有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细胞的融合蛋白 |
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| 申请号 | CN201380033060.7 | 申请日 | 2013-04-26 | 公开(公告)号 | CN104520444B | 公开(公告)日 | 2017-12-12 |
| 申请人 | 瓦西尼斯公司; | 发明人 | E·S·史密斯; T·潘迪纳; L·A·克罗伊; M·帕里斯; M·佐德勒; A·莫克萨; R·柯克; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及在真核细胞中表达免疫球蛋白分子的高效方法。本发明进一步涉及生产用于在真核细胞中表达的免疫球蛋白重链和轻链文库的方法，特别是使用三分子重组方法。本发明进一步提供了选择和筛选 抗原 特异性免疫球蛋白分子及其抗原特异性 片段 的方法。本发明还提供了用于生产、筛选和选择抗原特异性免疫球蛋白分子的 试剂 盒 。最后，本发明提供了通过本文中提供的方法产生的免疫球蛋白分子及其抗原特异性片段。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白重链可变区或其抗原结合片段的方法，包括： |
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| 说明书全文 | 有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细胞的融合蛋白 [0001] 相关申请的交叉参考 [0002] 本申请要求2012年4月26日提交的美国临时申请No.61/639,046，2012年12月3日提交的美国临时申请No.61/732,776和2013年3月15日提交的美国非临时申请No.13/844,388的优先权权益，在此各申请的全部内容按引用并入。 [0004] 随本文提交的ASCII文本文件(名称：“1843_071PC02_SequenceListing_ascii.txt”；大小：30,863字节；以及生成日期：2013年4月25日)中电子提交的序列表的内容全部按引用并入本文。 [0005] 发明背景发明领域 [0006] 本发明涉及在牛痘病毒颗粒(例如，EEV病毒粒)和/或宿主细胞上表达免疫球蛋白分子的高效方法、生产用于在牛痘病毒颗粒(例如，EEV病毒粒)和/或真核细胞中表达的免疫球蛋白重链和轻链文库的方法、分离结合特定抗原的免疫球蛋白的方法和通过这些方法中的任一种产生的免疫球蛋白。本发明还涉及用于在牛痘病毒颗粒(例如，EEV病毒粒)或宿主细胞上表达免疫球蛋白分子的融合蛋白。 [0007] 相关领域 [0008] 免疫球蛋白产生 [0009] 具有限定的特异性的抗体正用于数量日益增加的多种多样治疗应用中。多种方法已经用于获得对于人的治疗用途有用的抗体。这些包括嵌合抗体和人源化抗体，以及选自文库(例如，噬菌体展示文库)或来自转基因动物的完全人抗体。可以从天然或特意免疫的个体的抗体生产细胞得到在噬菌体中构建的免疫球蛋白文库，并且原则上可以包括新的和多样的人免疫球蛋白重链和轻链配对。尽管这种策略没有受到内在抗体谱(repertoire)的限制，但它需要在细菌细胞中合成所表达的免疫球蛋白片段的互补决定区(CDR)并正确折叠。然而，许多抗原结合区域难以在细菌细胞中正确装配成融合蛋白。此外，蛋白质将不会经历正常的真核生物的翻译后修饰。因此，这种方法对可以获得的抗体特异性强加了不同的选择性过滤。或者，可以在真核系统中从文库(例如，酵母展示、逆转录病毒展示或DNA病毒(如，痘病毒)中的表达)分离完全人抗体。参见，例如，美国专利No.7,858,559，将其全部按引用并入本文中。 [0011] 然而，在本发明中，已经研发了各种淘选和基于磁珠的方法来筛选牛痘-MAb病毒粒的文库，以选择编码特定抗体的重组病毒。在哺乳动物细胞感染时，抗体不仅结合至新产生的病毒中，其还在宿主细胞表面上展示。这实现了有效的选择策略：其结合了在无细胞淘选系统中选择牛痘-MAb病毒粒接着对高特异性的基于细胞的筛选和抗体优化的益处。 [0012] 这不同于该领域中表达单一scFV但不表达文库的其他技术。此外，设计了其他技术来重新指引通过scFv的牛痘感染以用于基因治疗并且没有用于抗体发现。另外，本发明的技术通过使用EEV而不是IMV及通过使用不同的融合蛋白(例如，A56R)而不同于之前的技术。 [0013] 发明概述 [0014] 在特定的方面中，本公开内容涉及融合蛋白，其包含(a)包含重链CH1结构域的第一多肽区段和(b)包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。 [0015] 在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含第三多肽区段，其包含免疫球蛋白重链可变区或其片段。在另一个实施方案中，牛痘EEV-特异性膜蛋白是A56R。 [0016] 在特定的方面中，本公开内容涉及编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含(a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段和(b)包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。在特定的实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸，其编码来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的氨基酸108至314。在特定的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:11的氨基酸215至421。在特定的实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸，其编码SEQ ID NO:11的氨基酸215至421。 [0017] 在特定的方面中，本公开内容涉及包含编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含(a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段和(b)包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。 [0018] 在特定的方面中，本公开内容涉及包含编码融合蛋白的多核苷酸的重组牛痘病毒，所述融合蛋白包含(a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段和(b)包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。在另一个方面中，本公开内容涉及重组牛痘病毒感染的宿主细胞。 [0019] 在另一个方面中，本公开内容涉及重组牛痘文库，其包含在编码多个免疫球蛋白融合多肽的牛痘病毒载体中构建的第一多核苷酸文库，其中牛痘病毒载体包含(a)编码包含重链CH1结构域的第一多肽区段的第一多核苷酸，(b)编码包含位于CH1结构域下游的牛痘病毒EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段的第二多核苷酸，和(c)编码位于CH1结构域上游的免疫球蛋白重链可变区或其片段的第三多核苷酸。在一个实施方案中，第一文库进一步包含用于促进EEV表面上的融合多肽表达的信号肽。在另一个实施方案中，EEV特异性膜蛋白是A56R。在另一个实施方案中，牛痘EEV特异性膜蛋白是A56R。在另一个实施方案中，第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的胞外结构域或其一部分。在另一个实施方案中，第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的胞内结构域或其一部分。在特定的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸，其对应于来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的多肽序列氨基酸108至314。在特定的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸215至421。在特定的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸215至421，其是来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的多肽序列氨基酸108至314。 [0020] 在另一个方面中，本公开内容涉及用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白重链可变区或其抗原结合片段的多核苷酸的方法，包括：(a)将权利要求13至18任一项的编码免疫球蛋白融合蛋白的第一文库引入允许牛痘病毒感染的宿主细胞群体中；(b)将一个或多个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸引入宿主细胞群体中，其中免疫球蛋白融合蛋白能够与免疫球蛋白轻链结合以形成免疫球蛋白分子的抗原结合结构域；(c)允许胞外包膜病毒(EEV)从宿主细胞释放；(d)从上清液收集释放的EEV；(e)将释放的EEV接触抗原；和(f)回收第一文库的多核苷酸，其编码在EEV的膜表面上表达的并且是抗原特异性的免疫球蛋白融合多肽。 [0021] 在一个实施方案中，对于用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白重链可变区或其抗原结合片段的多核苷酸的方法，其进一步包括：(g)将(f)中回收的多核苷酸引入允许牛痘病毒感染的第二宿主细胞群体中；(h)将一个或多个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸引入宿主细胞群体中；(i)允许胞外包膜病毒(EEV)从宿主细胞释放；(j)从上清液收集释放的EEV；(k)将释放的EEV接触抗原；和(l)回收第一文库的多核苷酸，其编码在EEV的膜表面上表达的并且是抗原特异性的免疫球蛋白融合多肽。 [0022] 在特定的实施方案中，将步骤(g)-(l)重复一次或多次，由此富集第一文库的编码作为特异性结合抗原的免疫球蛋白融合多肽的部分的免疫球蛋白重链可变区或其抗原特异性片段的多核苷酸。 [0023] 在特定的实施方案中，分离从第一文库回收的多核苷酸。 [0024] 在另一个方面中，本公开内容涉及一种用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法，其包括：(a)将第一文库引入允许牛痘病毒感染的宿主细胞群体中；(b)将第二文库引入宿主细胞群体中，其中在第二文库中，包含多个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸，其中免疫球蛋白融合多肽能够结合免疫球蛋白轻链以形成免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段；(c)允许从宿主细胞表达免疫球蛋白融合多肽；(d)从宿主细胞收集免疫球蛋白融合多肽；(e)将收集的免疫融合多肽与抗原接触；和(f)回收第一文库的多核苷酸，其编码对于抗原特异性的免疫球蛋白融合多肽。 [0025] 在一个实施方案中，用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法进一步包括：(g)将(f)中回收的多核苷酸引入允许牛痘病毒感染的第二宿主细胞群体中；(h)将第二多核苷酸文库引入第二宿主细胞群体中；(i)允许从宿主细胞表达免疫球蛋白融合多肽；(j)从宿主细胞收集免疫球蛋白融合多肽；(k)将收集的免疫球蛋白融合多肽与抗原接触；和(l)回收第一文库的多核苷酸，其编码对于抗原特异性的免疫球蛋白融合多肽。 [0026] 在特定的实施方案中，将步骤(g)-(l)重复一次或多次，由此富集第一文库的编码作为特异性结合抗原的免疫球蛋白融合多肽的部分的免疫球蛋白重链可变区或其抗原特异性片段的多核苷酸。 [0027] 在一个实施方案中，用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法进一步包括分离从第一文库回收的第三多核苷酸。 [0029] 图1.显示了pJEM1质粒元件及其各自的序列(SEQ ID NO:1)。 [0030] 图2.显示了使用重组牛痘病毒进行文库选择的一般策略的说明。 [0031] 图3A-C.显示了与野生型(WT)感染细胞(A)相比，用表达H2124-A56R+L517(B)或2408-A56R-scFv(C)的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的C35染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0032] 图4A-B.显示了使用C35/抗-Vac HRP(A)和C35/抗-Fab(B)，含有C35特异性融合蛋白(标记的“A56R EEV”)、对照(“L517+G7000-A56R EEV”)和标准膜结合IgG1形式的C35特异性抗体的EEV的ELISA结合结果。 [0033] 图5A-D.显示了2小时(A)和过夜(B)后C35结合以及2小时(C)和过夜(D)后VEGF结合的噬斑试验平板结果。 [0034] 图6.显示了CD100抗体选择策略的说明。 [0035] 图7.显示了CD100克隆C20的VH序列(SEQ ID NO:19)和通过重组牛痘文库选择鉴定的相同VH克隆的比对。 [0036] 图8.显示了具有轻链L48、L116和L9021的Her2.3.2和Her2.3.3选择的流式细胞术C35和Her2染色结果。 [0037] 图9.显示了Her2抗体选择策略的说明。 [0038] 图10.显示了对于Her2.3.2和Her2.3.3选择的C35+抗-His和Her2+抗-His的流式细胞分析结果。 [0039] 图11.显示了Her2克隆B10的VH序列(SEQ ID NO:20)和通过重组牛痘文库选择鉴定的相同VH克隆的比对。 [0040] 图12.显示了“Fab”、“TR”和“IgG-γ重链”构建体的图解。 [0041] 图13.显示了用表达8000-Fab L8000的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0042] 图14.显示了表达(A)8000-IgG L8000和(B)8000-TR L8000的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0043] 图15.显示了表达(A)H2124-IgG和(B)H2124-TRL517的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0044] 图16.显示了CD100 Lib 10.3 FLOW分析的对照。表达(A)2368和(B)8000的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0045] 图17.显示了甲苯磺酰基(Tosyl)选择的CD100 Lib 10.3 FLOW分析的结果。表达(A)L223、(B)L151和(C)L9021的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0046] 图18.显示了甲苯磺酰基选择的CD100 Lib 10.3 FLOW分析的结果。表达(A)L48、(B)L7110和(C)L122的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0047] 图19.显示了甲苯磺酰基选择的CD100 Lib 10.3 FLOW分析的结果。表达(A)L116、(B)L214和(C)L3-1的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0048] 图20.显示了ProG选择的CD100 Lib 10.3 FLOW分析的结果。表达(A)L223、(B)L151和(C)L9021的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0049] 图21.显示了ProG选择的CD100 Lib 10.3 FLOW分析的结果。表达(A)L48、(B)L7110和(C)L122的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0050] 图22.