在许多用途中，希望富集(或者，排除)生物样品中的某些细胞 群体。血液学、免疫学和肿瘤学领域依赖于外周血样品和来自有关组 织(如骨髓、脾脏、胸腺和胎肝)的细胞悬液。从这些异源样品中分离 特定细胞型对于这些领域的研究、对某些恶性和免疫/造血疾病的诊断 和治疗是关键的。
纯化的免疫细胞(如T细胞和抗原递呈细胞)群体是研究免疫功 能所必需的，并在免疫治疗中使用。对细胞、分子和生物化学过程的 研究需要分析分离的某些细胞型。大量技术已经用于分离T细胞亚组、 B细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突细胞。
造血干细胞的分离也已经是备受关注的领域。纯干细胞群体将促 进对血细胞生成的研究，来自外周血和/或骨髓的造血细胞的移植越来 越多地与高剂量化学治疗和/或放射治疗结合用于治疗多种疾病，包括 恶性、非恶性和遗传疾病。这些移植物中的极少量细胞能长期造血重 建，因此有一种强烈需求来发展造血干细胞的纯化技术。此外，严重 的并发症和实际上移植方法的成功很大程度上依赖于用于去除移植物 中对移植受体造成危险的细胞的方法的效果。这些细胞包括引起异体 移植中移植物抗宿主疾病(GVHD)的T淋巴细胞，和可引起恶性生 长复发的自体移植物中的肿瘤细胞。通过除去不必要的细胞，从而减 少需输入的细胞保藏剂的体积，缩减移植物也是重要的。
在某些情况中，从生物样品如骨髓移植物中除去或排除肿瘤细胞 是希望的。支气管、乳房导管和胃肠道及泌尿生殖道的上皮癌代表了 今天所能见到的主要的实体瘤类型。微转移肿瘤细胞迁移被认为是上 皮癌患者的一个重要的预后因素(Braun等人，2000；Vaughan等人， 1990)。检测这些转移细胞的能力受组织或液体取样的效率和肿瘤检测 方法灵敏度的限制。一种富集血样中循环上皮肿瘤细胞的技术会提高 检测转移疾病的能力，并将促进对这些稀少细胞的研究和确定使疾病 扩散的生物学变化。
造血细胞和免疫细胞已经根据物理性质(如密度)和对可杀伤循 环细胞的某些药理试剂的敏感性分离。抗细胞表面抗原的单克隆抗体 的出现已经大大扩展了区别和分离不同细胞型的能力。用单克隆抗体 从血液和相关细胞悬液中分离细胞群体有两种基本方法。它们的不同 之外在于是用抗体区别、标记希望的还是不希望的细胞。
在正选择技术中，希望的细胞用抗体标记，并从剩余的未标记/不 必要的细胞中移出。在负选择中，标记并移出不需要的细胞。抗体/补 体处理和免疫毒素的使用是负选择技术，但是FACS分选和大多数分 批免疫吸附技术能适用于正选择和负选择两者。在免疫吸附技术中， 细胞用单克隆抗体选择，优先结合到能从剩余细胞中去除的表面上， 例如珠柱、烧瓶、磁性颗粒。免疫吸附技术在临床上和研究中受到欢 迎，因为它们保持了用单克隆抗体导向细胞的高特异性，但是不同于 FACS分选，它们能被放大，以直接处理临床收获物中的大量细胞， 它们避免了使用细胞毒性试剂(如免疫毒素)和补体的危险。然而， 它们需要利用“装置”或细胞分离表面，如珠柱、淘洗瓶或磁铁。
分离造血干细胞、免疫细胞和循环上皮肿瘤细胞的现有技术全都 包括一个初始步骤，来除去红细胞，然后是对一种装置或人工颗粒的 抗体介导的粘附。(Firat等人，1988；de Wynter等人，1975；Shpall 等人，1994；Thomas等人，1994；Miltenyi Biotec Inc.，Gladbach，德 国)。在正选择的情况中，还有另外一个步骤：从该装置或颗粒中去除 细胞。所有这些多个步骤都需要时间并且导致细胞损失。 Slaper-Cortenbach等人(1990)描述了一种利用形成免疫玫瑰花结净化 骨髓的普通急性白血病(cALL)细胞的方法。该方法需要首先从骨髓样 品中去除红细胞，并用可结合cALL细胞的抗体标记。标记的红细胞 然后被加回cALL细胞已形成免疫玫瑰花结的样品中。当随后还有一 个补体介导的cALL细胞裂解步骤时，该排除方法效果最好。
密度分离通常用于将外周血单核细胞与粒细胞和红细胞分离。 Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)是用于此用 途的最常用的密度溶液。在Ficoll密度分离中，全血在Ficoll上分层， 然后离心。红细胞和粒细胞位于细胞沉淀中，而单核细胞保持在Ficoll 血浆界面。该技术的成功依赖于单核细胞和粒细胞密度的不同。如果 全血贮存超过24小时，粒细胞密度改变，将与红细胞一起沉淀。在一 次密度分离中不能从细胞密度改变的贮存的血液或样品中获得纯单核 细胞悬液。
由上可见，在本领域中需要提供新型方法，用来从生物样品中分 离希望的细胞或去除不希望的细胞。
发明概述
本发明已经发展了一种方法，通过使细胞与样品中已经存在的红 细胞形成免疫玫瑰花结分离细胞。与现有技术方法相比，本发明的方 法是一种更加简单但同样有效的免疫亲和技术。没有“装置”或不需 要细胞悬液中通常不存在的人工分离表面(例如，磁性颗粒、亲和柱)，。 不需要首先从样品中去除红细胞，然后在用抗体标记后重新导入它们。 特定细胞型与样品中存在的自体红细胞交联，随后通过沉淀或离心去 除玫瑰花结。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种从含有具核细胞和红 细胞的样品中分离具核细胞的方法，其包括：
(1)在具核细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样品接 触一种抗体组合物，后者含有：(a)至少一种抗体，其可与将要分离的 具核细胞上的抗原结合，该抗体与(b)至少一种可与红细胞结合的抗体 直接或间接地连接；和
(2)从样品中去除免疫玫瑰花结。
该方法能在正选择和负选择方案中使用。该方法适用于含有红细 胞的任何样品，包括全血、骨髓、胎肝、脐带血、棕黄层悬液、胸膜 和腹膜渗出液和胸腺细胞及脾细胞样品。
附图简述
现在参照附图描述本发明，其中：
图1是使用四聚抗体复合物在不希望的具核细胞周围形成的红细胞 玫瑰花结的示意图。
发明详述
I.发明方法
如上所述，本发明涉及一种通过细胞与红细胞形成免疫玫瑰花结 分离细胞的方法。
最广义的来讲，本发明提供一种从含有具核细胞和红细胞的样品 中分离具核细胞的方法，其包括：
(1)在具核细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样品接 触一种抗体组合物，后者含有：(a)至少一种抗体，其可与将要分离的 具核细胞上的抗原结合，该抗体与(b)至少一种可与红细胞结合的抗体 直接或间接地连接；和
(2)从样品中去除免疫玫瑰花结。
该方法能在正选择和负选择方案中使用。在正选择中，希望的细 胞形成玫瑰花结。在这种实施方案中，该方法进一步包括裂解免疫玫 瑰花结中的红细胞和分离希望的细胞的步骤。因此在正选择方法中， 抗体组合物将含有(a)至少一种抗体，其对人们希望获得或从样品中 分离的具核细胞特异。
优选地，本发明的方法在负选择方案中使用。在负选择中，希望 的细胞不形成免疫玫瑰花结，而是在去除免疫玫瑰花结后保留在样品 中。在负选择方法中，抗体组合物将含有(a)至少一种抗体，其对人们 希望从样品中去除的细胞特异。因此，本发明提供一种负选择方法， 用于在含有希望的细胞、红细胞和不希望的细胞的样品中富集并回收 希望的细胞，该方法包括：
(1)在不希望的细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样 品接触一种抗体组合物，后者含有：(a)至少一种抗体，其可与不希望 的细胞上的抗原结合，该抗体与(b)至少一种可与红细胞结合的抗体直 接或间接地连接；和
(2)从剩余样品中分离免疫玫瑰花结，以获得富含希望的细胞的样 品。
