基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备 |
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| 申请号 | CN201410122813.8 | 申请日 | 2014-03-31 | 公开(公告)号 | CN104950114A | 公开(公告)日 | 2015-09-30 |
| 申请人 | 天津德祥生物技术有限公司; | 发明人 | 黄志刚; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种基于膜结构的血清( 血浆 ) 抗体 筛查方法以及筛查检测 试剂 盒 的制备，其特征在于，该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化 抗原 结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸 水 材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。本发明的有益效果是，检测时间短，结果客观。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备，其特征在于，该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸水材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。当膜上的抗原特异性结合血清(血浆)中抗体后，可以与特定的指示细胞发生红细胞凝集反应，进而形成肉眼可见的红色团块。当膜上的抗原不与血清(血浆)中抗体结合，指示剂细胞就不会发生凝集，红细胞会被冲洗液分散，没有肉眼可见红色聚集块。操作人员可依据红细胞是否在滤膜形成肉眼可见的红色团块来判断结果，确定血清或者血浆中的抗体。指示剂红细胞和膜结构的结合，为反应提供了结果显示的方式。 |
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| 说明书全文 | 基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备 技术领域背景技术[0002] 血清或血浆中了除了常规的ABO血型抗体外，还含有大量的不规则抗体和血小板抗体。具有临床意义的不规则抗体会导致溶血性输血反应、新生儿溶血病等。因此，在临床检测中，对献血者的血清或血浆进行不规则抗体筛查，可以防止含有不规则抗体的血液注射给病人，引起病人的溶血性输血反应；将筛查到的不规则抗体的血液制备成抗体血清，有利于稀有血型的检测；对需要输血的患者经行不规则抗体筛查，有助于血液选择，可以防止与不规则抗体相对的抗原血细胞的输入，保证输血安全；对孕妇进行不规则抗体筛查，可以预防和治疗新生儿溶血病，提高胎儿和新生儿的身体素质。而血小板抗体会导致血小板输入无效、输血后紫癜等，在临床上，对于反复输注血小板的病人，定期测定血清中的血小板抗体可以预测血小板输注效果；对于血小板输注无效的病人的血清或者血浆中的血小板抗体进行筛查，能及时发现导致病人血小板输注无效的免疫性因素；对孕妇产前进行血小板抗体筛查，可为早期流产发生的风险提供诊断和治疗依据。因此，为了确保输血安全，输血前对血清(血浆)中的抗体筛查越来越引起重视。 [0003] 由于不规则抗体、血小板抗体主要是由输血或血小板或妊娠等免疫刺激产生，这些抗体在生理盐水介质中不能直接产生细胞凝集反应，因此，必须通过抗人球蛋白法、凝聚胺法等特殊方法检测。 [0004] 目前临床检测血清或血浆中抗体的筛查方法以平板法和柱凝集技术居多。平板法和柱凝集法操作复杂；离心等条件对实验结果有影响；对于样本较多时容易造成错误判断；需要辅助设备，耗时长，限制了在紧急状况下的应用。 发明内容[0005] 本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备。 [0006] 实现上述目的本发明的技术方案为，一种基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备，该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸水材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。当膜上的抗原特异性结合血清(血浆)中抗体后，可以与特定的指示细胞发生红细胞凝集反应，进而形成肉眼可见的红色团块。当膜上的抗原不与血清(血浆)中抗体结合，指示剂细胞就不会发生凝集，红细胞会被冲洗液分散，没有肉眼可见红色聚集块。操作人员可依据红细胞是否在滤膜形成肉眼可见的红色团块来判断结果，确定血清或者血浆中的抗体。指示剂红细胞和膜结构的结合，为反应提供了结果显示的方式。 [0007] 所述血清(血浆)抗体包括血型抗体、HLA抗体、血小板抗体及其它抗体。 [0009] 所述滤膜的周边包围有吸水材料，吸水材料可以是吸水纸、棉花等，吸水材料包围滤膜的方式为全部包围或者部分包围。 [0010] 所述将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上的方法为物理吸附法或者化学交联法。 [0011] 所述的待检血清或血浆滴加到滤膜表面，其中的待检血清或血浆为体积约10-200μL的新鲜的人血清或者血浆。 [0012] 所述的将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，其中指示剂细胞为保存在红细胞保存液或其他等渗溶液中的抗人球蛋白包被的血红细胞。指示剂红细胞的制备可以依据红细胞致敏的方法制作。根据实验要求，指示剂细胞浓度在0.5％-20％之间。 [0013] 该检测试剂盒由检测卡以及指示剂细胞组成。其中检测卡内设有能够允许单个红细胞通过的滤膜，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜周边垫有吸水垫，吸水垫的面积要大于滤膜，且滤膜和吸水垫都通过塑料固体结构来做固定和支撑。而指示剂细胞则是抗人球蛋白包被的血红细胞。 [0014] 检测时，将待检血清或血浆滴加到检测卡的滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。如果血清或者血浆中含有与滤膜上抗原发生特异性反应的抗体，血清或血浆中抗体将被结合到滤膜上，进而与指示剂细胞发生抗原抗体结合，指示红细胞则会留在膜表面形成肉眼可见的红色团块；反之，如果血清或者血浆中不含与滤膜上抗原发生特异性反应的抗体，对应的反定型指示剂细胞不会发生抗原抗体结合，指示剂红细胞将会随冲洗液液体渗出，则滤膜上不会形成肉眼可见的红色团块。 [0015] 所述冲洗液为生理盐水或者其他等渗的缓冲液。 [0017] 图1，是本发明所述基于膜结构的血清或血浆中抗体筛查方法的实施例1的结构示意图； [0019] 图2为血清或血浆中不规则抗体检测试剂卡的示意图，其中A为不规则抗体检测试剂卡的整体图；B为不规则抗体检测试剂卡的盖子图；C为不规则抗体检测试剂卡的吸水盒；D为不规则抗体检测试剂卡的加样板，而1为塑料底板，2为滤膜，带有血型抗原；3为吸水纸。 [0020] 图3为血清或血浆中血小板抗体检测试剂卡的示意图，其中A为血小板抗体检测试剂卡的整体图；B为血小板抗体检测试剂卡的盖子图；C为血小板抗体检测试剂卡的吸水盒；D为血小板抗体检测试剂卡的加样板，而1为塑料底板；2为滤膜，带有血小板抗原；3为吸水纸。 具体实施方式[0021] 下面结合附图对本发明的进行具体描述，本发明提供一种基于滤膜结构的血清或血浆中抗体筛查的方法以及其检测试剂盒制备。本试剂盒包括带有修饰后的滤膜的检测卡和对应的指示剂细胞。下面结合实施案例进一步举例描述本发明。 [0022] 实施案例1 [0023] 一种基于滤膜结构的血清或者血浆中的抗体筛查检测方法 [0024] 该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸水材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。当膜上的抗原特异性结合血清(血浆)中抗体后，可以与特定的指示剂细胞发生细胞凝集反应，进而形成肉眼可见的红色团块。当膜上的抗原不与血清(血浆)中抗体结合，指示剂细胞就不会发生凝集，红细胞会被冲洗液分散，没有肉眼可见红色聚集块。操作人员可依据红细胞是否在滤膜形成肉眼可见的红色团块来判断结果，确定血清或血浆中的抗体。 [0025] 实现所述的检测方法的试剂盒包括两部分，一部分为由带有细胞、细胞碎片或者纯化抗原的滤膜、吸水纸、塑料固体支架组成的检测卡(如图1所示)；一部分是用于检测的抗人球指示剂细胞。其中，上述方法中所述的选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，滤膜材质可以是玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、硅酸盐颗粒等能够形成特定连续液流通道的固体，且滤膜的孔径在2-20微米之间；所述的滤膜的周边包围有吸水材料，吸水材料可以是吸水纸、棉花等，吸水材料包围滤膜的方式为全部包围或者部分包围；所述细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，细胞、细胞碎片或者纯化抗原到滤膜上的方法为物理吸附法或者化学交联法；所述的待检血清或血浆滴加到滤膜表面，其中的待检血清或血浆为体积约10-200μl新鲜的人血清或者血浆；所述的将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，其中指示剂细胞为保存在红细胞保存液或其他等渗溶液中的抗人球蛋白包被的血红细胞。根据实验要求，指示剂细胞浓度在0.5％-20％之间；所述冲洗液为生理盐水或其他等渗的缓冲液。 [0026] 实施案例2 [0027] 血清或血浆中不规则抗体筛查检测试剂盒的制备以及检测步骤 [0028] 1在滤膜上固定血型抗原 [0029] 血型抗原的制备：选择三组已知抗原图谱的O型红细胞和一组被IgG致敏的O型红细胞分别作为检测抗原组和阳性对照组，使用低渗透压溶液破碎细胞，离心去上清，再使用相同的低渗透压溶液洗涤沉淀，直至上清无色透明，收集红细胞膜沉淀，作为血型抗原提取物。加入抗原保护剂稀释抗原提取物。