显示了ProG选择的CD100 Lib 10.3 FLOW分析的结果。表达(A)L116、(B)L214和(C)L3-1的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0051] 图23.显示了CD100 Lib 10.3/L3-1 FLOW分析的对照。表达(A)8000和(B)2368的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的前复合物(Precomplex)Her2染色、2步CD100染色和前复合物CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0052] 图24.显示了CD100 Lib 10.3Tosyl/L3-1 FLOW分析的结果。表达(A)CD100 Lib 10.3预分选的甲苯磺酰基选择的和(B)CD100 Lib 10.3分选的甲苯磺酰基选择的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的前复合物Her2染色、2步CD100染色和前复合物CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0053] 图25.显示了CD100 Lib 10.3ProtG/L3-1 FLOW分析的结果。表达(A)CD100 Lib 10.3预分选的ProtG选择的和(B)CD 100Lib 10.3分选的ProtG选择的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的前复合物Her2染色、2步CD100染色和前复合物CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0054] 图26.显示了流式细胞分析结果，显示出mAb 2050、2063和2110的对Juekat细胞(CD100+)和BxPC3细胞上的CD100的特异性。 [0055] 图27.显示了与阳性对照和阴性对照相比，用三种CD100特异性抗体(Mab2050、MabC2063和MabC2110)的(A)huCD100-His涂覆的和(B)Hemoglobin涂覆的平板的ELISA结果。 [0056] 图28.显示了用于在牛痘展示方法后鉴定特定的Ig-H/Ig-L的示意图。 [0057] 图29.表达Her2特异性克隆(A)D5、(B)D8和(C)H2的EEV重组牛痘感染的HeLa细胞的C35和Her2染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据。 [0058] 图30.显示了三种Her2特异性抗体(Mab8287、Mab8290和Mab9298)的ELISA结果。 [0059] 图31.显示了流式细胞分析结果，显示出Mab8289、Mab8293和Mab8297的对SKBR3细胞(Her2+++)上Her2的特异性。 [0060] 发明详述 [0061] 本发明宽泛地涉及在胞外包膜牛痘病毒(EEV)的表面上展示的真核系统中鉴定和/或生产作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体的功能性抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段(即，抗原结合片段)的方法。此外，本发明涉及从编码此类作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体的免疫球蛋白分子或片段的多核苷酸的复合表达文库中鉴定编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法，其中文库在胞外包膜牛痘病毒(EEV)的表面上展示的真核系统中构建和筛选。进一步的实施方案包括融合蛋白，其包含(a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段，(b)包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)-特异性膜蛋白的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段。在进一步的实施方案中，本文中公开的融合蛋白可以包含结合分子，例如，免疫球蛋白的抗原特异性部分或其部分，例如，重链可变区，其在与合适的免疫球蛋白轻链配对时结合目标抗原。 [0062] 本发明的一个方面是在胞外包膜牛痘病毒(EEV)的表面上展示的真核系统中构建复合免疫球蛋白文库，其作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体。 [0063] 应注意术语“一个(a)”或“一个”实体是指一个或多个所述实体；例如，“一免疫球蛋白分子”理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。同样，术语“一(a)”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。 [0064] 术语“真核细胞”或“真核生物体”意图包含动物界、植物界和原生生物界的所有生物体，包括原生生物、真菌、酵母、绿藻、单细胞植物、多细胞植物和所有动物(脊椎动物和无脊椎动物)。该术语没有包含细菌或病毒。“真核细胞”意图包含单数的“真核细胞”以及复数的“真核细胞”，并且包含源自真核生物的细胞。 [0065] 术语“脊椎动物”意图包含单数的“脊椎动物”以及复数的“脊椎动物”，并且包含哺乳动物和鸟类，以及鱼类、爬行动物和两栖动物。 [0066] 术语“哺乳动物”意图包含单数的“哺乳动物”和复数的“哺乳动物”，并且包括，但不限于人灵长类，如猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食物动物，如奶牛、猪和绵羊；有蹄动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；以及熊。在特定的实施方案中，哺乳动物是人类受试者。 [0067] 术语“组织培养物”或“细胞培养物”或“培养物”或“培养”是指植物或动物组织或细胞在允许保持细胞构造、保持细胞功能、进一步分化或所有这三者的条件下在体外的维持或生长。“原代组织细胞”是直接从组织获取的那些，即，在生物体中执行相同功能的相同种类的细胞群体。例如，用蛋白水解酶胰蛋白酶处理这些组织细胞将它们分离成单个的原代组织细胞，其在接种于培养平板上时生长或维持细胞构造。 [0068] 术语“多核苷酸”是指存在于核酸或构建体中的任何一个或多个核酸区段或核酸分子，例如，DNA或RNA片段。“编码免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸”是指包含此种多肽的编码区的多核苷酸。此外，多核苷酸可以编码调控元件，如启动子或转录终止子，或可以编码多肽或蛋白质的特定元件，如分泌信号肽或功能性结构域。 [0069] 如本文中所用的，术语“鉴定”是指其中从多个所需分子(例如，编码具有所需特异性或功能的免疫球蛋白分子的多核苷酸)或所需分子文库区分出此类分子的方法。鉴定方法可以包括“选择”和“筛选”。如本文中所用的，“选择”方法是其中所需分子可以从文库直接分离的那些。例如，在本文中所述的一种选择方法中，通过经受细胞溶解事件并且由此从其余宿主细胞连接的基质释放而使包含所需多核苷酸的宿主细胞与包含文库其余部分的宿主细胞直接分离。如本文中所用的，“筛选”方法是其中将包含所需分子的池经历其中可以检测所需分子的试验的那些方法。然后将其中分子被检测的池的等份试样连续分成同样进行分析的较小池，直至获得所需分子高度富集的池。 [0070] 免疫球蛋白。如本文中所用的，“免疫球蛋白分子”定义为完整的双分子免疫球蛋白，即，通常包含四个“亚基多肽”，即两个相同的重链和两个相同的轻链。在一些情况中，例如，源自骆驼科(camelid)物种的或基于骆驼免疫球蛋白工程化的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以只由重链组成，没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature 363:446-448(1993)。因此，“免疫球蛋白亚基多肽”表示单重链多肽或单轻链多肽。免疫球蛋白分子还称为“抗体”，并且该术语在本文中可以互换使用。“分离的免疫球蛋白”是指基本上从蛋白质和其他物质的环境中移除并且结合特定抗原的一个免疫球蛋白分子或者两个或更多个免疫球蛋白分子。 [0071] 决定免疫球蛋白分子“类别”的重链是较大的两个亚基多肽，并且包含可变区和恒定区。“重链”表示全长分泌的重链形式，即从细胞释放的形式，或膜结合重链形式，即包含跨膜结构域，例如，与包含EEV-特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体。免疫球蛋白“类别”是指在宿主中起不同功能的免疫球蛋白的大组。例如，人免疫球蛋白分成五类，即，IgG，包含γ重链；IgM，包含μ重链；IgA，包含α重链；IgE，包含ε重链；和IgD，包含δ重链。 [0072] “轻链”表示与重链氨基端区域结合的较小的免疫球蛋白亚基。与重链一样，轻链包含可变区和恒定区。存在两种不同类型的轻链，κ和λ，并且它们中的一对可以与各种重链中的任意一对结合以形成免疫球蛋白分子。 [0073] 免疫球蛋白亚基多肽通常包含恒定区和可变区。在大部分物种中，重链可变区或VH结构域和轻链可变区或VL结构域组合以形成“互补决定区”或CDR，这是免疫球蛋白分子特异性识别抗原表位的部分。通过导致形成编码给定可变区的基因的一系列种系DNA区段的重排，在动物中抗体产生细胞分化时产生了与重链和轻链恒定区结合的可变区的大集合。重链和轻链可变区的更多变异通过分化细胞中的体细胞突变来发生。免疫学领域的普通技术人员能充分理解免疫球蛋白分子的结构和体内形成。免疫球蛋白多样性产生的简要综述可以在例如Harlow和Lane，Antibodies,A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)(下文中称为“Harlow”)；和Roitt等，Immunology(免疫学)Gower Medical Publishing,Ltd.,London(1985)(下文中称为“Roitt”)中找到。将Harlow和Roitt全部按引用并入本文中。 [0074] 如本文中所用的，免疫球蛋白分子的“抗原特异性片段”是保持结合抗原能力的免疫球蛋白分子的任何片段或变体。抗原特异性片段包括，但不限于，Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链免疫球蛋白(例如，其中重链或其部分和轻链或其部分融合)、二硫化物连接的Fv(sdFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、scFv微抗体(minibody)、Fab微抗体和二聚scFv以及任何包含其构象使得形成特定CDR的VL和VH结构域的其他片段。 [0075] 抗原特异性免疫球蛋白片段可以包含单独的或者与完整的或部分恒定区(例如，重链上的CH1、CH2、CH3结构域，和轻链恒定结构域，例如，轻链上的Cκ或Cλ结构域，或其部分)结合的可变区。在特定的方面中，如本文中公开的融合蛋白包含与CH1恒定结构域融合的重链可变结构域，所述CH1恒定结构域与包含EEV特异性膜蛋白(例如，A56R)的跨膜结构域的多肽区段融合。 [0076] 在特定的实施方案中，本发明涉及鉴定(即，选择或可选地筛选)单独地或共同地编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法。在特定的实施方案中，提供了选择具有目标抗原特异性的免疫球蛋白分子的方法，其中免疫球蛋白或抗体在EEV表面上展示，分离EEV，并且分离编码免疫球蛋白的一部分(例如，VH区)的多核苷酸。 [0077] 在特定的方面中，提供了选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子的多核苷酸的方法，其中该方法包括：(1)将第一多核苷酸文库引入允许牛痘病毒感染的宿主细胞群体中。该文库可以在编码多个免疫球蛋白融合多肽的牛痘病毒载体(例如，EEV载体)中构建，其中牛痘病毒载体包含(a)编码包含人重链CH1结构域(例如，CH1-γ结构域)的第一多肽区段的第一多核苷酸，(b)编码包含牛痘膜蛋白的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段(例如，包含EEV-特异性膜蛋白例如，A56R的跨膜结构域的多肽区段)的第二多核苷酸，和(c)编码免疫球蛋白重链可变区或其片段的第三多核苷酸。该方法进一步包括(2)将编码轻链(例如，已知轻链)的多核苷酸或包含各自编码免疫球蛋白轻链的多个多核苷酸的第二文库引入宿主细胞群体中。一旦被引入宿主细胞群体中，免疫球蛋白融合多肽可以结合免疫球蛋白轻链以形成免疫球蛋白分子的抗原结合部分，其中该分子可以在可选择颗粒(例如，通过宿主细胞产生并释放至周围介质中的EEV病毒粒)的表面上表达或“展示”。该方法进一步用于选择从宿主细胞释放的结合目标抗原的EEV，例如，通过与平板或珠(例如，蛋白G珠、抗生物素蛋白链菌素珠或甲苯磺酰化珠)的抗原特异性连接。然后可以回收表达目标抗原结合结构域的EEV，并且用于重新感染新的宿主细胞，由此富集含有编码结合目标抗原的免疫球蛋白重链的多核苷酸的EEV。然后可以回收该多核苷酸。可以重复该方法，由此富集编码目标重链融合蛋白的多核苷酸。 [0078] 然后可以将分离的编码结合目标抗原的免疫球蛋白重链多肽融合蛋白的多核苷酸转移至宿主细胞中并在其中表达(作为EEV融合蛋白或不作为EEV融合蛋白)，其中编码与包含EEV-特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段融合的免疫球蛋白轻链可变区的多核苷酸的文库从而允许鉴定编码轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区在结合第一步中鉴定的重链可变区时，形成功能性免疫球蛋白分子或其识别特定的抗原的片段。 [0079] 如本文中所用的，“文库”是代表性多核苷酸类属(genus)，即通过例如其来自单一动物物种、组织类型、器官或细胞类型的来源相关的一组多核苷酸，其中文库总体地包含在给定多核苷酸类属内的至少两个不同种类。多核苷酸文库可以包含给定多核苷酸类属内的至少10、100、103、104、105、106、107、108或109个不同种类。所述类属可以是相关分子，例如，免疫球蛋白可变区，例如，人免疫球蛋白VH结构域或VL结构域。VH和VL结构域可以表示可变结构域的整个集合，或可以早已是抗原特异性的，例如，对相同抗原特异性的。更具体地，文库可以编码多个免疫球蛋白亚基多肽，即，重链亚基多肽或轻链亚基多肽。在这一情况中，“文库”可以包含共同类属的多核苷酸，所述类属是编码特定类型和类别的免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸，例如，文库可以编码人μ、γ-1、γ-2、γ-3、γ-4、α-1、α-2、ε或δ重链，或人κ或λ轻链。尽管任一个文库的各个成员可以编码相同的重链或轻链恒定区，但文库总体地可以包含至少两个，或至少10、100、103、104、105、106、107、108或109个不同的可变区，即与共同的恒定区结合的“多个”可变区。 [0080] 在其他实施方案中，文库可以编码多个免疫球蛋白单链片段，其包含可变区，如轻链可变区或重链可变区，或可以同时包含轻链可变区和重链可变区。 [0081] 在一个方面中，本文提供了生产编码免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸文库的方法。进一步提供了在真核表达载体(例如，EEV)中构建为融合蛋白的免疫球蛋白亚基多肽的文库，其中免疫球蛋白亚基多肽与包含EEV-特异性膜蛋白(例如，A56R)的跨膜结构域的多肽区段融合。 [0082] “受体细胞”或“宿主细胞”或“细胞”表示其中引入了如本文中所述的多核苷酸文库的细胞或细胞群体。用于本文中所述文库的合适宿主细胞是允许牛痘病毒感染的真核细胞。合适的细胞系可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物、小鼠、灵长类动物或人细胞或细胞系。 [0083] “宿主细胞群体”表示其中可以引入和表达如本文中提供的“文库”的一组培养的细胞。用于本文中所述的EEV文库的宿主细胞可以允许牛痘病毒感染。本发明的宿主细胞可以是粘附的，即粘附于固体基质生长的宿主细胞，或可选地，宿主可以是悬浮的。 [0084] 如上所述，鉴定免疫球蛋白分子的特定方法包括将“第一”多核苷酸文库(编码例如VH-CH1-A56R融合蛋白)引入宿主细胞群体中，以及将“第二”多核苷酸文库(例如，编码VL区)引入相同的宿主细胞群体中。