利用多种技术，能将在步骤(1)中红细胞和不需要的细胞之间形 成的免疫玫瑰花结与希望的细胞分离。在一个实施方案中，含有疫玫 瑰花结的样品在浮力密度溶液(如Ficoll-Hypaque)上分层并离心。免疫 玫瑰花结沉淀，而希望的细胞保留在浮力密度溶液与样品之间的界面 上。然后从界面上移出希望的细胞供进一步使用。在另外一个实施方 案中，在步骤(1)中获得的含有免疫玫瑰花结的样品与一种沉淀试剂 (如羟乙基淀粉/明胶或甲基纤维素)混合，并使玫瑰花结沉淀。需要的 细胞保留在悬液中，移出用于进一步用途。在另一个实施方案中，在 步骤(1)中获得的含有免疫玫瑰花结的样品在借助或不借助离心或反 向流动淘析的情况下沉淀。希望的细胞保留在悬液中，移出用于进一 步的用途。
下面更详细地描述本发明使用的抗体组合物。
本发明的方法可在含有红细胞的生物样品(包括血液(特别是脐 带血和全血)、骨髓、胎肝、棕黄层悬液、胸膜和腹膜渗出液和胸腺 细胞和脾细胞悬液)的处理中使用。令人惊讶的是，发明者发现该方 法能用来直接从全血或全骨髓中除去细胞，而不需要预先处理。这使 本发明的方法具有优于现有方法的一个重要优点。特别是，红细胞中 不须被去除、标记和加回样品中。
本发明的方法能用来制备富含任何细胞型的样品，这些细胞型包 括但不限于：T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、嗜碱 性粒细胞、肥大细胞、先祖细胞、干细胞和肿瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明的方法能用来由骨髓样品制备造血先 祖和干细胞制品。例如，本发明的方法可在负选择方案中用来从样品 中排除或净化B和T淋巴细胞、单核细胞、NK细胞、粒细胞和/或肿 瘤细胞，以制备造血先祖和干细胞制品，以在本领域技术人员明白的 移植以及其他治疗方法中使用。例如，在异体移植中能从供体中收集 骨髓或血液，并用此处描述的方法富集先祖和干细胞。利用负选择， 制品中的人造血先祖和干细胞不被抗体覆盖，或修饰，使其十分适用 于移植和本领域技术人员明白的其他治疗用途。
在另一个实施方案中，本发明的方法能用来从血液中分离并回收 成熟树突细胞和它们的前体。树突细胞有许多有用的用途，包括作为 能在体外和体内都激活T细胞的抗原递呈细胞。一个例子是，树突细 胞能在体外装载(脉冲)一种肿瘤抗原，并且体内注射，诱导抗肿瘤 T细胞反应。
在另一个实施方案中，本发明的方法也可用来由样品(如血液和 骨髓)制备细胞悬液，其富含所选的分化细胞型，如T细胞、B细胞、 NK细胞、单核细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞和浆细胞。这使得能 研究细胞与细胞的特异相互作用，包括生长因子产生和对生长因子的 反应。这也允许对特异细胞型进行分子和生物化学分析。富含NK细 胞、树突细胞和T细胞的细胞制品也能在针对某些恶性疾病的免疫治 疗中使用。
在另一个实施方案中，本发明的方法能用来从样品中分离肿瘤细 胞，例如非造血转移肿瘤细胞。该方法在检测来自患者的血液、骨髓、 腹膜和胸膜渗出液的非造血肿瘤细胞中有用，以帮助转移疾病的诊断 和检测，监视转移疾病的发展，监视治疗的效果。
II.抗体组合物
本发明包括在本发明的方法中使用的抗体组合物。该抗体组合物 将包含：(a)至少一种抗体，它能与具核细胞上的一种抗原结合，该抗 体与(b)至少一种能与红细胞上的抗原结合的抗体直接或间接地连接。
术语“至少一种抗体”意指抗体组合物至少包含一种类型的抗体 (与至少一个抗体分子不同)。一种类型的抗体是指一种可与特定抗原 结合的抗体。例如，可与抗原CD2结合的抗体被认为是一种类型的抗 体。优选地，本发明的抗体组合物含有(a)一种以上的可与具核细胞结 合的抗体类型。
两种抗体(a)和(b)可通过制备的双功能或双特异性抗体直接连接。 两种抗体(a)和(b)也可通过例如制备的四聚抗体复合物间接连接。所有 这些都在以下描述。
一方面，对具核细胞特异的抗体直接与红细胞特异的抗体连接。 在一个实施方案中，本发明的抗体组合物含有双功能抗体，其包含至 少一种对具核细胞特异的抗体，其与(b)至少一种红细胞特异性抗体 直接连接。双功能抗体可通过将一种抗体与另一种抗体化学偶联制备， 例如，使用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)。
在另一个实施方案中，抗体组合物含有双特异性抗体。双特异性 抗体含有红细胞特异的抗体的可变区，和对于将要分离的具核细胞表 面上的至少一种抗原特异的可变区。双特异性抗体可通过形成杂种杂 交瘤制备。杂种杂交瘤可以用本领域周知的方法制备，例如Staerz和 Bevan(1986，PNAS(USA)83：1453)和Staerz和Bevan(1986， Immunology Today，7：241)中所公开的。双特异性抗体也可通过使用 如Staerz等人(1985，Nature，314：628)和Perez等人(1985，Nature 316：354)所述的方法通过化学方法构建，或通过重组免疫球蛋白基因 构建体的表达构建。
另一方面，本发明的抗体组合物含有：(a)至少一种对具核细胞型 特异的抗体，其与(b)至少一种红细胞特异的抗体间接连接。“间接连 接”意指抗体(a)和抗体(b)不是彼此直接共价连接，而是通过连接部分 (如免疫复合物)连接。在一个优选实施方案中，通过制备四聚抗体 复合物将具核细胞型的抗体与红细胞特异的抗体间接连接。可以通过 将能与红细胞结合的第一种单克隆抗体与能与将要分离的具核细胞结 合的第二种单克隆抗体混合制备四聚抗体复合物。第一种和第二种单 克隆抗体来自第一种动物种。第一种和第二种抗体与大约等摩尔量的 第二种动物种的单克隆抗体反应，后者抗第一种动物种的抗体的Fc- 片段。第一种和第二种抗体也可与大约等摩尔数量的第二种动物种的 单克隆抗体的F(ab′)2片段反应，后者抗第一种动物种的抗体的Fc-片 段。(参见授予Lansdorp的美国专利号4,868,109，关于四聚抗体复合物 及其制备方法的描述在此引用作为参考)。
优选地，红细胞特异的抗体是抗-血型糖蛋白A。本发明的抗体组 合物中含有的抗-血型糖蛋白A用来结合红细胞。血型糖蛋白A特异 的单克隆抗体的例子有10F7MN(美国专利号4,752,582，细胞系：ATCC 保藏号HB-8162)和D2.10(Immunotech，马赛，法国)。
优选地，具核细胞特异的抗体是一种抗体组合。抗体组合可以对 许多细胞型特异，使得可以从样品中去除许多细胞型。当使用抗体组 合时，每种抗体将与一种红细胞特异的抗体连接(直接或间接地)。
在一个优选的实施方案中，抗体组合物是一种四聚复合物，其含 有(a)可结合红细胞的抗-血型糖蛋白A抗体，(b)一种可与人们希望形 成免疫玫瑰花结的具核细胞型结合的抗体，和(c)可与(a)和(b)两者的 Fc部分(任选的F(ab’)2抗体片段)结合的抗体。(a)∶(b)∶(c)的摩尔比 可能约为1∶3∶4。当要分离几种类型的细胞时，可用几种抗-具核细胞 抗体(b)制备复合物。然后可将复合物一起混合，形成一种抗体组合物， 供本发明的方法使用。图1是通过四聚抗体复合物形成的玫瑰花结的 示意图。
在本发明内容中，抗体被理解为包括单克隆抗体和多克隆抗体、 抗体片段(例如，Fab和F(ab′)2)、嵌合抗体、双功能或双特异性抗体 和四聚抗体复合物。如果以适当的亲和力(结合常数)结合，例如大于 或等于107M-1，则认为抗体对具核细胞或红细胞表面上的选择抗原有 反应性。
