测定方法和装置

申请号 CN201080022456.8 申请日 2010-03-31 公开(公告)号 CN102439450A 公开(公告)日 2012-05-02
申请人 生物广益有限公司; 发明人 M·邦斯; D·查威尔; B·J·帕斯;
摘要 本 发明 涉及用于检测分析物存在的方法和装置。更特别地,本发明涉及用于检测针对多态性同种 抗原 (如HLA抗原)和/或主要组织相容性 复合体 (MHC)的其他产物的免疫球蛋白的存在的方法和装置。
权利要求

1.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的流通测定装置,该装置包括与结合垫和芯吸垫液体连通的多孔膜,所述结合垫具有用于检测和结合特定分析物的检测部件,所述多孔膜具有检测区,其中固定的第二种捕获试剂被构造成结合分析物-结合物复合体的至少一部分,以产生检测信号
2.如权利要求1中所要求的装置,其中所述分析物包含HLA抗原、多态性蛋白或在移植或灌输情况下可能引起抗体应答的蛋白片段,如MICA、MICB、KIR、主要组织相容性抗原(MIHAg)、粒细胞抗原(HNA系列)、血小板抗原(HPA系列)、内皮细胞-单核细胞抗原(如P-选择蛋白、E-选择蛋白)、CD31和输血抗原,如Lewis、Rhesus、MN、I/i和HT-A,或针对其的免疫球蛋白。
3.如权利要求1或2中所要求的装置,其中所述测试可以用于鉴定针对多态性分析物的免疫球蛋白的存在或不存在。
4.如权利要求3中所要求的装置,其中所述多态性分析物包括包含许多表型的多种抗原的混合集合或针对其的免疫球蛋白。
5.如权利要求1、2或3中所要求的装置,其中所述装置可以用于鉴定针对来自多态性系统的单个分析物的免疫球蛋白或针对其的免疫球蛋白的存在或不存在。
6.如权利要求5中所要求的装置,其中所述分析物包括单个HLA抗原,如A0101、A0201等,或表示临床相关表位的单个抗原的肽片段。
7.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中所述分析物或配体包括可能源自多个组合来源以产生表示基因座上的所有多态性抗原的蛋白集合的抗原,或源自单个个体的抗原,或单个抗原,如重组抗原,或抗原的一个或多个片段,如一个或多个肽,或针对其的免疫球蛋白。
8.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中所述检测区含有不连续的多个抗原。
9.如权利要求6中所要求的装置,其中所述分析物包括一个区域中的I类HLA抗原,第二个区域中的II类HLA抗原,使得可以检测个体内多个免疫球蛋白特异性,或针对其的免疫球蛋白。
10.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中所述检测区可以含有与移动相相同的配体。
11.如权利要求1至10任一项中所要求的装置,其中所述检测区含有与移动相相关的抗原或表位,使得可以通过使第一个抗原的表位与第二个抗原上的表位连接来检测免疫交叉反应性,由此所述表位可以是相似的或不同的。
12.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中所述移动相由可移动颗粒组成,可移动颗粒可以为胶乳、聚苯乙烯、聚酸酯、胶态金属或其他可以在侧向流动测试区中检测到的可移动颗粒。
13.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中所述样品垫可以由能从全血中分离出血清并使血清在所述装置上流动的材料组成。
14.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中所述移动相可以由多个有差别地标记的颗粒组成,这些颗粒可以在不同检测区中得以区分。
15.如权利要求14中所要求的装置,其中所述标记的颗粒包括I类HLA抗原、II类HLC抗原和/或对照抗原。
16.如权利要求15中所要求的装置,包括附着于红色颗粒上的I类HLA,附着于蓝色颗粒上的II类HLA,附着于黑色颗粒上的对照抗原。
17.如权利要求14、15或16中所要求的装置,其中其他可移动试剂,如针对免疫球蛋白的标记的抗体可以用于双重标记反应,使得能区分抗体类别或同种型。
18.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中使用移动相中颗粒上的无关标记,如生物素或抗生物素蛋白链菌素和远端对照检测区中的相关配体来测试所述装置的正确流动。
19.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其特征在于该装置用于移植前或移植后监控以及筛选血液和其他血液制品中抗体的存在,其中所述装置包括可以未封装提供的样品垫、结合垫、测试试纸条和吸收垫,作为量杆测试,由此将样品垫浸入分析物中。