第一和第二文库是互补的，即如果“第一”文库编码免疫球蛋白重链可变结构域，那么“第二”文库将编码免疫球蛋白轻链可变结构域，由此允许免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段在宿主细胞群体中装配，使得免疫球蛋白在EEV表面上表达或展示。 [0085] 本文中所述文库中包含的多核苷酸可以通过“与转录控制区可操作地关联”来编码免疫球蛋白亚基多肽。在将给定多核苷酸中的一个或多个核酸分子置于功能关系中时，它们是“可操作地关联的”。这种关系可以是以允许在合适的分子(例如，转录激活子蛋白、聚合酶等)结合于调控序列时编码区表达的方式连接的多肽的编码区和调控序列之间的关系。“转录控制区”包括，但不限于启动子、增强子、操纵子和转录终止信号，并且与多核苷酸包括在一起以指导其转录。例如，如果启动子能够影响编码免疫球蛋白亚基多肽的核酸分子的转录，则启动子与该核酸分子可操作地关联。通常，“可操作地关联”表示DNA序列在多核苷酸中是连续的或紧密连接的。然而，一些转录控制区，例如，增强子，不必须是连续的。 [0086] “控制序列”或“控制区”表示在特定的宿主生物体中可操作在关联的编码序列表达所需要的DNA序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷化化信号和/或增强子。 [0087] 各种转录控制区是本领域技术人员已知的。如以下更详细讨论的，合适的转录控制区包括能够在痘病毒感染的细胞的细胞质中起作用的启动子。 [0088] 在特定的实施方案中，如本文中所述的融合蛋白可以包含连接物，例如，连接免疫球蛋白可变结构域与恒定结构域，例如，CH1、C-κ或C-λ结构域，和/或连接恒定结构域与包含EEV-特异性膜蛋白(例如，A56R)的跨膜结构域的多肽区段。连接物可以包含，例如，至少约5、至少约10或至少约15个氨基酸。合适的连接物可以由本领域普通技术人员来确定。 [0089] 在本文中所述的融合蛋白包含重链恒定区(例如，CH1结构域)的情况中，可以利用任何重链恒定区，包括，但不限于来自脊椎动物如鸟类、鱼或哺乳动物的免疫球蛋白重链，例如，人免疫球蛋白重链。例如，人免疫球蛋白重链或其部分，例如，CH1结构域，可以是μ重链或其片段(即，IgM免疫球蛋白的重链)，γ-1重链或其片段(即，IgG1免疫球蛋白的重链)，γ-2重链或其片段(即，IgG2免疫球蛋白的重链)，γ-3重链或其片段(即，IgG3免疫球蛋白的重链)，γ-4重链或其片段(即，IgG4免疫球蛋白的重链)，α-1重链或其片段(即，IgA1免疫球蛋白的重链)，α-2重链或其片段(即，IgA2免疫球蛋白的重链)，ε重链或其片段(即，IgE免疫球蛋白的重链)，或δ重链或其片段(即，IgD免疫球蛋白的重链)。 [0090] 如本文中所述的膜结合融合蛋白可以通过与重链多肽融合的跨膜结构域锚定于颗粒，例如，牛痘病毒颗粒(或病毒粒)，例如，EEV颗粒(或病毒粒)的表面上。在特定的实施方案中，跨膜结构域是包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的部分，即，在胞外包膜牛痘病毒的表面上表达但不在胞内牛痘病毒颗粒上表达的蛋白。在特定的实施方案中，EEV特异性膜蛋白是A56R，牛痘HA蛋白。“胞内结构域”、“细胞质结构域”、“细胞溶质区”或相关术语在本文中可互换使用，表示在细胞内部的融合多肽的部分。 [0091] 在其中融合蛋白或其他文库蛋白包含免疫球蛋白轻链或其片段的那些实施方案中，可以使用来自任何动物物种的任何免疫球蛋白轻链，例如，来自脊椎动物如鸟类、鱼或哺乳动物的免疫球蛋白轻链，例如，人轻链，例如，人κ和λ轻链。轻链可以与重链结合以产生免疫球蛋白分子的抗原结合蛋白。 [0092] 如本文中所述的编码重链融合蛋白的多核苷酸文库的每个成员可以包含(a)编码包含文库所有成员共有的免疫球蛋白恒定区(例如，CH1结构域，例如，γ或μCH1结构域)的第一多肽区段的第一核酸分子，(b)编码包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)特异性膜蛋白(例如，A56R)的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段的第二核酸分子，其中第二核酸分子在第一核酸分子直接下游并且与第一核酸分子同框(直接融合或通过连接物连接)，和(c)编码包含免疫球蛋白重链可变区的第三多肽区段的第三核酸分子，其中第三核酸分子在第一核酸分子直接上游并且与第一核酸分子同框(直接融合或通过连接物连接)。 [0093] 如本文中所述的编码轻链融合蛋白的多核苷酸文库的每个成员可以包含(a)编码包含文库所有成员共有的免疫球蛋白恒定区(例如，C-κ或C-λ结构域)的第一多肽区段的第一核酸分子，(b)编码包含牛痘胞外包膜病毒(EEV)特异性膜蛋白(例如，A56R)的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段的第二核酸分子，其中第二核酸分子在第一核酸分子直接下游并且与第一核酸分子同框(直接融合或通过连接物连接)，和(c)编码包含免疫球蛋白轻链可变区的第三多肽区段的第三核酸分子，其中第三核酸分子在第一核酸分子直接上游并且与第一核酸分子同框(直接融合或通过连接物连接)。 [0094] 没有与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段融合的免疫球蛋白重链或轻链的文库可以用于共同感染宿主细胞以提供“互补的”免疫球蛋白链，从而产生功能性抗原结合免疫球蛋白片段。这样的文库详细描述于例如美国专利No.7,858,559中。 [0095] 编码重链或轻链可变区的多核苷酸文库可以含有多个(即，至少两个，或至少10、100、103、104、105、106、107、108或109个)不同的可变区。如本领域普通技术人员公知的，轻链可变区由重排的核酸分子编码，其各自包含轻链VL区(具体是Vκ区或Vλ区)以及轻链J区(具体是Jκ区或Jλ区)。相似地，重链可变区由重排的核酸分子编码，其各自包含重链VH区、D区和J区。这些重排在细胞分化时在DNA水平上发生。例如，可以通过PCR从成熟B细胞和浆细胞(其最终分化来表达对特定表位具有特异性的抗体)得到编码重链和轻链可变区的核酸分子。此外，如果需要针对特定抗原的抗体，可以从已经用所述抗原免疫的动物的成熟B细胞和浆细胞分离可变区，并且由此产生与抗原相互作用的抗体可变区的扩增的集合。或者，如果需要更多样性的文库，可以从前体细胞(例如，前-B细胞和未成熟B细胞)分离可变区，所述前体细胞已经经历了免疫球蛋白基因的重排，但没有暴露于抗原(自体抗原或非自体抗原)。例如，可以通过RT-PCR从多名捐献者汇合的正常人骨髓分离可变区。或者，可变区可以是合成的，例如，在实验室中通过产生合成寡核苷酸来制得，或可以通过导致免疫球蛋白基因重排的种系DNA的体外操作来得到。 [0096] 除了分别编码免疫球蛋白恒定区和可变区的第一和第二核酸分子以外，如上所述的本发明的多核苷酸文库的每个成员可以进一步包含在编码可变区的核酸分子的直接上游并且与其同框的编码信号肽的另外的核酸分子。 [0097] “信号肽”表示例如指引新生的免疫球蛋白多肽亚基转运至宿主细胞表面的多肽序列。信号肽在本领域中也称为“信号序列”、“前导序列”、“分泌信号肽”或“分泌信号序列”。信号肽通常作为完整或“未成熟”多肽的部分来表达，并且通常位于N-末端。 [0098] 所有细胞(包括本发明的宿主细胞)具有组成型分泌途径，其中蛋白质(包括预定用于输出的分泌的免疫球蛋白亚基多肽)从细胞分泌。这些蛋白经过期号可发生修饰的ER-高尔基体加工途径。如果在蛋白质上没有检测到进一步的信号，其被指引至细胞表面用于分泌或作为宿主细胞或病毒颗粒(例如，EEV病毒粒)表面上表达的组成膜成分插入。免疫球蛋白亚基多肽的膜结合形式最初遵循与分泌形式相同的途径，经过ER内腔，除了它们通过停止-转移信号或“跨膜结构域”的存在而保留在ER膜中。跨膜结构域是约20个氨基酸残基的疏水性延伸，其跨越膜时采用α-螺旋构象。膜包埋蛋白锚定在质膜的磷脂双层中。与分泌蛋白一样，跨膜蛋白的N-末端区具有信号肽，其通过膜并且在出离到ER内腔中时切割。 [0099] 新合成的免疫球蛋白重链通过称为BiP的伴侣蛋白(Hsp70分子伴侣家族的成员)保持滞留在ER中。重链CH1结构域与其伴体轻链的CL结构域的配对诱导BiP的解离、最终的折叠和二硫键形成，以及装配的抗体从ER输出。然后抗体利用细胞的正常分泌途径，并且通过高尔基体输送至细胞表面，在此处分泌或保留在表面上(如果抗体具有跨膜结构域)。参见Daniel等，Molecular Cell 34:635-36(2009)。 [0100] 本文中提供的合适信号肽可以是天然产生的免疫球蛋白信号肽，即，由作为天然产生的重链或轻链转录物的部分的序列编码的，或者是保留指引与其可操作地关联的免疫球蛋白亚基多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。或者，可以使用异源信号肽或其功能性衍生物。在特定的方面中，信号肽可以是牛痘病毒A56R蛋白的信号肽或其功能性衍生物。 [0101] 在其他方面中，本文中所述的多核苷酸文库的成员可以进一步包含编码异源多肽的另外的核酸分子。这样的编码异源多肽的另外的核酸分子可以在编码免疫球蛋白可变结构域或恒定结构域或者EEV特异性膜蛋白的核酸分子的上游或下游。 [0102] 由另外的核酸分子编码的异源多肽可以是拯救序列。拯救序列是可以用于纯化或分离免疫球蛋白或其片段的序列或者编码其的多核苷酸。因此，例如，肽拯救序列包括用于Ni亲和柱的纯化序列，如6-His标签，以及用于检测、免疫沉淀或FACS(荧光激活细胞分选)的表位标签。合适的表位标签包括myc(用于商业购得的9E10抗体)、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列、flu标签、LacZ和GST。另外的核酸分子也可以编码肽连接物。 [0103] 本文中所述的各种文库中包含的多核苷酸可以引入合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞的特征可以在于例如能够表达与其表面连接的免疫球蛋白分子或是允许牛痘病毒感染。可以通过本领域普通技术人员公知的方法将多核苷酸引入宿主细胞中。在多核苷酸是病毒载体(例如，牛痘病毒)的部分的情况中，可以通过标准感染方便地引入宿主细胞中。 [0104] 可以以任何顺序或同时将第一和第二多核苷酸文库引入宿主细胞中。例如，如果在牛痘病毒载体(无论是传染性的或灭活的)中构建第一和第二多核苷酸文库两者，该载体可以作为混合物通过同时感染来引入，或可以以连续的感染来引入。如果在牛痘病毒载体中构建一个文库，而另一个在质粒载体中构建，则可以通过在另一个文库之前引入一个文库来进行引入。 [0105] 将第一和第二多核苷酸文库引入宿主细胞中后，允许EEV表面上的免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的表达发生。“允许表达”意思是允许已经引入宿主细胞中的载体经受免疫球蛋白亚基多肽的转录和翻译，允许宿主细胞将完全装配的免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体转运至膜表面。通常，允许表达需要在允许表达的合适条件下孵育其中已经引入多核苷酸的宿主细胞。允许表达所需的那些条件和时间将根据宿主细胞的选择和载体的选择而改变，如本领域普通技术人员公知的。 [0106] 在特定的实施方案中，然后将已经允许表达在其表面上的免疫球蛋白分子或分泌至细胞介质中的可溶性免疫球蛋白分子的宿主细胞和/或牛痘病毒粒接触抗原。如本文中所用的，“抗原”是可以特异性结合抗体、免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的任何分子。“特异性结合”表示抗原结合抗体的CDR。与CDR特异性地相互作用的抗原部分是“表位”或“抗原决定簇”。抗原可以包含单一表位，但通常，抗原包含至少两个表位，并且可以包含任何数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。 [0107] 抗原通常是肽或多肽，但可以是任何分子或化合物。例如，有机化合物(例如，二硝基酚或DNP)、核酸、碳水化合物或任何这些化合物的混合物(具有或不具有肽或多肽)可以是合适的抗原。据认为肽或多肽表位的最小尺寸为约四个至五个氨基酸。肽或多肽表位可以含有至少七个、至少九个，或至少约15至约30个氨基酸。由于CDR可以识别其三级形式的抗原性肽或多肽，因此构成表位的氨基酸不需要是邻接的，并且在一些情况中，甚至可以不是在同一肽链上。在本发明中，肽或多肽抗原可以含有至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25以及约15至约30个氨基酸的序列。在特定的实施方案中，包含抗原表位或由其组成的肽或多肽长度是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸残基。抗原可以是任何形式的，并且可以是游离的，例如溶解于溶液中，或可以连接于任何基质。本文中公开了合适的基质。在特定的实施方案中，抗原可以是抗原表达牛痘病毒的部分，例如，以下更详细描述的EEV病毒粒。 [0108] 可以根据本文中公开的方法来产生对于任一抗原特异性的免疫球蛋白分子。在特定的实施方案中，抗原是“自体”抗原，即源自所产生的免疫球蛋白分子的相同物种的抗原。例如，可能希望产生针对人肿瘤抗原的人抗体。其他所需的“自体”抗原包括，但不限于，细胞因子、受体、配体、糖蛋白和激素。 [0109] 也可以通过公开的方法来鉴定和选择针对传染剂上的抗原的抗体。这样的抗原的实例包括，但不限于，细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原和真菌抗原。 [0110] 在其中免疫球蛋白分子在EEV表面上表达的特定选择和筛选方案中，按照所述产生的重组EEV病毒粒通过将允许抗原(其特异性地识别EEV表面上表达的免疫球蛋白分子的CDR)结合CDR的方法来“接触”抗原，由此允许特异性结合抗原的重组EEV病毒粒与不结合抗原的那些EEV病毒粒区分开来。包括允许表达抗体的抗原特异性结合结构域的重组EEV病毒粒与抗原相互作用的任何方法。例如，如果EEV病毒粒在悬浮液中，并且抗原连接于固体基质，那么特异性结合抗原的重组EEV病毒粒将被捕获在固体基质上，从而允许不结合抗原的那些病毒粒被洗掉，并且随后回收结合的重组EEV病毒粒。本文中公开了允许重组EEV病毒粒接触抗原的方法。 [0111] 回收特异性结合抗原的重组EEV病毒粒后，可以从那些EEV病毒粒回收第一文库的多核苷酸。“回收”表示将所需的成分与不需要的那些成分粗略地分离。例如，可以基于它们与抗原涂覆的固体基质(例如为磁珠)的连接来“回收”结合抗原的重组EEV病毒粒，其随后可以用磁体来分离。 [0112] 可以通过本领域普通技术人员已知的任何标准方法来完成多核苷酸的回收。在特定的实施方案中，通过收获结合抗原的传染性EEV病毒粒来回收多核苷酸。 [0113] 如本领域普通技术人员容易认识到的，编码免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸的鉴定需要两轮或更多轮的如上所述的选择，且必然需要两轮或更多轮的如上所述的筛选。单轮选择不一定导致编码所需第一免疫球蛋白融合多肽的纯的多核苷酸集合的分离；第一轮后获得的混合物可以对于所需的多核苷酸是富集的，但可能还有非靶标插入序列的污染。因此，按照所述的第一选择步骤可以或必须重复一次或多次，由此富集编码所需免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸。为了重复这个实施方案的第一步骤，包含按照以上所述回收的那些多核苷酸的EEV可以经由感染引入宿主细胞群体中。第二多核苷酸文库也引入这些宿主细胞中，例如，通过用能够表达由文库中的多核苷酸编码的互补免疫球蛋白分子(例如，轻链)的牛痘病毒感染，并且允许在重组EEV病毒粒的膜表面上表达免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段。类似地重组EEV病毒粒与抗原接触，并且再次从EEV病毒粒(其表达特异性结合抗原的免疫球蛋白分子)回收第一文库的多核苷酸。这些步骤可以重复一次或多次，从而导致源自第一文库的多核苷酸的富集，所述多核苷酸编码作为特异性结合抗原和/或具有所需功能性特征的免疫球蛋白或其抗原特异性片段的部分的免疫球蛋白融合多肽。 [0114] 从上述第一文库适当地富集所需多核苷酸后，已经回收的那些多核苷酸是“分离的”，即，它们实质从其天然环境移除并且大部分与文库中不编码抗原特异性免疫球蛋白多肽的多核苷酸分离。例如，载体中所含的克隆多核苷酸被认为是分离的。