单克隆抗体优选地在本发明的抗体组合物中使用。对于具核细胞 表面上的选择抗原特异的单克隆抗体可以利用常规技术容易地产生。 例如，单克隆抗体可以通过Kohler和Milstein 1975发展的杂交瘤技 术产生(Nature 256，495-497；参见美国专利号RE 32,011、4,902,614、 4,543,439和4,411,993，在此引用作为参考；参见《单克隆抗体，杂 种瘤：生物学分析的一个新方面》，Plenum Press，Kennett，McKearn， Bechtol(编)1980，和《抗体：实验室手册》，Harlow和Lane(编)， 冷泉港实验室出版社，1988)。也可利用其他技术构建单克隆抗体(例 如，参见William D.Huse等人，1989，“在λ噬菌体中产生免疫球蛋 白组成成分大组合文库”，Science 246：1275-1281，L.Sastry等人，1989， “为了产生单克隆催化抗体，免疫学组成成分在大肠杆菌中的克隆： 重链可变区特异cDNA文库的构建”，Proc Natl.Acad.Sci.USA 86：5728-5732；Kozbor等人，1983 Immunol.Today 4，72，关于人B 细胞杂交瘤技术；Cole等人，1985，《癌症治疗中的单克隆抗体》，Allen R.Bliss，Inc.，77-96页，关于生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术； 参见Michelle Alting-Mees等人，1990，“单克隆抗体表达文库：杂交 瘤的一种快速替代”Strategies in Molecular Biology 3：1-9)。为了生 产对抗原有特异反应性的抗体，能免疫化学筛选杂交瘤细胞，并可分 离单克隆抗体。
抗体可以用常规技术切成片段，并用与以上对于完整抗体相同的 方法依用途筛选这些片段。例如，F(ab′)2片段能通过用胃蛋白酶处理 抗体产生。可处理产生的F(ab′)2片段，还原二硫桥，产生Fab’片段。
本发明也涉及嵌合抗体衍生物，即结合了非人动物可变区和人恒 定区的抗体分子。嵌合抗体分子可包括，例如，来自小鼠、大鼠或其 他种的抗体的抗原结合域，及人恒定区。已经描述了多种制备嵌合抗 体的方法，它们能用来制备含有可识别分化细胞或肿瘤细胞表面上的 选择抗原的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体。参见，例如，Morrison等 人，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851；Takeda等人，1985， Nature 314：452；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Boss等人， 美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公开文本EP171496； 欧洲专利公开文本0173494，英国专利2177096B。
双功能抗体可通过化学偶联、体细胞杂交或遗传工程技术制备。
化学偶联是基于含有ε-氨基或绞链区硫醇基的同型和异型双功能 试剂的使用。同型双功能试剂如5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DNTB) 在两个Fab之间产生二硫键，O-次苯基二马来酰亚胺(O-PDM)在两 个Fab之间产生硫醚键(Brenner等人，1985，Glennie等人，1987)。 异型双功能试剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)结合 抗体的暴露氨基和Fab片段，而无论类型或同种型如何(Van Dijk等 人，1989)。
体细胞杂交包括两种建立的杂种瘤的融合，产生四合瘤 (quadroma)(Milstein和Cuello，1983)，或一种建立的杂交瘤与来 自用第二种抗原免疫的小鼠的淋巴细胞的融合，产生三合瘤(trioma) (Nolan和Kennedy，1990)。使每种杂交瘤细胞系对特异抗药性标记有 抗性(De Lau等人，1989)，或用不同荧光染料标记每种杂交瘤并分选 出异源荧光细胞(Karawaiew等人，1987)，选择杂种杂交瘤。
遗传工程包括基于重组DNA的技术的使用，以将编码抗体特异 片段的DNA序列连接于质粒中，并表达重组蛋白。双特异性抗体也能 使用接头通过结合两种单链Fv(scFv)片段制备为单一共价结构 (Winter和Milstein，1991)；作为共表达来自转录因子fos和jun的序 列的亮氨酸拉链(Kostelny等人，1992)；共表达p53作用域的螺旋- 转角-螺旋(Rheinnecker等人，1996)，或diabodies(Holliger等人，1993)。
表1提供针对具核细胞上特定人抗原的抗体的例子，它们可在本 发明的方法中使用。本发明的方法也可用于其他物种。针对具核细胞 的一种或多种抗体的选择将取决于样品的性质、将要富集或排除的细 胞的选择，和该方法是正选择还是负选择方法。在所有情况中，当在 本发明的方法中使用时，针对将要形成免疫玫瑰花结的具核细胞的抗 体将与红细胞特异的抗体直接或间接连接。
本发明的方法和抗体组合物优选地在负选择方案中，用来制备一 种富含特定细胞型的细胞制品。这通过使用缺乏针对希望分离的特定 细胞型的抗体的抗体组合物实现。因此，本发明提供一种抗体组合物， 用于在含有希望的细胞、红细胞和不希望的细胞的样品中富集和回收 希望的细胞，该抗体组合物含有(a)至少一种可与不希望的细胞上的抗 原结合的抗体，其与(b)至少一种可结合红细胞的抗体连接。表2列出 了可在本发明的负选择方案中用于人体细胞的抗体组合物的具体实施 方案。该表提供了能在上述方法中用作抗体(a)富集特定细胞型的抗特 定抗原抗体的列表和混合配方(鸡尾酒)。在大多数情况中，提供了 必需抗体的几种选择，以及几种任选的抗体。例如，为了富集T细胞， 抗体(a)可以是抗下列成分的抗体的鸡尾酒：(1)CD16和/或CD66b和/ 或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22 和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14。鸡尾酒可任选地含有抗 CD33和/或CD56和/或IgE和/或CD41的抗体。除了表2列出的抗体 组合外，本领域技术人员应当理解，也可用其他抗体组合富集特定细 胞型，如美国专利号5,877,299所述，在此引用作为参考。由于本发明 涉及制备富集细胞制品的免疫玫瑰花结的制备，本领域技术人员应当 理解，也可使用其他抗体和抗体组合。
本发明的方法和抗体组合物可在正选择方案中，用来制备一种细 胞制品，其中希望的细胞形成免疫玫瑰花结。下面列出了在正选择方 案中有用的抗体组合的一些例子。
为了用正选择方法分离非造血肿瘤细胞，抗体组合物包含对肿瘤 细胞表达的非造血抗原特异的抗体，如抗乳癌和肺癌和成神经细胞瘤 细胞表面上表达的抗原的抗体。上皮肿瘤细胞上表达的非造血抗原的 抗体可从商业来源获得(如表3所示)，或可用本领域周知的技术制备。
为了用正选择方法分离B细胞，抗体组合物含有抗CD24和/或 CD19和/或CD20和/或CD22的抗体。
为了用正选择方法分离T细胞，抗体组合物含有抗CD3和/或CD2 和/或CD5和/或CD4和CD8两者的抗体。
为了用正选择方法分离NK细胞，抗体组合物含有抗CD56的抗 体。
为了用正选择方法分离粒细胞，抗体组合物含有抗CD16和/或 CD66e和/或CD66b的抗体。
为了用正选择方法分离单核细胞，抗体组合物含有抗CD14的抗 体。
下列非限制性实施例说明本发明：
                      实施例
实施例1
四聚体的制备
为了制备在本发明的方法中使用的四聚抗体复合物，可使用下列 方案：(a)使1mg细胞特异性抗体形成玫瑰花结(例如抗-CD2、CD3、 CD4、CD8、CD14、CD16、CD19等)；(b)加入3mg抗-血型糖蛋白 A抗体(抗红细胞)，混合均匀；(c)然后加入4.0mg P9抗体或2.72 mgP9 F(ab’)2抗体片段。37℃温育过夜。P9抗体与步骤(a)和(b)中加入 的抗体的Fc部分结合，形成四聚抗体复合物。关于四聚物制备的更 多信息，参见授予Lansdorp的美国专利号4,868,109，在此引用作为 参考。含有抗表达的抗原或具核细胞的不同抗体的四聚抗体复合物分 开制备，然后混合。
