血测试的目的是防止由于供体和受 体血细胞之间的免疫不相容性发生血细胞的血凝集或溶血而引起的不 良反应。″血型鉴定(blood grouping)″或″血型相配(blood matching) ″是用于检测供体红细胞的抗原性组成以及预测受体针对这种抗原的 反应的一系列测试。
临床最重要的抗原系统是ABO红细胞抗原系统，其是很独特的 因为大多数人类个体产生针对那些抗原的抗体而无需已经主动对其免 疫。因此，个体的红细胞可能显示A、B或同时显示A和B抗原。大 约40％的人群不携带任何一个抗原，因此定型或分类为″O″或零。O 型个体血液中的血浆或血清具有针对A和B型抗原的抗体。然而AB 型个体血液中的血浆或血清，不显示对A或B型抗原的抗体。因此， A型个体血液中的血浆或血清具有针对B型抗原的抗体，而B型个体 血液中的血浆或血清具有针对A型抗原的抗体。
ABO抗原系统中的不相容性可能导致强烈的不良反应，其可通过 使供体与受体进行相配而加以防止。理想地，供体和受体应属于相同 的血型；然而当缺乏相同的供体时，备选的血型可能是合适的，只要 受体血清或血浆不携带针对供体红细胞的天然抗体。因此O型是万能 供体，因为其红细胞不会与存在于所有其他类型血液中的抗A或抗B 的抗体反应。AB型个体可以接受来自所有血型的血液，因为他们不 具有对任何上述血型的抗体。
Rh或″D″抗原也作为上述″血型鉴定″的部分而一起进行测试。 个体的红细胞可能携带Rh抗原(Rh+或″Rh-阳性″)或不携带Rh抗 原(Rh-或″Rh-阴性″)。不同于ABO抗原系统，抗Rh(抗D)抗体 通常不存在于Rh-阴性血型的个体中。然而，这种抗体在Rh-阴性个 体中随着由于用Rh-阳性血液输血或由于怀有Rh-阳性胎儿而产生的 免疫增强作用而发展。现代的输血医学规定除ABO相配外，供体和 受体之间Rh也要相配，以免在Rh阴性个体中产生Rh抗体，以及防 止携带抗Rh抗体个体中的不良反应。
除A、B和Rh抗原外，红细胞可能携带往往称为″亚型(sub- groups)″的多种其它抗原(参见：Brecher，2002，有详细的论述)。 类似于Rh抗原(以及自然界中的大多数抗原)，针对那些抗原的抗体 通常不存在于人类血液中，但可能由于先前的血液输入或怀有携带抗 原的胎儿而产生抗体。这种抗体称为″出乎意料的″或″稀有的″。尽管 归因于这种抗原和抗体的不良反应是稀有或较少的，在工业化国家中 当供体血液的供应是充足且合适的时候，进行血液受体中出乎意料的 抗体以及供体红细胞上相关抗原的测试。
因此显然从上可知，血液凝集过程在输血医学以及经受各种水平 测试的各个献血单位和各个献血的潜在受体中举足轻重，其可能包括 下列全部或部分：
血型鉴定：测试所有的献血单位和新近接纳的患者和/或潜在的血 液受体的血液中ABO/Rh抗原的存在；
反转鉴定(Reverse Grouping)：测试潜在的血液受体中针对 ABO/Rh血液抗原的抗体的存在以及任选地测试其血浆或血清中″出 乎意料抗体″的存在；
交叉配血：这是预输血测试的最后阶段，其中使受体血清/血浆 与所选择的供体血液单位的红细胞起反应。在一些国家中，实际上在 实验室中不进行交叉配血，而是通过与计算机储存的测验数据进行相 配。在其它国家中，例如法国，由护理人员在受体的床边进行交叉配 血。
可通过多种标准手册和自动化的颗粒凝集方法实行上述测试。所 有的颗粒凝集方法涉及使颗粒与可以是血清/血浆的凝集试剂，或人工 产生的抗体试剂混合，孵育该混合物不同长度的时间以及，最后观察 混合物中凝集颗粒的存在。在所有的方法中，使红细胞与其在血液中 的浓度相比稀释1∶10或以上，而洗涤细胞以除去血浆或血清痕迹是 强烈推荐或完全必要的。
可通过肉眼观察优选被涂敷到平面上的混合物而实现凝集的检测 (Riochet，1993)。备选地，多种手段和仪器对于增强凝集和非凝集 颗粒之间的视差是有效的。
几乎可在任何地方进行″载玻片凝集反应″法，而不需要任何仪 器。使一滴稀释的红细胞在显微镜载玻片或任何其它的不透水表面上 与一滴血清/血浆/抗体混合。通过棒条或通过涡旋载片几分钟使二 个成分混合，并小心观察凝集。这种方法的一些缺陷包括：(a)需要 混合几分钟；(b)主观目测结果；(c)由干燥导致的假阳性反应；以 及(d)不能储存载片。
在″试管凝集反应″法中将规定体积的稀释的血球悬浮液与规定体 积的血清/血浆/抗体在圆底或V形底的透明试管中混合。在阴性 反应的情况下，红细胞可能缓慢地降到试管底部中心里并且可能形成 明显的红色″钮扣形″。在阳性反应的情况下，凝集的红细胞形成网格 状而遍及试管底的表面而不形成明显的钮扣形。代之以表现为细胞″ 细筛(lawn)″。代替等待细胞缓慢沉淀的是，现行办法(Brecher， 2002；Gamma Biologicals，2001)规定离心红细胞与抗体溶液的混合 物，通过重悬浮。在阳性凝集反应情况下细胞块是清楚可见的。也可 在微量滴定板的孔中进行试管凝集反应，从而减少试剂和血液的体积 并且增加处理量。试管凝集反应法的一些缺陷包括：(a)需要实验室 用仪器、人员和环境；(b)主观目测结果；(c)不正确的离心速度或 时间可能导致假阳性或假阴性结果，因为可能认为细胞块是免疫凝集 的；(d)没有直接记录结果；(e)笨重的试管；以及(f)破损和溢出 的危险。
在″凝胶过滤″法中，将红细胞和血清/血浆/抗体的混合物施加 到凝胶分离介质柱上(其可以是微粒)。通过离心迫使混合物进入凝 胶。凝集的红细胞不能够穿透凝胶而将保留在凝胶顶部。未凝集的细 胞可穿过凝胶柱而到达其底部。小型的凝集物可能进入凝胶柱但不会 到达其底部。