20.如之前任一项权利要求中所要求的装置,包括:
a.外壳
b.样品垫
c.结合垫
d.膜,其上具有标记的一个或多个反应区,和
e.吸收垫。
21.如权利要求1至20任一项中所要求的装置,装有多个对不同的分析物具有特异性并装在总的容器中的其他装置,使得可以对于单个样品同时进行多个测试。
22.如之前任一项权利要求中所要求的装置,其中可以通过眼睛或通过测量测试区和对照区强度以获得可以产生定量或半定量结果的数字输出的装置来辨别结果。
23.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的方法,包括:
i)提供一种流通测定装置,其包括与结合垫和芯吸垫液体连通的多孔膜,该多孔膜限定了:a)检测区,其中固定了第一种抗体,该抗体被构造成结合分析物和结合的检测部件之间形成的复合体,以产生检测信号;b)对照区,其中固定了第二种抗体,当包含在对照区内时,能够产生对照信号;
ii)使含有分析物的测试样品与芯吸垫接触;和
iii)检测所述检测信号。
24.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的试剂套盒,包括:
a)如权利要求1至22任一项或多项中所要求的装置;
b)洗涤缓冲液和/或追踪缓冲液;和
c)检测部件。
25.如权利要求24中所要求的试剂盒,进一步包括用于收集样品并且含有所述检测部件的容器。
26.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的方法,包括:
a)使含有分析物的测试样品接触检测部件;
b)通过洗涤除去未结合的检测部件和/或其他材料;
c)提供一种流通测定装置,其具有(i)检测区,其中固定了第一种抗体,该抗体被构造成结合在分析物和结合的检测部件之间形成的复合体,以产生检测信号,和(ii)对照区,其中固定了第二种抗体,当包含在对照区内时,能够提供对照信号;
d)使结合检测部件的洗涤过的分析物接触所述装置;和
e)检测所述检测信号。
27.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的两阶段测定法,包括:
第一阶段,包括:
a)使含有分析物的测试样品接触检测部件;
b)通过洗涤除去未结合的检测部件和/或其他材料;
和第二个阶段,包括:
c)提供一种流通测定装置,其具有(i)检测区,其中固定了第一种抗体,该抗体被构造成结合在分析物和结合的检测部件之间形成的复合体,以产生检测信号,和(ii)对照区,其中固定了第二种抗体,当包含在对照区内时,能够提供对照信号;
d)使结合检测部件的洗涤过的分析物接触所述装置;和
e)检测所述检测信号。

说明书全文

测定方法和装置

[0001] 本发明涉及用于检测分析物存在的方法和装置。更特别地,本发明涉及用于检测针对多态性同种抗原(如HLA抗原)和/或主要组织相容性复合体(MHC)的其他产物的免疫球蛋白的存在的方法和装置。
[0002] 移植和/或输血程序常常需要筛选受试者是否存在可能结合存在于捐赠者组织或血液上的捐赠者抗原的抗体;这些捐赠者抗原的实例是HLA抗原。
[0003] 本领域已知的用于HLA测试的方法包括补体依赖性淋巴细胞毒性(CDC)测试,其中用捐赠者的淋巴细胞培养接受者的血清,接着与补体一起培养。然后通过用眼睛分辨死细胞和活细胞来估算细胞毒性的平。这种方法是劳动密集性的,需要活细胞,可能是非特异性的,并且需要主观评价。
[0004] 免疫测定,例如,利用免疫系统的机制,其中应答致病的或生物体外来的抗原的存在而产生抗体。这些抗体和抗原,即免疫反应物,能够彼此结合,因此引起高特异性的反应机制,这可以用来确定生物样品中的特定抗原的存在或浓度。
[0005] 已经描述了用于检测抗-HLA抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)(Zaer等,Transplantation 63:48-51(1997);美国专利6046013&美国专利5482841),藉此将从集合的血小板或类淋巴母细胞细胞系纯化的I类HLA分子固定于测定板的孔中并可以用于检测抗-HLA抗体,由此该系统的读出是测试板孔中的光密度变化。Barnardo等(Transplantation,2000年8月15日;70(3):531-6)证实了单个重组HLA,而不是来自集合的细胞或血小板的抗原,可以用于检测HLA抗原的ELISA形式中。
[0006] 最近,Jar-How在美国专利5948627中教导了HLA抗原可以附着于微珠上并且可以利用流式细胞计数器,Luminex平台或用于检测结合的抗HLA抗体的相似的装置在流体ELISA测定中进行检测。