将理解通过本文中所述的方法可以回收两种或更多种不同的免疫球蛋白融合多肽(其与例如轻链结合时特异性地结合相同的抗原)。因此，编码结合相同抗原的多肽的多核苷酸的混合物也被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的更多实例包括保持在异源宿主细胞、重组牛痘(例如，EEV病毒粒)的那些或在溶液中的纯化(部分或基本上)的DNA分子。然而，对于本发明的目的，作为混合文库的成员并且没有与文库的其他克隆分离(例如，通过编码抗原特异性免疫球蛋白融合多肽)的克隆中所含的多核苷酸不是“分离的”。例如，在已经回收并且任选噬斑纯化后，病毒载体中所含的多核苷酸是“分离的”。 [0115] 鉴于抗原可以包含两个或更多个表位，并且几种不同的免疫球蛋白分子可以结合任何给定的表位，设想可以从这个实施方案的第一步回收几种合适的多核苷酸，例如，两种、三种、四种、五种、十种、100种或更多种多核苷酸，其全部可以编码免疫球蛋白融合多肽，该免疫球蛋白融合多肽在与由预选的多核苷酸或第二文库的多核苷酸编码的合适免疫球蛋白亚基多肽结合时将形成能够特异性地结合目标抗原的免疫球蛋白分子或其抗原结合片段。设想单独地分离从第一文库回收的每种不同的多核苷酸。 [0116] 一旦从分离了来自第一文库的一种或多种合适的多核苷酸，在这个实施方案的第二步骤中，在第二文库中鉴定一种或多种多核苷酸，其编码能够与从第一文库分离的多核苷酸编码的免疫球蛋白融合多肽结合以形成特异性结合目标抗原的免疫球蛋白分子或其抗原结合片段的免疫球蛋白亚基多肽。 [0117] 本文中提供了用于抗原结合分子表达的牛痘病毒载体，其中抗原结合分子，例如，免疫球蛋白重链可变区和CH1，作为与EEV特异性膜蛋白的融合体来表达。在特定的实施方案中，作为EEV融合蛋白来回收重链，并且轻链文库或单个预选择轻链可以在牛痘病毒或其他载体(例如，质粒载体)中作为可溶性蛋白来表达。 [0118] 在特定的实施方案中，可以用4’-氨基甲基-氧补骨脂素(补骨脂素)并且随后将病毒载体暴露于紫外(UV)光来进行表达可溶性互补链(例如，轻链)的病毒的灭活。病毒的补骨脂素和UV灭活是本领域普通技术人员公知的。参见，例如，Tsung，K.等，J.Virol.70:165-171(1996)，将其全部按引用并入本文中。 [0119] 在真核细胞中从编码免疫球蛋白亚基多肽(其中一个亚基作为与EEV特异性膜蛋白的融合体来表达)的两个多核苷酸文库装配和表达免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的能力提供了优于在细菌系统中生产单链抗体的方法的显著进步，因为两步选择方法可以是用于选择具有各种特异性的免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的基础。 [0120] 牛痘EEV载体。痘病毒在DNA病毒中是独特的，因为它们只在宿主细胞的细胞质中，在细胞核外复制。在其复制周期中，牛痘病毒产生外膜存在不同的四种感染性形式：胞内成熟病毒粒(IMV)、胞内包膜病毒粒(IEV)、细胞相关包膜病毒粒(CEV)和胞外包膜病毒粒(EEV)。普遍的观点是IMV由单一脂蛋白膜组成，而CEV和EEV都是由两个膜层包围，且IEV具有三个包膜。EEV从宿主细胞的质膜脱落，并且EEV膜源自转运-高尔基体。 [0121] 感染后，病毒丧失其膜，并且DNA/蛋白质核心沿着微管转运至细胞中。由早期牛痘mRNA(“早期”定义为DNA复制前)编码的蛋白质导致牛痘核心的脱壳以及随后的DNA复制。这种复制发生在所谓的“病毒工厂”中，其主要位于ER的顶部。在病毒工厂内，未成熟的病毒粒(IV)装配并且加工以形成IMV(胞内成熟病毒)。IMV含有源自ER的膜。大部分的IMV通过细胞裂解从细胞释放。一些IMV在微管上转运至由转运高尔基体网络或早期核内体包裹的位点。IMV颗粒被双重膜包裹形成了称为IEV(胞内薄膜病毒)的牛痘病毒形式。然后IEV在微管上转运至细胞表面。外层IEV膜与质膜融合以在细胞表面暴露CEV(细胞相关包膜病毒)。来自宿主细胞的肌动蛋白聚合可以驱动CEV感染邻近的细胞，或病毒可以作为EEV释放。参见，例如，Kim L.Roberts和Geoffrey L.Smith。Trends in Microbiology 16(10):472-479(2008)；Geoffrey L.Smith.等，Journal of General Virology 83:2915-2931(2002)。 [0122] 至少六种病毒编码的蛋白质已经报道为EEV包膜的组分。其中，四种蛋白质(A33R、A34R、A56R和B5R)是糖蛋白，一种(A36R)是非糖基化跨膜蛋白，和一种(F13L)是棕榈酰化外周膜蛋白。参见，例如，Lorenzo等，Journal of Virology 74(22):10535(2000)。在感染过程中，这些蛋白质定位至高尔基体复合物，它们在此处并入传染性病毒中，然后传染性病毒转运并释放至胞外介质中。如本文中提供的，免疫球蛋白融合多肽(例如，可变重链)，例如，作为与EEV特异性膜蛋白(例如，A56R)的融合蛋白，结合EEV膜。 [0123] 如本文中提供的EEV融合蛋白可以在任何合适的牛痘病毒中表达。在特定的实施方案中，可以将编码EEV融合蛋白的DNA插入牛痘病毒基因组中对于生长和载体的复制非必需的区域中，使得产生传染性病毒。尽管已经表征了牛痘病毒基因组的多种非必需区域，但最广泛使用的用于外源基因插入的基因座是胸苷激酶基因座，位于基因组中的HindIII J片段中。 [0124] 将编码免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸的文库插入牛痘病毒载体中形成与转录控制区的可操作的关联，所述转录控制区在痘病毒感染的细胞的胞质中起作用。 [0125] 痘病毒转录控制区包含启动子和转录终止信号。痘病毒中的基因表达受到时间调控，并且用于早期、中期和晚期基因的启动子具有不同的结构。特定的痘病毒基因组成型地表达，并且用于这些“早期-晚期”基因的启动子带有杂合结构。合成的早期-晚期启动子也已经开发。参见Hammond J.M.等，J.Virol.Methods 66:135-8(1997)；Charkrabarti S.等，Biotechniques 23:1094-7(1997)。对于本文中公开的实施方案，可以使用任何痘病毒启动子，但基于选定的宿主细胞和/或选择方案，使用早期、晚期或组成型启动子可能是理想的。在特定的实施方案中，使用组成型启动子。用于本文中所述方法中的合适启动子是早期/晚期7.5-kD启动子，或早期/晚期H5启动子(或其变体)。 [0126] 三-分子重组方法。传统上，痘病毒载体，如牛痘病毒，尚未用于从复合文库鉴定之前未知的目标基因，因为对于牛痘不存在构建和筛选文库的高效率、高效价的产生方法。牛痘病毒中异源蛋白表达的标准方法涉及体内同源重组和体外直接接合。使用同源重组，重组病毒的产生效率在大约0.1％或更低的范围中。尽管使用直接接合的重组病毒产生效率较高，但所得到的效价相对低。因此，对于蛋白质表达和疫苗研发的目的，牛痘病毒载体的使用限于之前分离的DNA的克隆。 [0127] 如Zauderer，PCT公开No.WO00/028016和美国专利No.7,858,559中公开的三-分子重组是一种用于在牛痘病毒中产生文库的高效率、高效价产生方法。使用三-分子重组方法，本发明人已经实现了以至少90％的效率和高于通过直接接合获得的效价至少2个数量级的效价来产生重组病毒。 [0128] 在特定的实施方案中，如本文中所述的能够表达免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸的文库可以通过三-分子重组在痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体)中构建。 [0129] 在特定的实施方案中，提供了用于产生融合多肽文库的转移质粒，其包含通过与牛痘病毒H5启动子可操作地关联编码免疫球蛋白重链CH1和牛痘病毒A56R蛋白的至少跨膜部分的多核苷酸。示例性载体是pJEM1，其包含序列： [0130] [0131] -H5启动子 [0132] 单下划线-前导肽 [0133] -代表性重链可变区 [0134] -IgG CH1结构域 [0135] 无下划线-牛痘病毒A56R [0136] 粗斜体-BssHII和BstEII可变基因克隆位点 [0137] 其在本文中称为SEQ ID NO:1。各种不同的PCR扩增的重链可变区可以同框地插入唯一的BssHII和BstEII位点中，其是以上用粗斜体表示的。 [0138] 质粒pJEM1是美国专利No.7,858,559中所述的p7.5/tk的衍生物。pJEM1保留与牛痘基因组同源的侧翼区域，其使得能够如美国专利No.7,858,559中所述的进行重组。然而，替代p7.5/tk中的表达盒(启动子和表达的序列)，pJEM1含有以下元件： [0139] 牛痘病毒H5启动子 [0140] 前导肽 [0141] 用于克隆可变重链的5’BssHII克隆位点 [0142] 重链可变区 [0143] 用于克隆可变重链的3’BstEII克隆位点 [0144] IgG CH1结构域 [0145] 牛痘病毒A56R [0146] 这些元件列于图1和SEQ ID NO：1中。这一盒可以通过合成形成。 [0147] 在另一个实施方案中，本发明的包含通过与牛痘病毒p7.5启动子可操作地关联编码免疫球蛋白κ轻链多肽的多核苷酸的转移质粒是pVKE，其包含序列： [0148] GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCCCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTTGACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGTCGAC [0149] 其在本文中称为SEQ ID NO：2。PCR-扩增的κ轻链可变区可以同框地插入唯一的ApaLI)和XhoI位点中，其是以上用粗体表示的。 [0150] 此外，在其中希望在如上所述的选择第一文库的多核苷酸的过程中在质粒载体中具有第二文库的多核苷酸的那些实施方案中，可以使用pVKE。 [0151] 在另一个实施方案中，本发明的包含通过与牛痘病毒p7.5启动子可操作地关联编码免疫球蛋白λ轻链多肽的多核苷酸的转移质粒是pVLE，其包含序列： [0152]GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCCCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGC TTGACTCGAG ACCGTCCTACGAACTGTGGCTGCACCATCTG TCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGTCGAC[0153] 其在本文中称为SEQ ID NO：3。PCR-扩增的λ轻链可变区可以同框地插入唯一的ApaLI和HindIII位点中，其是以上用粗体表示的。 [0154] 此外，在其中希望在如上所述选择第一文库的多核苷酸的过程中在质粒载体中具有第二文库的多核苷酸的那些实施方案中，可以使用pVLE。 [0155] 除非另外指出，本发明的实施将使用常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的技术，其在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有详细的解释。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第2版，Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Sambrook等编辑，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning(DNA克隆)，卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonu cleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编辑， 1984)；Mullis等，美国专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；Transcription And Translation(转录和翻译)(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；Culture of Animal Cells(动物细胞的培养)(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(固定化细胞和酶)(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆实用指导)(1984)；论文，Methods In Enzymology(酶学方法)(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology(酶学方法)，第154和155卷，(Wu等编辑),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)(Mayer和Walker编辑，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986)；Manipulating the Mouse Embryo(操纵小鼠胚胎)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y., 1986)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)。 [0156] 抗体工程的一般原理列于Antibody Engineering(抗体工程)，第2版，C.A.K.Borrebaeck编辑，Oxford Univ.Press(1995)中。蛋白质工程的一般原理列于Protein Engineering,A Practical Approach(蛋白质工程化，实用方法)，Rickwood,D.等编辑，IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.(1995)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理列于：Nisonoff,A.,Molecular Immunology(分子免疫学)，第2版，Sinauer Associates,Sunderland,MA(1984)和Steward,M.W.,Antibodies,Their Structure and Function(抗体，其结构和功能)，Chapman and Hall，New York，NY(1984)中。此外，本领域已知的并且没有特意描述的免疫学中的标准方法通常遵循Current Protocols in Immunology(免疫学中的通用实验方案)，John Wiley&Sons,New York；Stites等(编辑)，Basic and Clinical–Immunology(基础和临床-免疫学)(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)以及Mishell和Shiigi(编辑)，Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学中的选定方法)，W.H.Freeman and Co.,New York(1980)。 [0157] 给出免疫学一般原理的标准参考著作包括Current Protocols in Immunology(免疫学通用实验方案)，John Wiley&Sons,New York；Klein,J.,Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(免疫学：自体-非自体辨别的科学),John Wiley&Sons,New York(1982)；Kennett,R.等编辑，Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(单克隆抗体，杂交瘤：生物分析中的新维度)，Plenum Press，New York(1980)；Campbell,A.,"Monoclonal Antibody Technology"(单克隆抗体技术)，在Burden,R.等编辑，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物学中的实验室技术)中，第13卷，Elsevere，Amsterdam(1984)。