在美国专利号5,338,689中描述的一种这类方法，使用胶粒柱 并且已经发展成用于血型鉴定的商业化成功的产品系列，其可从 DiaMed AG，瑞士获得。这种方法的优点是：(a)相对容易使用；(b) 清楚的结果分析；(c)能够根据对于凝胶的进入分级凝集反应水平。缺 陷是：(a)需要实验室用仪器、人员和环境；b)没有直接记录结果； (c)笨重的测试硬件(即使制造商将产品称为“卡片”，其实际上是 在支持物中的一系列试管，而并没有像″卡片″那么扁平)；以及(d) 复杂的制备(将凝胶插入狭窄的试管)而导致高成本。
有时，认为针对红细胞抗原的抗体是″不完全的″，因为它们不能 直接使红细胞凝集而需要加入抗球蛋白和/或抗补体的抗体(时常称 为：″Coombs试剂″)以便于凝集反应(Coombs等人，1945；Brecher， 2002)。当试图检测针对相对弱的抗原，例如血液亚型以及有时主要 血型的某些变体的抗体时，这种现象是最普遍的。上述所有的3种方 法都可经受使抗体-反应的红细胞经历Coombs试剂的附加步骤。然 而，这种过程必然伴有大量的手工操作。首先，必须充分洗涤红细胞 和不完全抗体的混合物以从反应混合物除去所有未反应的免疫球蛋 白。然后，使洗涤的、抗体包被的红细胞与Coombs试剂混合，并且 使用如上所述的方法之一测试凝集反应。
在涉及除了红细胞外的颗粒的免疫测试中，已经使用规定孔径大 小的滤器以容易地分离凝集的和未凝集的颗粒(例如，美国专利号 4,459,361和4,847,199)。迄今，这种方法还没有用于将红细胞作为凝 集颗粒，特别是作为例证性的血型鉴定和血液配比过程的凝集反应 法，尽管早就观察到该方法是可行的。
根据Castaneda(1950)对保藏的细菌细胞的初步观察，Malone 和Stapleton(1951)表明红细胞在滤纸上的横向移动受加入血型抗血 清的影响，因此当加入盐水时，与不相关的抗血清混合的红细胞(例 如A型细胞与抗B)可横向移动，而与相关抗血清混合的红细胞(例 如A型细胞与抗A血清)则″固定″到其位置中，且加入盐水后并不 移动。建议了分组法，其中将一滴高滴度的抗血型血清置于一张滤纸 上(用原文的专业名词″吸墨纸″)。血清分散后，将一滴样品血液置 于相同的位置并且容许部分干燥(″当已经失去光泽时″)。最后加入2 滴盐水。血液斑点比阴性反应的更小则表示为阳性反应。也建议用于 测定抗血型抗血清效价的相反步骤，其中将一滴血清置于吸墨纸上然 后放置一滴洗过的红细胞。部分干燥后，在血液的顶部加入2滴盐水。 抗血清的效价与血细胞横向散布的程度为负相关关系。
尽管其相对的简单性，这个方法除了在作者(Dunsford和 Bowley，1955，1967)的实验室和另外的场所(Farr和Godwin 1955) 中评估抗血型试剂的质量外，在血库中不可行。在测试的最后步骤前 需要等待试剂干燥，以及根据红色圆形大小的阳性和阴性反应之间不 清楚的差别是主要的缺点，并且可能是该方法无法令人继续有兴趣的 理由。
在该技术的变化中(Anderson 1970)，使血液和抗血清混合并培 养30分钟。通过将滤纸纸条插入到混合物中以及随后混合物因“灯 芯”效应进入到纸条中(即横向流动)来检测血凝集。在阳性反应中， 血细胞留在流动开始的位点处，同时无细胞的血清向着纸条的末尾进 发，而在阴性反应中，血细胞与血清一起沿着纸条移动。反应需要的 持续时间和需要2个分开的硬件部件(混合皿和纸条)是使操作复杂 化并可能导致误差的缺陷。
Akers Biosciences Inc.(Thorofare，新泽西，美国)改良了 Anderson(1970)的想法并且将其发展成为配套的装置，其在转让给 Akers Research的美国专利号5,231,035和5,565,366中有描述。该盒 式装置能够通过将大滴放置到该装置顶板中2个开口的每一个中(一 个用于A而另一个用于B血型测定)，等待2分钟，然后加入一滴盐 水来测定患者血液的血型。在阴性反应的情况下血液横向移动而出现 在第二个开口(窗口)中。在阳性反应情况下，红细胞不会移动，因 而第二个开口保持澄清(或可能显示盐水洗涤的颜色)。虽然Akers 装置使血型鉴定简单化到这样的程度以致其可在实验室外(例如在床 边)由非血库专业人员使用，它仍然有一些缺点：(a)其需要相对大 体积的血液；(b)其要求操作者记录步骤的时间；(c)其仅容许正向 血型鉴定而非用于交叉配血(观测受体的抗体针对供体的红细胞的活 性)；(d)结果的外观可能会令人误解：结果窗口中没有红色指示阳 性结果，而阴性反应结果却有红色的出现；以及(e)必须恰恰在加 入盐水洗涤后1分钟观测结果。这些要求阻碍了储备该反应装置作为 稳定的记录。
显然标准的血型鉴定和交叉配血法是相当劳动密集的，易出错的 以及需要专业人员在实验室环境中进行操作。既然存在对在实验室外 由非血库专业操作员(例如在法国在床边进行交叉配血的护士)进行 血型鉴定操作的需要，就要开发产品以达到使操作简单化并且消除操 作误差的目的。尽管这些产品实际上使血液测试步骤简单化至一定的 程度，但它们不是完全没有误差，并且对于一些人员来说可能是复杂 的(Rachel和Plapp，1990；Migeot等人，2002)。
发明概述
背景技术没有教导或暗示根据通过确定孔径大小滤器的垂直移 动，涉及容易携带装置的迅速、简单和准确的血液测试步骤，其使用 几乎不需要专业训练，并且其提供直接可记录的结果。