[0007] 这些抗体检测方法缓慢并且需要昂贵的专用实验室设备,如光密度平板阅读器或流式细胞计数装置。缺乏快速的重点照护检验意味着用于同种抗体筛选的所有样品必须进行贮存并分批检验,导致用于移植的不稳定的病房用血液、血液制品和器官的使用延迟。
[0008] 侧向流动测试或免疫色谱测定已经存在有些时间了。它们是胶乳凝聚测试中所用技术的合理延伸,胶乳凝聚测试首先是由Singer和Plotz在1956年研发的。侧向流动测试的益处包括:快速测试(通常少于10分钟)、易于使用(通常就在样品中蘸一下)、长期稳定性,这使其适于全世界使用。
[0009] 在它们最简单的形式中,侧向流动测试是吸水试纸条,其中样品通过由吸水试纸条一端的吸收垫产生的毛细管作用沿着试纸条流动。随着样品穿过试纸条,其遇到了有色试剂,通常是已经结合了特异性结合成员(通常是蛋白质或抗体)的微粒。涂覆的微粒与样品混合并结合其配体。珠子-分析物复合体通过试纸条,遇到已经预先用抗体或抗原处理过的线条或区域。根据样品中存在的分析物,有色试剂结合在测试线或区域中。侧向流动测试可以与竞争性测定或夹层测定那样来进行。通常描述两种类型的色谱免疫测定。在一种类型中,检测人流体(尿液、血液、血浆、血清和唾液)中含有的蛋白质或小分子分析物。分析物包括hCG、FSH、LH、CKMB、TSH、肌蛋白、肌肉球蛋白、癌蛋白、病毒/细菌蛋白、半抗原、治疗药物和滥用药物。
[0010] 在其他色谱免疫测定中,待检测的分析物是与以下如病毒/细菌蛋白(HIV、甲肝和丙肝、幽螺杆菌、EBV、Rubella、CMV、HSV、登革热、Lyme、Chagas、TB、弓形虫、自身免疫抗原等)或过敏原(花粉、霉菌、粉尘/螨类、食物、动物上皮细胞等)等物质特异性反应的人抗体。
[0011] 为了在侧向流动测试中检测抗体,可以使用各种形式;两种常用的方法是竞争性的或非竞争性的。竞争性的形式依赖于通过标记的竞争性试剂阻止待测试的分析物在试纸条上的测试区结合;用于分析物的阴性测试是由标记的竞争性试剂在测试区引起的颜色变化而产生的。在竞争性测试中,沿着测试区进一步检测到无关标记,表明测定已经进行了工作。在竞争性测定中,测试区可以包含抗原或抗体;如果使用抗原,则竞争性标记的试剂是抗-抗原,其与测试抗体在测试区竞争结合。如果在竞争性测定的测试区使用了抗体,则竞争性试剂是标记的抗原,允许该抗原结合测试样品中的配体并且因此阻止其在测试区的结合。由于以下情况:阴性视觉结果实际上是测试的阳性结果并且因此看上去是违反直觉的,尤其是对于外行,因此竞争性测定没有非竞争性测定那么普遍。
[0012] 在非竞争性测定中,阳性测试区是用于分析物的阳性测试:在这些非竞争性测试中,测试区可以是分析物或分析物的抗体。如果测试区是分析物(抗原),则可移动的标记试剂通常是抗-免疫球蛋白。在该测试中,移动相中的抗-免疫球蛋白将样品中的所有免疫球蛋白进行标记,标记的免疫球蛋白通过试纸条,并且如果存在抗原的抗体,则在测试区被捕获,导致测试区的颜色变化。如果在测试区使用抗-免疫球蛋白,则标记的移动相为测试分析物,其结合样品中的抗体,通过试纸条并且被测试区的抗-免疫球蛋白捕获。
[0013] 侧向流动测定是实验室测试有用的产物,因为它们是潜在快速的并且经济的测定临床分析物存在的方法。然而,现有的装置存在它们的问题,并且现有的设计并不适用于所有分析物。为了改进侧向流动测定装置,已经描述了改进的一步测定装置和方法。例如,May等的美国专利5,602,040,5,622,871,5,656,503,6,187,598和6,228,660描述了有助于一步侧向流动测定方法的装置、试剂盒和方法。提供了一种测试试纸条,上面含有干燥的标记试剂,其通过液体生物样品释放成可移动形式。标记的试剂特异性地结合待检测的分析物,形成复合体,并且液体样品沿着侧向流动基质的移动通过毛细管作用将复合体传送至检测区。
[0014] 无关的血液成分可能引起侧向流动测定中的干扰。Padhia等在专利WO/2007/063423中公开了用于检测IgE的两步法,由此装置的外壳含有用于除去全血成分(如,细胞材料)的滤器,这使得可以在全血中使用该装置。
[0015] 更具体地,侧向流动测试中的问题是样品中大量的IgG,这可能干扰其他类别(如IgE)的检测。为了解决这一问题,Hubscher等在美国专利6,528,325中公开了一种更特异性的用于检测人血清中的IgE抗体的装置和方法,其中使用了有助于一步技术的侧向流动测定。
[0016] 获自体液的测试样品与金标记的抗原反应,并且所得到的复合体穿过膜并沿着侧向流动试纸条移动。沿着测试试纸条的特定位置中形成的有色线条表示测试样本中类别特异性抗体的存在。在Hubscher等公开的更具体的实施方案中,侧向流动测定具有加入样品垫的IgG反应蛋白(例如,蛋白A或IgG的抗体),以与样品中所含的IgG复合,使得IgG复合体的分子量高于1.0百万。这个大的复合体明显比IgA、IgM和IgE的移动慢,由此使这些抗体在IgG之前反应。因此,这个发明对于IgG的检测不再工作,因为IgG的移动性被阻碍,导致未结合的IgG阻断了特异性结合的IgG的捕获。
