[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及家蚕钠钾ATP酶，还涉及编码家蚕钠钾ATP酶的基因和应用。

[0002] 钠钾ATP酶(NKA)又叫钠钾泵，是由丹麦科学家J.C.Skou在1957年首次发现的P-type ATP酶，它存在于大多数真核生物细胞中。细胞内外的钠离子浓度梯度可以维持细+ + + 2+胞的体积，而且可以通过Na/H 和Na/Ca 交换体维持细胞内的氢和钙离子浓度。此外，细胞内钠离子梯度产生的静电势是很多细胞膜转运过程(例如葡萄糖，氨基酸和其他营养物质向细胞内的转运)的驱动力，而NKA的主要功能就是维持细胞内的高钾和低钠的离子浓度梯度。

[0003] 迄今为止，在脊椎动物细胞中共发现四个NKA的同位体，除了具有离子转运的功能外，脊椎动物的NKA的α1亚单位可与Src相互作用形成内源激素哇巴因(ouabain)的受体，进而介导细胞下游信号通路来调控细胞的生长速度，特别是在胚胎发育，神经导向，中枢神经系统发育等生理学过程中，发挥了重要作用。近年来许多非脊椎动物如果蝇、暗蚊、线虫和水蛭等的钠钾ATP酶基因相继被克隆出来，经过同源比对发现它们与脊椎动物的NKA同源性非常高，但对非脊椎动物NKA是否也可以与Src相互作用形成受体复合物的研究未见报道。作为鳞翅目昆虫模式生物，家蚕的神经组织中存在NKA，但NKA基因在家蚕体内是以何种形式存在及该基因表达酶的活性包括对家蚕生长发育等过程的影响均未被研究，因此，对家蚕钠钾ATP酶(BmNKA)的全长基因进行克隆、表达和相关功能的研究将有利于阐明NKA在参与无脊椎动物发育、信号传导等过程中所起的具体功能。

[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕钠钾ATP酶，本发明的目的之二在于提供编码家蚕钠钾ATP酶的基因，本发明的目的之三在于提供含有上述基因的表达载体；本发明的目的之四在于提供家蚕钠钾ATP酶的应用。

[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 1、家蚕钠钾ATP酶，所述家蚕钠钾ATP酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或SEQ ID NO.8所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且来源于家蚕的具有钠钾ATP酶功能的酶。

[0007] 2、编码权利要求1所述家蚕钠钾ATP酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7第172-3021位所示或SEQ ID NO.7第172-3021位经取代、缺失或添加至少一个碱基且来源于家蚕的编码具有钠钾ATP酶功能的核苷酸序列。

[0008] 优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0009] 3、含有所述基因的表达载体。

[0010] 优选的，所述表达载体由SEQ ID NO.7第172-3201位所示核苷酸序列连入pEYFP-C1载体的BspEI和BamHI酶切位点处。

[0011] 4、权利要求1所述家蚕钠钾ATP酶在改良蚕丝纤维性能中的应用。

[0012] 本发明的有益效果在于：本发明公开了家蚕钠钾ATP酶和编码家蚕钠钾ATP酶的基因，家蚕钠钾ATP酶具有四个钠、钾离子及ATP结合的保守的氨基酸位点，属于典型的P-type钠钾ATP酶，组织表达谱分析发现家蚕钠钾ATP酶基因在五龄第3天的各个组织中均有表达，而在蛋白水平钠钾ATP酶只在家蚕五龄三天的头部和表皮中有表达，将编码家蚕钠钾ATP酶的基因构建重组表达载体在体外真核表达后具有水解ATP酶活性，建立单克隆细胞系是后续钠钾ATP酶在信号传导功能研究良好的细胞模型，这为阐明家蚕钠钾ATP酶参与家蚕发育、信号传导等过程具有重要意义，也为获得一种丝纤维性能改良的新型家蚕品种具有重要意义。附图说明

[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0014] 图1为BmNKA基因的结构注释图。

[0015] 图2为BmNKA基因和BmNKA蛋白在5龄第3天家蚕雌雄幼虫中的组织表达特征(A：BmNKA基因组织表达谱；B：BmNKA蛋白Western检测结果)。

[0016] 图3为建立的表达YFP-ratα1和YFP-Silkwormα两个单克隆细胞系中外源大鼠与家蚕钠钾ATP酶和内源钠钾ATP酶的Western定量检测结果(A和C表示外源钠钾ATP酶表达结果；B和D表示内源钠钾ATP酶表达结果)。

[0017] 图4为稳定表达YFP-ratNKAα1和YFP-SilkwormNKAα的两个单克隆细胞系中外源钠钾ATP酶的细胞定位检测结果(A：稳定表达YFP-ratNKAα1的单克隆细胞系；B：稳定表达YFP-SilkwormNKAα的单克隆细胞系)。

[0018] 图5为家蚕和大鼠的钠钾ATP酶分别在PY17细胞系中瞬时转染表达后的酶活性测定及Western定量检测。

[0019] 图6为转基因家蚕获得的结果图(A为构建过表达BmNKA基因的转基因载体示意图，B为绿色波长的激发光下筛选转基因阳性个体，转基因阳性个体的蛹和蛾的眼分别在下发出绿色荧光；C为以EGFP为探针的Southern blot杂交结果，泳道1是转家蚕钠钾ATP酶基因的实验组，泳道2与3分别为阳性与阴性对照)。