实施例 [0158] 实施例1 [0159] CH1-A56R融合蛋白的制备 [0160] 构建重链融合蛋白以帮助重组牛痘病毒细胞表面上表达的特定免疫球蛋白区段的选择。 [0161] 通过以下方法构建了编码融合蛋白的表达载体，所述融合蛋白包含与来自Western Reserve牛痘病毒的A56R的胞外和跨膜结构域融合的人Cγ的重链CH1结构域(在本文中称为CH1-A56R)以及C35-特异性VH(H2124)。 [0162] pJEM1。构建了包含编码人γ免疫球蛋白恒定区(CH1)、牛痘A56R的片段和用于人重链可变区(例如，H2124)插入的盒的多核苷酸序列的表达载体，在本文中称为“pJEM1”。简而言之，通过以下方法，将按照PCT公开No.WO00/028016(将其全部按引用并入本文中)中所述产生的p7.5/tk转化成pJEM1。 [0163] IgG CH1。使用获自Clontech，Palo Alto，CA的SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒，从骨髓RNA分离编码IgG重链的cDNA。使用5’引物huCγ1-5B：ATTAGGATCC GGTCACCGTC TCCTCAGCC 3'(SEQ ID NO:4)和3’引物huCγ1-3S：5'ATTAGTCGAC TCATTTACCC GGAGACAGGG AGAG 3'(SEQ ID NO:5)进行PCR。PCR产物包含以下元件：BamHI-BstEII-(编码VH的氨基酸111-113的核苷酸)-(编码Cγ1的氨基酸114-478的核苷酸)-TGA-SalI。将该产物在BamHI和SalI位点亚克隆至pBluescirptII/KS中，并且通过定点诱变除去对应于Cγ1的CH1结构域内的氨基酸191和192的第二BstEII位点而不改变氨基酸序列。用BstEII和SalI消化质粒pBluescirptII/KS，并且将约1Kb的较小DNA片段凝胶纯化。然后将该较小片段用作PCR反应中的模板，所述PCR反应使用正向引物CHl(F)-5'-CAAGGGACCCT GTCTCCTCAGCCTCC-3'(SEQ ID NO:6)(斜体和下划线的是BstEII限制性位点)和反向引物CH1(R)5'-AACTTTCTTGTCC ACCTTGGTGTTG-3'(SEQ ID NO:7)。将所得到的约320个碱基对的PCR产物凝胶纯化。 [0164] 全长IgG。使用获自Clontech，Palo Alto，CA的SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒从骨髓RNA分离编码人IgG重链的cDNA。使用5’引物huCγ1-5B：(SEQ ID NO:4)和3’引物huCγ1-3S：(SEQ ID NO:5)进行PCR。PCR产物包含以下元件：BamHI-BstEII-(编码VH的氨基酸111- 113的核苷酸)-(编码Cγ1的氨基酸114-478的核苷酸)-TGA-SalI。将该产物在BamHI和SalI位点处亚克隆至pBluescirptII/KS中，并且通过定点诱变除去对应于Cγ1的CH1结构域内的氨基酸191和192的第二BstEII位点而不改变氨基酸序列。用BstEII和SalI消化质粒pBluescirptII/KS，并且将对应于全长IgG1的933个碱基对的DNA片段凝胶纯化。 [0165] A56R(较长形式)。使用正向引物A56R(F)5'-CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTACATCAACTACAAATGAC ACTGATAG-3'(SEQ ID NO:8)和反向引物A56R(R)5'-TATACCTAGACTTTGTTCTCTGTTTTGTATTTACG-3'(SEQ ID NO:9)(斜体和下划线的是SalI限制性位点)从分离的Western Reserve牛痘病毒DNA扩增编码来自牛痘病毒(Western Reserve)的A56R血凝素(hemmagglutinin)蛋白的氨基酸108至314的DNA片段，该蛋白包含柄、跨膜和胞内结构域(Genbank登录号No.YP_233063)。将所得到的约660个碱基对的PCR产物凝胶纯化。 [0166] A 5 6 R ( 较 短 形 式 ) 。使 用 正 向 引 物 A 5 6 R ( F 2 ) ：5 ' -CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTACCACCGATGATGCGGAT CTTTATGA-3'(SEQ ID NO:21)和反向引物A56R(R)(SEQ ID NO:9)从分离的Western Reserve牛痘病毒DNA扩增编码来自牛痘病毒(Western Reserve)的A56R血凝素蛋白的氨基酸240至314的DNA片段，该蛋白包含柄、跨膜和胞内结构域(Genbank登录号No.YP_233063)。将所得到的约263个碱基对的PCR产物凝胶纯化。 [0167] Fab构建体(具有A56R较长形式的IgG CH1)。320和660-碱基对的片段然后使用用于5’产物的正向引物CH1(F)(SEQ ID NO:6)和反向引物CH1(R2)：5'-ACAAAAGTATTGGTAATCGTGTCATAACTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTG-3'(SEQ ID NO:22)及用于3’产物的与A56R(R)(SEQ ID NO:9)组合的A56R(F)(SEQ ID NO:8)通过SOE PCR结合。这两个产物然后结合以产生约980个碱基对的融合片段。用BstEII和SalI消化这一片段，并且将所得到的934-碱基对的片段凝胶纯化。 [0168] TR构建体(具有A56R较短形式的全长IgG1)。使用用于5’产物的正向引物CH1(F)( S E Q I D N O : 6 ) 和 反 向 引 物 A 5 6 R ( R 2 ) ：5 ' -TCATAAAGATCCGCATCATCGGTGGTTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3'(SEQ ID NO:23)及用于3’产物 的 与 A5 6R (R) ：(SE Q I D N O : 9) 组 合的 A 56 R (F 3) ：5 '-GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAACCACCGATGATGCGGATCTTTATGA-3'(SEQ ID NO:24)。这两个产物然后结合以产生约1256个碱基对的融合片段。用BstEII和SalI消化这一片段，并且将所得到的1235-碱基对的片段凝胶纯化。 [0169] FL构建体(具有A56R较长形式的全长IgG1)。993和660-碱基对片段使用用于5’产物的正向引物CH1(F) ：(SEQ ID NO:6)和反向引物A56R(R3)：5 '-TATCAGTGTCATTTGTAGTTGATGTTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3'(SEQ ID NO:25)及用于3’产物 的 与 A 5 6 R ( R ) ( S E Q I D N O : 9 ) 组 合 的 A 5 6 R ( F 4 ) : 5 '-GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAACATCAACTACAAATGACACTGATA-3'(SEQ ID NO:26)通过SOE PCR结合。这两个产物然后结合以产生约1653-碱基对的融合片段。用BstEII和SalI消化这一片段，并且将所得到的1632-碱基对的片段凝胶纯化。 [0170] 质粒p7.5/tk也用BstEII和SalI消化，并且将较大的约5.7Kb的所得片段凝胶纯化。然后将这两个BstEII/SalI片段连接以产生pJEM1质粒。 [0171] pJEM1保留与牛痘病毒基因组同源的侧翼序列，这使得能够重组。然而，替代p7.5/tk中的表达盒(启动子和表达的序列)，pJEM1含有以下元件：牛痘病毒H5启动子；前导肽；用于克隆可变重链的5’BssHII克隆位点；重链可变区；用于克隆可变重链的3’BstEII克隆位点；IgG CH1结构域；和牛痘病毒A56R，pJEM1的这些元件的序列显示于图1和SEQ ID NO:1中。 [0172] 将对于C35特异性的重链可变区(H2124)插入pJEM1的BssHII和BstEII位点中，产生VH(H2124)-CH1-A56R融合构建体。pJEM1中制备的VH(H2124)-CH1-A56R融合构建体的核苷酸和氨基酸序列分别显示如下。 [0173] 编码VH(H2124)-CH1-A56R Fab产物融合蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:10)： [0174] [0175] [0176] 编码VH(H2124)和CH1结构域的核苷酸序列加下划线，而编码A56R结构域的核苷酸序列加双下划线。 [0177] VH(H2124)-CH1-A56R Fab产物融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)： [0178] [0179] [0180] VH(H2124)和CH1结构域的氨基酸序列加下划线，而A56R结构域的氨基酸序列加双下划线。 [0181] 编码VH(H2124)-IgG-A56R TR构建体融合蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:27)： [0182] [0183] [0184] 编码VH(H2124)和全长Ig结构域的核苷酸序列加下划线，而编码较短形式A56R结构域的核苷酸序列加双下划线。 [0185] VH(H2124)-IgG-A56R TR构建体融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)： [0186] [0187] VH(H2124)和全长Ig结构域的氨基酸序列加下划线，而较短形式A56R结构域的氨基酸序列加双下划线。 [0188] 编码VH(H2124)-IgG-A56R FL构建体融合蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:29)： [0189] [0190] [0191] [0192] 编码VH(H2124)和全长Ig结构域的核苷酸序列加下划线，而编码较长形式A56R结构域的核苷酸序列加双下划线。 [0193] VH(H2124)-IgG-A56R FL构建体融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)： [0194] [0195] VH(H2124)和全长Ig结构域的氨基酸序列加下划线，而较长形式A56R结构域的氨基酸序列加双下划线。 [0196] 实施例2 [0197] A56R融合蛋白在Hela细胞表面上的表达 [0198] 用表达重组免疫融合构建体，可变重链(H2124)CH1-A56R(以上实施例中所述的)和Ig-K(“A56R H+L”)或scFv-A56R(“A56R scFv”)的重组EEV牛痘病毒感染或共感染HeLa细胞。用重组EEV牛痘病毒感染细胞的一般策略和随后的文库选择步骤的说明显示于图2中。在本实施例中，替代文库的使用，HeLa细胞用表达VH(H2124)CH1-A56R融合体的重组牛痘病毒和表达Ig-K(A56R H+L)的重组牛痘病毒共感染或用表达scFv-A56R的重组牛痘病毒感染。进行了用EEV重组牛痘病毒感染的细胞的C35染色和CD100染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析。简而言之，将1μg/ml CD100-His或1μg/ml C35-His加入样品中，并且在冰上孵育30分钟。然后洗涤细胞，并加入抗-his APC，并且将样品在冰上孵育30分钟，然后洗涤样品，固定并进行分析。FACS数据显示于图3A-C中。这些结果表明A56R融合蛋白在细胞表面上表达。 [0199] 还通过ELISA测试了EEV形式的克隆。将纯化的C35蛋白以碳酸盐缓冲剂中的1μg/mL涂覆于96-孔ELISA板(Nunc-MaxiSorp 96孔平底免疫板Cat#439454)上。洗涤板，然后用1xPBS，10％FBS封闭板。然后将在1x PBS/10％fbs/0.05％吐温-20中稀释的补骨脂素灭活的EEV加入板中指定的孔中，并使其结合。使用兔抗-牛痘-HRP缀合抗原(AbCam目录#28250)检测病毒颗粒，将抗体在1x PBS/10％fbs/0.05％吐温-20中1:2000稀释。然后将TMB底物(检测辣根过氧化物酶(HRP)活性)加入平板中；使其显色，然后用等体积的2N H2SO4终止反应。将板在ELISA读板器上阅读，并且结果显示于图4A中。使用第二ELISA通过检测FAb来证实结合，其使用以上相同的条件，除了二抗是以储备抗体的1:10,000稀释使用的缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2-HRP(Jackson Immuno Reseach目录#109-036-097)，使用1X PBS/10％FBS/0.05％吐温-20作为稀释缓冲液。结果显示于图4B中。两个板上都是阳性的孔表明抗体构建体在牛痘病毒病毒粒的存在下表达。如图3A-B中所示，含有C35特异性融合蛋白的EEV(标记的“A56R EEV”)结合C35，而对照(“L517+G7000-A56R EEV”)，非-C35结合EEV，不结合，并且标准膜结合IgG1形式的C35特异性抗体(“mbg EEV”)也不结合。数据证明了抗体与A56R一起表达时EEV的抗原特异性结合。 [0200] 实施例3 [0201] 基于板和基于溶液的融合蛋白选择 [0202] 使用基于淘选的试验，测试表达与已知C35和VEGF结合分子的A56R融合体的重组牛痘病毒与目标分子的结合。在BSC1细胞中产生表达已知对于C35(scFv2408-A56R，H2124-L517-A56R双基因和L517+H2124-A56R共感染)或VEGF(L7000+H7000-A56R)特异性的免疫球蛋白分子的重组EEV(约24小时)。H2124-L517-A56R双基因产生了与L517+H2124-A56R相同的抗体，除了Ig-H和Ig-K基因由来自双基因的相同病毒编码，而Ig-H和Ig-K基因由用于H2124-A56R共感染的单独病毒编码。 [0203] 通过斑试验测试EEV形式的克隆。将无菌96-孔ELISA板涂覆1μg/ml C35或1μg/ml VEGF。通过产生1:10至1:106稀释的连续稀释，稀释了含有EEV的上清液“纯净物(Neat)”(未稀释的)。将100μl的各种病毒构建体加入指定的孔中，并且使结合在室温下进行2小时或过夜。用PBS将细胞洗涤10次以除去未结合的EEV，然后将大约25,000BSC1细胞加入每个孔中，并且将板在37℃下孵育过夜。通过用结晶紫对孔染色来检测噬斑形成。图5A-D分别显示了2小时和过夜后C35结合以及2小时和过夜后VEGF结合的噬斑试验平板结果。这些结果表明A56R融合蛋白在牛痘病毒粒的表面表达。此外，结果表明使用EEV上表达的A56R融合体产生的已知结合区段能够结合其特异性靶标。 [0204] 接着，使用抗生物素蛋白链菌素珠、蛋白G珠或甲苯磺酰基珠进行了基于珠的选择。 [0205] 抗生物素蛋白链菌素(SAV)珠选择。使用表达MAb 2408(H2124-A56R+L517(C35-特异性的))或MAb 7000(H7000-A56R+L7000(VEGF-特异性的))的重组EEV测试了基于磁珠的选择。在两个T175烧瓶中，用各种病毒构建体感染Hela细胞2天，收集上清液，并且使细胞沉淀。通过在SA-600转子中在15,000RPM下旋转1小时来沉淀EEV。将EEV沉淀物重悬浮于1ml补7 充了10％FBS的DMEM中。对于每个重组病毒，使用了500μl上清液(～10 pfu)。接着，将含有1μg生物素-C35的500μl DMEM加入每个样品中(形成1ml体积的1μg/ml浓度的溶液)。将溶液在冷藏室中在转子上孵育2小时。将200μl M280抗生物素蛋白链菌素(SAV)磁珠加入EEV/C35溶液中(SAV珠浓度足够高以结合全部的生物素-C35，使得不需要洗涤步骤)。将溶液在室温下旋转20分钟以使得珠结合生物素-C35。将按照以上所述制备的病毒构建体加到珠子中。使用磁体收集珠，并且单独地收集未结合的病毒。用1ml PBS将珠洗涤5X。将所有具有未结合病毒的洗涤液合并(“未结合”)。从磁体移除珠。加入1ml补充了2.5％FBS的DMEM，并且将溶液转移至新鲜试管中(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”滴定。结果显示于表1中。 