[0017] 因此,对检测同种抗原的抗体的改进方法,包括快速、方便且精确的用于测定抗体的方法存在着需求。
[0018] 本发明的目的是克服或减轻一个或多个与现有技术相关的问题。
[0019] 没有一篇现有技术教导或公开了适用于多态性抗原(如,MHC或HLA抗原)的抗体或血小板糖蛋白的快速且灵敏的测试的快速而有效的侧向流动方法。
[0020] 根据本发明的第一个方面,提供了一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的流通测定装置,该装置包括与结合垫(conjugate pad)和芯吸垫(wicking pad)液体连通的多孔膜,所述结合垫具有用于检测特定分析物的检测部件,所述多孔膜具有检测区,其中固定了第一种捕获试剂,该捕获试剂被构造成结合在分析物和分析物-结合物复合体的至少一部分,以产生检测信号
[0021] 本发明提供了一种改进的用于检测抗体的快速方法,其使得使用者可以快速地评价生物样品中抗体(例如,HLA抗原的抗体)的存在或不存在,并且在其他实施方案中,还可以测定抗体的特异性。测试可以是临床重点照护检验(POC)测试,和/或基于手指戳刺的基于家庭的POC测试,由此患者可以在家里检查抗体状况。该测试包括将来自受试者的生物流体加入侧向流动装置中:含有相关抗体的生物流体沿着装置流动并且接触结合了有色的、荧光和/或金微粒的抗原配体。分析物结合的抗体的检测发生在测试线上,由此固定相同或相似的抗原:通过抗体结合两个位置(珠子和试纸条)的抗原来固定抗体-抗原-颗粒聚集物,并且通过有色珠子的视觉存在来表示阳性测试。在本申请中,应当清楚使用HLA抗原只是举例说明,并且是多态性同种抗原系列的优选实施方案,并且本发明包括用于检测任何同种抗原的任何同种抗体的侧向流动测试。
[0022] 优选地,对照区位于多孔膜上的检测区的下游并且具有固定在对照区内的第二种捕获试剂。
[0023] 在一个实施方案中,结合垫位于检测区的上游,并且具有检测探针,该检测探针具有用于分析物的特异性结合膜。
[0024] 检测部件优选包括视觉标记物,如有色的颗粒和/或直接连接的发色团和/或荧光团,用于结合并标识/标记配体,使得可以检测分析物。
[0025] 结合垫含有发出分析物存在信号的检测部件。结合垫还可以包括其他不同的检测部件群,包括用于在对照区显示的部件。检测部件可以是纳米颗粒,例如,直径5-150nm的纳米颗粒,更特别地,部件具有20至60nm的直径,以促进标记物-分析物结合物的移动。合适的检测部件包括由金属胶体(如和金胶体)、荧光颗粒、、聚苯乙烯和染色的胶乳颗粒制得的那些。
[0026] 在一个实施方案中,将含有分析物的样品沉积在结合垫上,与检测部件相互作用,并且朝向用于检测的检测区移动。
[0027] 术语“上游”和“下游”指的是相对于样品从测定装置上的沉积点的流动方向的物品位置。
[0028] 术语“分析物”通常指的是待检测的物质。例如,分析物可以包括多态性抗原,如MHC或HLA抗体或血小板糖蛋白、半抗原、抗体,及其组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、药物中间体或副产物、细菌、病毒粒子和上述任何物质的代谢产物或针对上述任何物质的抗原或免疫球蛋白。
[0029] 术语“测试样品”通常指的是怀疑含有分析物的材料。
[0030] 术语“液体连通”指的是液体及其内含物(包括分析物等)能够从一个区域移动至另一个区域的能
[0031] 例如,测试样品可以包括从来源直接获得的材料,以及使用技术预先处理的材料,这些技术如但不限于过滤、沉淀、稀释、裂解、蒸馏、混合、浓缩、灭活干扰成分、添加试剂等。测试样品可以源自生物来源,如生理流体,包括血液、间质液、唾液、眼睛分泌物、脑脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、阴道分泌物、月经、精液、粪便羊水等。
[0032] 芯吸垫优选与膜液体连通,并且由于垫子的毛细管作用给液体移动提供驱动力。
[0033] 因此,本发明提供了一种检测涉及移植和血液制品灌输的多态性抗原的临床相关抗体的测试装置。受过训练的技师或未受过训练的人员可以容易地使用测试装置,并且优选只需要将样品施加至样品垫上(例如,来自手指戳刺的血液或血样或血清样品),并且此后在观察到分析结果之前,使用者只需要很少或不再需要动作。理想地,应当快速地观察到分析结果,在十分钟或更短时间内。