[0020] 图7为利用红外光谱仪对转基因蚕与非转基因蚕的再生丝蛋白溶液蛋白二级结构观察结果。

[0021] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0022] 以下实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

[0023] 实施例1、家蚕钠钾ATP酶基因(BmNKA)mRNA全长序列的克隆

[0024] 从NCBI中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载果蝇典型的钠钾ATP酶全长氨基酸序列，将该序列在家蚕9倍基因组预测的蛋白质数据库(http://silkworm.swu.edu.cn/silksoft/blast2-simple.html)中进行同源比对，发现基因编号为BGIBMGA005058的基因与果蝇的钠钾ATP酶具有最高的同源性，由于家蚕的钠钾ATP酶(BGIBMGA005058)基因具有8条EST序列，利用软件DNAStar Lasergene对这8条EST序列进行拼接得到该基因的部分正确的mRNA序列后，设计合成5’RACE的基因特异引物和巢氏基因特异引物。5’RACE引物序列如下：

[0025] 5058-p1：5'-ttcgataatacggatgtcggcggga-3'(SEQ ID NO.1)；

[0026] 5058-p2：5'-gaagataccagtaacgatcacgacg-3'(SEQ ID NO.2)；

[0027] 5058-p3：5'-acggatgacggtggcgaattggggg-3'(SEQ ID NO.3)。

[0028] 然后按照GeneRacerTM试剂盒(Invitrogen公司)说明书，扩增得到该基因5’端的非翻译区序列(SEQ ID NO.4)，根据获得的5’端的非翻译区序列与拼接的EST序列设计BmNKA基因的全长序列扩增引物，具体引物如下：上游引物序列为：(5'-cgtccggaatgggcgagacgcgcagaaaacctcccgc-3')(SEQ ID NO.5)；下游引物序列为：(5'-gcggatccttaataataagtctcttgttcgagcc-3')(SEQ ID NO.6)。

[0029] 以家蚕(大造)五龄3天的头部cDNA为模板，利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)切胶回收纯化目的片段，再将所得目的片段克隆到载体pEasy-T1 simple(Transgen公司)，并委托上海生工生物工程有限公司进行测序，结果SEQ ID NO.7所示。结果显示，BmNKA基因mRNA全长共计3030个核苷酸，开放阅读框(ORF)为3030个核苷酸，编码长为1009个氨基酸的BmNKA蛋白(SEQ ID NO.8)，经信号肽预测发现在BmNKA蛋白N端包含一个由22个氨基酸组成的信号肽序列，将获得的全长序列同家蚕基因组数据库比对分析，发现BmNKA基因含15个外显子和14个内含子，如图1所示。

[0030] 将BmNKA基因开放阅读框(ORF)序列及预测的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST比对，根据比对结果分析BmNKA基因进化树。结果显示昆虫、鸟类和哺乳动物等典型的NKA蛋白序列均具有很高的同源性，而且不同物种的钠钾ATP酶亚单位的α1，α2，α3，α4分别聚为一支。但作为NKA酶家族进化的早期形式的昆虫和虫类的钠钾ATP酶仅具有一种亚单位形式。然后根据比对BmNKA，果蝇NKAα，线虫NKAα，人NKAα1，鼠NKAα1，鼠NKAα2和鼠NKAα3的氨基酸序列。结果显示，BmNKA基因含有NKA基因的典型结构，表明BmNKA基因属于典型的P-type钠钾ATP酶。

[0031] 实施例2、BmNKA基因组织表达谱

[0032] 根据BmNKA基因 全长序列 设计特异 引物，具体 如下：上游引物 序列 (FP)：5’-gacaggaatggacctaccg-3’(SEQ ID NO.9)；下 游 引 物 序 列 (RP)：5’-gcctgatctcgtcgtagat-3’(SEQ ID NO.10)。同时设计内参基因家蚕肌动蛋白基因Actin3的特异引物，具体如下：上游引物为(A3-F:5'-aacaccccgtcctgctcactg-3')(SEQ ID NO.11)，下游引物为：(A3-R:5'-gggcgagacgtgtgatttcct-3')(SEQ ID NO.12)。分别取家蚕5龄第3天雌雄幼虫的各组织(1.生殖腺；2.头；3.表皮；4.中肠；5.脂肪体；6.马氏管；7.血细胞；8.前部丝腺；9.中部丝腺；10.后部丝腺；11.阴性对照)材料，取一部分组织材料分别采用TRIzol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，利用M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA第一链，再用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物对进行PCR，PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟，95℃变性40秒、55℃退火30秒、72℃延伸90秒，共25个循环，最后72℃终延伸10分钟，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2(A)所示。结果显示，在mRNA水平，5龄第3天的家蚕各个组织都有BmNKA基因的表达。然后将各组织的剩余材料用于Western杂交以在蛋白水平检测BmNKA酶在各组织的表达情况(与家蚕钠钾ATP酶杂交的LEAVE抗体由美国德克萨斯大学医学院生理学与细胞生物学实验室馈赠)，结果如图2(B)所示。结果显示，在蛋白水平BmNKA酶只在家蚕五龄三天的头部和表皮中有表达。