抗原保护剂可以是含5％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％PVP、5％的小牛血清的5mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)。抗原保护液即可以保护抗原原性，增强抗原的有效期；也可以辅助抗原固定在虑膜上。将稀释后的抗原提取物滴加到活化处理过的1.5cm×1.5cm滤膜的中心，然后37℃烘干处理并密封保存。 [0030] 2指示剂细胞的制备： [0031] 一定浓度的O型红细胞与抗D(IgG)抗体等体积混合，37℃孵育器，孵育30min，得到抗D(IgG)抗体致敏细胞，使用5倍体积生理盐水洗涤数次，去除多余的IgG，用红细胞保存液重悬至所需浓度，最后加入一定体积抗人球蛋白试剂混匀，得到抗IgG指示剂细胞。 [0032] 3检测试剂卡的组装： [0033] 检测试剂卡主要有处理过的滤膜，吸水材料和塑料支架组成。其中塑料支架有三部分组成，一是盖子，二是加样板，三是吸水盒。加样板为一带有4个孔(孔径为0.5cm)的方形塑料板，可从试剂卡上拆除。带有不同抗原检测组和对照组细胞膜的滤膜贴在加样板的背部，虑膜上的抗原中心与塑料版上的样品孔相对映。在盖子和吸水盒里面填充了4cm×4cm的方形吸水材料。滤膜和吸水材料都是使用防水胶黏贴在塑料版上，防止加样和冲洗过程滤膜和吸水纸脱落或串位置。 [0034] 组装后的不规则抗体检测试剂卡以如图2所示，其中加样孔I、II、III为带有三组已知抗原的滤膜，加样孔IV为阳性对照孔，即滤膜上带有制敏细胞膜。如图2所示。 [0035] 4血清或者血浆中不规则抗体试剂盒的样品检测 [0036] 首先将检测卡(图2A)打卡，抽出加样卡(图2D)。然后将10-200μl血清或血浆样品滴加在加样卡的I、II、III膜上。滴加待检测样品后，置于37℃孵育箱，孵育1-40min，取出加样卡，将加样卡放置在盖子上，然后向每个样品膜缓慢加入50-500ul的冲洗液，冲洗除去未反应或多余的抗体。然后将加样卡插回吸水盒，再向加样孔中滴加10-200μl指示剂细胞，等待30s至1min，向每个样品孔缓慢加入200-1000ul的冲洗液，待冲洗液被吸水纸吸收后，观察加样孔的颜色。 [0037] 在加样孔上有显著的红色物质残留为阳性反应，说明血清含有与膜上抗原对应的抗体；加样垫上没有红色物质残留为阴性反应，则说明血清中不含与之对应的抗体。结合抗原与抗体特异性反应，抗人球蛋白实验原理，可以很容易得知待检测样品中的抗体。或者，也可以利用光信号或者电信号采集系统采集加样垫上残留的红色残留物质，然后可以对结果自动化判断，从而实现对批量血清或血浆样品的不规则抗体检测。 [0038] 实施案例3 [0039] 血小板抗体筛查检测试剂盒的制备以及检测方法 [0040] 1在滤膜上固定血小板抗原 [0041] 使用化学方法处理活化滤膜后，然后使用保护剂稀释后的血小板抗原(或血小板)滴加到1.5cm×1.5cm滤膜的中心，然后37℃烘干处理并密封保存。 [0042] 3检测试剂卡的组装： [0043] 检测试剂卡包括处理过的滤膜、吸水材料以及塑料支架组成。塑料支架有三部分组成，一是盖子，二是加样板，三是吸水盒。加样板为一带有4个孔(孔径为0.5cm)的方形塑料板，可从试剂卡上拆除。带有血小板抗原的滤膜贴在加样板的背部，虑膜上的抗原中心与塑料版上的样品孔相对映。在盖子和吸水盒里面填充了4cm×4cm的方形吸水纸。滤膜和吸水纸都是使用防水胶黏贴在塑料版上，防止加样和冲洗过程滤膜和吸水纸脱落或串位置。 [0044] 组装后的血小板抗体检测试剂卡以如图3所示，其中加样孔I、II为检测孔，加样孔III为阳性对照孔，加样孔IV为阴性对照孔。 [0045] 3指示剂细胞的制备： [0046] 一定浓度的O型红细胞与抗D(IgG)抗体等体积混合，37℃孵育器，孵育30min，得到抗D(IgG)抗体致敏细胞，使用5倍体积生理盐水洗涤数次，去除多余的IgG，用红细胞保存液重悬至所需浓度，最后加入一定体积抗人球蛋白试剂混匀，得到抗IgG指示剂细胞。 [0047] 4样品检测： [0048] 取出检测试剂盒的样品板，标记检测孔、阳性对照孔以及阴性对照孔，向检测孔滴加10-200μL的待测血清或血浆，向阳性对照孔滴加10-200μL阳性对照(含有抗人血小板抗体)，阴性对照孔滴加10-200μL阴性对照(不含抗人血小板抗体)，将样品板置于37℃的孵育器中孵育1-40min，再次滴加50-500μL的生理盐水，冲洗去除多余的血清或血浆。最后向反应孔中滴加10-200μl指示剂细胞，等待30s至1min，向每个反应孔缓慢加入 200-1000ul的冲洗液，待冲洗液被吸水纸吸收后，观察加样孔的颜色。 [0049] 添加阳性对照的反应孔上应该有显著的红色物质残留，其原理是阳性对照中含有抗人血小板抗原可以血小板抗体结合，进而与指示剂细胞结合，将细胞截留在滤膜表面；添加阴性对照的反应孔，因为阴性对照中不合有抗人血小板抗体，因此不能截留指示剂细胞，没有红色物质残留。根据结合抗原与抗体特异性反应，抗人球蛋白实验原理，并且参考阳对照孔和阴对照孔结果，可以很容易得知待检测样品中是否含有抗人血小板抗体。 |
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