[0034] 本发明涉及用于检测移植或灌输同种抗原的抗体的快速实验室和重点照护检验方法。同种抗原是物种中以可替换(等位基因)形式存在的抗原,因此包括将一种形式转移至缺少这种形式的物种成员中时的免疫应答;这些的实例包括抗人白血球抗原(HLA)抗体以及针对人血小板抗原(HPA)的血型抗体和红血球抗体。个体在怀孕过程中,或通过输血或血小板灌输或之前的器官移植,可能对同种抗原变得敏感。暴露于HLA同种抗原可以产生抗体应答,该应答可以是免疫球蛋白类别中的任何一种,但通常是IgG、IgM,或很少是IgA。个体中同种抗原的检测在许多临床情况下是重要的,如灌输和移植。测定对HLA等位基因的敏感性的测试与组织和器官移植相关,其中对抗捐赠者的HLA抗原的接受者抗体的存在预示着移植排斥的高险。对移植后抗-HLA抗体的测试也可能是临床相关的,因为抗-HLA抗体的出现或提高可能与移植排斥相关。检测免疫球蛋白的IgG类别是最重要的,因为这个类别对于移植成功是危害最大的,并且因此大部分抗体检测系统依赖于IgG检测。移植领域中的标准实践是相对一组选定来代表人群的HLA抗原来测试所有潜在的接受者,并且测定相对其血清是反应性的HLA等位基因的百分比。该方法是漫长的并且成本高,在一些情况下,获得非常快速的结果是重要的。如果样品未具有HLA抗体,在常规测试中可能就浪费了时间和金钱,因此对快速且廉价的鉴定有害抗体存在的筛选测试存在着需求。此外,血液或血液制品(如全血)或血小板灌输内多态性抗原(如HLA)的存在可能引起接受者灌输相关的急性损伤(TRALI),如果灌输含有抗-HLA抗体;因此,本发明非常适合筛选和鉴定血液制品中的有害抗体。
[0035] 装置可以是简单的量杆,藉此将样品垫插入血清样品或血样样品中。或者,可以进一步包括外壳,在样品垫上具有孔隙,使得可以添加样品,并且在测试区具有窗口,用于观察结果。或者,可以将多重测定结合单个血清或血液收集装置,如通过多重分析物尿液分析装置(如检测滥用药物的尿杯)所证明的。在这最后一个实施方案中,可以预期装置将装有1至50个测试试纸条,每个测试试纸条具有1至50个同种抗原区,允许一次测试高达2,500个单个同种抗原。装置接收器可以接受一定体积的用于分析的试剂,并且同时使特定的量施加至每个单独的测试中。
[0036] 在另一个实施方案中,可以将测试装置整体地与血液制品收集袋一起使用,以产生血液制品的同种抗体状态的视觉指示。
[0037] 根据本发明进一步的方面,提供了一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的方法,该方法包括:
[0038] i)提供一种流通测定装置,其包括与结合垫和芯吸垫液体连通的多孔膜,该多孔膜限定了:
[0039] a)检测区,其中固定了第一种抗体,该抗体被构造成结合在分析物和结合的检测部件之间形成的复合体,以产生检测信号;
[0040] b)对照区,其中固定了第二种抗体,当其包含在对照区内时能够产生对照信号;
[0041] ii)使含有分析物的测试样品接触结合的检测部件;和
[0042] iii)检测所述检测信号。
[0043] 根据本发明进一步的方面,提供了用于检测测试样品中分析物的存在或量的试剂套盒,其包括:
[0044] a)如上所述的装置;
[0045] b)洗涤缓冲液和/或追踪缓冲液;和
[0046] c)检测部件。
[0047] 根据本发明进一步的方面,提供了用于检测测试样品中分析物的存在或量的方法,包括:
[0048] a)将含有分析物的样品接触检测部件;
[0049] b)通过洗涤除去未结合的检测部件和/或其他材料;
[0050] c)提供流通装置,其具有检测区和对照区,检测区内固定了第一种抗体,该抗体被构造成结合在分析物和结合的检测部件之间形成的复合体,以产生检测信号,对照区内固定了第二种抗体,当其包含在对照区内时能够提供对照信号;
[0051] d)使含有分析物的测试样品接触结合的检测部件;和
[0052] e)检测所述检测信号。
[0053] 现在将参照附图来描述本发明的特定实施方案,只是举例说明,其中:
[0054] 图1a和b是根据本发明的侧向流动测定装置的示意图;
[0055] 图2a和b是图1a和b的侧向流动测定装置的示意图;
[0056] 图3显示了根据本发明的量杆测试。
[0057] 图4显示了根据本发明的实施例16的两级测定的结果;和
[0058] 图5显示了根据本发明的实施例17的两级测定的结果。
[0059] 本发明的装置10最低限度包括侧向流动装置或侧向流动量杆,该装置或量杆包括图1中所示的组成部分,即任选的血液分离垫12、芯吸垫14、结合垫16、含有固定的抗原(测试分析物)和对照分析物的有背衬的测试试纸条18,20、22、24分成测试区和对照区以及安置在支持物28上的吸收垫26。可以提供未封装的测试试纸条,作为量杆测试,由此只需要将样品垫浸入分析物中,或者;侧向流动测试装置可以包含在塑料外壳中,外壳使试纸条变得不明显,就显示样品垫、测试区和对照区;在这个实施方案中,通过滴在暴露的样品垫窗口上来施加样品。或者,侧向流动装置中带有多个对不同分析物特异性的侧向流动量杆,并封装在普通的容器中,使得可以对单个样品同时进行多个测试。
