[0001] 共同未决申请

[0002] 本申请要求2012年8月24日提交的U.S.临时申请No.61/692,994和2011年11月10日提交的U.S.临时申请No.61/558,009的优先权权益，并且将所述两篇申请按引用并入本文中，如同在以下全部列出。

[0003] 发明背景

[0004] I.发明领域

[0005] 本发明涉及简单的、低成本的、快速的纸基诊断装置及其使用方法。

[0006] II.总的背景

[0007] 生物流体的分析对于诊断疾病或病症以及用于监控个体和群体的健康。最常用的诊断试验通常需要大的和昂贵的实验室装置，所述装置必须由受过训练的人员来操作，并且进一步需要相当大体积的生物样品。因此，最常用的诊断试验难以在偏远地区实施，并且因此对于显色中国家是难以实现的。因此，最常用的诊断试验对于紧急情况或家庭健康护理情况是没有用的。因此，对于不麻烦的并且可以在小的生物样品体积上进行的低成本诊断试验仍然存在需求。

[0008] 微流体纸基装置(“μPAD”)通常是小的、可携带的并且是容易地从不昂贵的材料制得，运送至偏远的、资源缺乏的地区。例如，可以通过使用固体墨(蜡)打印机将图案打印在纸上，并且将墨熔化来形成跨过整个纸基质厚度的疏水性屏障，从而来容易地制造μPAD。μPAD使用纸作为流体基质，并且利用纸的芯吸/毛细管特性，将生物样品从样品沉积区域运出。这些装置通常不需要复杂的实验室装置，并且因此通常非常适用于紧急情况和家庭健康护理情况中的临床实践中的诊断应用，并且特别是在显色中国家。

[0009] 这些μPAD中的许多运行比色试验。用于生物流体分析的比色试验的使用通常是吸引人的，因为这些试验产生视觉读出，并且通常操作简单、稳定和廉价。在比色试验中，生物样品与测试读出区内沉积的试剂反应，并且反应产生可检测的颜色。然而，传统比色试验限于光学透明样品(例如，水、尿、预先分离的血浆)。如果使用非透明样品，则样品的颜色干扰所产生的颜色的检测。

[0010] 血浆通常用作生物样品，因为其组成特别能够提供关于影响整个身体的器官和组织的病理过程的信息。例如，通过测试血浆来进行非酯化脂肪酸、葡萄糖、肝素和溶血磷酸的检测。然而，为了在比色试验中使用血浆，首先从全血中分离出血浆是有益的。血浆分离对于比色试验是特别重要的步骤，因为全血中的红细胞(“RBC”)的强烈颜色可能影响诊断比色试验的结果的定量。基于离心或磁分离的从全血分离血浆的常规方法是有效的，但需要其他样品制备步骤(在诊断试验之外)，以从全血样品分离血浆。基于微小规模的全血的流体动力学和流变学行为的血浆纯化方法需要特别设计的具有精细特征的微流体装置，以实现分离；并且，因此，不适用于大部分临床情况中(并且特别不适用于野外或家庭健康护理情况)。因此，对μPAD中创新的需求允许将血浆分离步骤整合为诊断试验的一部分。将血浆分离步骤包括在比色μPAD的设计中将其转化成完全整合的诊断装置，并且因此通过消除对分开的样品制备步骤的需求显著提高了它们的多用性，分开的样品制备步骤常常需要昂贵的、体积庞大的装置，以及专门受过训练的人员。这些完全整合的μPAD将能够分析在野外直接获取的全血样品，并且简单地放置在装置的凝集区上。整合的血浆分离将使得比色μPAD适用于许多更多的应用和情况，其中可以使用比色方法来测试人血浆中存在的大量临床相关生物分子，同时控制来自由RBC呈现的深红色的干扰。因此，对μPAD中的创新存在需求，使得可以进行案例诊断，具有自动化定量的能力。

[0011] μPAD还可以用于检测血样中镰状血红蛋白的存在(例如，用于诊断镰状细胞病)。血红蛋白(Hb)是RBC中的含铁氧转运蛋白。血红蛋白的每个分子由四个球蛋白链组成：胎儿血红蛋白(Hb F)具有两个α和两个γ链，而成年血红蛋白(Hb A)具有两个α和两个β链。控制球蛋白链产生的基因的突变包括改变氨基酸序列并产生Hb异常形式的结构变体和降低或消除球蛋白链产生的突变(地中海贫血)。与大部分其他正常和异常的Hb形式不同，脱氧-Hb S改变了构造，使得一个Hb S分子的β链上的缬氨酸替代位点的疏水性块(patch)结合另一个Hb S分子的β链上的互补疏水性位点。厌氧环境中Hb S的聚合使得RBC成为扭曲的、镰状细胞。

[0012] 遗传了仅有一个Hb S拷贝并且具有编码正常Hb A的基因的其他拷贝(基因型Hb AS)的那些人携带镰状细胞性状(SCT)，但通常认为是健康的，尽管具有较高的静脉血栓栓塞和肾髓质癌的风险。遗传了两个Hb S拷贝(基因型Hb SS)的那些人产生了镰状细胞贫血，最普遍的镰状细胞病(SCD)的形式。当负责其他异常类型的Hb(C 或E)或β-地中海贫血的突变结合Hb S作为复合异源突变(基因型Hb SC、Hb SE、Hb Sβ+或Hb Sβ0)时，产生了更罕见的SCD形式。具有Hb SS和Hb S β0的人员具有最严重形式的SCD。