本发明通过提供用于以简单的方式进行各种血型鉴定和交叉匹配 测试的方法和装置而克服了现有技术的缺陷，其适合于由非专业人员 在非实验室环境中使用。此外，可任选地直接保存和储存/存档结果 以作日后参考。
根据本发明的优选实施方案，提供用于检测和/或观测颗粒悬浮液 中颗粒凝集的方法，包括将一定体积的颗粒悬浮液和含有凝集试剂的 一定体积的溶液或悬浮液置于滤器表面上基本相同的所选位置，构建 该滤器使得容许单个未凝集颗粒以垂直于该表面的方向通过；任选地 将洗液置于与凝集试剂基本相同的位置；以及观察该表面所选择位置 颗粒的存在。
任选地且优选地，在放置包含凝集试剂的一定体积的溶液或悬浮 液前将一定体积的颗粒悬浮液置于所选择的位置。
任选地且优选地，滤器包括多孔体的多孔表面，该表面孔的大小 至少容许通过单个颗粒。
任选地以及更优选地，多孔表面是固有地吸收性的或包括附着于 吸收性材料的多孔层。
根据本发明进一步优选的实施方案，水溶性薄膜位于多孔层和吸 收性材料之间。
根据本发明进一步优选的实施方案，该方法进一步包括干燥滤 器。
任选地且优选地，颗粒悬浮液的体积和凝集试剂溶液或悬浮液的 体积各自包括可递送的体积。任选地以及更优选地，可递送的体积包 括至少1微升。
任选地且优选地，颗粒悬浮液的颗粒用结合对成员(MBP)包被。 任选地以及更优选地，凝集试剂包括MBP。
根据本发明进一步优选的实施方案，颗粒包括至少一种天然颗粒 或合成颗粒。
根据本发明进一步优选的实施方案，颗粒包括可检测标记。任选 地且优选地，该标记选自颜料、放射性物质、磁性或顺磁性物质、荧 光团、以及发光物质。
任选地且优选地，颗粒悬浮液包括第一血液产品。
根据本发明的优选实施方案，第一血液产品包括全血。
根据本发明进一步的优选实施方案，第一血液产品包括血液成 分。
任选地且优选地，血液成分在悬浮液中。
根据本发明进一步的优选实施方案，第一血液产品包括红细胞。
根据本发明更进一步优选的实施方案，第一血液产品包括选自未 洗涤的红细胞、未稀释的红细胞或未洗涤且未稀释的红细胞中的至少 一种。
根据本发明优选的实施方案，本发明方法的操作中没有离心或将 第一血液产品与颗粒悬浮液或凝集试剂预混合。
根据本发明的优选实施方案，凝集试剂包括第二血液产品。
根据本发明进一步的优选实施方案，凝集试剂包括针对血型的抗 体。
根据本发明更进一步的优选实施方案，凝集试剂包括血清或血 浆。
根据本发明进一步优选的实施方案，在放置一定体积的颗粒悬浮 液之前，将一定体积的含有凝集试剂的溶液或悬浮液置于所选择的位 置。
任选地且更优选地，滤器中浸透了凝集试剂。任选地以及更优选 地，滤器浸透了选自抗球蛋白试剂和抗补体试剂的试剂。
根据本发明其它的优选实施方案，该试剂包括Coombs试剂。
根据本发明进一步优选的实施方案，洗液是盐溶液。任选地且优 选地，盐溶液是等渗的。任选地以及更优选地，盐溶液是盐水(saline) 溶液。任选地以及更优选地，盐水是缓冲的。任选地以及更优选地， 缓冲盐水是磷酸盐缓冲盐水。
根据本发明进一步优选的实施方案，洗液进一步包括附加的洗涤 成分。任选地且更优选地，附加的洗涤成分包括聚合物。任选地以及 更优选地，该聚合物选自聚乙二醇和硫酸葡聚糖钠盐。任选地以及更 优选地，聚合物的浓度范围适于维持渗透平衡。任选地以及最优选地， 该浓度范围是大约0.0001至大约20％w/v。
根据本发明进一步优选的实施方案，洗液进一步包括至少一种去 污剂和表面活性材料。任选地和优选地，该去污剂包括聚氧乙烯-10- 十三烷基醚。任选地以及更优选地，该去污剂或表面活性剂的浓度在 0.0001至0.1％w/v范围之间。任选地以及最优选地，浓度在0.001至 0.01％w/v范围之内。
根据本发明进一步优选的实施方案，提供用于检测和/或观测样品 中颗粒凝集的装置，包括以便容许置于滤器表面上的单独的、未凝集 颗粒以垂直于所述表面的方向通过而构建的滤器。
任选地和优选地，该装置进一步包括放置在滤器上表面上的网 格筛。
根据本发明优选的实施方案，该装置进一步包括用于容纳凝集试 剂并从凝集试剂除去颗粒的附加滤器。任选地且优选地，在加入含有 颗粒的凝集试剂后以及在向第一滤器加入含有颗粒的样品前移去该附 加滤器。
任选地以及优选地，该凝集试剂包括全血中的抗体或血液成分。
根据本发明进一步优选的实施方案，提供用于施行本发明方法的 试剂盒，该试剂盒包括用于容纳样品的滤器；还有置于滤器上的凝集 试剂；以及任选地在凝集试剂和样品后置于滤器上的洗液。
任选地和优选地，该试剂盒进一步包括用于检测和/或测量凝集反 应的仪表。任选地以及更优选地，该仪表包括光度计，其包括将光发 射到滤器多孔表面上的光源，和被放置以测量由多孔表面反射或散射 的光的光传感器。
任选地和优选地，该试剂盒进一步包括将测量的光转化为可见信 号的转换器，和用于显示该信号的显示器。
该试剂盒可任选地包括至少一个附加的光传感器和/或至少一个附 加的光源。
任选且优选地，本发明的试剂盒进一步包括处理电路。
任选且优选地，本发明的试剂盒进一步包括滤器的支持物。
任选地以及更优选地，光源提供彩色光。
根据本发明优选的实施方案，该试剂盒进一步包括用于容纳凝集 试剂并从凝集试剂除去颗粒的附加滤器。任选地以及更优选地，附加 滤器是可拆卸的。
根据本发明进一步的实施方案，提供用于施行本发明方法的试剂 盒，该试剂盒包括用于容纳样品和凝集试剂的滤器，其中滤器任选地 用试剂浸透；以及任选地在凝集溶液和样品后置于滤器上的洗液。