抗体组合物根据人们希望排除哪些细胞通过结合不同的四聚抗体 复合物制备。不同的四聚抗体复合物的浓度不同：抗具核细胞上表达 的抗原的抗体一般在四聚复合物中为10-30μg/mL。该组合物然后向 细胞中1/10稀释，使细胞悬液中每种抗具核细胞抗体的终浓度为 1.0-3.0μg/mL。
实施例2
使用Ficoll的免疫玫瑰花结形成方法
下面叙述了使用Ficoll Hypaque从全外周血中使细胞形成免疫玫 瑰花结的负选择方法。
1.每mL全外周血加入100μL抗体组合物。
2.在室温下温育20分钟。
3.用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)+2％胎牛血清(FCS)稀释样品， 并轻轻混合。
4.将被稀释的样品在Ficoll Hypaque上分层，或使Ficoll在被稀 释的样品之下分层。
5.在关闭刹车的情况下，在室温下以1200×g离心20分钟。
6.从Ficoll：血浆界面移出富集的细胞。
7.用5-10×体积的PBS+2％FBS洗涤富集的细胞。
注意：为了富集单核细胞和其他粘附细胞，向全血样品和所有洗 涤/稀释溶液中加入1mM EDTA。
实施例3
利用羟乙基淀粉沉淀的免疫玫瑰花结形成方法
下面叙述了利用羟乙基淀粉从全外周血中使细胞形成免疫玫瑰花 结的负选择方法。羟乙基淀粉是许多可通过凝集提高红细胞沉淀速率 的化合物之一。
1.每5mL血液和混合物加入1mL 6％羟乙基淀粉盐水溶液。
2.向全血中加入实施例1中描述的抗体组合物，使得每种抗-具 核细胞抗体的终浓度为1.0-2.0μg/mL。
3.在室温下温育10分钟。
4.在室温下以50×g离心5分钟。
5.取出上清液。该级分中含有富集的细胞。
6.用2-5×体积的PBS+2％胎牛血清(FBS)洗涤富集的细胞级分。
实施例4
利用羟乙基淀粉/碘克沙醇(Iodixanol)混合物的免疫玫瑰花结形成方 法
下面叙述了一种从全外周血中使细胞形成免疫玫瑰花结的负选择 方法。
1.每5mL血液和混合物中加入1mL 6％羟乙基淀粉盐水溶液。
2.加入0.6mL的60％w/v碘克沙醇和混合物。碘克沙醇是许多 可略微增加水溶液密度的化合物之一。
3.向全血中加入实施例1中描述的抗体组合物，使每种抗-具核细 胞抗体的终浓度为1.0-2.0μg/mL。
4.在室温下温育10分钟。
5.在室温下以50×g离心5分钟。
6.移出上清液。该级分中含有富集的细胞。
7.用2-5×体积的PBS+2％FBS洗涤富集的细胞级分。
实施例5
免疫玫瑰花结形成方法——正选择
下面叙述了一种从全外周血中使细胞形成免疫玫瑰花结的正选择 方法。
1.留出1mL血液。
2.将10mL血液在Ficoll-Paque上分层，并在室温和关闭刹车的 情况下，以1200×g离心20分钟。
3.回收Ficoll：血浆界面上的MNC层，用PBS+2％FBS洗涤。
4.计数细胞，并以1×108/mL重悬浮。
5.测量样品体积，称为体积A。
6.加入0.2mL来自步骤1的保留血液。
7.用PBS+2％FBS使总体积达到体积A的两倍。
8.以1.0μg/mL的终浓度加入对特定抗原特异的四聚抗体复合 物，其合成在实施例1中描述。
9.在室温下温育20分钟。
10.用PBS+2％FBS稀释两倍，并在以1.085g/mL的密度和280 mOsm摩尔渗透压浓度制备的Percoll上分层。
11.如步骤2以1200×g离心20分钟。
12.弃去上清液，重悬浮包含富集细胞的沉淀。
13.用氯化铵溶液裂解红细胞，并用PBS+2％FBS洗涤。
实施例6
T细胞的富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集T细 胞。制备了含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗体的四聚抗体复 合物的T细胞富集鸡尾酒。结果(显示在表4中)证明本发明的方法 可产生95％的T细胞纯度，回收率接近50％。
实施例7
CD8+T细胞的富集——使用Ficoll的免疫玫瑰花结形成
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集 CD8+T细胞。测试了两种四聚抗体复合物鸡尾酒。一种鸡尾酒含有抗 CD4、CD16、CD19、CD36和CD56的抗体，另一种含有抗CD4、 CD16、CD19、CD36、CD56和IgE的抗体。结果(显示在表5中) 证明，向鸡尾酒中加入抗IgE可提高CD8+T细胞的纯度，而不影响 回收率。
实施例8
CD4+T细胞的富集——使用Ficoll的免疫玫瑰花结形成
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集 CD4+T细胞。制备了四聚抗体复合物的两种CD4+T细胞富集鸡尾酒。 一种鸡尾酒含有抗CD8、CD16、CD19、CD36和CD56的抗体。另一 种鸡尾酒含有抗CD8、CD16、CD19、CD36、CD56和IgE的抗体。 结果(显示在表6中)证明，本发明的方法导致93％的CD4+T细胞 纯度和46％的回收率，向富集鸡尾酒中加入抗-IgE可提高CD4+T 细胞的纯度。
实施例9
B细胞的富集——使用Ficoll的免疫玫瑰花结形成
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集B细 胞。制备了四聚抗体复合物的两种B细胞富集鸡尾酒。一种鸡尾酒含 有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56的抗体。另一种鸡尾酒含有 抗CD2、CD3、CD16、CD36、CD56和IgE的抗体。结果(显示在 表7中)证明，本发明的方法导致88％的B细胞纯度和43％的回收 率，向富集鸡尾酒中加入抗-IgE可提高B细胞的纯度。
实施例10
NK细胞的富集——使用Ficoll的免疫玫瑰花结形成
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集NK 细胞。制备了四聚抗体复合物的两种NK细胞富集鸡尾酒。一种鸡尾 酒含有抗CD3、CD4、CD19、CD66b和CD36的抗体。另一种鸡尾 酒含有抗CD3、CD4、CD19、CD66b和CD36和IgE的抗体。结果 (显示在表8中)证明，本发明的方法导致74％的NK细胞纯度和44％ 的回收率，向鸡尾酒中加入抗-IgE可提高纯度但降低回收率。
实施例11
先祖细胞的富集
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全脐带血中富集先祖 细胞。使用两种不同的四聚抗体复合物的鸡尾酒：
(a)含有抗CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56和 CD66b的四聚抗体复合物的先祖细胞富集鸡尾酒；
(b)含有抗CD2、CD14、CD19和CD66b的四聚抗体复合物的减 量鸡尾酒。
结果(显示在表9中)证明，对于广泛先祖富集鸡尾酒，本发明 的方法导致29％的CD34+细胞纯度和53％的回收率，而对于四种抗 体减量鸡尾酒只导致5％的纯度和45％的回收率。
实施例12
单核细胞的富集——使用Ficoll的免疫玫瑰花结形成
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集单核 细胞。制备了几种四聚抗体的单核细胞富集鸡尾酒(见表10)。表10 所示的结果证明，本发明的方法导致76％的CD14+细胞纯度和65％的 CD14+细胞回收率，抗-CD8或抗-IgE的加入可提高单核细胞的纯度， 但同时加入CD8和抗-IgE两种没有加成作用。
实施例13
非造血肿瘤细胞的富集
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集乳癌 细胞。以1/103、1/104和1/105的频率将来自CAMA乳癌细胞系的细 胞加入全外周血样品中。制备四聚抗体复合物的三种肿瘤细胞富集鸡 尾酒。鸡尾酒的抗体组成在表11中列出。结果(显示在表12中)证 明，本发明的方法导致超过2 Log的肿瘤细胞富集，和20-50％的肿 瘤细胞回收率。更广泛的鸡尾酒引起更高程度的肿瘤细胞富集。