[0013] 估算5％的世界人群携带临床上显著的Hb变体。在非洲，接近85％的SCD发病率，并且超过所有的70％影响了出生，其中甚至保守估计的SCD发病率表明出生时10.68/1000的比例(与美国0.49/1000相比)。在美国，通过新生儿筛选，每年大约有2,000名婴儿诊断为SCD，这是现在的国家需求。尽管SCD引起明显的终身患病率和早产儿死亡率，但高收入国家(如，美国)中出生的大部分受影响的人能够存活至成年。形成鲜明的对照，由于缺乏早期干预，低收入国家中出生的大部分受影响的人在5岁之前死亡。

[0014] 新生儿筛选在高收入国家中的SCD治疗中已经是唯一的最高进展。在临床情况中，主要通过血红蛋白电泳(HE)来诊断，但也使用高性能液相色谱(HPLC)和等电聚焦(IEF)测试，其利用了Hb变体的电荷差异，以检测它们在病人的RBC中的存在。然而，进行这些诊断测试，需要装备有专门仪器的临床实验室，可消耗的材料和高度训练过的技术人员，这是昂贵的并且在其中SCD最普遍的低收入国家资源有限的情况中，在很大程度上是不可实现的。因此，在非洲的大部分国家中，通用的新生儿筛选仍然是相当昂贵的，并且大部分受影响的个体在出生时或生命过程中没有得到诊断。研发用于SCD的低成本诊断测试的迫切需求最近被世界卫生组织认为是优先考虑的事情。

[0015] 此外，目前用于高收入国家中的诊断测试(例如，HE、HPLC和IEF)需要将血样从护理点转移至集中的医院实验室，这使得在急症室情况中不可能使用这些测试确定地诊断SCD。因此，对于能够在护理点诊断SCD以证实具有未知医史的正在寻求用于SCD相关并发症紧急治疗的成年病人的诊断的快速测试存在大量需求。

[0016] 脱氧-Hb S在高浓度磷酸盐缓冲液中的不溶性已经被血库和临床实验室用作简单的定量方法，以在视觉上证实血样中Hb S的存在。尽管标准Hb溶解性测试是低成本和快速试验，但其不能区分SCT和SCD，因为两种类型的血样都含有Hb S。之前解决了这种限制的Hb溶解性试验的改进需要额外的样品制备步骤，使用其他实验室装置(例如，离心、膜滤器)，并且依赖于分析工具(例如，分光光度计)来区分SCT和SCD，这使得测试明显更昂贵、复杂、费时，并且对于资源有限或紧急护理情况在很大程度是不现实的。因此，对于μPAD中的创新存在需求，以使得可以进行案例诊断，具有快速和简单诊断SCD的能力。

[0017] 以下将更全面地看出，μPAD在结构、使用和方法上与其他μPAD有相当大的不同，并且解决了领域中已知的问题，如以上讨论的那些。

[0018] 尽管在权利要求中指出了以下显示和描述的本发明的特定新特征，本发明不受限于具体说明的详细内容，因为相关领域的普通技术人员将理解可以进行所说明的本发明的形式和详细内容及其操作中的各种省略、改变、替换和变化，而没有以任何方式脱离本发明的精神。

[0019] 发明概述

[0020] 本发明的一个方面包括一种诊断装置，其包括具有孔的基质、凝集区和测试读出区，其中所述凝集区用凝集剂功能化。

[0021] 本发明的再一个方面包括一种诊断疾病或病症的方法，其包括提供诊断装置的步骤，所述诊断装置包括具有孔的基质、凝集区、测试读出区，并且其中所述凝集区用凝集剂功能化，并且所述测试读出区用试验试剂功能化；将血样沉积在所述凝集区上；使所述血样显色；并且观察所述测试读出区。

[0022] 本发明的再另一个方面包括一种诊断疾病或病症的方法，其包括提供诊断装置的步骤，所述诊断装置包括具有孔和凝集区的基质；将一定体积的血样与一定体积的凝集剂混合；将一滴所述混合物沉积在所述凝集区；使所述液滴显色并且在所述基质上形成血迹；并且观察所述血迹。

[0023] 本发明的再另一个方面包括一种诊断疾病或病症的方法，其包括步骤：提供一种诊断装置，所述诊断装置包括具有孔的基质，其中所述基质进一步包括凝集区和测试读出区，并且其中所述凝集区用凝集剂功能化，并且所述测试读出区用试验试剂功能化；将血样沉积至所述凝集区；使所述血样显色；并且观察所述测试读出区。

[0024] 本发明的再另一个方面包括一种诊断疾病或病症的方法，其包括步骤：提供一种诊断装置，所述诊断装置包括具有孔的基质，其中所述基质进一步包括凝集区；将一定体积的血样与一定体积的凝集剂混合；将所述液滴沉积在所述凝集区上；使所述液体显色，并且在所述基质上形成血迹；并且观察所述血迹。

[0025] 本发明的再另一个方面包括一种用于诊断疾病或病症的系统，其包括：具有孔的基质，其中所述基质进一步包括：凝集区和测试读出区；其中所述凝集区用凝集剂功能化；能够捕获所述测试读出区图像的光学图像捕获装置；和能够分析所述图像的计算机软件。