任选地和优选地，该试剂包括Coombs试剂。
任选地和优选地，浸透滤器的试剂是凝集试剂。
根据本发明优选的实施方案，提供用于检测多个测试成分之间存 在或不存在凝集反应的装置，该装置包括具有上表面的滤器，其构建 为使得测试成分的流向垂直于上表面，将测试成分施加到上表面，以 及任选地经受洗涤操作，其中已经经历凝集反应的测试成分在上表面 上是可检测的。
任选地以及优选地，测试成分包括至少一种全血或血液部分或血 液成分。
根据本发明更进一步优选的实施方案，该装置配备有可任选地包 括一个或多个层的滤器。该滤器的尺寸(优选包括至少一个深度或面 积)优选设计成容许测试成分的流向垂直于这些成分所施加的表面。 所述成分可任选地是血液或血液部分或成分，但也可任选地包括许多 不同的待分离成分的任何混合物。优选地，该成分在施加至滤器表面 上之前或期间有些反应，以使得根据反应的产物发生不同的分离。例 如，对于血液成分，反应可任选地是凝集，以使得如果血液(或其成 分)凝集，该测试成分不进入滤器(或仅仅短距离进入)。
任选以及更优选地，视觉确定，最优选地通过用肉眼观察滤器确 定存在或不存在反应。任选地，可使用仪表。备选地，可使用其它类 型的标记或报告剂，例如(任选且优选地)使用检测标记或报告剂存 在的仪表。下文更详细地描述各种例证性的标记和报告剂，但任何合 适的标记或报告剂都可使用，并可由本领域的普通技术人员进行选 择。应该注意到仪表可根据本领域普通技术人员的设计，任选地与标 记或报告剂一起或不一起使用。
根据本发明优选的实施方案，结果的确定任选且优选地不涉及主 观因素或相反优选地涉及少许化验者方面的主观性。
根据本发明优选的实施方案，该装置可任选地是便携式的。
根据本发明优选的实施方案，它可任选地由非专业操作者容易地 使用。
根据本发明优选的实施方案，该方法任选且优选地不需要反应成 分的预混合。
根据本发明优选的实施方案，可任选优选使用完全的、未洗涤的 血液。
根据本发明优选的实施方案，小体积的样品血液是任选且优选需 要的。
根据本发明优选的实施方案，任选且优选需要没有离心步骤。
根据本发明优选的实施方案，任选不需要反应终止的计时。
根据本发明优选的实施方案，任选获得直接记录的结果。
本发明进一步附加的优点是其任选且优选适于血型鉴定和交叉配 血。
本发明的特性是测试成分的流向优选垂直于多孔体的表面。
本发明的优点是该方法和装置使用简单。
本发明进一步的优点是避免假阳性结果。
本发明进一步的优点是优选以极低的误差范围快速准确地获得结 果。
在本说明书中，在此下文中论述大量术语，其仅仅是为说明的目 的而没有任何加以限制的意图。除非另外限定，否则在此所使用的所 有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所认为 的相同意义。
结合对(BP)-受体-配体对，包括但不限于抗原-抗体、互补的核 酸、凝集素-碳水化合物对、酶-底物等等。
结合对成员(MBP)-结合对成员，例如抗体是抗原-抗体结合对 的MBP。
血型鉴定(Blood typing)-在此参见″血型鉴定(blood grouping) ″。
凝集试剂-包括但不限于导致颗粒相互结合的物质。
滴-任选且优选地，一定体积的液体，其重得足够从分配装置，包 括但不限于吸管、针、瓶或任何其它容器、试管或具有薄的、突出开 口的导管、或任选地实心物体的孔作为单个物质(single mass)落下， 其中滴的体积任选且优选地，但不是必须地为大约20至大约50μL体 积。
多孔体-在其中具有孔的一团物质。多孔体的非限制性实例包括但 不限于滤器、滤纸、吸水纸等。
滤器-包括但不限于多孔材料或物质的装置，包括但不限于纸或 沙，其中可通过液体或气体以便将悬浮颗粒物质的至少一部分与液体 分离开，或任何其它吸收材料，其中可为了这种分离而通过液体或气 体；或包含这种多孔材料的装置。
横向移动-例如液体和/或颗粒(任选悬浮或分散在液体中)任选 且优选地在物体，包括但不限于扁平吸水的(即多孔或另外吸收性的) 物体(包括但不限于膜、纸)表面上或内部并且与该物体表面平行的 移动。
垂直移动-例如液体和/或悬浮在这种液体中的颗粒通过物体，包 括但不限于扁平吸水的(即多孔或另外吸收性的)物体(包括但不限 于膜或纸)并且垂直于该物体表面的移动。
流过-参见上述的″垂直移动″
多孔表面-具有孔或空隙的表面，其容许通过例如气体或液体，但 其不容许通过悬浮或溶于液体或气体的至少一部分颗粒，其中该颗粒 具有比所述的孔大的尺寸或附着于孔的表面。
血型鉴定(blood grouping)-通过测试法确定ABO/Rh血型，包 括但不限于测试血液样本中其红细胞上ABO/Rh抗原的存在，或通过 测试血液样本中对A和B抗原的抗体的存在。
交叉配血-预输血测试的最后阶段，其中使受体的血清/血浆与供 体的血液或其红细胞起反应。
相配-参见上述的″交叉配血″。
预输血交叉配血-参见上述的″交叉配血″。
亚型-包括但不限于，红细胞上的抗原，其不属于ABO/Rh抗原 系统并且是独立于ABO/Rh抗原遗传的。
出乎意料的抗体-在例如人类血液的血清/血浆中发现的针对非 ABO/Rh抗原的抗体。
标记-示踪物；相对容易可检测的物质或部分，其被添加或结合到 例如化学的、生物的、或物理实体以便于其检测或观测。用于生物医 学领域的标记实例包括但不限于：染料、放射性同位素、磁性或顺磁 性物质、荧光团、发光的物质、酶、颗粒。