实施例14
T细胞富集——用抗-CD36取代抗-CD14的作用
该实施例证明，当富集鸡尾酒由于用抗-CD36取代抗-CD14而改 变时，利用实施例2中描述的方法从全外周血中富集T细胞提高。表 13中的结果显示，抗体取代使CD3+细胞的％纯度提高24％。
实施例15
利用羟乙基淀粉沉淀对特异细胞群体的富集
该实施例说明利用实施例3中描述的方法从全外周血中富集不同 细胞群体。
制备含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗体的四聚抗体复合 物的T细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致95％以上的T细胞纯度和 60％回收率。
制备含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗体的四聚抗体 复合物的B细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致75％的B细胞纯度和 39％的回收率。
制备含有抗CD3、CD4、CD19、CD36和CD66b抗体的四聚抗 体复合物的NK细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致65％的NK细胞 纯度和27％的回收率。
实施例16
利用羟乙基淀粉/碘克沙醇混合物对特异性细胞群体的富集
该实施例说明利用实施例4中描述的方法从全外周血中富集不同 细胞群体。结果(表14中列出)总结如下。
制备含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗体的四聚抗体复合 物的T细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致95％的T细胞纯度和61％ 的回收率。
制备含有抗CD8、CD16、CD19、CD36和CD56抗体的四聚抗 体复合物的CD4+T细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致89％的CD4+ 细胞纯度和64％的回收率。
制备含有抗CD4、CD16、CD19、CD36和CD56抗体的四聚抗体 复合物的CD8+T细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致80％的CD8+T 细胞纯度和43％的回收率。
制备含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗体的四聚抗体 复合物的B细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致84％的B细胞纯度和 58％的回收率。
制备含有抗CD3、CD4、CD19、CD36和CD66b抗体的四聚抗 体复合物的NK细胞富集鸡尾酒。本发明的方法导致80％的NK细胞 纯度和50％的回收率。
实施例17
使用不同分层基质的免疫玫瑰花结形成
该实施例证明，用不同基质代替步骤4中的Ficoll-Hypaque能改 进实施例2的方法。Ficoll的密度是1.077g/mL，而摩尔渗透压浓度 约为300mOsm。Percoll和碘克沙醇溶液制备为1.085g/mL密度和280 mOsm的摩尔渗透压浓度。制备含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和 CD56抗体复合物的AB细胞富集鸡尾酒。
两种不同样品的B细胞富集结果(显示在表15中)证明，以较 高密度使用不同的分层基质能提高B细胞的回收率而不降低B细胞 纯度。
实施例18
利用免疫玫瑰花结形成的T细胞净化
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中去除T细 胞。制备抗CD3的四聚抗体复合物的T细胞净化鸡尾酒。本发明的方 法导致2.3log的CD3+细胞排除。
实施例19
利用免疫玫瑰花结形成的B细胞净化
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从全外周血中去除B细 胞。制备抗CD19的四聚抗体复合物的B细胞净化(purging)鸡尾酒。 本发明的方法导致3.0log的CD19+细胞排除。
实施例20
利用免疫玫瑰花结形成的乳癌细胞净化
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从接种有1-5％CAMA 乳癌细胞的全外周血中去除乳癌细胞。制备含有抗乳癌抗体5E11和 BRST1的四聚抗体复合物的净化鸡尾酒。表16所示的结果证明，本 发明的方法导致1.0-1.4log的乳癌细胞排除。
实施例21
从预先贮存的全外周血中去除粒细胞
全外周血样品中粒细胞的密度在贮存＞24个小时后降低。通常用 来从新鲜全血中去除红细胞和粒细胞的密度分离方法不能有效地从贮 存的血样中去除粒细胞。贮存的粒细胞的沉淀率可能提高，使得能通 过形成免疫玫瑰花结在标准Ficoll密度分离(1.077g/mL)中有效去除。
该实施例说明利用实施例2中描述的方法从贮存(48小时)的全外 周血中去除粒细胞。制备含有抗CD66b的四聚抗体复合物的粒细胞排 除鸡尾酒。表17显示的结果证明，本发明的方法导致1.8-2.6log的 粒细胞排除。
实施例22
利用免疫玫瑰花结形成对特异性细胞群体的正选择
该实施例说明利用实施例5描述的正选择方法从全外周血中富集 CD8+细胞。制备抗CD8的四聚抗体复合物。本发明的方法导致CD8+ 的富集，单核细胞级分的百分比从开始时的25％升至沉淀中的32％。
虽然参照目前认为是优选的实施例描述了本发明，但应当理解， 本发明不限于所公开的实施例。相反，本发明旨在覆盖在附加权利要 求书的精神和范围内包括的多种修改和相当的安排。
所有公开文本、专利和专利申请书在此完整引用作为参考，每个 公开文本、专利和专利申请书特别、分别地引用作为参考。
                                表1
                        在细胞分离中使用的抗体 抗原  抗体 来源 CCR5  BLR-7 R&D，Minneapolis，MN CD2  6F10.3  MT910 IMMUNOTECH，马赛，法国 Dako，Carpinteria，CA CD3  UCHT1  SK7 IMMUNOTECH，马赛，法国 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. CD4  13B8.2 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. CD5  UCHT2 Serotec，Raleigh，NC CD8 B911 OKT3 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. BioDesigns CD10 ALB1 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD11b ICRF44 Pharmingen，San Diego，CA CD14 MEM 15 MEM 18 Exbio，Praha，捷克共和国 CD15 DU-HL60-3 Sigma，St.Louis，MO CD16 MEM 154 3G8 NKP15 Exbio，Praha，捷克共和国 IMMUNOTECH，马赛，法国 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. CD19 J4.119 4G7 HD37 IMMUNOTECH，马赛，法国 