[0026] 本发明的再另一个方面包括一种用于诊断疾病或病症的系统，其包括：具有孔的基质，其中所述基质进一步包括凝集区；和沉积在所述凝集区上的样品，其中所述样品由全血和凝集剂的混合物组成；能够捕获所述基质图像的光学图像捕获装置；和能够分析所述图像的计算机软件。

[0027] 本发明的再另一个方面包括一种用于诊断疾病或病症的装置，其包括：用于接收血样的部件；用于凝集所述血样红细胞的部件；用于从所述接收部件转移出所述血样的血浆的部件；和用于测定所述血浆中分析物存在的部件。

[0028] 本发明的再另一个方面包括一种用于诊断疾病或病症的装置，其包括：用于接收血样的部件，所述样品由与用于凝集所述全血的部件混合的全血组成；用于从所述接收部件转移出所述样品的可溶形式的Hb并形成血迹的部件；用于扫描所述血迹的部件；和用于使所述扫描的血迹与所述疾病或病症的所述诊断关联起来的部件。

[0029] 本发明的上述和其他目标及特征将通过附图、所给出的描述和所附的权利要求变得很清楚。

[0030] 附图简述

[0031] 为了进一步理解本发明的性质和目的，必须参考以下结合附图的描述，其中相同的部分用相同的参考编号给出。

[0032] 图1A示出了尝试从全血中分离出RBC时，已知的RBC特征性变形性。

[0033] 图1B示出了从全血中的RBC滤出血浆的已知方法。

[0034] 图1C示出了使用RBC凝集从全血中的RBC滤出血浆。

[0035] 图2A示出了在未处理过的纸上点上全血的结果。

[0036] 图2B示出了在用凝集抗体抗-A、B处理过的纸上点上全血的结果。

[0037] 图2C示出了全血样品的体积和全血斑点半径、凝集RBC斑点的半径以及血浆条带宽度之间的关联。

[0038] 图3示出了具有整合血浆分离的μPAD的设计。

[0039] 图4A示出了具有整合血浆分离的μPAD的操作。

[0040] 图4B示出了已经在测试区发生反应后，具有整合血浆分离的μPAD。

[0041] 图5示出了使用具有整合血浆分离的μPAD，对全血样品中葡萄糖浓度的定量。

[0042] 图6示出了使用利用凝集反应的纸基血红蛋白溶解性试验的示意图。

[0043] 图7A示出了使用利用凝集反应的纸基血红蛋白溶解性试验的过程中形成的血迹。

[0044] 图7B示出了图7A中所示的定量血迹的红色强度谱。

[0045] 图8A示出了正常(Hb AA)、SCT(Hb AS)和SCD(Hb SS、Hb Sβ或Hb SC)血样的颜色强度谱。

[0046] 图8B示出了图8A的每种样品在5mm的标准化颜色强度值。

[0047] 优选实施方案的详述

[0048] 本发明的一个方面提供了一种诊断装置及其使用方法，用于将全部包含在μPAD内的小全血样品中的血浆与红细胞(RBC)分离。

[0049] 使用RBC凝集，将血浆与RBC分离

[0050] 如图1A中所绘，正常的健康RBC 100可变形性非常高，可以容易地通过具有小于RBC 100直径的孔102的基质101。基质100可以是纸，尤其是色谱纸、布、线或其他具有芯吸或毛细管特性的材料。RBC 100可以穿过的最小孔102的直径取决于细胞的体积和表面积，但对于正常人RBC大约为2.5μm。因此，具有各自直径(d)小于2.5μm的孔102的基质101提供了用于将全血样品中的血浆与RBC分离的非常直接的方式，如图1B中所示出的。然而，因为4
通过孔102的流速(Q)与孔102直径(d)的四次方Qα d 成比例，基质101的孔102的直径(d)越小，血浆通过基质101的体积流速越低。此外，滤过的RBC易于非常有效地在基质101上堆积(由于其可变形能力)，这最终导致血浆通过基质101的流动完全脱离。因此，尽管具有小于
2.5μm的孔102的基质101可以非常有效地将血浆与RBC 100分离，但纯化血浆的产量不足以用于比色试验。相反，提高孔102的直径将提高纯化血浆通过基质101的流动，但将不可避免地降低分离的效率。

[0051] 如图1C中所说明的，本发明通过形成可以使用具有显著大于2.5μm的孔102的基质101滤出的大的多细胞凝集RBC 103，从而利用RBC凝集来提高RBC的有效大小，并且因此以高得多的体积流速来产生纯化血浆。通常，凝集是颗粒(诸如RBC)凝聚，以形成大的颗粒。可以通过添加凝集剂，或替换地，通过温度改变，来引起凝集。由于凝集，RBC形成凝集的RBC 
103，其太大，以致不能通过μPAD的基质101内的孔102。结果，凝集的RBC 103陷入基质101中，并且因此与全血样品中的血浆分离。然后通过基质101的孔102的血浆，通过基质101向外芯吸。在本发明中，基质101的孔102足够小，使得能够有效滤出凝集的RBC 103，同时也足够大，使得能够适当地高速血浆流动，用于完成比色试验。