这些结果显示表达C35特异性的2408抗体的EEV结合珠，而表达VEGF特异性的7000抗体的EEV不结合。 [0206] 表1.使用生物素-C35和SAV磁珠的C35-特异性mAb的选择 [0207]病毒 滴度 ％结合 MAb 7000未结合的 1.45×107 MAb 7000结合的 1.2×104 0.1％ MAb 2408未结合的 7.6×106 6 MAb 2408结合的 7.7×10 50％ [0208] 进行了掺入(spiking)实验，其中将表达L517的EEV设定为moi＝1，并且用混合物共感染至Hela中，其中将表达H2124-A56R的EEV稀释至1:104和将表达H7000-A56R的EEV稀释至1:105(每个掺入条件一个T175Hela)。简而言之，收获EEV，并且将500μl含有EEV的上清6 液(5X 10 pfu)用于每次掺入。将500μl含有1μg生物素-hC35的DMEM加入每个样品中(1ml体积，1ug/ml浓度)。使用以上所述的SAV-珠(M280)选择方法收集结合的和未结合的溶液。在T75烧瓶中在BSC1上扩增结合的病毒。 [0209] 通过流式细胞术测试每个掺入实验收集的结合和未结合样品的富集。来自掺入实验的结果显示出珠10-4和10-5的明显富集，并且珠选择比平板选择方法更有效(数据未显示)。 [0210] 还使用以上针对SAV珠描述的那些相似的方法测试了测试了不同的珠，蛋白G珠(Dynal)和甲苯磺酰基激活珠。在选择试验过程中使用了以下的之前鉴定的抗体：MAb 2408(C35-特异性抗体，包含H2124+L517的人源化1F2抗体)、MAb 2368(C100特异性抗体，美国申请No.2010/0285036中公开的)、mAb 7000(贝伐单抗(bevacizumab)的VEGF-特异性亲本抗体)和mAb 8000(曲妥珠单抗(trastuzmab)Her2-特异性亲本抗体)。 [0211] 蛋白G珠选择。使用6孔板中小规模Hela细胞感染产生的EEV(滴度～5X105/ml)。使用表达2368-A56R(H2090-A56R+L512，VH和VL都在牛痘中表达)的EEV:1ml病毒(～5X105pfu)和表达2408-A56R(H2124-A56R+L517，VH和VL都在牛痘中表达)的EEV:1ml病毒(5X105pfu)测试了蛋白G珠选择。如下制备结合蛋白G珠的CD100：使用了300μl磁性蛋白G珠(2X标准量/样品)，并且使用磁体进行下拉。将600μl PBS+18μl CD100-Fc(＝36μg)加入珠中，将其在室温下孵育20分钟(在转子上)以使得CD100-Fc结合蛋白G珠。珠用磁体下拉，并且用1ml PBS洗涤1X。接着，将珠重悬浮于300μl补充了10％的DMEM中。将100μl CD100-Fc/Pro G珠加入每个病毒样品中(～2XPro-G珠的标准量)，其约为12μg/ml CD100-Fc。将溶液在室温下孵育2小时。除去550μl(约50％)珠，并且在标准的5X 1ml PBS洗涤后收集未结合的。珠从磁体移除，并且加入1ml补充了2.5％的DMEM，将溶液转移至新鲜试管(“结合的”)。 将“未结合的”和“结合的”滴定。如上所述，使剩余的550μl继续在室温下孵育另外1.5小时(总共3.5小时)，然后在4度下孵育18小时，然后收获。 [0212] 甲苯磺酰基激活珠选择。将以上蛋白G珠选择实验中使用的表达相同2408(G35-特异性的)和2368(CD100-特异性的)的EEV用于甲苯磺酰基激活珠选择。将100μg C35-His在PBS或ELISA涂覆缓冲液(CB)中与甲苯磺酰基激活磁珠缀合。将溶液在37度下孵育过夜，然后在37用PBS、10％FBS、0.5％BSA封闭1小时。将珠洗涤1X，重悬浮于160μl补充了10％的DMEM中。将50μl的各珠样品加入各病毒样品中，并且在室温下孵育5小时。标准5X 1ml PBS洗涤后收集未结合的。珠从磁体移除，加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将珠转移至新鲜试管(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”滴定。 [0213] 使用以上针对C35抗体选择实验所述的相同方法，使用2368-A56R(1ml病毒(～5X105pfu))和2408-A56R(1ml病毒(～5X105pfu))将100μg CD100-His与PBS中的甲苯磺酰基激活磁珠缀合用于CD100抗体选择试验。 [0214] 使用蛋白G珠选择的结果显示于表2中，并且使用甲苯磺酰基激活珠选择的结果显示于表3和4中。 [0215] 表2：使用CD100-Fc和蛋白G珠的CD100-特异性mAb的选择 [0216]病毒/结合时间 样品 滴度 ％结合 MAb 2408-2小时 未结合 100,00 MAb 2408-2小时 结合 360 0.36％ MAb 2368-2小时 未结合 64,000 MAb 2368-2小时 结合 88,000 58％ MAb 2368-过夜 未结合 130,000 MAb 2368-过夜 结合 90,000 41％ MAb 2408-过夜 未结合 320,000 MAb 2408-过夜 结合 160 0.05％ [0217] 表3：使用C35甲苯磺酰基激活珠的C35-特异性mAb的选择 [0218]病毒 样品 滴度 ％结合 MAb 2408 未结合 96,000 MAb 2408 结合 160,000 61％ MAb 2368 未结合 240,000 MAb 2368 结合 1,600 0.6％ [0219]MAb 2408 未结合 97,000 MAb 2408 结合 140,000 59％ [0220] 表4：使用CD100-His甲苯磺酰基激活珠的CD-100特异性mAb的选择 [0221]病毒 样品 滴度 ％结合 MAb 2408 未结合 384,000 MAb 2408 结合 480 0.1％ MAb 2368 未结合 264,000 MAb 2368 结合 232,000 46.7％ [0222] 实施例4 [0223] CH1-A56R融合蛋白文库建立 [0224] 如下产生编码免疫球蛋白区段的多核苷酸的文库。使用购自商业供应商(Life Technologies)的代表超过100名供体的骨髓RNA形成了称为“天然重链，A56R融合体”的重组牛痘文库。使用人免疫球蛋白γ或μ的恒定区特异性的反义引物进行了逆转录。将所得到的cDNA用作用于PCR的模板，其使用结合人可变重链框架区1的开始处并且引入BssHII限制性位点的两个正义引物之一与结合各种种系人J区段并且引入BstEII限制性位点的反义引物的集合相结合。这些引物的序列如下： [0225] 正义VH3：AATATGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(SEQ ID NO:12) [0226] 正义VH3a：AATATGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG(SEQ ID NO:13) [0227] 反义JH1：GAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCA(SEQ ID NO:14) [0228] 反义JH2：GAGACGGTGACCAGGGTGCCACGGCCCCA(SEQ ID NO:15) [0229] 反义JH3：GAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCA(SEQ ID NO:16) [0230] 反义JH4/5：GAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCA(SEQ ID NO:17) [0231] 反义JH6：GAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCA(SEQ ID NO:18) [0232] 将所得到的PCR产物克隆至以上所述的pJEM1质粒中用于形成重组牛痘病毒的目的。特别地，本文中所述的人免疫球蛋白可变重链表达盒与人免疫球蛋白恒定结构区CH1和牛痘病毒完整膜蛋白A56R cDNA同框地克隆。从文库表达形成的所得蛋白质是在牛痘EEV表面上表达的含有免疫球蛋白重链可变区段、重链CH1和A56R蛋白的一部分的融合蛋白。 [0233] 将天然重链，A56R融合体文库与表达已知Ig-L或牛痘病毒表达的Ig-L文库(如之前在美国专利No.7,858,559中公开的，将其全部按引用并入本文中)一起使用用于牛痘淘选，如图2中所说明的。 [0234] 实施例5 [0235] 针对CD100抗体选择的CH1-A56R融合蛋白文库筛选 [0236] 使用来自之前实施例中所述的天然重链，A56R融合体文库(也称为“文库3”)的～1,200,000克隆+轻链克隆(L48，L116和L9021)进行了新CD100抗体的选择。 [0237] 用以上所述的表达融合体文库+轻链的EEV感染T-175Hela细胞2天，之后收获上清液，用低速旋转沉淀2X，并且以15,000RPM将EEV沉淀1小时。将EEV重悬浮于3ml补充了10％FBS的DMEM中。 [0238] 第1轮选择。将表达2368-A56R的EEV(1ml病毒(～5X105pfu))和表达2408-A56R的EEV(1ml病毒(～5X105pfu))用作对照，并且将文库3(1ml病毒(～108pfu))用于选择试验。首先，用磁体下拉300μl蛋白G珠(2X标准量/样品)，并且将600μl PBS+18μl CD100-Fc(＝36μg)加入珠中。将溶液在室温下孵育20分钟(在转子上)以允许CD100-Fc结合于蛋白G珠。珠用磁体下拉，用1ml PBS洗涤1X，并且重悬浮于300μl补充了10％的DMEM中。 [0239] 接着，将每样品100μl CD100-Fc/Pro G(约12μg/ml CD100-Fc)加入EEV中(2408和2368对照，以及文库3)并且在室温下孵育2小时。移出550μl(约50％)的珠，并且在标准5X 1ml PBS洗涤后收集未结合的病毒。珠从磁体移除，并且加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将溶液转移至新鲜试管中(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”进行滴定。用45分钟后加入的甲基纤维素滴定这些“2小时孵育”样品。将从结合的文库回收的珠在T75中的BSCI上扩增(将这第1轮的2小时选择称为“CD1003.1A”)。使另外550μl(约50％)的珠在室温下继续孵育另外1.5小时(总共3.5小时)，然后在4℃下孵育18小时(“过夜”)。在标准5X 1ml PBS洗涤后收集未结合的病毒。珠从磁体移除，并且加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将溶液转移至新鲜试管(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”进行滴定。结合的文库在T75中的BSC1上扩增(将这第1轮的过夜选择称为“CD100 3.1B”)。结果显示于表5中。 [0240] 表5：CD100 Ab的第1轮选择 [0241]病毒/结合时间 样品 滴度 ％结合 2408-2小时 未结合 100,000 2408-2小时 结合 360 0.36％ 2368-2小时 未结合 64,000 2368-2小时 结合 88,000 58％ 文库3.1A-2小时 未结合 22,000,000 文库3.1A-2小时 结合 20,000 ～0.1％ 2408-过夜 未结合 130,000 2408-过夜 结合 90,000 41％ 2368-过夜 未结合 320,000 2368-过夜 结合 160 0.05％ 文库3.1B-过夜 未结合 56,000,000 文库3.1B-过夜 结合 17,000 0.03％ [0242] 文库3.1A和3.1B在BSC1上产生了良好的扩增，收获并滴定(各～2X107ml)。 [0243] 第2轮选择。使用了6孔板中小规模Hela感染产生的EEV(滴度～5X105/ml)。将文库3.1A和3.1B一起汇合到一个样品中。将表达2368-A56R的EEV(1ml病毒(～5X105pfu))、表达 2408-A56R的EEV(1ml病毒(～5X105pfu))和3.1A/B文库(1ml病毒(～5X105pfu))各自与300μl蛋白G珠(2X标准量/样品)组合。将600μl PBS+18μl CD100-Fc(＝36μg)加入珠中。将溶液在室温下孵育20分钟(在转子上)以使CD100-Fc结合于蛋白G珠。如以上针对第1轮所述的，洗涤珠，并且重悬浮。将每样品100μl CD100-Fc/Pro G(～12μg/ml CD100-Fc)加入病毒样品中，并且在室温下孵育4.5小时。收集“未结合的”和“结合的”并滴定。在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第2轮选择称为“CD100 3.2”)。第2轮选择的结果显示于表6中。 [0244] 表6：CD100 Ab的第2轮选择 [0245]病毒-抗原 样品 滴度 ％结合 2408-CD100-Fc 未结合 384,000 2408-CD100-Fc 结合 780 0.2％ 2368-CD100-Fc 未结合 264,000 2368-CD100-Fc 结合 224,000 46％ 文库3.2-CD100-Fc 未结合 780,000 文库3.2-CD100-Fc 结合 5,000 0.6％ [0246] 文库3.2在BSC1上获得了良好的扩增，收获和滴定(～3X107/ml)，并且得到小的阳性细胞群体。进行了第三轮选择。 [0247] 第3轮选择。使用“文库3.2A”(第1和2轮＝CD100-Fc/Pro G)，使用以上所述的相同方法进行了第三轮选择。在T75中在BSC1上扩增结合的文库(将第3轮选择称为“CD100 3.3A”)。通过流式细胞术测试了第3A轮选择的结果。使用以上公开的方法，用PBS中与甲苯磺酰基激活磁珠缀合的100μg CD100-His进行第二次第3轮选择。加入每样品50μl用于使用与用于CD100 3.3A(2368-A56R(1ml病毒(～5X105pfu))、2408-A56R(1ml病毒(～5X105pfu))和3.2A(1ml病毒(～5X105pfu))的相同批次的病毒进行选择。将溶液在室温下孵育4小时。 收集“未结合的”和“结合的”并滴定。在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第3轮甲苯磺酰基激活选择称为“CD100 3.3B”)。通过流式细胞术测试了第3B轮选择的结果。概括了CD100抗体选择策略的示意图说明于图6中。 [0248] 流式细胞术染色表明了当与L116配对时在CD100 3.3A/B中可能存在阳性群体。挑选来自3.3A(n＝27)和3.3B(n＝30)的噬斑，并且在24-孔板中在BSC1上扩增3天(每孔1噬斑)。Hela细胞在24-孔板中用1/3的各扩增的噬斑感染。细胞用moi＝1的L116共感染(对照：2368、2408和未感染的Hela上清液)。EEV产生2天，收获，并且用补骨脂素和长波UV光照射(PLWUV)灭活。使用50μl EEV+50μl ELISA封闭缓冲剂/孔将病毒结合于CD100(2μg/ml)和C35(2μg/ml)涂覆的板O/N。 [0249] 通过加入抗-Fab-HRP来检测抗体结合。两个克隆(3.3.C20和3.3C27)对CD100具有良好的结合，并且测序。通过流式细胞术进一步表征这些克隆的特异性和亲和性。在T75中的BSC1上扩增这些克隆并滴定。将3.3A/B(具有L116)感染的细胞进行CD100分选。将来自分选细胞(150个细胞)的病毒扩增、滴定，并通过流式细胞术测试(100μg/ml CD100-His：冰上30分钟，用5ml洗涤，接着抗-HIS-APC+抗-Fab-FITC：冰上30分钟)。克隆20和27两者都结合CD100，如通过流式细胞术测定的。 [0250] 当与L116配对时，用于两个高亲和性CD100 VH克隆(3.3.C20和3.3C27)的序列是相同的。两个克隆的序列比对显示于图7中。用于可变重链的氨基酸序列如下(VH CDR1-3是加下划线的)： [0251] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG WIRQAPGKGPEWLSRFTISRDNTRNSIYLQMNNLRVEDTAVYYCAR WGQGTLVT (SEQ ID NO：19). [0252] 实施例6 [0253] 用于Her2抗体选择的CH1-A56R融合蛋白文库筛选 [0254] 使用来自天然重链、A56R融合体文库(也称为“文库3”)的1,200,000个克隆+轻链克隆(L48，L116和L9021)进行了对于新的Her2抗体的选择。