血液成分的检测方法及用于检测的物质

                      技术领域

本发明涉及特异地检测来自人体血液的方法，更详细地说是涉及 能够从粪便检测出消化道中微小出血的血液成分的检测方法，例如用 来筛选检查大肠癌等以及用于检测的物质。

                      技术背景

检测人体血液的成分，在多方面都是必要的，特别在医疗领域其 必要性更高。例如众所周知的，消化道的出血是由各种疾病引起的， 特别对消化道的恶性肿瘤，消化道的出血是非常重要的初期症状。

检测消化道出血，诊断消化道恶性肿瘤的方法，现在主要是通过 测定粪便中的血液成分、特别是血红蛋白来进行的。

这种检测粪便中血红蛋白的方法有逆受体血球凝集法、胶乳凝集 法、金胶体凝集法、酶免疫鉴定法、放射免疫鉴定法。其原理是调制 抗血红蛋白的抗体，使之发生血红蛋白和抗原-抗体反应，再用各种 方法测定、检出其结果。

但是，这种过去使用抗血红蛋白的抗体的免疫学检测方法，作为 被检测物质的血红蛋白，通常要与引起失活的粪便一起提供给检查， 所以随着温度和时间的变化血红蛋白的抗原决定基失活，结果检测灵 敏度显著地下降。

特别夏季高温时，往往引起血红蛋白的改性或分解，本来是阳性 的试样可能报告出阴性(藤好建史及小山真理子、“基础和临床”、 免疫便潜血试剂的基础研究、23(15)、6097-6101，1989)。

而且特别是在血红蛋白低浓度时，上述失活显著，这对于具有诊 断意义的低浓度检测造成了困难。

因此，本发明的目的是提供以下的方法，也就是，即使使用粪 便等试样也不易由于温度和保存时间受到影响，可以准确地测定血液 成分的方法。

本发明者对于使用血红蛋白代替血液成分检测粪便等中的血液或 血液成分的存在进行了精心的研究，结果发现人体红血球膜带3糖 蛋白(以下简称“带3”)即使在粪便等试样中也难于失活，而且与 特定的红血球凝集素结合可以形成复合物，所以很容易地检测出，从 而完成了本发明。

即，本发明提供了使检体中的带3和属于耳霉属微生物产生的红 血球凝集素进行反应，检测生成的复合物来确定检体中血液成分的检 测方法及用于此方法的检测物质。

本发明中，作为血液成分检测出的带3，是红血球的标记，这在 文献中报告(Beppu，M.et al.，J.Biol.Chem.256(6)，3226-3233 (1990)，＂Binding of anti-band 3 autoantibody to oxidatively damaged erythrocytes”等)，它是监视红血球作用的成分。

另一方面，本发明方法中所使用的耳霉属微生物所产生的红血球 凝集素(以下称为“CA”)是属于耳霉属，例如由闪表耳霉属 (Conidiobolus lamprauges)和短枝耳霉属(Conidiobolus nanodes)等微生物产生的人体特异红血球凝集素，可以和带3之间 相互作用，这方面已有报告(Ishikawa，F.et al.，Agric.J.Biol.Chem. 45(9)，2105-2110(1981)，＂Action of proteases on human erythrocyte glycoproteins in relation to hemagglutination by Conidiobolus chitin-binding agglution＂)，但是使用它检测的 方法尚无人知。

本发明的方法，因为可以检测出含在检测系中血液成分的带3与 CA的复合体中的带3，检测出检体中人体血液成分，所以只要达到 此目的采用任何方式都可以。

作为实施本发明方法的一个例子可以举出所谓的夹层法，即将 CA作成固相的表面不溶解物，向其中加入试样及与该带3特异结合 并标记过的抗带3抗体后，则试样中的带3由固相化CA和标记的抗 带3抗体成为夹层，通过存在于试样中的带3，可以测定试样中的血 液存在或其量。

上述的方法中，如下所述，也可以预先向试样中添加抗带3。

即，上述体系中，试样带3上的肽部分通过添加抗带3抗体被识 别，另外通过固相化CA用其它方法识别、捕捉带3的糖链部分，进 而通过标记抗带3抗体，可以识别与添加的抗带3抗体最初识别的带 3的肽部分不同处的肽部分，由抗带3抗体和固相化CA、标记的抗 带3抗体所确定的试样中的带3高度地被限定，与夹杂在试样中的多 种类糖蛋白难于交叉，所以提高了灵敏度和特异性。

另外，本发明方法中，除了上述例子外，替换固相化成分和标记 成分也可以将固相化抗带3抗体和标记CA组合、或固相化成分和标 记成分与CA之间组合，作为特异的检测系都是可以的。在这种情况 下，为提高灵敏度和特异性，可以采取与上述类似的方法。