[0052] 可以通过将凝集剂，如凝集抗体(抗-A、B)，加入全血中，来启动凝集。抗-A、B是免疫球蛋白类别IgM的单克隆抗体，其选择性地结合人RBC表面上存在的抗原A和抗原B。当A或B，或A和B两种抗原存在于RBC的表面上(血型A、B和AB)时，发生了通过抗-A、B抗体引起的直接RBC凝集。

[0053] 图2A描绘了点在用磷酸盐缓冲盐水(用于对照)处理过的纸基上的全血样品的视觉外观，而图2B描绘了点在用凝集抗体处理过的纸上的全血样品的视觉外观。将图2A与图2B相比，可以看到点在用磷酸盐缓冲盐水(用于对照)预处理过的纸上的全血样品201表现为均一相，RBC和血浆通过纸芯吸，而没有分离。然而，当全血样品沉积在用抗-A、B抗体预处理过的纸上时，血浆与凝集的RBC 202分离(陷入纸纤维中)，形成围绕凝集的RBC202的血浆条带203。血浆条带203明显比磷酸盐缓冲盐水处理过的纸上的凝集RBC 202或全血样品201分布更广。

[0054] 通过将15μL抗-A、B溶液或磷酸盐缓冲盐水(用于对照)点在色谱纸上，使纸干燥，加入1μL至10μL范围体积的全血样品，并且随后测量用磷酸盐缓冲盐水(对照)处理过的全血样品形成的点半径以及用凝集抗体处理过的纸上的全血样品形成的RBC点半径和血浆条带的宽度，我们发现由分离的血浆产生的条带的宽度不明显依赖于沉积在用抗-A,B抗体处理过的纸上的全血血样的体积。这进一步可以在图2C中看到，其示出了不同体积的全血样品的全血点半径、凝集的RBC点的半径和血浆条带的宽度，都以毫米计。

[0055] 利用RBC凝集的μPAD装置

[0056] 图3示出了使用凝集，整合了从全血中分离血浆的μPAD 300的设计。μPAD 300的图案包括中心区的凝集区301和μPAD 300四周的四个测试读出区302、303、304、305。将上述数据(图2C中说明的)用于测定μPAD 300的最佳形状和大小，用于有效地将凝集的RBC保持在μPAD 300的中央部分内，并且能够使足量的分离血浆流入四周的测试读出区302、303、304、305中。凝集区301的中心与测试读出区302、303、304、205之间的最佳距离大约为0.5cm。

[0057] 将μPAD 300优化，以在大约7μL全血样品上运行，其相当于容易用手刺针获得的血量和目前在资源有限情况中可用的许多快速诊断测试中需要的血样体积。

[0058] 将μPAD 300的测试读出区302、303、304、305形成矩形，以简化测试读出区302、303、304、305中的颜色变化的分析。μPAD 300设计的测试读出区302、303、304、305的矩形使得当通过扫描和计算机分析进行颜色变化定量时能够进行自动化选择。然而，测试读出区可以是任何形状。

[0059] 可以使用固体墨(蜡)打印机(例如，Phaser8560N，Xerox，Norwalk，CT)，通过将许多μPAD 300(例如，以矩阵来排列)的图案打印在色谱纸(例如，Whatman No.1色谱纸，Piscataway，NJ)上，并且随后将有图案的纸在150℃的热板上加热3分钟，并且使所述纸冷却至室温，使得能够形成通过纸的全部厚度的疏水屏障，从而来制造μPAD 300。熔化过程导致打印线变宽，在最初设计μPAD的图案时，产生了这种情况。然后通过(i)将抗-A、B抗体点在凝集区301上，优选1-20μL的体积，(ii)将比色试验301的试剂，优选1-20μL的体积，点在三个测试读出区302、303、304的每一个上，和(iii)将磷酸盐缓冲盐水301，优选1-20μL的体积，点在剩余的一个测试读出区305上，将μPAD 300功能化。用磷酸盐缓冲盐水处理过的测试读出区305用于颜色变化校准。然后在进一步使用前，将每个功能化的μPAD 300干燥。

[0060] 利用RBC凝集的μPAD的使用

[0061] 参照图4A和4B，使用μPAD 400来进行全血样品的比色试验，将7μL一滴的全血样品401沉积在μPAD 400中心的凝集区402上。全血样品401扩散，以填满凝集区402，其作为用于全血样品401的“截留井”，截留凝集的RBC 403，同时允许血浆侧向向外芯吸至μPAD 400四周的测试读出区404、405、406、407中。分离的血浆填满测试读出区404、405、406和407，其中血浆的目标分析物与比色试验的试剂反应，产生与血浆的目标分析物的浓度成比例的颜色变化。在图4B中，用比色试验的试剂将测试读出区404、405、406功能化，因此导致那些读出区404、405、406中的颜色变化，并且测试读出区407没有用比色试验的试剂功能化(可以替代地用磷酸盐缓冲盐水功能化)，因此作为对照，并且没有导致颜色变化。通常，从引入全血样品401用于RBC凝集403，血浆分离和测试读出区404、405、406中产生可检测的颜色变化，短于5分钟。