文库与用于以上讨论的CD100选择的相同。 [0255] 第1轮选择。将文库3(1ml病毒(～108pfu))用于这一选择。首先，将100μl PBS+100μl Her2-Fc(R&D Systems)(＝10μg)加入蛋白G珠中。将溶液在室温下孵育25分钟(在转子上)以使Her2-Fc结合蛋白G珠。珠用磁体下拉，用1ml PBS洗涤1X，并且重悬浮于100μl补充了10％的DMEM中 [0256] 接着，将100μl Her2-Fc/Pro G(～10μg/ml Her2-Fc)加入1ml文库3中，并且在室温下孵育4小时。除去珠，并且在标准5X 1ml PBS洗涤后收集未结合的病毒。珠从磁体移除，并且加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将溶液转移至新鲜试管中(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”滴定。将从结合的文库回收的珠在T75中的BSC1上扩增(将第1轮选择称为“Her2.3.1”)。 [0257] 第2轮选择。滴定扩增的Her2.3.1，并且在6孔板形式中扩增(与L48、L116和L9021共感染)，并且使用以上所述方法进行另外的Her2-Fc/ProG选择循环。在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第2轮选择称为“Her2.3.2”)。 [0258] 第3轮选择。滴定扩增的Her2.3.2，并且在6孔板形式中再次扩增(与L48、L116和L9021共感染)，并且使用以上所述方法进行了另外的Her2-Fc/ProG选择循环。在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第3轮选择称为“Her2.3.3”)。通过流式细胞术测试了Her2.3.2和Her2.3.3选择的结果。在这个实验中，3μg/ml C35-His或10μg/ml Her2-His在冰上与抗-His-APC MAB孵育30分钟以形成复合物。然后加入抗-Fab-FITC，并且将抗原-抗-His复合物加入细胞中，在冰上持续30分钟。然后用2ml PBS，0.5％BSA，2nM EDTA洗涤细胞。然后加入抗-his-APC和抗-Fab-FITC，在冰上持续30分钟，然后洗涤细胞、固定，并且运行流式细胞术试验。如图8中所示，所有三种轻链富集了Her2特异性抗体。 [0259] 第4轮选择。仅用Her2.3.3和L116共感染6孔板形式中的Hela细胞，按照以上所述的分离EEV，并且使用以上所述的方法进行了另外的Her2-Fc/ProG选择循环。在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第4轮选择称为“Her2.3.4”)。概括了Her2抗体选择策略的略图说明于图9中。 [0260] 使用以上所述的染色方法，通过流式细胞术测试了Her2.3.3和Her2.3.4选择的结果。使用了对照H8000-A56R+L8000(8000＝嵌合4D5；曲妥珠单抗的小鼠亲本)。 [0261] 流式细胞术结果显示出3.3和3.4样品中的2个群体。将Her2.3.4样品共感染至Hela细胞中，并且针对Her2结合将样品染色，并分选阳性细胞。从分选的样品中挑选克隆，并且从Her2.3.4/分选挑选出筛选的30个噬斑，并且在24-孔板中在BSC1上扩增2天(1噬斑/孔)。在24-孔板中1/3的每种扩增的噬斑感染Hela细胞。用moi＝1的L116共感细胞(对照：8000、2368、2408和未感染的Hela上清液)。EEV产生3天，收获，并且用PLWUV灭活。使用50μl EEV+50μl ELISA封闭缓冲剂/孔，将病毒结合于CD100(2μg/ml)和Her2(2μg/ml)涂覆的平板O/N。结果显示于图10中。 [0262] 通过添加抗-Fab-HRP来检测抗体结合。鉴定了具有与Her2的良好结合的五个阳性克隆，并测序。所有5个克隆具有相同的序列(参见图11)。以下显示了克隆B 10的VH序列。 [0263] Her2B 10克隆序列： [0264]EVQLLESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFAFNNYALSWVRQAPGRGLKWVSAISPDGDYIYYADSVKGRFIFSRDNSRNMLSLQMTSLGAEDTALYYCARQNNVRDGAVAGPLDHWGQGTLVT(SEQ ID NO：20). [0265] 实施例7 [0266] 用于C35抗体选择的CH1-A56R融合蛋白文库筛选 [0267] 使用来自天然重链、A56R融合体文库(也称为“文库3”)的约1,200,000个克隆+轻链克隆(L48、L116和L9021)进行了对于新的C35抗体的选择。文库与用于以上讨论的CD100和Her2选择的是相同的。 [0268] 第1轮选择。将100μg C35在PBS或ELISA涂覆缓冲液(CB)中与甲苯磺酰基激活磁珠缀合。将溶液在37℃下孵育过夜，并且在37℃下用PBS，10％FBS，0.5％BSA封闭1小时。将珠洗涤1X，重悬浮于160μl补充了10％的DMEM中。将50μl的各种珠样品加入各种病毒样品中，并且在室温下孵育3.5小时。标准5X 1ml PBS洗涤后，收集未结合的。珠从磁体移除，加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将珠转移至新鲜试管中(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”滴定。 [0269] 将结合的文库在T75中的Hela上扩增(将第1轮选择称为“C353.1”)。通过流式细胞术测试C353.1轮的结果。C353.1结合，但较低(数据未显示)。 [0270] 第2轮选择。滴定扩增的C353.1，并且用于在6孔板形式中通过C353.1与L48、L1165 和L9021(滴度～5X 10/ml)共感染来产生重组EEV，并且使用以上所述的方法进行了另外的甲苯磺酰基激活C35选择的循环。将溶液在室温下孵育3.0小时而不是第1轮的3.5小时。 结合的和未结合病毒的滴度显示于表7中。将结合的文库在T75中的Hela上扩增(将第2轮选择称为“C353.2”)，并且如上所述通过流式细胞术测试结合。 [0271] 表7：对于C35Ab的第2轮C35-His/甲苯磺酰化激活的选择 [0272]病毒 样品 滴度 ％结合 2368 未结合 684,000 2368 结合 1600 0.2％ 2408 未结合 600,000 [0273]2408 结合 168,000 28％ 文库C353.2 未结合 972,000 文库C353.2 结合 10,400 1％ [0274] 第3轮选择。将扩增的C353.2滴定，并且用于在6孔板形式中通过与L48、L116和L9021(滴度～5X105/ml)共感染来产生重组EEV，并且使用以上针对第2轮所述的方法进行了另外的甲苯磺酰基激活的C35选择的循环。结合的和未结合病毒的滴度显示于表8中。将结合的文库在T75中的Hela上扩增，并且如上所述通过流式细胞术测试C35结合(将第3轮选择称为“C353.3”)。 [0275] 表8：对于C35Ab的第3轮C35-His/甲苯磺酰化激活的选择 [0276]病毒 样品 滴度 ％结合 2368 未结合 400,000 2368 结合 480 0.1％ 2408 未结合 228,000 2408 结合 108,000 47％ 文库C353.3 未结合 540,000 文库C353.3 结合 2600 0.5％ [0277] 克隆将从C353.3以及可能的第四轮选择筛选。通过流式细胞术来表征阳性细胞，并且测试特异性、亲和性和功能。 [0278] 实施例8 [0279] 表达重链或轻链的牛痘病毒的选择性扩增 [0280] 用带有重链或轻链免疫球蛋白的单独重组牛痘病毒组合感染是表达用于选择的抗体的有效方式。然而，选择后，在扩增和收获过程中，目前不存在用于分离含重链和轻链的病毒的机制。因此，能够单独地扩增含重链和轻链牛痘病毒是有利的，例如在以高于一的复数下进行重链和轻链感染的情况中以及在需要选择后去卷积的情况中。为此，已经产生了与药物选择标记(具有新霉素抗性的重链和具有潮霉素抗性的轻链)偶联的表达重链或轻链的重组牛痘病毒。以下实验证明了独立地选择性扩增含重链或轻链的重组牛痘病毒的实用性。 [0281] 将BSC1细胞以1.25x 106细胞/孔和以2.5ml/孔接种于6-孔板的15个孔中。第二天，根据表9形成用于选择的潮霉素或G418的连续稀释物。DMEM-2.5表示含有2.5％FBS的DMEM。 [0282] 表9A.潮霉素稀释物的制备 [0283] [0284] 表9B：G418稀释物的制备 [0285] [0286] [0287] 第三天，用MOI＝3的野生型牛痘病毒或含有各自的选择标记的牛痘病毒(VHE H5LX-IRES-HYGRO或VHE H5HX-A56R NEO)感染BSC1细胞。然后将潮霉素和G418稀释物同时应用至板孔中。将不含抗生素的DMEM-2.5加入对照孔中。在0.65ml/孔的体积中进行感染，并且将细胞在37℃下孵育。2小时后，将培养基体积变成2.65ml/孔，并且补充另外的潮霉素或G418以维持含药物孔中预期的浓度。同时，将新的BSC1细胞以2x105细胞/孔接种于12-孔板中用于感染后滴度测定。 [0288] 感染后24小时，将所有样品收获至15ml圆锥离心管中，冻融三次，涡旋，并且通过温和涡旋重悬浮于1.8ml DMEM-2.5中。将样品在最大强度下超声波处理2分钟，然后转移至2.0ml Sarstedt管中。在7.5ml聚丙烯管中制备每种样品的连续稀释物。首先，从每种样品取出30μl初始物，并且与无抗生素DMEM-2.5合并至3000μl的终体积(1:102稀释)。接着，将 30μl 1:102稀释物加入第二3000μl终体积中以制备1:104稀释物。然后进行连续1:10稀释以 5 9 制备1:10至1:10稀释物。使用5ml管，将所有稀释物在生物安全柜中涡旋。 [0289] 通过一式两份地分配每个试验孔0.333ml的每个滴定稀释物，随后使用每个样品的六个稀释物(1:104至1:109)感染滴定板中的BSC1细胞。因此，用于计算滴度的因子等于2个重复孔中的总噬斑数除以0.66ml。将感染在37℃下孵育至少2小时。在吸附和感染的初始2小时后，将另外的1.0ml DMEM-2.5加入每个孔中。 [0290] 感染后48小时，将结晶紫加入12-孔滴定板中。只有大于1mm直径的噬斑才被计数。从计数中排除子斑。 [0291] 结果显示于表10中。在潮霉素抗性实验中，0.01至0.08mg/ml潮霉素显著抑制了表达与新霉素抗性标记连接的重链的牛痘病毒的扩增，但对表达与潮霉素抗性标记连接的轻链的牛痘病毒的扩增具有很少或没有抑制作用(除了0.04mg/ml数据点)，直至潮霉素浓度提高至0.1至0.2mg/ml。相似地，在新霉素抗性实验中，0.125至2mg/ml的G418显著抑制了野生型牛痘病毒的扩增，但对表达与新霉素抗性标记连接的重链的牛痘病毒的扩增没有抑制作用。 [0292] 表10A：潮霉素抗性实验的结果 [0293] [0294] 表10B：新霉素抗性实验的结果 [0295] [0296] [0297] 因此，表达经由内部核糖体进入位点(IRES)连接的免疫球蛋白和药物抗性标记的重组牛痘病毒提供了对抗用该药物处理下宿主细胞死亡的保护。这允许在病毒的链特异性繁殖以及在重组过程中针对野生型牛痘病毒的选择。 [0298] 实施例9 [0299] Hela细胞表面上的A56R融合蛋白的表达 [0300] 在12-孔板中，用表达免疫球蛋白融合构建体，具有L8000Ig-K的可变重链(H8000)CH1-A56R(其一起编码抗体的Fab片段(“Fab”))、具有L8000Ig-K的可变重链(H8000)FL-A56R(其一起编码全长(“FL”)IgG)、具有L8000Ig-K的可变重链(H8000)FL-平截的A56R(其一起编码具有较短A56R的全长IgG(“TR”))、具有L517Ig-K的可变重链(H2124)FL-A56R(2408“FL”)和具有L517Ig-K的可变重链(H2124)FL-平截的A56R(2408“TR”)的重组EEV牛痘病毒共感染HeLa细胞。显示了“Fab”、“TR”和“IgG”构建体的图显示于图12中。进行了用重组牛痘病毒感染的细胞的C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选(FACS)分析。～18小时后，用C35-His/His-APC和Her2-His/His-APC以及抗-Fab-FITC将细胞染色；并且在Canto上通过FLOW分析来检测。简而言之，将细胞胰蛋白酶化，并且分成每样品两个等份；用2mL洗涤缓冲液洗涤；将10μg/ml Her2-His或4μg/ml C35-His加入两个样品中的一个中，并且在冰上孵育30分钟。然后洗涤细胞，并且加入抗-His APC，并且将样品在冰上孵育30分钟，用第二检测试剂抗-Fab-FITC染色，然后洗涤样品，固定(具有1:100PI的0.5％仲甲醛，在冰上20min)并且通过Canto的FLOW进行分析。FACS数据显示于图13-15中。这些结果表明表达Fab或全长IgG的A56R融合蛋白在细胞表面上表达，并且对于IgG的表面表达，仅A56R的跨膜和胞内结构域是需要的。 [0301] 实施例10 [0302] 基于溶液的Vac-Ig选择 [0303] 甲苯磺酰基激活珠选择。在6孔板中，将表达C35-特异性(H2124)“Fab”、“FL”和“TR”VH的EEV连同L517共感染至Hela细胞中，并且通过在感染大约48小时后以1200rpm旋转和收集上清液(EEV)来从上清液收获EEV。作为对照，以相同方式产生对照Her2特异性H8000-Fab+L8000。对于珠选择，将100μg C35-His与PBS中的甲苯磺酰基激活磁珠缀合。将溶液在37℃下孵育过夜，并且用PBS、10％FBS、0.5％BSA在37℃下封闭1小时。将珠洗涤1X，重悬浮于补充了10％的160μl DMEM中。将50μl的各种珠样品加入各种病毒样品中，并且在室温下孵育2小时。在标准的5X 1ml PBS洗涤中收集未结合的EEV。珠从磁体移除，加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将珠转移至新鲜试管(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”进行滴定。 [0304] 如表11中所示，选择了表达Fab和FL融合蛋白两者的C35特异性构建体的牛痘病毒，而不选择具有TR融合蛋白的构建体。这一数据表明对于并入至EEV中，一些胞外A56R序列是需要的。 [0305] 表11：甲苯磺酰基激活珠选择的结果 [0306]病毒 ％结合 MAb 2408-Fab 24％ [0307]Mab 2408-FL 18％ Mab 2408-TR 2.3％ Mab 8000-Fab 0.8％ [0308] 实施例11 [0309] 用于CD100抗体选择的CH1-A56R融合蛋白文库筛选 [0310] 在A56R-Fab载体中产生etgf使用由～7,000,000个含有天然VH和合成VH序列的组合的克隆组成的重链文库进行的新CD100抗体的选择。为了在EEV的表面上产生表达Ig文库的牛痘，将A56R融合体文库(也称为“文库10”)连同9个轻链克隆(κ链：L48、L116、L122、L7110和L9021；和λ链：L3-1、L151、L214和L223)的混合物共感染至1X109个Hela细胞中。重链病毒的总moi为1，轻链病毒的总moi为1，添加构成大约1/9总轻链病毒的各轻链。 [0311] 将生长于悬浮液中的Hela-S细胞感染2天，此后收获上清液，并且用低速旋转2X沉淀，并且将EEV在F16/F250转子中以13,000RPM沉淀1小时。将EEV重悬浮于3ml补充了10％FBS的DMEM中，并且将1ml用于选择CD100特异性抗体。 [0312] 第1轮选择。将表达2368-A56R的EEV(1ml病毒，具有大约～5X105pfu)和表达2408-A56R的EEV(1ml病毒，具有大约～5X105pfu)用作对照，并且将文库10(1ml病毒，具有大约～108pfu)用于选择分析。首先，用磁体下拉300μl蛋白G珠(2X标准量/样品)，并且将600μl PBS+18μl CD100-Fc(＝36μg)加入珠中。将溶液在室温下孵育20分钟(在转子上)以使CD100-Fc结合于蛋白G珠。用磁体下拉珠，用1ml PBS洗涤1X，并且重悬浮于300μl补充了 10％FBS的DMEM中。 [0313] 接着，将每样品100μl CD100-Fc/Pro G(约12μg/ml CD100-Fc)加入EEV(2408和2368对照，以及文库10)中，并且在室温下孵育2小时。标准5X 1ml PBS洗涤后，除去未结合的病毒。