作为本发明的其他方案可以举出所谓竞争反应检测方法，即试样 中的带3捕捉在固相上的同时，将预先准备的并标记过的带3向固相 进行竞争的捕捉，利用后者带3的标记可以知道试样中血液存在或其 量。

作为上述CA和抗带3抗体的标记方法可以使用放射性同位素标 记、酶标记、荧光标记、化学发光物质标记等的任何一种方法、例如 生物素标记后，用标记后的卵白素检测方法、不直接标记CA、抗 带3抗体，对于这些使用标记第二抗体的方法，重要的是只要能检测 出标记，对于特异的检测系统都没有任何影响。

本发明中，也可以将抗带3抗体或CA预先存在于试样中，例如 采用在采便杆的表面上预先涂上所需要的可以溶出的抗带3抗体或 CA的方法。

另外，从含有抗带3粪便等的试样中可以溶解洗脱出抗带3的基 液有各种缓冲液如醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、TRIS盐酸缓冲液、甘 氨酸缓冲液、铵缓冲液、硼酸酸缓冲液、碳酸缓冲液等。这些基液的 pH值是4-11.5，优选的是4.5-8.5。

这些基液中最好添加接近生理食盐浓度的食盐，另外作为抗菌剂 最好添加0.05-0.5重量％的叠氮化钠等。进而作为抗体等，蛋 白的稳定剂最好添加0.05-2.0重量％的牛血清白蛋白等。

本发明因为是检测含在人体红血球膜中带3的方法，所以溶解红 血球膜后进行检测更为有效，作为溶解剂可以使用表面活性剂。

作为这些溶解剂，适宜的表面活性剂代表例可以举出如下，当然 也不仅限于这些。

十二烷基苯磺酸钠

聚氧化乙烯-异辛基苯基醚(Triton X-100等)

聚氧化乙烯壬基苯基醚(Noident P-40等)

聚氧化乙烯山梨糖醇醚(Tween20等)

3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐

3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐

正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷

辛酰-N-甲基葡糖酰胺

壬酰-N-甲基葡糖酰胺

癸酰-N-甲基葡糖酰胺

正庚基-β-D-硫代葡糖酰胺

正辛基-β-D-硫代葡糖酰胺

N，N，-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺

对于这些表面活性剂的添加方法虽然没有特殊的限制，但是使用 上述的缓冲液作为基液时，表面活性剂添加浓度在1重量％以下时更 能发挥效果。

本发明是使用CA和抗带3抗体，通过带3从粪便等试样中检测 出含有的人体血液成分的检测方法，特别适用于便潜血的检测方法。 如以后实施例所述，这种方法与以往的使用抗血红蛋白抗体的便潜血 的检测相比，可以高灵敏度、稳定地检测出便潜血。

以下通过实施例具体地说明本发明，但是本发明不受这些实施例 的限制。

实施例1

使用酶标记抗带3抗体和CA，检测粪便中带3的检测方法：

(1)带3的离析精制

将添加抗凝固剂的人的O型血液200ml，用320Xg离心 10分钟，分离血浆。将沉渣悬浮在含有1mM EDTA及5mM 2-巯 基乙醇、0.03mM苯甲磺酰氟的200ml的0.05mM磷酸缓冲液 (pH7.3)中，用1mM NaOH调节成pH7.5后，在4℃下缓 慢搅拌18小时。用10,000Xg离心分离1小时，将沉渣悬浮在 用1M NaOH调节成pH12的冰水中，在4℃下缓慢搅拌30分 钟。

用10,000Xg离心分离30分钟，将沉渣悬浮在含有1％癸 基硫酸钠、2mM EDTA及0.04mM 2-巯基乙醇的40mM TRIS盐 酸缓冲液(pH7.4)，在4℃下放置1小时后回到室温。

将该溶液通过用上述缓冲液平衡了的琼脂糖6B(法尔马西亚社 制)柱(2cmΦ×98cm)，以在280nm的吸光度作为指标， 收集馏分。带3在血型糖蛋白A之前溶出。

(2)对于带3的多细胞株抗体的制作

将带3以4mg/ml溶解在生理盐水中，将其1ml以2周时间 间隔，在兔子的背部皮下进行8次注射。最后，在皮下注射后第3周 采血，得到抗带3抗血清。

将该抗带3抗血清，加入到0.2M NaCl的20mM TRIS盐酸缓 冲液(pH8.3)平衡了的蛋白质A琼脂糖CL-4B(法尔马西 亚社制)柱(1cmΦ×14cm)中，用相同的缓冲液将该柱洗脱， 收集馏分。洗脱直到280nm的吸光度回到标准线为止。

