基于多重PCR的二代测序建库技术 |
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| 申请号 | CN201611145969.3 | 申请日 | 2016-12-13 | 公开(公告)号 | CN106498504A | 公开(公告)日 | 2017-03-15 |
| 申请人 | 上海美迪维康生物科技有限公司; | 发明人 | 王筱恬; 徐峰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 技术领域，特别涉及二代测序文库构建技术。该方案中利用两轮多重PCR来建库。针对每个靶标区域或者靶标位点，设计两条特异性引物，上游的引物OP用于第一轮多重PCR，下游的引物IP用于第二轮多重PCR。将第二轮PCR产物纯化后，进行Q-PCR定量，稀释到合适的浓度用于二代测序。本发明能够有效的缩短Ampliseq 试剂 盒 存在的问题，对于客户定制化的panel设计生产周期只需要两周，并降低单个样本建库的成本，且Ion Torrent和Illumina测序平台都通用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 基于多重PCR的二代测序建库技术技术领域背景技术[0002] 二代测序由于其超高的测序能力在科研和临床中具有极为重要的应用。二代测序技术也称深度测序、大规模平行测序，核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要有Roche/454FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454FLX的测序片段比较长，高质量的读长能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于 99.94％，而在15×覆盖率时的准确度可以达到99.999％。 [0003] Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 [0004] 二代测序的一般流程如下：1)文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将测序接头与片段连接；2) 簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段；3)测序，DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解；4)数据分析，测序得到的原始数据是长度为几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，进一步分析得到有生物学意义的结果。 [0005] 聚合酶链反应(即PCR)是一种广泛运用于分子遗传和诊断的技术，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作是生物体外的特殊DNA复制，可分析任何短的DNA序列，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加，即使样品中只含有低水平的DNA。PCR技术可用于扩增分析用的DNA或RNA选定片段。 [0006] 目前市场上最成功的商业化多重PCR建库技术是Thermo Fisher公司的Ampliseq技术，该技术可以在同一孔反应中完成上千对引物的扩增，使得多个靶标区域的富集可以通过一次PCR反应完成，随后加上Ion Torrent测序平台的通用接头建好文库用于二代测序。然而，这个产品存在最大的缺陷是客户定制化的panel设计生产周期较长，需要两到三个月，严重的增加了时间成本；并且每个样本的建库费用高达1000-2000元，致使其经济成本极高；另外该试剂盒只适用于Ion Torrent测序平台，受平台因素影响大，亦不利于测序费用的降低。 发明内容[0007] 鉴于以上问题，本发明提供了一种基于多重PCR的二代测序建库技术，该技术可以有效的解决Ampliseq试剂盒存在的问题，对于客户定制化的panel设计生产周期只需要两周，并且可以极大的降低单个样本建库的成本，且在IonTorrent和Illumina测序平台都通用。 [0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0009] 本发明中用到了两轮多重PCR来建库。 [0010] 首先针对每个靶标区域或者靶标位点，需要设计两条特异性引物，一条引物在另一条引物的3’下游100-150bp的位置，处于下游的引物在5’端加上二代测序平台通用的测序接头。上游的引物OP用于第一轮多重PCR，下游的引物IP用于第二轮多重PCR。 [0011] 具体的建库过程是： [0012] 步骤1，将样本DNA进行片段化处理，随后每个片段两端加上特殊的接头； [0013] 步骤2，加入第一轮扩增的上游引物混合池，与特殊接头互补的通用引物，配制成PCR总体系，进行第一轮扩增； [0014] 步骤3，将第一轮PCR产物纯化后，加入第二轮扩增的下游引物混合池，与第二步中使用过的特殊接头互补的通用引物配制成PCR总体系，进行第二轮扩增； [0015] 步骤4，将第二轮PCR产物纯化后，配置反应总体系，进行Q-PCR定量，稀释到合适的浓度，即可用于二代测序。 [0016] 上述技术方案中，作为优选，步骤2中，第一轮特异性引物是普通的PCR扩增引物，共20个左右的碱基，Tm值设定在60℃，序列根据目标区域设计得到，多个引物混成一个OP引物池做为第一轮PCR的上游引物。PCR总体系为：2倍PCR Mix 35uL，10umol/L P7 1uL，1umol/L OP 1uL或0.5umol/L OP 2uL，DNA 25uL。 [0017] 上述技术方案中，作为优选，步骤3中，第二轮特异性引物是普通的PCR扩增引物，在其5’端加上测序接头5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80个左右的碱基，其中根据目标区域设计得到的序列长度是20个碱基左右，Tm值设定在60℃，多个引物混成一个IP引物池做为第二轮PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3’。PCR总体系为：2倍PCR Mix 15uL，10umol/L P7 1uL，1umol/L OP 1uL或0.5umol/L OP 2uL，DNA 5uL，NFW 5uL。 [0018] 上述技术方案中，作为优选，所述步骤4中的PCR总体系10uL具体为：VAHTS SYBR qPCR Master Mix 5uL，qPCR Primer Mix 1uL，DNA 2uL，ROXReference Dye 2 0.2uL，NFW 5uL。 [0019] 上述技术方案中，作为优选，所述的第一轮PCR扩增循环数目为10-14。 [0020] 上述技术方案中，作为优选，所述的第二轮PCR扩增循环数目为10-14。 [0021] 本发明的优点和有益效果在于：提供一种基于多重PCR的二代测序建库技术。在二代测序过程中采用该技术则不需要再购买商业的建库试剂盒，所有反应试剂都可以单独购买组合，极大的降低了实验成本。另外由于在PCR过程中固定了一端的通用引物，极大的降低了多重PCR反应体系中的引物种类和数量，可以有效的抑制非特异性扩增和引物之间的相互干扰，也降低了不同引物间的扩增效率的差异。附图说明 [0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0023] 图1为两轮多重PCR的二代测序建库过程。 [0024] 图2为10个样本100 SNPs平均覆盖深度。 具体实施方式[0025] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。 [0026] 实施例1.基因组DNA片段化 [0028] b.转移总量为1ug的基因组DNA到0.2mL的离心管中，用Nuclease Free Water(以下称NFW)补足到100uL，震荡混匀，短时离心。 [0029] c.将0.2mL的离心管装入超声破碎仪的适配器，旋紧中轴，插入顶盖，闭合机器，设定打断程序：振幅-25％，on&off为20s-30秒，时长15分钟。开始打断。 [0030] d.打断结束后，取出0.2mL离心管，按照顺序排列整齐，开盖。 [0031] 实施例2. 3in 1接头连接 [0032] a.配置反应体系22uL，先配置去除DNA之外的试剂，按照理论值的125％配，震荡混匀，短时离心，分装到96孔板中，每孔加7uL，之后从前面0.2mL离心管中转移15uL的DNA到每孔中，盖上盖子。震荡混匀，短时离心。 [0033] [0034] b.96孔板或八联管放入PCR仪。设定程序：25℃30分钟、72℃15分钟、4℃保持。 [0035] c.结束后，每孔中加入0.5uL的T4 Ligase(单枪)和1uL的Adapter，盖上新的盖子。震荡混匀，短时离心。室温下孵育20-30分钟。 [0036] d.磁珠震荡30秒，充分混匀后，每一孔中加入25uL的磁珠，盖上新盖子。震荡混匀，短时离心。室温下孵育5分钟。 [0037] e.将96孔板或八联管放上磁力架，等待2分钟，溶液澄清后，吸弃上清。 [0038] f.每孔加入100uL 80％乙醇，静置30秒，吸弃上清。重复一遍。短时离心，吸弃上清。 [0039] g.晾干3-5分钟，观察磁珠表面不再潮湿反光，成雾面状，可离开磁力架，每孔加入30uL NFW，吹打混匀重悬磁珠，室温孵育1分钟。 [0040] h.孔板再次放上磁力架，等待2分钟，溶液澄清后，转移上清到新的孔板中。 [0041] 实施例3.多重PCR [0042] 一、第一轮多重PCR [0043] a.按照Qubit dsDNA HS Assay Kit操作手册检测样品浓度，根据Qubit检测的样本浓度，每个样品取同样的量(10ng)，每5～10个样本混合在一起转移到新的孔板中。 [0044] b.第一轮特异性引物是普通的PCR扩增引物，共20个左右的碱基，Tm值设定在60℃，序列根据目标区域设计得到，多个引物混成一个OP引物池做为第一轮PCR的上游引物。配置PCR总体系,按照理论值的125％配，震荡混匀，短时离心。 [0045] [0046] c.孔板放入PCR仪中，选择MAPlex-1st程序运行2个小时。 [0047] 二、PCR产物纯化 [0048] a.PCR结束后，取下孔板，打开盖子，每孔加入60uL的磁珠，吹打混匀，室温下孵育5分钟。 [0049] b.将孔板或八联管放上磁力架，等待2分钟，溶液澄清后，吸弃上清。 [0050] c.每孔加入100uL 80％乙醇，静置30秒，吸弃上清。重复一遍。 [0051] d.晾干3-5分钟，观察磁珠表面不再潮湿反光，成雾面状，可离开磁力架，每孔加入20uL NFW，吹打混匀重悬磁珠，室温孵育1分钟。 [0052] e.孔板再次放上磁力架，等待2分钟，溶液澄清后，转移上清到新的孔板中。 [0053] 三、第二轮多重PCR [0054] a.第二轮特异性引物是普通的PCR扩增引物，在其5’端加上测序接头5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80个左右的碱基，其中根据目标区域设计得到的序列长度是20个碱基左右，Tm值设定在60℃，多个引物混成一个IP引物池做为第二轮PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’。配置PCR总体系，按照理论值的125％配制，震荡混匀，短时离心。 [0055] [0056] b.孔板放入PCR仪中，选择MAPlex-2nd程序运行2个小时。 [0057] 四、PCR产物纯化 [0058] 步骤同二，做两次纯化，彻底去除引物二聚体。第一次使用28uL的磁珠纯化，用20uL的NFW洗脱；第二次用20uL的磁珠纯化，用25uL的NFW洗脱。 [0059] 五、电泳鉴定 [0060] 每个样品取5uL，进行2.5％的琼脂糖电泳，观察是否有条带，以及条带长度是否在300-400bp之间。 [0061] 实施例5.文库定量与混合 [0062] a.将标准品、荧光定量试剂、引物从-20℃取出放置于冰上融化。 [0063] b.样品稀释10000倍，分两次梯度稀释。第一次取文库原液2uL，加入198uL的NFW，振荡混匀或者用枪吹打混匀，短时离心。再从中取出10uL，加入990uL NFW，振荡混匀或者用枪吹打混匀，短时离心。 [0064] c.配置反应体系10uL，,按照理论值的125％配，震荡混匀，短时离心。 [0065] [0066] d.打开ABI7500荧光定量PCR仪，放入样品，开始检测。检测结束，根据检测结果将所有样品稀释到同样浓度，使终浓度不小于2.5nmol/L，体积不小于30uL，再等量混合后，送出测序。 [0067] e.实验结果如图2所示，MAPlex custom panel中包含100个SNPs，基因组DNA起始量是250ng，通过MAPlex方法建库，HiSeq2500测序平台PE 2*150测序，单个样本取100Mb数据，上靶率93％，平均深度为321×，92％的位点测序深度在20×以上，可重复性100％。 |
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