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. Dako，Carpinteria，CA CD20 MEM97 L27 Exbio，Praha，捷克共和国 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. CD21 B-Ly4 Pharmingen，San Diego，CA CD22 HIB22 Pharmingen，San Diego，CA CD24 32D12 ALB9 Steinar Funderud博士，癌症研究院，免疫学系，Oslo，挪威 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD25 3G10 Caltaq，Burlingame，CA CD27 1A4CD27 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD29 Lial.2 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD33 D3HL60.251 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD34 581 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD36 FA6.152 IVC7 IMMUNOTECH，马赛，法国 CLB，荷兰中心实验室，红十字输血中心 CD38 T16 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD41 PI1.64 SZ22 Kaplan，第五届国际人类白细胞分化抗原会议 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD42a Bebl Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. CD45 J33 MEM28 IMMUNOTECH，马赛，法国 Exbio，Praha，捷克共和国 CD45RA 8D2.2 L48 Craig等人，1994，StemCell Technologies，Vancouver，加拿大 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif CD45RO UCHL1 Dako，Carpinteri，CA CD56 T199 MY31 IMMUNOTECH，马赛，法国 Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif. CD66c CLB/gran 10 CLB，荷兰中心实验室，红十字输血中心 CD66b B13.9 80H3 CLB，荷兰中心实验室，红十字输血中心 IMMUNOTECH，马赛，法国 CD69 L78 BD Biosciences，San Jose，CA CD71 My29 Zymed Laboratories，San Francisco，CA CD124 S456C9 IMMUNOTECH，马赛，法国 HLADR IMMU357.12 IMMUNOTECH，马赛，法国 IgAl NiF2 IMMUNOTECH，马赛，法国 IgE G7-18 Pharmingen，San Diego，CA IgG 8A4 IMMUNOTECH，马赛，法国 TCRαβ WT31 BD Biosciences，San Jose，CA TCRγδ Immu510 IMMUNOTECH，马赛，法国
                            表2
                        免疫玫瑰花结
                用于人细胞负选择的抗体鸡尾酒
T细胞富集
抗-
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
静息T细胞富集
抗-
HLA-DR和/或CD25、CD69
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
γδT细胞富集
抗-
αβTCR
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
αβT细胞富集
抗-
γδTCR
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
CD4+T细胞富集
抗-
CD8
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
幼稚CD4+T细胞富集
抗-
CD8
CD45RO和/或CD29
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
记忆CD4+T细胞富集
抗-
CD8
CD45RA
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
静息CD4+T细胞富集
抗-
CD8
HLA-DR和/或CD25、CD69
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
CD4+αβT细胞富集
抗-
γδTCR
CD8
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
TH1 CD4+T细胞富集
抗-
CD8
CD124
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
TH2 CD4+T细胞富集
抗-
CD8
CCR5
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20，CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
CD8+T细胞富集
抗-
CD4
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
幼稚CD8+T细胞富集
抗-
CD4
CD45RO和/或CD29
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
记忆CD8+T细胞富集
抗-
CD4
CD45RA
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
静息CD8+T细胞富集
抗-
CD4
HLA-DR和/或CD25、CD69、CD27
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
CD8+αβT细胞富集
抗-
γδTCR
CD4
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、Ig
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、IgE、CD41
B细胞富集
抗-
CD2和/或CD3、CD4和CD8两者
CD16和/或CD66b、CD11b、CD15
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD56、CD41
NK细胞富集
抗-
CD3
CD66b和/或CD15
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24
CD36和/或CD14
和任选的抗-CD33、CD4、IgE、CD41
单核细胞富集
抗-
CD2和/或CD3、CD5
CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24
CD66b和/或CD16