接着，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)将该柱洗脱， 直到280nm的吸光度回到标准线为止，收集馏分，贮存此吸光度 下含有蛋白质的馏分，且对于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)进 行透析。

得到的抗体，用欧克塔尼法(オクタロニ-法)，对于来自人体 的红血球带3是特异的(以下，将本抗体简称“抗带3抗体”)。

(3)抗带3抗体的酶标记

将西洋山萮菜过氧化酶(以下，简称“HRPO”；西格马化学社制)， 用以下方法与抗带3抗体结合。

将HRPO，以15mg/m1溶解在10mM醋酸缓冲液(pH4.5) 中，向其中加入偏(meta)过碘酸钠，使最终浓度达到33mM， 在25℃下，将混合物培养15分钟。将混合物通过用上述醋酸缓冲 液平衡了的Sefdex G-25(法尔马西亚社制)柱(1cmΦ×14cm)， 收集洗脱出的茶色馏分。该馏分就是活性化HRPO。

用上述醋酸缓冲液将该活性化HRPO馏分的最终浓度调节成 1mg/ml，向其中加入抗带3抗体(上述抗带3抗体是在50mM碳 酸缓冲液中(pH9.5)调节成4mg/ml物质)，而后在室温下培 养4小时。

向该混合物加入硼氢化钠，使最终浓度达2.6mM，使反应稳 定，在4℃下将其反应30分钟。向其中加入丙酮，使最终浓度 达0.2％(v/v)，停止硼氢化钠的反应，制成HRPO标记抗带3 抗体。

(4)CA的配制

将闪表耳霉CBS153，56的菌株接种在含有乳糖1％、胨 0.5％、醇母浸汁0.3％及麦芽浸汁0.3％的0.05M磷酸缓冲液 (pH7.0)5ml的内径16mm的试管中，在120rpm的往复 式试验管振荡机上，在27℃下培养3天。接着将该培养液5ml接 种在注有100ml上述组合液的500ml容量的带凸缘振荡烧瓶 中，在120rpm的旋转式振荡机上，进一步在27℃下培养5天。

用滤纸过滤该培养液，过滤出菌体，将得到的滤液3000ml， 在冰中一边冷却一边加入固体硫铵直到75％饱和后，在低温下 放置一昼夜。以10,000Xg通过20分钟的离心收集析出的沉 淀物，将其溶解到0.05M磷酸缓冲液(pH6.0)，该缓冲 液透析一昼夜。将生成的不溶性物质，以10,000Xg通过2 0分钟离心除去，得到上清液142ml。

将该溶液通过用上述缓冲液平衡了的CM-Sefdex C-50(西 格马化学社制)柱(2cmΦ×98cm)，收集用上述缓冲液0.05 -0.5M的梯度法洗脱的馏分，确认作为CA的红血球凝聚活性。将 该馏分67ml，吸附在用1M食盐-0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0)平衡了的结合β-N-乙酰-D-葡萄糖胺的琼脂糖4B(法 尔马西亚社制)柱(1cmΦ×14cm)上，用相同缓冲液洗净柱后， 在用0-0.36M的N-乙酰-D-葡萄糖胺溶液的梯度法洗脱的馏分内， 将梯度最开始的部分作为CA精制标品。

(5)CA的固相化

将CA2μg/ml溶液(0.1mol TRIS盐酸缓冲液；pH8.4) 各150μl分注在微板的各孔中，在4℃下放置一昼夜，吸附在 表面上进行固相化(不溶化)。

(6)粪便试样的制作

将人体血液8.0μl混合在健康人大便2g中，作成试样。取 之约1/4即0.5，与健康人便1.5g混合，即稀释4倍，作成试 样2。进而，以相同方法再稀释4倍，作成试样3(稀释16倍)。 另外，以完全不含血液的作为空白试样，作成试样4。

其结果，加入的血液量对于粪便1g来说，是4，1，0.25 ml的3阶段及0。

(7)试样溶解液的制作

制成含有1％氚核(Triton)×100(西格马化学社)、 0.1％叠氮化钠、0.1％牛血清白蛋白及0.9％氧化钠的0.1 mol/l TRIS盐酸缓冲液(pH8.0)，各2ml分注在试管中 作成试样溶解液。

(8)试样的采取及试样液的调制

将采取便杆分别插入到各试样中，约采取10mg，将试样分散 到试样溶解液2ml中，进行溶解，在37℃下使其反应5分钟， 作成便试样液。

(9)测定

将上述(5)的固相化CA板，用0.1mol TRIS盐酸缓冲液 (pH8.4)洗净后，将用(8)采取的便试样液，各100μl 加入到各孔穴中。进而，各加入50μl 0.5mol醋酸缓冲液(pH 4.5)，在37℃下反应1小时，捕集到试样液中的带3。