珠从磁体移除，并且加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将溶液转移至新鲜试管(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”进行滴定。结果显示于表12中。在T175烧瓶中的BSC1细胞上扩增结合的病毒，持续3天。 [0314] 表12：甲苯磺酰基激活珠选择的结果 [0315]病毒 选择 未结合的滴度 结合的滴度 结合百分比 文库_10 CD100-Fc 1.5×108 2.2×106 0.15 2368 CD100-Fc 72,000 37,000 34 2408 CD100-Fc 338,400 80 0.12 [0316] 这些结果表明文库10.1产生了在BSC1上良好的扩增、收获和滴度。 [0317] 第2轮选择。通过在细胞堆积机(cell stacker)中以moi＝1感染Hela细胞各2天来产生来自10.1+新鲜等份的9种轻链的EEV，并且如上所述进行收获。将收获的病毒分成两半，50％在ProG珠上选择，50％在CD100涂覆的甲苯磺酰基激活珠上选择。 [0318] 使用ProG珠的第2轮选择。将表达2368-A56R的EEV(1ml病毒(～5X105pfu))、表达2408-A56R的EEV(1ml病毒(～5X105pfu))和10.1文库(1ml病毒(～5X105pfu))用于选择。将 600μl PBS+18μl CD100-Fc(＝36μg)加入Pro-G珠中。将溶液在室温下孵育20分钟(在转子上)以使CD100-Fc结合于蛋白G珠。如以上针对第1轮所述的，洗涤珠并且重悬浮。将每样品 100μl CD100-Fc/Pro G(～12μg/ml CD100-Fc)加入病毒样品中，并且在室温下孵育2小时。 收集“未结合的”和“结合的”，并且滴定。在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第2轮选择称为“CD100 10.2/ProG”)。第2轮选择的结果显示于表13A中。在T175烧瓶中的BSC1上扩增结合的病毒，持续3天。 [0319] 使用甲苯磺酰基激活珠的第2轮选择。将以上蛋白G珠选择实验中使用的表达相同2408(C35-特异性的)、2368(CD100-特异性的)和文库10抗体的EEV用于甲苯磺酰基激活磁珠选择。将100μg CD100-His与PBS中的甲苯磺酰基激活磁珠缀合。将溶液在37℃下孵育过夜，并且用PBS、10％FBS、0.5％BSA在37下封闭1小时。用DMEM，10％FBS将珠洗涤1X，重悬浮于160μl补充了10％FBS的DMEM中。将50μl的各珠样品加入各病毒样品中，并且在室温下孵育2小时。在标准5X 1ml PBS洗涤中收集未结合的病毒。珠从磁体移除，加入1ml补充了 2.5％的DMEM，并且将珠转移至新鲜试管中(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”进行滴定。将结合的病毒在T175烧瓶中的BSC1上扩增3天。第2轮选择的结果显示于表13B中。 [0320] 表13A：对于CD100 Ab的第2轮选择(蛋白G珠选择) [0321] [0322] 表13B：对于CD100 Ab的第2轮选择(甲苯磺酰基激活珠选择) [0323] [0324] 这些第二轮的结果表明文库10.2/ProG和10.2/甲苯磺酰基都在BSC1上获得了良好的扩增。 [0325] 第3轮选择。使用以上所述的相同方法进行了第三轮选择。用CD100-Fc/ProG选择10.2/ProG用于第三轮，并且用CD100-His/甲苯磺酰基选择10.2/甲苯磺酰基用于第三轮。 通过在T175中对于总重链和总轻链重组病毒各自以moi＝1感染Hela细胞2天来产生来自 10.2/ProG+新鲜等份的9种轻链的EEV，并且如上所述进行收获。通过对于总重链和总轻链重组病毒各自以moi＝1感染T175中的Hela细胞2天来产生来自10.2/甲苯磺酰基+新鲜等份的9种轻链的EEV，并且如上所述进行收获。滴度显示于表14A-B中。 [0326] 表14A：对于CD100 Ab的第3轮选择(蛋白G珠选择) [0327] [0328] 表13B：对于CD100 Ab的第3轮选择(甲苯磺酰基激活珠选择) [0329] [0330] 在T75中的BSC1上扩增结合的文库(将第3轮选择称为“CD100 10.3ProG和CD100 10.3/甲苯磺酰基”)。通过流式细胞术测试第3轮选择的结果。 [0331] 在这个实验中，用各轻链单独地共感染等份的10.3选择试样，然后测试与CD100和Her2的结合。以moi＝1感染Hela细胞。过夜感染后，收获细胞，并针对CD100结合和Her2结合作为对照染色。将细胞胰蛋白酶化，用冰冷流动缓冲液(FB 1X PBS，0.5％BSA，2mM EDTA)洗涤，并且用三种不同检测方法中的每一种来检测。在第一种检测方法(2步)中，细胞用FB中的10ug/mL huCD100-His在冰上孵育30min，然后用2mL FB洗涤，并且与混合了1:500(2ug/ml)FITC标记的山羊-Fab抗人-Fab的1:50(2ug/ml)小鼠抗6XHis-APC在冰上孵育30分钟。在第二种和第三种检测方法中(前复合)，用FB中1:50(2ug/mL)的小鼠抗6XHis-APC在冰上预孵育10ug/mL的huCD100-His或10ug/mL huHer2-His 30min，然后将混合物加入具有1:500(2ug/mL)GtFab抗huFab-FITC的细胞中，并且在冰上孵育30min。与用检测试剂孵育后，细胞用2mL FB洗涤1X，并且在0.5％仲甲醛中重建，并且在冰上孵育20min。在FACS Canto上阅读20,000个事件。结果显示于图16-22中。 [0332] 流式细胞术染色显示出当与大部分轻链配对时，CD100 10.3/ProG和甲苯磺酰基中CD100结合细胞的阳性群体。特别地，用L3-1共感染时，观察到了强阳性群体。 [0333] 为了分离特定的VH，Hela细胞用10.3/ProG或10.3/甲苯磺酰基单独地感染，并且与L3-1共感染。过夜感染后，收获细胞，并且用以上所述的前复合的方法针对CD100结合进行染色。然后通过细胞分选分离抗原结合细胞。分选后，通过冻/融从细胞释放病毒，然后在BSC1细胞上扩增病毒。通过分析流试验，测试分离的EEV-VH链的扩增样品的富集。在这个试验中，与L3-1轻链共感染扩增的分选的CD100 10.3样品的等份试样，然后用以上所述的2-步和前复合的方法测试与CD100和Her2的结合。结果显示于图23-25中。 [0334] 扩增后，收获病毒，并且使用Qiagen DNA血液微型试剂盒(cat#51104)从等份的病毒提取DNA。使用重链特异性引物428；5'-GATATATTAAAGTCGAATAAAGTG-3'(SEQ ID NO:31)和430；5'-GACATCACATAGTTTAGTTGC-3'(SEQ ID NO:32)对纯化的DNA进行PCR扩增。将所得到的PCR产物克隆至含有分泌的全长人IgG1(EFVH)的质粒载体中，然后将所得到克隆中含有的V基因进行测序。测序结果的概述显示于表15中。测序来自10.3/ProG的188个克隆后，鉴定了44个独特的克隆，并且在测序来自10.3/甲苯磺酰基的188个克隆后，鉴定了46个独特的克隆。 [0335] 表15：独特克隆的概述 [0336]筛选 测序的克隆 独特的序列 通过ELISA的结合 10.3/ProG 188 44 56.8％ 10.3/甲苯磺酰基 188 46 60.9％ [0337] 针对每个独特重链的质粒DNA使用Lipofectamine 2000连同编码VL3-1的质粒载体共转染至CHO细胞中3天，并且随后通过CD100+Jurkat细胞上的流式细胞术和通过ELISA测试了培养基所含的抗体针对CD100的特异性(分别为图26和27A-B)。对于流式细胞术试验，实验抗体与流动缓冲液(1XPBS，0.5％BSA，2mM EDTA)中1:400或[2.5ug/mL]Gt抗Hu Fc-Dylight 649二抗以1ug/mL预孵育。将Jurkat细胞以250,000/孔接种于96孔板中，并且与预先形成的Ab复合物在冰上孵育30min。然后用200uL流动缓冲剂将细胞洗涤2X，并且用1X碘化丙啶(PI)用0.5％仲甲醛孵育20min。在FACS Canto上检测细胞，阅读了对活细胞群体门控的10,000个事件。总体地，通过ELISA或流式细胞术，至少75个独特的抗体显示出对于CD100是特异性的。 [0338] 实施例12 [0339] 用于Her2抗体选择的CH1-A56R融合蛋白文库筛选 [0340] 在A56R-Fab载体中，作为与IRES-新霉素的融合体产生了由含有天然VH和合成VH序列组合的～3,000,000个克隆组成的重链文库。为了产生在EEV表面上表达Ig文库的牛痘，A56R融合体文库(也称为“文库9”)连同含有潮霉素抗性基因的1,000个κ轻链克隆的文库共感染至5X109个Hela细胞中。轻链文库由分离自人骨髓(“天然”)的VK序列组成。重链病毒的总moi为1，而轻链病毒的总moi为1。 [0341] 将生长于悬浮液中的Hela-S细胞感染2天，此后收获上清液，并且用低速旋转2X沉淀，并且将EEV在F16/F250转子中在13,000RPM下沉淀1小时。将EEV重悬浮于3ml补充了10％FBS的DMEM中，并且将1ml用于选择Her2/neu特异性抗体。 [0342] 第1轮选择。将文库9用于这个选择。首先，将600μl PBS+24ug Her2-Fc加入600ul蛋白G珠中。将溶液在室温下孵育20分钟(在转子上)以使Her2-Fc结合于蛋白G珠。用磁体下拉珠，用1ml PBS洗涤1X，并且重悬浮于400μl补充了10％FBS的DMEM中。 [0343] 接着，将100μl Her2-Fc/Pro G(～6μg/ml Her2-Fc)加入1ml文库9中，并且在室温下孵育2小时。将相似量的珠加入阳性对照MAb 8000EEV和阴性对照MAb 2408EEV中。除去珠，并在标准5X 1ml PBS洗涤中收集。珠从磁体移除，并且加入1ml补充了2.5％的DMEM，并且将溶液转移至新鲜试管(“结合的”)。将“未结合的”和“结合的”进行滴定(参见表16)。在1mg/ml G418的存在下，在三个T175烧瓶中的BSC1上扩增从结合的文库回收的珠。该扩增选择用于重链重组病毒。(将第1轮选择称为“Her.9.1”)。 [0344] 表16：用于Her2Ab的第1轮选择 [0345]病毒 选择 未结合的滴度 结合的滴度 结合百分比 文库9 Her2-Fc 1.4×109 4.6×106 0.32 2408 Her2-Fc 1.2×105 180 0.14 8000 Her2-Fc 3×105 7.2×104 19.3 [0346] 第2轮选择。滴定扩增的Her.9.1，并且通过在2个CellStackers中将Her.9.1和新鲜等份的VK1000文库共感染至Hela细胞中2天来进行第二轮选择。按照以上所述的收获病毒，并且使用以上所述的方法进行了另外的Her2-Fc/ProG选择循环。在两个含有1mg/ml G418(用于选择重链)的T175烧瓶中的BSC1上扩增50％的结合的病毒，在两个含有0.030mg/ml潮霉素(用于选择轻链)的T175烧瓶中的BSC1上扩增50％的结合的病毒。滴度结果显示于表17中。将扩增的病毒称为Her.9.2/VH和Her 9.2/VK。 [0347] 表17：用于Her2Ab的第2轮选择 [0348]病毒 选择 未结合的滴度 结合的滴度 结合百分比 Her2.9Rd1+VK Her2-Fc 1.76×108 1.9×105 0.1 2408 Her2-Fc 1.4×105 80 0.1 5 4 8000 Her2-Fc 3.3×10 6.2×10 16 [0349] 第3轮选择。将扩增的Her.9.2/VH和Her 9.2/VK滴定，在CellStacker中共感染至Hela细胞中2天，按照以上所述的纯化EEV，并且使用以上所述的方法进行另外的Her2-Fc/ProG选择循环。 [0350] 在含有1mg/ml G418(用于选择重链)的T175烧瓶中的BSC1上扩增50％的结合的病毒，和在含有0.030mg/ml潮霉素(用于选择轻链)的T175烧瓶中的BSC1上扩增50％的结合的病毒。将扩增的病毒称为Her.9.3/VH和Her 9.3/VK。 [0351] 通过流式细胞术测试了Her.9.3/VH和Her 9.3/VK中Her2特异性抗体的选择。用Her.9.3/VH和Her 9.3/VK以moi＝1将Hela细胞共感染过夜，然后针对与Her2的结合进行染色，不存在与对照抗原(C35)的结合。在这个实验中，在冰上用抗-His-APC抗体孵育3μg/ml C35-His或6μg/ml Her2-His 30分钟以形成复合物。然后加入抗-Fab-FITC，并将抗原-抗-His复合物加入细胞中，在冰上持续30分钟。然后用2ml PBS，0.5％BSA，2nM EDTA洗涤细胞。将细胞固定，并且运行流式细胞术试验。数据显示出VH和VK两者的富集。 [0352] 为了进一步富集，用各自moi＝1的9.3VH和VK感染新鲜的Hela细胞，如上所述将细胞染色，然后分选抗原结合细胞。通过三个冻/融循环从分选的细胞释放病毒，然后在含有1mg/ml G418(用于选择重链)的T175烧瓶中的BSC1上扩增50％的病毒，和在含有0.030mg/ml潮霉素(用于选择轻链)的T175烧瓶中的BSC1上扩增50％的病毒。将扩增的病毒滴定，并称为Her.9.3/VH/分选和Her 9.3/VK/分选。 [0353] 通过流式细胞术测试了Her.9.3/VH/分选和Her 9.3/VK/分选中Her2特异性抗体的选择。用Her.9.3/VH/分选和Her 9.3/VK/分选以moi＝1将Hela细胞共感染过夜，然后针对与Her2的结合进行染色，不存在与对照抗原(C35)的结合。在这个实验中，在冰上用抗-His-APC抗体孵育3μg/ml C35-His或6μg/ml Her2-His 30分钟以形成复合物。然后加入抗-Fab-FITC，并将抗原-抗-His复合物加入细胞中，在冰上持续30分钟。然后用2ml PBS，0.5％BSA，2nM EDTA洗涤细胞。然后将细胞固定，并且运行流式细胞术试验。数据显示出VH和VK两者的富集。 [0354] 为了固定VH和VK的抗原特异性配对，将Her.9.3/VH/分选和Her9.3/VK/分选各自以moi＝0.1共感染至Hela细胞中，然后按照以上针对结合Her2所述的染色。将细胞再次分选，但这次将单个感染细胞分选至96孔平板的单个孔中。每个抗原结合分选细胞应当含有特定VH与特定VK的固定抗原特异性配对。分选后，将细胞经历冻/融，并且然后在96孔板中的BSC1上扩增病毒，使得来自一个细胞的病毒在一个接收孔中扩增。5天后，将板经历冻/融，并且然后将每个孔中的等份的病毒感染至96孔板中的Hela细胞中。每个孔中的病毒应当含有VH和VK的混合物，并且Hela细胞的感染应当导致表面IgG的表达和抗原结合。过夜结合后，按照以上所述的收获细胞并针对Her2结合染色(图28)。 [0355] 从筛选1个平板，鉴定了26个特异性的克隆。通过流式细胞术，这些克隆的重复测试证明了它们结合Her2，但不结合C35。三个代表性的克隆(D5、D8和H2)显示于图29A-C中。然后从病毒提取DNA，并且使用VH和VK特异性的引物将这些病毒中所含的VH和VK基因进行PCR扩增，并克隆至哺乳动物表达载体中，使得它们作为全长IgG1和全长κ来表达。然后测定VH和VK基因的序列。通过测序，这26个克隆含有15个独特的抗体。然后通过IgG和κ表达质粒的共转染在CHO细胞中表达这些抗体，并且在3天后从细胞上清液收获抗体。通过ELISA定量抗体，然后在SKBR3细胞上通过ELISA和流式细胞术测试特异性(Her2+++)。通过ELISA和流式细胞术显示出具有特异性的抗体的代表性数据分别显示于图30和31中。 [0356] 根据本文中的方法重复单细胞分选和筛选其他克隆导致了另外的新抗-Her2抗体的鉴定。 [0357] *** [0358] 本发明的范围不受所描述的特定实施方案的限制，这些特定实施方案打算作为本发明的单个方面的单一说明，并且功能上相等的任何构建体、病毒或酶在本发明的范围内。实际上，除了本文中所示和所述的那些以外的本发明的各种改变对本领域技术人员而言，从之前的描述和附图将变得明显。确定这样的改变落入所附权利要求的范围内。 [0359] 本说明书中提及的全部出版物和专利申请按引用并入本文中，至如同每篇单独的出版物或专利申请特意和单独表明按引用并入的相同程度。将1997年9月22日提交的美国申请No.08/935,377和2000年3月28日提交的美国申请No.60/192,586的公开内容和权利要求按引用并入本文中。 |
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