相似的位置-优选包括但不限于某一位点，其基本上接近于先前一 定体积的溶液或悬浮液所放的位置，但也可任选地包括邻接或附近的 位置。
附图简述
在此参考所附的附图仅仅举例描述本发明：
图1显示根据本发明的教导进行血型鉴定检验的结果；以及
图2显示根据本发明的教导构建的装置和试剂盒的略图。
发明详述
本发明提供用于检测或观测(visualization)多种测试成分的颗 粒凝集(凝集反应)，例如用于检测抗原-抗体相互作用的方法和装置。 该装置优选配备具有上表面的滤器。测试成分的流向主要垂直于上表 面。优选通过限制相对于样本和洗涤试剂的体积的表面积保持流动的 垂直方向。作为非限制性的实例，可将大约0.2至大约0.25cm2表面 积任选且优选地用于50μL或更少的样本。将测试成分施加于上表面， 以使得如果测试成分经历凝集反应，起报告剂作用的可见的和/或另外 可检测的测试成分(例如，本发明的优选实施方案所述的红细胞)不 会明显地(appreciably)以垂直方向穿过滤器，使得其在任选的洗涤 步骤后在表面上是可见的和/或另外可检测的(otherwise detectable)。
本方法任选以及优选地涉及将颗粒悬浮液滴置于滤器表面上，将 包含凝集试剂的溶液或悬浮液滴置于相同或相似的位置，以及任选地 将洗液置于相同或相似的位置。选择滤器以使得孔能够使单个血细胞 垂直于滤器表面通过，但凝集后的凝块细胞不能通过。因此凝集的细 胞保留在滤器表面上，并可通过在反应位点存在的红斑而进行检测。 应该注意到优选将凝集试剂置于与测试样品(测试成分或组分)基本 上相同的所选位置，以使得凝集试剂能够与测试样品反应。因此术语′ 基本上相同的所选位置′是指能够使凝集试剂与测试样品反应的位置。
备选地可任选使用多个垂直叠加的滤器，优选与水溶性薄膜一起 使用，用于控制至少在第一滤器和其下叠加的至少一个滤器之间液体 转移的速率。第一滤器容纳结合对的两个成员(MBP)。MBP是受体 -配体对，例如如下列所更详细描述的抗原-抗体、互补的核酸、凝集 素-碳水化合物对等等。因此，凝集试剂可以是MBP的互补成员，以 使得颗粒凝集反应和装置可用于检测/测定结合对的成员。优选地， 第一滤器顺序地容纳两个成员。如果发生凝集，用洗液洗涤第一滤器 不会导致洗涤MBP垂直通过第一滤器到第二滤器上。凝集可任选地 是视觉检测的或根据标记进行检测。
也可任选使用单个足够厚的滤器，任选与浸透在滤器内的水溶性 膜一起。选择滤器使沿着滤器的横向移动最小化，以使得非凝集颗粒 的至少相当大的部分的移动以垂直于滤器表面的方向发生，而凝集颗 粒保留在滤器表面上。
本发明可用于血型鉴定和交叉配血的目的。本发明提供可由非专 业操作者在实验室外使用的方法和装置，其不需要预混合反应成分， 其使用完整的、未洗涤的血液，其在阳性反应情况下提供清楚的彩色 信号，以及其可存储作为记录。
与上述讨论的现有技术方法相反，其依赖于测试成分在滤器上的 横向流动，本发明人已经发现如果移动方向通过滤器(即该方向垂直 于滤器的表面)，滤器可有利地用于血凝集方法(包括血型鉴定和配 血)，其与现有方法相比具有明显的优点：(a)凝集和非凝集之间的差 异很明显：阳性反应情况下出现红色斑点，而阴性反应情况下没有斑 点显现(或没有反应)；(b)红细胞及其凝集试剂不必在将其置于滤 器上之前混合和/或孵育任何时段；(c)不需要离心来将非凝集红细胞 与凝集的红细胞分离开以便于观测结果；(d)可使用全血代替稀释的 (任选且优选为大约1至大约5％)洗涤的红细胞的悬浮液；以及(e) 可干燥反应滤器并储存/归档作为反应及其结果的明确记录。用于本发 明系统的滤器具有合适的尺寸和特性以保证至少显著比例的颗粒运动 以垂直于滤器表面的方向发生。
根据本发明优选的实施方案，提供用于检测/观测颗粒凝集的方 法，包括：将颗粒悬浮液滴置于多孔体的多孔表面上，选择该表面的 尺寸和孔以便容许单个颗粒的垂直通过；将包含凝集试剂的溶液或悬 浮液滴置于与该颗粒悬浮液滴相同或相似的位置；任选地将洗液置于 与所述滴相同或相似的位置；观察该位置的表面上颗粒的存在，该存 在表明发生了颗粒的凝集。通过任选地干燥该多孔材料，可将这种干 燥的材料储存为记录。
根据本发明备选的实施方案，上述实施方案的开始两个步骤的顺 序是可逆转的，使得用于血型鉴定的方法优选包括将包含针对血型抗 原的抗体的溶液滴置于多孔表面上，规定该表面的孔和尺寸以使得容 许至少单独的红细胞垂直通过；将红细胞悬浮液滴任选地置于与抗体 溶液滴相同或相似的位置；将洗液置于该表面上，任选地与所述滴相 同或相似的位置；观察该位置的表面红色的存在。
洗液任选且优选为渗透溶液，更优选为等渗溶液。更优选地，洗 液是盐水，以及最优选为缓冲盐水溶液。根据本发明优选的实施方案， 洗液包括磷酸盐缓冲盐水。
洗液可任选地包括附加的洗涤成分或进一步的成分，包括聚合 物、去污剂或表面活性剂。附加的洗涤成分优选能够帮助减少与滤器 的非特异结合。任选的聚合物优选地选自聚乙二醇和硫酸葡聚糖钠 盐。任选且优选地，加入的任选聚合物的浓度范围适合于保持渗透平 衡。更优选地，浓度在大约0.0001至大约20％w/v的范围之内。洗 液可任选地进一步包括去污剂和/或一种或多种表面活性剂，更优选地 浓度范围为大约0.0001至0.1％w/v。最优选地，去污剂或表面活性 剂的浓度在大约0.001至大约0.01％w/v的范围之内。