[0062] 实施例1：全血样品中血浆葡萄糖浓度的测定

[0063] 使用用于血浆葡萄糖的试验作为实例，测试了具有基于RBC凝集的血浆分离的μPAD。在该试验中，葡萄糖氧化酶催化血浆样品中存在的葡萄糖的氧化，以产生过氧化氢(H2O2)。然后辣根过氧化物酶催化H2O2与碘化钾的反应，其产生棕色。颜色变化的强度与产生的H2O2含量成比例，并且因此与葡萄糖的含量成比例。

[0064] 为了校准比色试验对血浆葡萄糖的灵敏度，将3.5μL具有不同已知浓度葡萄糖的血浆点在用试验试剂预先处理过的色谱纸的方形图案区中(相同的纸用于制造μPAD，并且具有观察到的大约2-200μm的直径的孔)。通过全血样品(获自从健康的同意的志愿者收集的人静脉血)的离心(800xg，15分钟)来制备血浆。按照制造商针对Liquid Glucose(Oxidase)Reagent Set(Pointe Scientific，Inc.)的说明，通过分光光度(500nm，NanoDrop 1000，Nano Drop产品，Wilmington，DE)测量了血浆浓度。用1μL磷酸盐缓冲盐水处理的一些方形图案的区域用作颜色变化对照。使试验显色5分钟，扫描纸，将图像输入并且定量各种葡萄糖浓度的颜色变化。图5显示了根据生理范围内(50-200 mg/dL)的血浆中葡萄糖浓度的颜色变化的校准曲线。

[0065] 在制造中，μPAD 400能够进行这种直接针对全血样品401的血浆葡萄糖的比色试验，在μPAD 400的三个测试读出区404、405、406中，将相同的比色试验功能化，以进行针对相同样品401的测量，重复三次，尽管原则上，可以使用针对相同分析物的不同比色试验，或针对不同分析物的比色试验。用1μL由碘化钾(去离子水中0.6M)、淀粉(饱和盐溶液中0.3g/mL)、葡萄糖氧化酶(0.1M磷酸钾中100U/mL，pH7.4，0.05M NaCl，5mM胆酸、0.1％ X-100)和辣根过氧化物酶(0.1M磷酸钾中20U/mL，pH7.4，0.05M NaCl，5mM胆酸、0.1％X-100)组成的溶液将三个测试读出区404、405、406功能化。第四个测试读出区407用1μL磷酸盐缓冲盐水处理，以对照亮度和背景颜色的变化。凝集区402用7μL Seraclone抗-A、B(ABO3)克隆BS63/BS85(Biotest Medical Diagnostics GmbH，德国)功能化。在使用μPAD 400之前，使所有试剂干燥。

[0066] 为了使用μPAD 400测试具有未知浓度葡萄糖的全血样品401(取自从具有A、B或AB血型的健康的同意的志愿者收集的人静脉血)，将7μL样品401沉积在μPAD的凝集区402上，并使其显色5分钟。接着，通过在便携式扫描仪(例如，CanoScan LiDE110，Canon USA Inc，Lake Success，NY)上扫描含有μPAD 400的色谱纸，并通过 (The MathWorks Inc.Natick,MA)分析图像来定量μPAD 400的测试读出区404、405、406中的颜色变化。最后，使用用于试验的校准曲线(如图5中所示)，将颜色变化值转化成血浆葡萄糖浓度。然而，装备有数码相机的智能手机也可以用于完成试验的这一个部分。用μPAD 400测量时，全血样品中的葡萄糖浓度为89.5mg/dL，而使用常规分光光度计(NanoDrop 1000)单独测量时，为82.5mg/dL。

[0067] 该实验使用了抗-A、B抗体来诱导获自具有血型A、B或AB的志愿者的全血样品中的RBC凝集。然而，对于具有血型O(大约全部人群的44％)的那些人，这种特定的分离测试的实施就不适用，因为那些个体的血液不含抗原A或抗原B。抗原H存在于所有RBC的表面上，包括具有血型O的那些人，除了具有Oh“Bombay表型”的那些(低于0.0004％人群)。抗原H是抗原A和抗原B的前体，并且取决于人的ABO血型，其转化成抗原A或抗原B，或两者。因此，血型A、B或AB的RBC具有显著低于血型O的RBC的抗原H，并且我们推测抗-H IgM抗体将诱导血型O RBC的强凝集和血型A、B或AB RBC的弱凝集。因此，我们进一步推测使用与抗原A、B和H反应性的IgM(作为抗-H和抗-A、B的混合物或单一的抗-ABH抗体)将这种血浆分离方法的适用性延伸至几乎全部人。

[0068] 尽管以上的实验使用了比色试验来测试葡萄糖浓度，我们推测使用它们的相关试剂也可以测试其他分析物。实例可以包括Sigma甘油三酯诊断试剂盒，用以测试非酯化脂肪酸；含有联苯卡巴腙的联苯卡巴胼，用以测试游离脂肪酸；amplex红、胆固醇氧化酶、磷酸盐缓冲盐水中的辣根过氧化物酶，用于胆固醇；蔚蓝A试验用于肝素；以及含有0.01％Triton-X的HEPES缓冲液(pH7.6)中的溶血磷脂酶、过氧化物酶、G3PO、G3PDH、HSD、NADH、胆酸、TOOS和4-氨基抗吡啉，用于溶血磷脂酸。