和任选的抗-CD8、CD56
树突细胞富集
抗-
CD3
CD14
CD16
CD19
CD34
CD56
CD66b
嗜碱性粒细胞富集
抗-
CD2
CD3
CD14
CD15
CD16
CD19
CD24
CD34
CD36
CD56
CD45RA
先祖细胞富集
抗-
CD2和/或CD3
CD16和/或CD66b
CD19和/或CD24
CD14
和任选的抗-CD56、CD10、CD45RA、CD38、CD36、CD33、CD71
红系先祖细胞富集
抗-
CD2和/或CD3
CD16和/或CD66b
CD19和/或CD24
CD14
CD45RA
CD33
CD10
和任选的抗-CD56
髓祖细胞富集
抗-
CD2和/或CD3
CD16和/或CD66b
CD19和/或CD24
CD14
CD71
CD10
和任选的抗-CD56
巨核细胞先祖富集
抗-
CD2和/或CD3
CD16和/或CD66b
CD19和/或CD24
CD14
CD45RA
CD10
和任选的抗-CD56
上皮肿瘤细胞富集
抗-
CD45
CD66b
和任选的CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD56、
CD66e
                                    表3
                可识别在上皮肿瘤细胞上表达的非造血抗原的抗体 特异性 抗体 抗原 供应商/发展者 上皮细胞标记物 BerEp4 ESA，(上皮特异性抗 原)(也称作HEA) DAKO HEA125 ESA Serotec，Cymbus，Pierce，RDI， Biodesign VU-1D9 ESA Cymbus GP1.4 EMA，(上皮膜抗 原)(也称作PEM/ Episialin，一种唾液粘 蛋白) IMMUNOTECH，马赛，法国 VU-4H5 EMA Neomarkers MC.5 EMA Biogenex，也来自Biodesign B24.1 EMA Biomeda E29 EMA DAKO H11 EGFR DAKO RAR9941 上皮糖蛋白 Baxter，德国 RAR9948 上皮糖蛋白 Baxter，德国 癌(乳癌、宫颈癌、 卵巢癌、肺癌、子 宫内膜癌) CU-18 BCA 225(乳癌相关抗 原) ID Labs 癌 115D8 癌相关抗原 Biogenex，Biodesign 腺癌 B72.3 TAG-72(肿瘤相关糖 蛋白) ID Labs，Biogenex，Signet 腺癌、乳腺及肺癌 B6.2 未知，乳癌标记物 Biogenex 乳癌 5E11 未知，乳癌 STI 6E7 未知，乳癌 STI H23A 未知，乳癌 STI CA27.29 MAM-6，粘蛋白 Cedarlane SM-3 奶粘蛋白核心抗原 Cymbus，Biodesign，Imperial Cancer Research Fund DF3 CA 15-3(乳癌标记物) ID Labs 552 CA 15-3 Biodesign 695 CA 15-3 Biodesign RAR9938 c-erbB2 Baxter，德国 C13B5 c-erbB2 IMMUNOTECH，马赛，法国， 也来自Biogenex 肺 MOC-1 小细胞肺癌 ICN Biomed，也来自Biodesign MOC-21 小细胞肺癌 ICN Biomed，也来自Biodesign MOC-31 小细胞肺癌 ICN Biomed，也来自Biodesign MOC-32 小细胞肺癌 ICN Biomed，也来自Biodesign MOC-52 小细胞肺癌 ICN Biomed，也来自Biodesign TFS-4 小细胞肺癌 Biodesign 黑素瘤 NKI/C3 黑素瘤相关抗原 ICN Biomed，也来自Biodesign NKI/M6 黑素瘤相关抗原 Biodesign PAL-MI 黑素瘤相关抗原 ICN Biomed，也来自Biodesign HMB45 黑素瘤细胞 Biodesign 卵巢肿瘤 185 CA-125(卵巢肿瘤标 记物) ICN Biomed，也来自Biodesign OV-632 卵巢癌标记物 ICN Biomed，也来自Biodesign 胃肠癌 CA 19-9 GI肿瘤标记物 ICN Biomed，也来自Biodesign CA242 GI癌 Bio Design 肾细胞癌 RC38 肾细胞癌 Biodesign 尤因肉瘤 O13 Signet 尤因肉瘤 CC49 在人腺癌上 Signet 成神经细胞瘤 UJ13A 未知 Hurko和Walsh(1983) Neurology 33：734 UJ181.4 未知 ″ UJ223.8 未知 ″ UJ127.11 未知 ″ 5.1.H11 未知 ″ 390，459 未知 R.C.Seeger，L.A.Children′s Hospital，Calif. BA-1.2 未知 ″ HSAN1.2 未知 Reynolds和Smith(1982) Hybridomas in Cancer p235
              表4
T细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     纯度     平均值     95     SD     4     n     19     回收率     平均值     46     SD     12     n     19
SD＝平均值的标准差
纯度＝％CD3+细胞
回收率＝CD3+细胞的回收率
                                  表5
              CD8+T细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     鸡尾酒     n     ％纯度±1SD   ％回收率±1SD  CD4、CD16、CD19、CD36、CD56     19     76±8     44±19  CD4、CD16、CD19、CD36、CD56、TgE     5     81±4     45±37*
SD＝平均值的标准差
纯度＝％CD8+细胞
回收率＝CD8+细胞的％回收率
*n＝4
                                表6
            CD4+T细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     鸡尾酒     n ％纯度±1SD ％回收率±1SD  CD8、CD16、CD19、CD36、CD56     19     89±4     57±22  CD8、CD16、CD19、CD36、CD56、TgE     7     93±3     46±10
SD＝平均值的标准差
纯度＝％CD4+细胞
回收率＝CD4+细胞的％回收率
*n＝5
                           表7
          B细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     鸡尾酒     N   ％纯度±1SD   ％回收率±1SD  CD2、CD3、CD16、  CD36、CD56     22     72±15     61±27  CD2、CD3、CD16、  CD36、CD56、TgE     5     88±7     43±18
SD＝平均值的标准差
纯度＝％CD19+细胞
回收率＝CD19+细胞的％回收率
                                表8
            NK细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     鸡尾酒     n ％纯度±1SD ％回收率±1SD  CD3、CD4、CD19、CD66b、CD36     15     74±10     44±19  CD3、CD4、CD19、CD66b、CD36、TgE     6     88±4     27±20