该颗粒可任选地用结合对(MBP)包被。MBP是受体-配体对， 例如抗原-抗体、互补的核酸、凝集素-碳水化合物对等等。因此，凝 集试剂可以是MBP的互补成员，以使得颗粒凝集反应和装置可用于 检测/测定结合对成员(测试成分)。
该颗粒可任选地是天然的(例如细胞或亚细胞部分)或合成的(乳 液、金属、金属氧化物、碳、染料)。该颗粒应当优选用例如染料、 放射性物质、磁性或顺磁性物质、荧光团、发光材料标记，以便于容 易检测或观测。
在本发明优选的实施方案中，颗粒是红细胞。在该实施方案中， MBP中的抗原任选地是血型抗原，例如位于红细胞表面上的ABO/Rh 抗原系统，而抗体任选且优选是相应的存在于血液液体部分中的抗血 型抗体。
在本发明的另一实施方案中，起可凝集颗粒作用的红细胞悬浮液 任选且优选地包括全血。使用全血能够如下进行血型鉴定：将红细胞 悬浮液滴置于多孔表面上，选择该表面的孔和尺寸以使得容许至少单 独的红细胞垂直于该表面的平面通过；将包含针对血型抗原的抗体的 溶液滴任选地置于与红细胞悬浮液滴相同或相似的位置；将洗液置于 该表面上，任选地与所述滴相同或相似的位置；观察该位置的表面红 色的存在，这种颜色表明红细胞与抗体起反应，并且那些红细胞携带 抗体所针对的抗原，和/或该红细胞为相应于该抗体的血型。
在下文中″红色″包括但不限于具有红色色调(red tone)或微红 的、或似乎与红色相似的任何颜色，和/或指示红细胞和/或提供红色 的任何其它血液成分的存在的任何颜色，以及血液可能呈现的任何颜 色。
多孔体的多孔表面任选是固有地吸收性的或备选地是附着于吸收 性材料的多孔层。多孔层和附着的吸收性材料可任选地呈现扁平卡片 的形状。多孔层可从多孔膜(例如纤维素、醋酸纤维素或硝酸纤维素、 Nuceleopore)、编织物(例如由Sefar，Riischlikon，瑞士所供应的)、 网格筛、吸水材料(例如纸、可从例如Whatman，Maidstone，英国 获得)、深度过滤介质(例如玻璃纤维纸、可例如从Ahlstrom，PA， 美国获得)产生。玻璃纤维纸是优选的，特别是用粘合剂加固的这种 纸，例如由Ahlstrom，Mount Holley Springs，PA，美国供应。
在该实施方案的变化中，可在发生血型鉴定测试前用抗体浸透多 孔材料，干燥和储存一段时间，以使得现成可用的装置可以得到，用 于即刻配备用于血液样本鉴定，任选地不需要任何新鲜的抗体试剂。 可被动的用抗体浸透多孔材料，即仅仅通过向多孔材料加入抗体溶 液，并且让其在环境温度或提高的温度下以及在大气压力或在真空中 干燥。备选地，浸透可任选地涉及抗体与多孔材料的基质通过本领域 公知的各种方法的活性化学结合，例如(但不限于)戊二醛介导的与 各种材料的结合、溴化氰、氰尿酰氯或高碘酸盐介导的与基于多糖材 料的结合、硅烷介导的与玻璃的结合。另外，抗体可任选地首先结合 颗粒(例如乳胶)，然后将这种抗体包被的颗粒包埋到多孔材料中。 这些和附加的方法由Dent和Aslam，1998，Dean等人，1985等详细 描述。
本发明提供用于血型鉴定的方法，包括：将红细胞悬浮液滴置于 预先浸透针对血型的抗体的多孔表面上；将洗液置于所述滴的位置； 观察该位置的表面红色的存在。
上述血型鉴定的实施方案也提供用于测定红细胞的血型抗原或当 使用规定血型的红细胞时，用于确定特异的抗血型抗体存在的方法。 在任一组合中，本发明的实施方案容许使用完整的、非分离的血液代 替洗涤的和/或稀释的红细胞悬浮液。
在本发明的血型鉴定应用的优选实施方案中，本发明可用于预输 血交叉配血。交叉配血测试是实际输血前的最终测试步骤。在这个测 试中，医务人员检查受体血液中针对供体血液的抗体的存在。
可使用本发明的方法测试受体血浆或血清与来自供体血液的洗涤 的和/或稀释的红细胞的相容性。然而，可通过使用来自供体的完整、 未经处理的血液作为用于与受体血浆或血清进行交叉配血检验的红细 胞来源而使检测过程显著地简化，使得交叉配血方法任选且优选包 括：将受体的血清或血浆滴置于多孔表面上，规定该表面的孔大小以 容许单独红细胞的垂直通过；将供体的血液滴置于表面上，任选地与 受体血液滴相同或相似的位置；将洗液置于该血液滴的位置；观察该 位置的表面红色的存在，这种颜色表明发生了红细胞凝集，并且供体 血液与受体血液不相容。
也可任选地通过逆转上述开始两个步骤的顺序进行该交叉配血方 法。因此，本发明进一步的实施方案提供用于出人意料的血型鉴定的 预输血交叉配血测试，优选包括将供体红细胞的悬浮液滴置于多孔表 面上，规定该表面孔的大小以便容许单个红细胞的垂直通过；将受体 的血清或血浆滴置于表面上，任选地与该红细胞悬浮液滴相同或相似 的位置；将包含抗球蛋白或抗补体试剂的溶液滴置于表面上，任选地 与该红细胞悬浮液滴相同或相似的位置；将洗液置于所述滴的位置； 观察该位置的表面红色的存在。
为了进一步简化该过程以便其更适于床边使用，其中不可能得到 例如离心机的实验室设备来从受体血液分离血清或血浆，下列方法使 用来自供体和受体的全血样本，包括：将防止血细胞通过而离开全血 的第一滤器置于第二滤器的多孔表面上，第二滤器的孔大小可容许单 个红细胞通过；将受体的全血滴置于第一滤器上并且等待至少部分样 本进入第一滤器和/或为第一滤器所吸收，以便该全血的滤出液润湿第 二滤器的表面；除去第一滤器；将供体血液滴置于该表面上，任选与 第一滤器除去前相同或相似的位置；将洗液置于该血液滴的位置；观 察该位置的表面红色的存在，这种颜色表明发生了红细胞凝集，并且 供体的血液与受体的血液不相容。