[0060] 作为多态性系列的实例来使用HLA抗原,并且本发明涉及用于检测任何同种抗体的侧向流动测试。
[0061] 在第一个实施方案中(如图2中所示的),侧向流动测试用于同时检测和区分针对多态性I类HLA抗原的免疫球蛋白和另一个检测区中的II类抗原。测试装置由任选的血液滤膜、含有移动相标记试剂的结合垫、通常由尼龙或硝基纤维素制得的使施加的样品移动至固定了配体的测试和对照区的有背衬的测试试纸条和吸收用过的样品并促进沿着试纸条芯吸的吸收垫组成。第一个实施方案利用了移动相,其中测试珠子是结合从捐赠者集合通过亲和性纯化的I类HLA抗原的特定颜色的聚苯乙烯珠;将另一种有色珠子,不同于第一种珠子的颜色,结合II类抗原。选择捐赠者的集合,使得集合中代表了大部分常见的HLA抗原。将相同集合的抗原以高浓度涂覆在独立的位置上,形成两条测试线;I类测试区和II类测试区。将测试珠沿着边在结合垫上干燥,对照珠群,优选利用第三种颜色的珠子,覆盖抗生物素蛋白链菌素。对照区由结合血清白蛋白(BSA)的生物素组成。在阳性测试中,将样品施加至样品垫上。使用血液分离滤器,如Vivid血浆分离膜(Pall Ltd),使样品是血液或血清或可能含有抗体的任何其他生物流体;含有抗体的组分穿过血浆分离膜进入结合垫中,由此免疫球蛋白遇到HLA抗原并与其结合。然后测试试纸条的芯吸作用牵引含有样品的珠子、免疫球蛋白和对照珠沿着试纸条移动。随着结合抗体的珠子遇到固定的抗原,珠子/免疫球蛋白复合体将变成固定的。该相是基于IgG和IgM免疫球蛋白对抗原各自具有两个和十个化合价来工作的。因此,在IgG结合的情况下,IgG分子的一个部分结合移动相,而该分子的其他部分结合固定相。在阴性测试的情况下,没有抗原覆盖的珠子固定在测试区。然而,抗生物素蛋白链菌素覆盖的珠子通过生物素配体固定在测试试纸条的远端。利用此来显示所有试剂已经正确地穿过测试区。
[0062] 在第一个实施方案中,测试鉴定了同种抗原集合的抗体的存在或不存在。在第二个实施方案中,单个或多个抗原的各种组合可以用于鉴定抗体的特异性。例如,通过重组生物学方法制得的单个抗原或从细胞膜分裂并通过亲和性纯化的单个抗原或单个捐赠者抗原(一个个体的抗原的综合)可以施加于移动相、测试区或两者中。在这个实施方案中,将单个施加于固定区中,每个区一种同种抗原,而将相同的单个抗原,或相关抗原类别的集合,结合移动区中的珠子。因此,免疫球蛋白结合移动区中的抗原,并且被携带至测试区;阳性测试结果将表示单个抗原的特异性抗体的存在。可以使用多个测试区,每个测试区含有不同的单个抗原或多个抗原。同样,在第三个实施方案中,肽片段可以用于鉴定表位。
[0063] 在第四个实施方案中,测试的独特特征,即,移动抗原和固定抗原之间夹入的样品免疫球蛋白,使得可以在两个位置使用两种不同的抗原并且因此可以检查交叉反应性的免疫学现象。在这个测试中,移动相将展示抗原,例如,A0101,多个固定的测试区将展示一个测试区(最远端的测试区)中的相同抗原和其他测试区中的相关(交叉反应性)抗原,例如,测试区1、2&3可能各自含有A3601、A1101和A0101。该测试的基础是二价IgG分子的每个臂是相同的,但每个单独的臂可以以不同的亲和性或亲合力结合不同同种抗原上的相似表位,本领域技术人员称为交叉反应性。在该测试中,如果抗体于A0101和A3601是交叉反应性的,则二价抗体将珠子与测试区2和3中的抗原结合起来。如果抗体在A0101和A1101之间是反应性的,则结果将在区域2和3显示出阳性反应。这样,可以详细分析同种抗原的特异性,从其获得的信息对于本领域技术人员监控患者在移植或灌输情况下的抗体应答是有临床价值的。
[0064] 因为第一个至第四个实施方案中的测试没有区分免疫球蛋白类别(IgG、IgM等)或同种型(IgG1、IgG2等),因此可以使用第五个实施方案,由此可以使用另外的指示剂来显示抗体存在的类别或同种型。在这个实施方案中,将标记的类别或同种型特异性的抗体,例如,抗-IgG加入结合垫中,或此后加入追踪缓冲液中,由此标记的抗体将特异性地识别测试区中存在的珠子-抗体-抗原复合体的类别或同种型。标记的抗体将需要具有不同于任何标记的抗原或对照的标记,使得可以通过视觉来区分。该标记可以是不同颜色的颗粒或直接标记的荧光标记物,如Cy3或Cy5,或是任何其他通过适当刺激可以视觉观察到的荧光团。