[0069] 本发明的另一个方面提供了一种用于将全部包含在μPAD内的小的全血样品中的Hb A、C和F与脱氧-Hb S分离，以检测血样中是否存在镰状血红蛋白的诊断装置和方法，。

[0070] 使用凝集的Hb A、C和F与Hb S的分离

[0071] 现有技术已知的是常规的Hb溶解性试验，如SickleDex(SickleDexTM，Streck，Omaha，NE)，其使用皂素来化学溶解血样中的RBC，将Hb释放至溶液中，其中在亚硫酸氢钠(廉价且安全的还原剂)的存在下，游离的Hb转化成脱氧-Hb。在高浓度的磷酸盐缓冲液中，脱氧-Hb S改变构型、聚合并沉淀，视觉上看到溶液变浑浊(Hb的非镰刀形式的溶解性保持未受影响)。由于聚合，Hb S分子凝集，形成大的超分子凝集物，这显著提高了相对于其他类型的Hb的有效尺寸。

[0072] 常规的、可商业购得的Hb溶解性试验(如，SickleDex)可用于区分正常的(Hb AA)血样与含有Hb S的那些，但它们不能区分SCT(Hb AS)血液和来自SCD病人的血液(Hb SS、Sβ或SC)，因为所有这些样品都含有一些Hb S。因此，需要μPAD的创新，以允许作为诊断试验的一部分，从全血中分离出Hb A、C和F。

[0073] 本发明的一个方面是通过使用凝集，将Hb S与Hb A、C和F分离，从而解决了上述问题的μPAD。将一滴混合了Hb溶解性试验成分的全血沉积在基质上，将形成聚合的脱氧-Hb S(由Hb释放至溶液中引起，其中在亚硫酸氢钠的存在下，游离的Hb转化成脱氧-Hb并聚合)。基质可以是纸，尤其是色谱纸、布、绳或任何具有芯吸或毛细管特性的材料。全血的聚合脱氧-Hb S随后将保持在血迹的中心，不能通过基质的孔，并被基质缠住，而Hb A、C和F的分子保持可溶，并且通过毛细管作用从侧面转移至血迹的外周。然后基于每种样品产生的特征性血迹，可以容易地区分正常的、SCT和SCD样品。

[0074] 图6示出了纸基Hb溶解性试验的运行原理。为了进行纸基Hb溶解性试验，将一滴10-50μL体积的血液加入凝集剂中，在这种情况中，为SickleDex溶液。加入SickleDex溶液，使得血样与SickleDex溶液的体积比为1:20。将一滴这种混合物601沉积在μPAD 600的纸基质602上。聚合的脱氧-Hb S以及细胞碎片的凝集物不能通过纸基质602的孔，被纸基质602缠住，并且保留在最初液滴的轮廓内，在正在显色的血迹中心形成红色斑点603。液滴中存在的可溶性形式的Hb朝侧面运送，在中心红色斑点603周围形成粉色环604。通过沉积在纸基质602上的液滴601的体积来测定血迹的整体直径和中心红色斑点的直径，并且与样品的类型无关。然而，粉色环604的颜色强度与血样中存在的可溶性形式的Hb(例如，Hb A、F或C)的浓度强烈相关。

[0075] 利用Hb S凝集的μPAD

[0076] 图7A示出了利用凝集，从全血中分离出Hb S的μPAD的设计。μPAD 700包括方形疏水性屏障702和中心区域的凝集区701。设计μPAD 700的疏水性屏障702的方形图案，以限制血液从一个μPAD 700扩散至另一个，因此防止潜在的样品的交叉污染。μPAD 700的每个角的45°定位线703给操作者提供了将样品液滴沉积在μPAD 700中心的凝集区701中的视觉指导。μPAD 700的简单化设计还明显简化了用于数字化和分析血迹的自动化图像分析。然而，其不需要使用特别成型的μPAD 700–简单的一片色谱纸将足以进行该试验。使用演示软件(例如，Canvas 11，ACD Systems International Inc.，Seattle，WA)在白色背景上用黑线画出疏水性屏障702的图案，然后使用固体墨打印机(例如，Phaser 8560N，Xerox，Norwalk，CT)，在色谱纸(例如，No.1，Whatman，Piscataway，NJ)上打印出来。将打印的色谱纸在热板上在高于蜡的熔点下加热(150℃，3分钟)，使得形成通过全部厚度的纸的疏水性屏障702。熔化过程导致打印线变宽，在最初设计μPAD的图案时，产生了这种情况。

[0077] 利用Hb S凝集的μPAD的使用

[0078] 再次参照图6，为了使用μPAD 600进行全血样品的纸基Hb溶解性试验，将大约10-50μL的小体积全血与SickleDex溶液以1:20的体积比温和混合，持续5分钟，然后将20μL的混合物液滴沉积在μPAD 600的中心上。液滴从中心通过纸基质602快速扩散，形成特征性的血迹。然后用便携式扫描仪将所得到的血迹数字化并分析。

[0079] 使用图像处理算法分析了血迹。通过血迹的天然对称性明显简化了血迹的定量。计算机算法自动检测血迹的几何中心，并且围绕中心以1°幅度旋转图像，收集血迹的360个单独的一像素宽的水平线扫描(通过虚线605示出了一个这样的线扫描)。然后将这些线扫描平均，以获得从血迹中心到其外周的红色强度变化图案的简单曲线表示。图7B中显示了对于含有Hb AA、Hb AS和Hb SS的血样的这种曲线的实例。