为了检测出人意料的或弱的血型抗原和抗体，鉴定和交叉配血过 程要求加入抗球蛋白试剂(也称为Coombs试剂)或抗补体试剂以便 从这种抗原和抗体获得可见的凝集。本发明进一步的实施方案便于将 这种试剂简单地加入血型鉴定和交叉配血法。因此，本发明所述的血 型鉴定方法任选地包括：将红细胞悬浮液滴置于多孔表面上，该表面 孔的大小容许单个红细胞的垂直通过；将包含针对血型抗原的抗体的 溶液滴置于该表面上，任选地与该红细胞悬浮液滴相同或相似的位 置；将包含抗球蛋白或抗补体试剂的溶液滴置于该表面上，任选地与 该红细胞悬浮液滴相同或相似的位置；将洗液置于表面上，任选地与 所述滴相同或相似的位置；观察该位置的表面红色的存在，这种颜色 表明发生了红细胞凝集，并且那些红细胞携带该抗体所针对的抗原。
在上述包括Coombs试剂的方法中，可改变开始3个步骤的顺序 而不会减损本发明的性能。在本发明另外的实施方案中，可在发生血 型鉴定或交叉配血测试前在滤器中预先浸透Coombs试剂，干燥和储 存一段时间，以使得该现成可用的装置适用于即刻配备用于血液样本 鉴定而不需要任何新鲜的抗体试剂。根据这种实施方案，使用Coombs 试剂的血型鉴定或配血方法优选包括：将受体的血清或血浆滴置于预 先浸透Coombs试剂的多孔表面上，该表面孔的大小容许单个红细胞 的通过；将供体红细胞的悬浮液滴置于该多孔表面上，任选地与该受 体血清或血浆滴相同或相似的位置；将洗液置于表面上，任选地与所 述滴相同或相似的位置；观察该位置表面的红色的存在。这个实施方 案任选地也可备有可拆卸的血细胞滤器以便受体的全血可用于最初的 步骤中。
在本方法说明的上述所有实例中，(血液或血清/血浆或抗体试剂 的)″滴″可被用装置，例如下列的一种或多种：吸管、微量吸液管、 毛细管、滴管、滴瓶、注射器、环、开环和/或任何其它机械、导管或 用于流体处理的装置所递送的液体的更明确的体积替代。那些装置可 接触多孔表面以便于递送进行测试所需要的完整体积的液体。
参照图2，可根据本发明的教导也可任选地构建装置100和试剂 盒。该装置可具有卡片102的结构，其由以下形成：顶部的滤器104 (多孔层)、任选的吸收层106、任选的衬垫108、滤器104上的任选 的网格筛层109)，其便于测试成分快速进入滤器并混合这些测试成 分，以及具有孔112的任选的顶盖110，其限定了放置测试样本和进 行测试的位置。顶盖中的孔112可四周环绕有壁，因此产生具有确定 体积的孔，以便于用确定体积的洗液洗涤反应物(未显示)。此外， 可将水溶性薄膜任选地置于滤器和吸收层之间以减少液流通过滤器的 速率(未显示)，由此增加本发明对弱的抗原和/或低水平抗体的灵敏 性。
在该装置的优选实施方案中，卡片具有用于进行测试的多个位 置；可任选地通过各种方法标明该位置，例如印制形状，具有齿墙形 状的粘性膜。可将整个卡片任选地装入盒114中。可以构建装置100 以容许使用后进行拆卸，以便可拆卸具有反应区的滤器，加以干燥并 归档/储存结果作为记录。卡片可任选地具有用于书写各种信息项的区 域，例如受体和供体的标识、日期、设备标识等。包括一个或多个 卡片以及所有或部分必需试剂、洗液、对照液和器皿的试剂盒是本发 明另外的实施方案。
在本发明本发明优选的实施方案中，所有或部分的抗血型抗体和/ 或抗球蛋白和抗补体试剂可以以湿润或优选干燥的形式浸透多孔表 面。因此，可得到具有单个或多个抗血型和/或抗球蛋白和/或抗补体 试剂的测试卡片以便于差异鉴定血型，同时防止误差并减少手工操作 的数量。这种装置可任选地包括阳性和阴性对照测试区。阴性对照区 可任选地通过用非免疫性的血清(例如来自从未接收任何血液输入的 AB/Rh阳性男性的血清)在该位置浸透滤器而完成。阳性对照区可任 选地用抗红细胞抗血清或抗体(例如抗血型糖蛋白抗体)在该位置浸 透滤器而完成。
在本发明的另一实施方案中，提供具有多个测试区的装置(例如 用于单个样本的血型鉴定)。可构建该装置以便于在一个步骤中将测 试样本，以及任选将洗液分散遍及所有的测试区。可通过各种设计要 点实现这种实施方案，例如：(a)用单片的，优选亲水的网格筛(mesh) 覆盖所有的测试区；(b)通过在全部测试区域上放置非吸收性的覆盖 物在测试区上产生毛细管空间。
该装置可进一步包括任选的仪表116，其可解释测试结果而不需 要人肉眼的鉴定。仪表116优选容纳(receive)卡片102以使得仪表 116能够测量用于检测凝集反应的标记或报告剂。任选地，仪表116 是光学仪表并且测量来自样本放置位置反射或散射或通过该位置透射 的光的数量并由此确定结果。在其最基本的形式中，该仪表(meter) 包括：(a)光源118，其指导一束入射光119到样本放置的位置上；(b) 光传感器120，其被放置以便测量/检测由多孔表面反射/散射或通 过该多孔表面透射的光121；(c)显示来源于光传感器的信号的装置 或电路122。
在本发明进一步的实施方案中，光源任选是彩色的以便提高红细 胞的检测。在多孔反应表面是白色的情况中，光应任选且优选为非红 色，并更优选蓝色，以致红细胞将减少从白色表面反射/散射的光的数 量。相反地，如果表面是非红色或任选且优选为黑色或蓝色，并且光 是红色的，则红细胞将增加反射/散射光的数量。
此外该仪表可任选地另外具有下列一个或多个特征：显示器和/或 用于提供结果的打印设备；多个光传感器和任选地多个光源用于测量 多个反应区；处理电路(其可任选地包括处理器和辅助的电子设备) 用于分析由传感器产生的信号、滤器或测试卡片的支持物、电池、可 充电电池、存储器、时间和日期功能、条型码读取器或接触面，光符 阅读器、通讯能力和其他特征，这些都是医学诊断设备的设计师和制 造商公知的。该仪表优选进一步包括用于观察显示结果的透明或半透 明的窗口。