[0065] 可以使用图1中所示的组成部分来构建侧向流动装置。任选的血液分离层系统(acts)是从全血中除去特定物质(特别是、纤维蛋白和细胞材料)的滤器,使含有抗体的级分(血浆)进入下一个相中(芯吸垫)。滤器通常由浸渍pyols的渗透性玻璃纤维构成,pyols使血液成分凝结,防止不溶性成分传送,如美国专利5725774中所述的,典型实例TM使Vivid 血浆分离膜(Pall Ltd)。在不存在血液分离滤器的情况下,通常不推荐将侧向流动装置与全血一起使用。接下来的阶段是样品垫,其起作用将分析物转移至含有结合物的垫子。结合垫通常由玻璃纤维构成,这使得配体-珠子结合物在上面干燥,以这样的方式使得移动分析物阶段到达时,珠子不受玻璃纤维固体支持物的影响,并且分析物、配体-珠子和液体成分转移至吸水性的测试试纸条上。测试试纸条用于将反应物和液体从结合垫区域转移至远端吸收垫,并使这些成分接触试纸条上离散区域中分散的固定试剂(测试和对照区)。试纸条应当由任何可以使试剂以受控方式穿过试纸条的材料制得,受控方式可以使反应物接触测试区和对照区。测试试纸条通常由多孔膜制得,多孔膜由丙烯酸共聚物、醋酸纤维素、硝基纤维素、尼龙、聚醚砜(PES)、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)或聚偏二氟乙烯(PVDF)构成。通常将测试区和对照区喷雾并干燥在1mm宽区域的膜上,对照区通常远离测试区,以确保完全的测试。远端吸收垫可以由任何吸收材料制得,其足以能够吸收加入的总液体体积。装配的试纸条可以和通常的侧向流动测试那样包含在塑料外壳内,或可以没有外壳和“量杆”那样使用,在这种情况下,将近端插入分析物流体中,并使其沿着量杆进行芯吸,以完成测试。
[0066] 参照图3,提出以下实施例,以给本领域普通技术人员提供完整的怎样形成和使用本发明的公开内容和描述,并且不是用来限制发明人所认为的发明的范围,也不是用来表示以下的实验就是所进行的全部的或仅有的实验。已经进行了尝试来确保关于所用数字的精确性,但应当说明一些实验错误和偏差,除非另外指出。
[0067] 对于本发明的工作实施例,构建了三个不同的装置。用于所有测试的测试膜来自Sartorius;UniSart CN140由硝酸纤维素多态性物构成(背面有层压的不能渗透的衬底材料),零件号码1UN14ER050025:装置1含有测试试纸条,测试试纸条含有由I类HLA抗原的集合组成的单个测试区,和由生物素组成的分开的远端对照区;第二个装置由II类HLA抗原的集合和分开的远端对照区组成,该对照区由生物素组成;第三个装置含有两个测试区,由此将I类和II类抗原施加于两个不同的测试区中,远端对照区为生物素。在每个情况下,作为亲和性纯化的人MHC抗原从GTI Inc(Waukesha,WI 53186 USA)购得HLA抗原,并且以0.75mg/ml的浓度来施加I类和II类抗原结合,并且施加的速率使得测试装置接受大约0.5ul/装置。在每种情况下,将来自储液的蛋白质稀释于含有5%(w/v)BSA和20%(w/v)蔗糖的0.01M酸盐缓冲液中。硼酸盐缓冲液是混合的0.8g氯化钠,3.81g Borax(焦硼酸钠)和1升蒸馏水,调节至pH8.5,并在使用前高压灭菌。通过施加2mg/ml的BSA-生物素结合物来构建生物素对照区,速率为传送大约0.5ul/装置。将测试配体和对照划上条TM纹后,将膜风干,然后通过施加来自SurModics,Inc.(Eden Prairie,USA)的Stabilcoat来阻断。
[0068] 对于测试的移动相,将来自GTI Inc的相同I类和II类抗原集合结合Bangs Labs DC02B Dark Blue聚苯乙烯微球体,其具有-COOH活性基团和0.43um的平均直径。用于这的实验方案如下:
[0069] 1.将50ul珠子(10%浓缩物)与1450ul洗涤缓冲液混合。
[0070] 2.在21000-21500g离心4分钟。
[0071] 3.洗涤珠子&重复离心两次,并且重悬浮于洗涤缓冲液中。
[0072] 4.除去上清液并且重悬浮于125ul的洗涤缓冲液中(如果可能,对于该阶段,使用200ul吸液管-通过再一次的温和洗涤作用)。
[0073] 5.在连续旋转下,在35℃下培养两小时。
[0074] 6.加入125ul阻断缓冲液。
[0075] 7.边旋转边培养30分钟。
[0076] 8.按照之前的离心4分钟。
[0077] 9.除去上清液并且重悬浮于750ul洗涤缓冲液中。
[0078] 10.洗涤珠子&重复离心两次,并且重悬浮于洗涤缓冲液中,再次离心,除去上清液,并且重悬浮于250ul贮存缓冲液中。贮存在4℃。
[0079] “洗涤缓冲液”是ph8.5的硼酸盐缓冲液。
[0080] “阻断缓冲液”是使用硼酸盐缓冲液制备的,包含4%BSA w/v。
[0081] “贮存缓冲液”还是基于硼酸盐缓冲液,包含5%BSA和20%蔗糖w/v(+0.01%叠氮化钠作为防腐剂)。
[0082] 将固定相(剥离并阻断的试纸条)装配成量杆:将玻璃纤维结合垫连接在近端,将吸收垫连接在远端。将量杆贮存在环境温度下,直至使用。
[0083] 实施例1至15显示为量杆测试(参见图3),即,没有将测试试纸条密封在标准塑料侧向流动外壳中,然而,可以理解相似的方法和程序可以用于成品中,作为商品用于销售。本领域技术人员将会理解侧向流动制造中所用的试剂浓度,和所用的测试样品的体积可以在任何临床上成功的产品中有所不同。