用0.1mol磷酸缓冲液(pH6.8)，充分地洗净各孔穴后， 各加入150μl HRPO标记抗带3抗体溶液(HRPO标记抗带3抗 体，以1μg/ml溶解在含有2％牛血清白蛋白的0.1mol磷酸缓 冲液(pH6.1)中的溶液)，在37℃下反应1小时。

接着再用0.1mol磷酸缓冲液(pH6.8)充分洗净，各 加150μl基值溶液(含有0.03％邻苯二胺、0.01％过氧化氢的 0.05M醋酸缓冲液(pH4.5)，在37℃下反应30分钟。 各加入50μl的4M盐酸，停止反应，用分光光度计(科罗纳制微 板阅读式)，在492nm和630nm的2波长下测其发光。用此方法， 大便试样中1-3中的带3对于空白试样显示的吸光度均在0.5以 上，明显地是阳性。

比较例1

使用抗血红蛋白抗体的便潜血的检测方法(以往方法)：

(1)抗人体血红蛋白抗体致敏胶乳试剂的配制

在5％羧基化聚乙烯胶乳10ml中，加入1mg/ml的1-乙 基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺10ml，一边搅拌一 边反应20分钟。离心分离后弃掉上清液。在沉淀的胶乳中加入 等容的0.01mol/l-硼酸缓冲液，搅拌均匀后重复2次离心分离， 除去上清液的操作，最后加入10ml上述缓冲液进行再分散。

在10ml该胶乳(浓度5％)中，添加用对于兔子免疫的精制 人体血红蛋白A。制成的抗人体血红蛋白抗体(兔子Ig G、浓度5 mg/me)7ml，一边缓慢地搅拌一边反应5小时。离心分离后 弃掉上清液。在沉淀的胶乳中加入含有0.1％牛血清白蛋白的 0.01mol/l-硼酸缓冲液(pH8.0)10ml，进行搅拌，重复 2次离心分离除去上清液的操作，进而加入上述缓冲液10ml， 进行搅拌，得到胶体浓度1％的抗人体血红蛋白抗体致敏胶乳试剂。

(2)免疫学的胶乳凝聚反应

在载玻片血清反应板上，各加100μl用实施例1(8)制作 的便试样液，加入25μl上述的胶乳试剂，进行混合搅拌5分 钟后用肉眼观察凝聚图象，其结果，可看到试样1及试样2的凝聚 图象，但对于试样3及试样4，没有看到凝聚图象，与本发明方法相 比，明显地灵敏度变差。 综合实施例1与比较例1的结果，如表1所示

                     表1   血液浓度  (μl/g便)    以往方法    (比较例1)  本发明方法  (实施例1) 试样1 试样2 试样3 试样4     4     1     0.25     0       +       +       -       -      +      +      -      -

其中，-...便潜血阴性(以往方法，凝聚反应阴性、在发明方 法中，对于空白试样，吸光度0.4以下)

+...便潜血阳性(以往方法，凝聚反应阳性、在发明方 法中，对于空白试样，吸光度0.5以上)

实施例2

本发明方法与以往方法比较：

将实施例1(7)的试样1、试样2、试样3及试样4(试样空 白)，分别在37℃下培养6天，每天用实施例1的本发明方法及 比较例1的以往方法测定血液的存在，并进行比较。其结果如表 2所示。

                               表2       测定法             37℃培养时间(日)   0     1     2     3     4     5     6 试样1  本发明方法   以往方法   +     +     +     +     +     +     -   +     +     -     -     -     -     - 试样2  本发明方法   以往方法   +     +     +     +     +     -     -   +     -     -     -     -     -     - 试样3  本发明方法   以往方法   +     +     +     +     -     -     -   -     -     -     -     -     -     - 试样4   本发明方法   以往方法   -     -     -     -     -     -     -   -     -     -     -     -     -     -

其中，-...便潜血阴性(以往方法中，凝聚反应阴性、在发明 方法中，对于空白试样，吸光度0.4以下)

+...便潜血阳性(以往方法，凝聚反应阳性、在本发明 方法中，对于空白试样，吸光度0.5以上)

以上结果表明，在以往方法中，在37℃下培养时，即使可检测 血红蛋白只能检测出一天左右的，但用本发明方法，通过带3 可延长高灵敏度地检测时间，即使连续地保持37℃的情况下，也可 充分长时间地进行检测。

如以上详细说明那样，只要按照本发明的检测方法，由于利用 CA，可特异地、高灵敏度地、稳定地检测出带3，所以从因血红蛋 白的存在，而难确认血液存在及其量的粪便、消化系统内容物、怀疑 有血液存在的物品等试样中，可以定性或定量地，精确地检测出如消 化道出血、大便潜血等。