[0080] 如图7B中可以看到的，对于所有类型的血样，红色强度曲线大致具有相同的整体特征。颜色强度从血迹的中心逐渐增强，在中心点和外周粉色环的交界处达到最大。推测这种穿过中心斑点的特征性颜色变化是由于聚合的Hb S凝集物运送引起的，最初液滴的沉积使得液体朝向轮廓的径向流出。粉色环的颜色相对均一，在血迹的外边缘逐渐融入背景中。推测粉色环颜色的均一性是由于可溶性形式的Hb浓度决定了粉色环颜色的事实引起的，其在分子水平保持均匀地溶解于高磷酸盐缓冲溶液中。

[0081] 实施例2：将血样分类为健康、SCT或SCD

[0082] 对作为代表性实例的一个正常(Hb AA)、一个SCT(Hb AS)和一个SCD(Hb SS)血样，使用本发明的μPAD。我们以1:20的体积比温和地混合小体积的大致10-50μL的每种全血样品与SickleDex溶液，等待5分钟，并且将20μL液滴的每种混合物沉积在μPAD的中心上。从健康的同意的志愿者收集正常的人静脉血(Hb AA)；在Sickle Cell Center of Southern Louisiana(New Orleans，LA)获得了SCD(Hb SS)和SCT(Hb AS)血样。排除在之前三个月中接受了输血的SCD病人的血样。通过血红蛋白电泳测定了SCD样本的Hb A、F、C和S含量，作为标准病人护理的一部分。从SCD病人的生物父母(通常是母亲)收集SCT血样。排除具有低于25％红细胞压积值的SCT样品(表明是贫血)。该实验中使用的SickleDex溶液(SickleDexTM，Streck，Omaba，NE)是商业可购得的测试试剂盒，其由两个组分组成：(i)作为干试剂粉提供的皂素和亚硫酸氢钠，和(ii)含有0.1％2-氯乙酰胺的2.3M磷酸钾溶解性缓冲液。将含有试剂粉的一个小瓶的内含物加入一瓶溶解性缓冲液中(由制造商提供)，并且使用强烈搅拌来完全溶解。将Hb溶解性试验的溶液与血液以1:20的体积比混合。

[0083] 沉积在每个μPAD上的液滴从中心通过纸基质放射性地扩散，形成三种类型样品中每一种的特征性血迹，如图7A中所示。μPAD的大小和液滴的体积使得血迹的最外缘没有到达μPAD四周的定位线和图案轮廓。将一叠含有具有血迹的μPAD阵列的色谱纸插入便携式平板扫描仪(CanoScan LiDE110，Canon USA Inc.，Lake Success，NY)中。然而，装备有数码相机的智能手机也可以用于完成试验的这一个部分。用图像算法( The MathWorks Inc.，Natick，MA)分析扫描的图像，并数字化，以产生红色强度谱，如图7B中所示。花费大约10分钟来完整所有试验操作，包括将样品引入μPAD上，形成血迹，扫描图像和最终的自动化图像分析。相反，通常用于诊断SCD的标准Hb电泳测试需要花费2小时，并且常常长达约一周。

[0084] 仍然参照图7A，尽管三种血样中的每一种产生了相似大小的血迹，在μPAD的中心具有较深红色的斑点704(～3mm半径)(圈出样品液滴最初放置位置的轮廓)，μPAD的四周具有较浅粉色的环705(～5.5mm宽)，我们观察到血迹之间视觉上显著的差异。正常血液(Hb AA)产生的血迹颜色整体上几乎是均匀的，略深的轮廓画出了中心斑点704(是由我们推测的由RBC裂解产生的细胞碎片沉积产生引起的)。由SCT血液(Hb AS)产生的血迹的中心斑点704明显较深，四周的粉色环705明显比正常样品浅。由SCD血液(Hb SS)产生的血迹的中心点704是三个样品中最深的，μPAD四周的粉色环705几乎不可见。

[0085] 因为Hb S(在浓缩磷酸盐缓冲液中脱氧时，其聚合)负责中心斑点的颜色，而其他形式的Hb(其在相同条件下保持可溶)负责粉色环的颜色，这些差异可以通过每种样品的RBC中存在的显著不同的Hb S和可溶形式Hb的分数来解释。通常，来自健康受试者(Hb AA)的RBC的Hb S含量为0％，对于SCT受试者(Hb AS)，Hb S含量在20-40％之间变化，而对于SCD受试者(Hb SS)，可以高达80-100％。因此，SCD(Hb SS)样品，其具有最高的Hb S分数和最低的可溶性Hb的分数(例如，Hb A、F或C)，产生了较深的中心斑点，和四周几乎不可见的粉色环。