SD＝平均值的标准差
纯度＝％CD56+细胞
回收率＝CD56+细胞的％回收率
                            表9
CD34+细胞从全脐带血的富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     鸡尾酒     n   ％纯度±1SD   ％回收率±1SD   先祖细胞富集     15     29±9     53±29     减量的     8     5±1     45±20
纯度＝％CD34+细胞
回收率＝CD34+细胞的％回收率
SD＝平均值的标准差
                                表10
            单核细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     鸡尾酒   n   ％纯度±1SD   ％回收率±1SD   CD2、CD3、CD19、CD56、CD66b   8     71±7     63±28   CD2、CD3、CD19、CD56、CD66b、CD8   5     76±1.5     65±28   CD2、CD3、CD19、CD56、CD66b、IgE   6     77±4     58±24   CD2、CD3、CD19、CD56、CD66b、IgE、   CD8   4     76±3     64±26   CD2、CD3、CD19、CD56、CD66b、CD16   1     76     64   CD2、CD3、CD19、CD56、CD66b、CD20   1     73     41
纯度＝CD14+细胞的％纯度
回收率＝CD14+细胞的％回收率
                        表11
              肿瘤富集鸡尾酒的抗体组成     鸡尾酒              鸡尾酒中的抗体     单独的CD45                   CD45     CD45和CD66b                CD45、CD66b     广泛鸡尾酒 CD45、CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD66b
                                               表12
                                     CAMA乳癌细胞从全血中的富集   初始频率   (CAMA)   1/103     1/104     1/105   1/103     1/104   1/105     1/103     1/104     1/105             CAMA细胞的％纯度              CAMA细胞的Log富集             CAMA细胞的％回收率   富集的   单独的   CD45   4±2   (n＝4)     5±2     (n＝7)     0.5±0.4     (n＝3)   1.4±0.3   (n＝4)     2.2±0.3     (n＝7)   2.3±0.4   (n＝3)     10±3     (n＝4)     26±7     (n＝5)     55±36     (n＝2)   CD45和   CD66b   27±4   (n＝6)     3.2±0.6     (n＝6)     0.5±0.1     (n＝5)   2.4±0.1   (n＝6)     2.5±0.1     (n＝6)   2.7±0.1   (n＝5)     15±2     (n＝6)     12±1     (n＝5)     22±4     (n＝5)   广泛的鸡   尾洒   65±8   (n＝9)     26±8     (n＝9)     3±1     (n＝6)   2.8±0.1   (n＝9)     3.2±0.2     (n＝9)   3.2±0.3   (n＝6)     38±8     (n＝7)     49±14     (n＝5)     33±7     (n＝5)
                      表13
     T细胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花结形成     n 含CD14的鸡尾酒     ±1SD 含CD36的鸡尾酒     ±1SD     纯度     3     80±10     94±5     回收率     3     56±12     42±10
SD＝平均值的标准差
纯度＝CD3+细胞的％纯度
回收率＝CD3+细胞的％回收率
                                  表14
             利用羟乙基淀粉/碘克沙醇混合物的免疫玫瑰花结形成 富集的细胞     型              纯度                回收率   平均值   SD     n   平均值   SD     n   T细胞   95％   3％     3   61％   9％     3   CD4+细胞   89％   5％     2   64％   5％     2   CD8+细胞   80％   8％     2   43％   1％     2   B细胞   84％   8％     5   58％   26％     5   NK细胞   80％   15％     4   50％   23％     4
SD＝平均值的标准差
纯度＝希望的细胞型的％纯度
(T细胞＝CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞，B细胞＝CD19+细 胞，NK细胞＝CD56+细胞)
回收率＝希望的细胞之％回收率
                          表15
            利用不同分层基质的免疫玫瑰花结形成
                        B细胞富集     基质     Ficoll     Percoll     碘克沙醇   样品1(一式三份)     纯度±1SE     82±2.9     81±1.4     86±2.7     回收率±1SE     78±6.0     110±3     104±10   样品2(一式三份)     纯度±1SE     71±1.2     77±1.5     81±2.4     回收率±1SE     49±8     78±3     64±1
SE＝平均值的标准误
纯度＝CD19+细胞的％纯度
回收率＝CD19+细胞的％回收率
                        表16
        利用免疫玫瑰花结形成对乳癌细胞的净化     样品1     样品2     CAMA细胞的Log排除     1.4，1.4     1.1，1.0
                                表17
                     从贮存的全外周血中去除粒细胞   免疫玫瑰花结形成     单独的Ficoll   轻密度级分中的％粒细胞   1.1，1.4，0.7，0.4     20.9，18.0
免疫玫瑰花结形成＝实施例2中概述的方法，使用含有抗-CD66b的排 除鸡尾酒
单独的Ficoll＝不使用免疫玫瑰花结的标准Ficoll密度分离
本说明书中引用参考文献的全部引文
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