[0084] 实施例1
[0085] 实施例1是用于比较目的的未经测试的侧向流动量杆。
[0086] 对于图3中显示的实施例2-5,将1ul结合I类的测试珠子和0.5ul 0.32um抗生物素蛋白链菌素珠子CP01B/8891(Bangs Labs)的1%溶液施加于结合垫上。随后,使用Gilson移液管将40ul血清样品(由牛津组织定型实验室,牛津赠送,并且已知含有HLA抗体)施加于结合垫上。用含有1%v/v吐温20的PBS缓冲液来“追踪”样品,通过将40ul追踪缓冲液加入96-孔微量滴定平板的孔中,并将试纸条放入孔中,使得结合垫吸收追踪缓冲液,这使得血清和珠子-结合物垂直沿着试纸条向上,穿过测试线和对照线,并到达吸收垫上。当出现对照线时,在10分钟内完成测试。
[0087] 实施例2-4
[0088] 实施例2-4是未稀释、1/10(在PBS中稀释)和1/50稀释测试的相同抗-B18血清样品。所有样品显示出阳性I类测试线,强度随着样品稀释而变弱。
[0089] 实施例5
[0090] 实施例5是针对DR2和DQ1的II类抗体阳性的样品,因此这对于I类测试线恰好是阴性的。
[0091] 实施例6和7
[0092] 实施例6和7使用在测试区剥离的仅含有II类的试纸条,并且对照区还是生物素。对于图3中所示的实施例6-7,按照之前所述的,使用1ul II类结合的测试珠和0.5ul0.32um抗生物素蛋白链菌素珠子的1%溶液。样品6是I类抗血清,恰好显示为相对II类线是阴性的,而测试7显示了含有II类抗体的血清的成功鉴定。
[0093] 实施例8-15
[0094] 这些实施例利用了含有不同组合的I类和II类抗体的测试试纸条。对于图3中所示的实施例8-15,使用了1ul结合I类和1ul结合II类的测试珠子,和0.5ul 0.32um抗生物素蛋白链菌素珠子的1%溶液。通过第一个位置(d.)的线来证明抗-I类的存在,通过第二个位置(e.)的阳性线来证明II类的抗体。一些测试血清对I类和II类抗体的存在都是阳性的,并且因此显示出两条阳性线,相反,样品15是没有显示出I类或II类抗体的阴性对照样品。
[0095] 两阶段测定
[0096] 用于HLA抗体的侧向流动测定的可替换形式包括两阶段测定,其中在施加于侧向流动装置的反应区之前,将分析物接触HLA配体。这种方法的优势在于可以使抗原接触样品抗体,并且可以在珠子-抗原-免疫球蛋白复合体穿过侧向流动装置之前,除去无关蛋白或其他材料。这种方法还使得可以将测定用于可替换的检测方法中。以下显示了这些中的一些实例。
[0097] 实施例16
[0098] 两阶段测定变化1
[0099] 为了测试两阶段测定,按照所述的实验方案将1类HLA蛋白结合胶乳微粒。将结合的颗粒与对照生物素化的胶乳颗粒1∶1混合。将1ul的珠子混合物加入以下的阳性和阴性测试样品中。
[0100] 1)50ul抗-HLA II类(DRB)单克隆(阴性对照)
[0101] 2)50ul HLA 1类阴性血清(阴性测试)
[0102] 3)50ul PBS吐温中的50ul抗-HLA A2单克隆抗体(阳性测试)
[0103] 4)50ul 抗-1类HLA阳性的血清(阳性测试)
[0104] 通过在14,300rpm下离心5分钟,使每个测试沉淀,并且丢弃上面的上清液。然后将胶乳颗粒重悬浮于50ul PBS吐温中并在测试侧向流动试纸条上运行。这些试纸条上的测试线是鼠抗人IgG,形成用于阳性样品的阳性对照。测试线是抗生物素蛋白链菌素对照线,其结合未结合的珠子,显示测试已经完成。结果显示于图4中。
[0105] 该两阶段测定中的测试线可以是与这种情况下相同的抗-IgG,或者是任何其他类别或同种型特异性的实例,如抗IgM,抗IgG/A/M,抗同种型,如IgG1、2、3或4。
[0106] 实施例17
[0107] 两阶段测定变化2;二价抗原测试
[0108] 将来自实例x的相同血清和单克隆在可替换的试纸条上运行,试纸条在测试线上含有浓缩的HLA蛋白,来替代之前所述的“二价”测试中的抗体。结果显示于图5中。
[0109] 一或两阶段测定的其他变化包括使用第二种抗体的夹层测定;在该实施例中,如果样品含有HLA结合的抗体,将HLA覆盖的珠子接触蛋白样品。然后将珠子-抗体复合体接触并结合分离缓冲液或结合垫中的抗人抗体。这些第二种抗体的实例可以是任何鼠抗人IgG、山羊抗人IgG或鸡抗人IgG。可以使用任何物种的抗人免疫球蛋白,并且同样这些可以是类别或同种型特异性抗体。为了检测珠子-HLA-抗体-第二层复合体,在测试线使用抗-物种抗体;因此如果将鸡抗人用作第二层,测试线将由合适的抗鸡抗体组成,这将固定复合体,产生阳性应答。
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