[0086] 因此，血迹之间的差异可以用于区分来自健康、SCT和SCD受试者的血样。图8A显示了来自正常(Hb AA)、SCT(Hb AS)和SCD(Hb SS、Hb Sβ、Hb SC)受试者样品的血迹的标准化颜色强度谱。通过曲线下的总面积(其反映出最初样品中的Hb浓度)来标准化颜色强度谱，以说明受试者之间的红细胞压积的差异，然后将每种Hb基因型内的所有受试者平均。从血迹中心5mm距离处的标准化颜色强度(称为SCD指数，并且通过图8A中的虚线来显示)，在来自相同Hb基因型组的受试者之间高度一致，并且显示出组之间最明显的差异。SCD指数的物理含义是在浓缩磷酸盐缓冲液中脱氧时，在样品中保持可溶的Hb的分数。如图8B中所示，我们使用了SCD指数作为定量度量标准来区分Hb基因型中的样品。点表示每种血型的血样(Hb AA(3)、Hb AS(3)、Hb SS(6)、Hb Sβ(1)和Hb SC(4))，而SCD指数用于单独的样品。每个血型Hb AA、Hb AS、Hb SS和Hb SC的三条水平线对应于样品的平均(中心水平线)以及高于和低于平均的一个标准偏差(分别为顶部和底部水平线)。我们的实验只包括一个样品用于血型Hb Sβ，并且因此，样品只包括平均，没有计算标准偏差。因此，从图8B看，可以观察到使用这种方法分析的大部分样品导致离开平均一个偏差内的SCT值。从图8B，也可以看到正常(Hb AA)样品的SCD指数显著高于(p<0.001)任何其他类型测试样品(SCT或SCD)。来自SCT个体(Hb AS)的血样的SCD指数显著高于(p<0.001)具有Hb SS和Hb Sβ0的病人(两种最常见的和最严重形式的SCD)，并且特别(尽管不太显著)高于(p<0.05)具有Hb SC病人的(不太常见，较温和形式的SCD)。Hb SS/Sβ组和Hb SC之间的差异也是非常显著的(p<0.001)，就SCD指数而言，将具有Hb SC的病人放置在通常健康的SCT个体和具有更严重形式的SCD的病人之间。由于Hb基因型之间的SCD指数值的显著差异，这种SCT指数值证明了将血样鉴定为正常(Hb AA)、SCT(Hb AS)和SCD(Hb SS、Hb Sβ、Hb CC)是有效的。

[0087] 此外，我们推测本发明的μPAD可以用于诊断以下疾病和感染，使用以下相应的凝集剂：获得性重症肌无力和乙酰胆碱受体抗体；肺炎支原体和冷凝集素；传染性单核细胞增多症和冷凝集素；流感和冷凝集素；非细菌性感染和冷凝集素；胶原蛋白血管疾病和冷凝集素；肝硬化和冷凝集素；白血病、淋巴瘤、多发性硬化和冷凝集素；沙门氏菌和热凝集素；立克次氏体和热凝集素；布氏杆菌病和热凝集素；土拉菌病和热凝集素；白血病和热凝集素；淋巴瘤和热凝集素；人免疫缺陷病毒和HIV抗体；人免疫缺陷病毒和尿液HIV抗体；人免疫缺陷病毒和唾液HIV抗体；哮喘和IgE抗体；皮炎和IgE抗体；食物过敏和IgE抗体；乳胶过敏和IgE抗体；过敏性鼻炎和IgE抗体；血管性水肿和IgE抗体；系统性红斑狼疮和抗心磷脂抗体；
抗磷脂综合症和抗心磷脂抗体；CREST综合症和抗着丝点抗体；系统性红斑狼疮和抗-DNA抗体；慢性肝炎和抗-DNA抗体；传染性单核细胞增多症和抗-DNA抗体；胆汁性肝硬化和抗-DNA抗体；肾肺综合症和抗肾小球基底膜抗体；自体免疫肾小球性肾炎和抗肾小球基底膜抗体；
狼疮肾炎和抗肾小球基底膜抗体；自体免疫肝炎和抗-肝/肾微粒体抗体；高丙球蛋白血症和抗-肝/肾微粒体抗体；梅毒和抗线粒体抗体；风湿性心脏病和抗心肌抗体；链状球菌感染和抗心肌抗体；心肌病和抗心肌抗体；恶性贫血和抗壁细胞抗体；青少年糖尿病和抗壁细胞抗体；硬皮病和抗硬皮病抗体；慢性活动性肝炎和抗平滑肌抗体；单核细胞增多性肝炎和抗平滑肌抗体；病毒性肝炎和抗平滑肌抗体；慢性甲状腺炎和抗甲状腺球蛋白抗体；类风湿性关节炎和抗甲状腺球蛋白抗体；甲亢和抗甲状腺球蛋白抗体；甲状腺机能减退和抗甲状腺球蛋白抗体；慢性甲状腺炎和抗甲状腺过氧化物酶抗体；类风湿性关节炎和抗甲状腺过氧化物酶抗体；甲状腺毒症和抗甲状腺过氧化物酶；甲状腺机能减退和抗甲状腺过氧化酶抗体；急性真菌感染和真菌抗体IgG、IgA和IgM；乳糜泄和麦醇溶蛋白抗体和肌内膜抗体；军团病和军团病抗体；传染性红斑和细小病毒B19抗体；短暂的再生障碍性贫血和细小病毒B19抗体；慢性贫血和细小病毒B19抗体；免疫性血小板减少和血小板抗体；狂犬病和狂犬病中和抗体；风疹感染和风疹抗体；麻疹感染和麻疹感染抗体；弓形虫病和弓形虫病抗体；以及西尼罗河病毒和西尼罗河病毒抗体。