实施例
下列实施例是本发明所述方法和系统的例证性实施。这些实施例 不是旨在以任何方式加以限制。
实施例1-洗液
用于形成本实施例的洗液是：
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)，获得自Biological Industries， BeitHa′emek，以色列。
溶液，由在水中1∶1稀释的PBS与4％w/v聚乙二醇(PEG)15000 -20000MW(Fluka)和0.3％w/v硫酸葡聚糖钠盐(Amersham Biosciences)制成。
A.Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)具有0.001-0.01％w/v聚 氧乙烯-10-十三烷基醚(Sigma)。
实施例2-血型鉴定
将0.5×0.5cm的Ahlstrom#142滤纸片置于吸收性的衬垫上。吸 取2μL全血置于滤器的中心，然后是2μL的抗血型试剂(Gamma Biologicals Inc.，Hosuton，TX，美国)。然后用几滴(来自滴瓶)洗 液洗涤滤器并干燥。或者，使用4mm直径圆形的Ahlstrom#142滤 纸、10μL血液和10μL抗血型试剂，然后是来自实施例1的几滴洗液 C。
用各种血型的多个血液样本(来源于Central Blood Services并由 其进行预测试，Israel Red Magen David，Tel Hashomer，以色列) 重复这个测试，并且其中的每一个都用抗A、抗B、抗AB和抗D(＝Rh) 血型试剂进行测试。A-血液仅仅与抗A和抗AB试剂产生红点。B-血 液与抗B和抗AB试剂产生斑点。AB-血液与抗A、抗B和抗AB试 剂起反应。O-血液与任何试剂都不起反应，而O+血液仅仅与抗D试 剂反应。
实施例3-具有干燥试剂的血型鉴定
将0.5×0.5cm的Ahlstrom#142滤纸片置于非吸收性的表面(空 的、一次性Petri培养皿的底部)。吸取50μL等分的抗血型试剂(Gamma Biologicals Inc.，Hosuton，TX，美国)置于每个滤纸片上。将装有 包含抗血型试剂的滤纸片的Petri培养皿在37℃培养过夜。在此间干 燥滤纸片。
为了检测干燥的、渗透抗体的纸片正确鉴定全血样本的血型的能 力，将其置于吸收性的衬垫上，并将1μL等分的测试血液置于一系列 滤器衬垫中每一个的近似中心处。该系列包括衬垫，其各自用抗A、 抗B或抗D(＝Rh)试剂中的任意一种浸透。
通过放置5-10滴洗液A或B从滤器衬垫洗去过量的血液。然后 空气干燥该滤器片用于保存记录。结果如图1所示。显然A-血液仅在 浸透抗A试剂的滤器片上产生斑点。B-血液在浸透抗B的滤器上产 生斑点。AB-血液与抗A和抗B滤器片都起反应。O-血液不与任何滤 器反应而2个O+血液样本仅仅与浸透抗D试剂的滤器片反应。
下列对步骤的改变似乎可产生改善的信号而任选且优选地包括在 本发明中。
1.将水溶性薄膜置于滤器块之下以便控制在滤器及其下的吸收性 衬垫之间的液体转移速率。
2.每个滤器片的抗血型抗原抗血清的体积：25μL
3.每个滤器片的血液样本的体积：10μL
4.洗涤步骤：2滴洗液B(实施例1)，然后是几滴PBS。
应该注意到上述体积仅仅是例证性的实施例不是意味着以任何方 式对本发明加以限制。
实施例4-交叉配血
从Central Blood Services，Israel Red Magen David，Tel Hashomer，以色列获得已预测试其ABO/Rh血型的全血样本。血浆 部分来源于一些血液样本而起血液受体样本模型的作用。
将0.5×0.5cm的Ahlstrom#142滤纸片置于吸收性的衬垫上。吸 取2μL全血供体样本置于滤器的中心，然后是10μL的受体血浆。然 后用几滴(来自滴瓶)洗液洗涤滤器并干燥。根据下列表格，只有当 受体和供体之间存在不相容性时，洗涤后滤器上保留有红色血点：   受体组     供体组     结果   (红点)   A   A   A   A   AB   AB   AB   O   O   O   O   A   B   AB   O   A   B   O   A   B   AB   O   -   +   +   -   -   -   -   +   +   +   -
因此这些结果清楚表明本发明兼备足够的灵敏性和足够的可重复 性以及可信度以用于血液测试和血型鉴定。
尽管本发明已经结合其特定实施方案进行了描述，很明显许多备 选方案、改进和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此， 旨在包含属于所附的权利要求的精神和广泛范围的所有这种备选方 案、改进和变化。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请 在此全部引入本说明书作为参考，以达到如各个单独的出版物、专利 或专利申请具体且逐一指明在此引入作为参考的相同程度。此外，不 应认为本申请中任何参考文献的引用或标识是承认这种参考文献是本 发明可获得的现有技术。
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