[0033] 实施例3、单克隆细胞系的建立过程如下

[0034] 根据BmNKA基因mRNA全长序列设计扩增BmNKA基因开放阅读框(ORF)的引物，具体如下：上游引物序列(FW)：5'-cgtccggaatgggcgagacgcgcagaaaacctcccgc-3'(SEQ ID NO.13)，下划线为BspEI酶切位点；下游引物序列(RW)：5'-gcggatccttaataataagtctcttgttcgagcc-3'(SEQ ID NO.14)，下划线为BamHI酶切位点；然后以家蚕五龄3天的头部cDNA为模板进行PCR扩增，经BspEI和BamHI酶切后连入pEYFP-C1载体的(pEYFP-C1载体同样也经过BspEI和BamHI进行双酶切)，获得重组表达质粒，命名为BmNKA-pEYFP。

[0035] 同时克隆大鼠的钠钾ATP酶基因(基因编号GI：55771)，将其连接入pEYFP-C1载体，获得含有大鼠钠钾ATP酶的pEYFP-C1载体RatNKA-pEYFP，作为阳性对照。

[0036] 将LLC-PK1(猪肾表皮细胞系)细胞在6孔板进行培养，待细胞生长到80％左右分别用重组表达质粒BmNKA-pEYFP和RatNKA-pEYFP转染，细胞转染过程参照invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂盒说明；之后给细胞换成不含FBS和抗生素的培养基，24小时后换成含FBS和抗生素G418(500μg/mL)的培养基培养5天，筛选仅表达家蚕和大鼠NKA酶的细胞群落，继续在含有抗生素G418(500μg/mL)的培养基中扩大培养3-5天，再将扩大培养的混合的细胞群落用胰酶消化下来后转移到含有新的培养基的24孔板继续扩大培养一周，最后把这些细胞消化下来后移种入96孔板，确保每个孔内仅含有一个细胞，扩大培养后筛选两个单克隆细胞系(YFP-ratα1和YFP-Silkwormα)进行Western杂交分别检测家蚕和大鼠NKA蛋白(一抗购自FISHER公司，CAT#05369MI)在单克隆细胞系表达的正确性。利用YFP抗体检测外源大鼠与家蚕钠钾ATP酶基因在猪肾表皮细胞系(LLC-PK1)中的表达，Western杂交结果如图3(A与C)所示。结果显示，两个外源钠钾ATP酶基因BmNKA-pEYFP和RatNKA-pEYFP质粒都能够在LLC-PK1细胞中特异表达，但大鼠比家蚕的钠钾ATP酶基因表达量要高的多。同时以转染E-YFP质粒的LLC-PK1细胞系为阴性对照，利用YFP抗体未检测到外源大鼠和家蚕钠钾ATP酶基因在转染E-YFP质粒在LLC-PK1细胞系中表达量。

[0037] 为检测新建立的YFP-ratα1和YFP-Silkwormα两个单克隆细胞系中内源性猪钠钾ATP酶(GI:164381)的表达量，利用通用的商品化哺乳动物的钠钾ATP酶抗体α6F与两个单克隆细胞系进行杂交，Western杂交结果如图3的B与D所示。结果显示，在YFP-ratα1单克隆细胞系中大鼠与猪的钠钾ATP酶基因均可以在大鼠的单克隆细胞系中表达，而在YFP-Silkwormα单克隆细胞系中内源性pigα1表达量比YFP-ratα1细胞系中ATP酶表达量要高得多。

[0038] 四.BmNKA的细胞定位与酶活性测定

[0039] 1、BmNKA细胞定位流程

[0040] 将灭菌后的玻璃切片轻放于6孔板，将YFP-ratα1和YFP-Silkwormα两个细胞系分别培养于玻璃切片上，待贴壁生长至细胞密度达到80％左右后直接利用荧光共聚焦显微镜观察，如图4所示。结果显示，连接有YFP标签的大鼠钠钾ATP酶α1亚单位基本都定位在细胞膜上，而家蚕钠钾ATP酶大部分都在细胞质中，但仍有少部分定位在细胞的膜上。

[0041] 2、BmNKA酶活测定步骤

[0042] (1)制备PY17细胞系：PY17细胞系是通过瞬时转染A4siRNA表达载体(pSuppessor-A4siRNA)到猪肾表皮细胞系(LLC-PK1)24小时后利用浓度1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)进行筛选，其中内源性的猪钠钾ATP酶基因被设计的siRNA靶标序列干涉掉，最后获得了仅含有维持细胞生命必需的7.5％左右内源性猪钠钾ATP酶的PY17细胞系，PY17细胞系可作为下一步测量钠钾ATP酶活性的生物模型(具体方法参见：Man Liang et al.Functional Characterization of Src-interacting Na/K-ATPase Using RNA Interference Assay.JBC.2006.281(28)。

[0043] PY17细胞系培养至细胞密度达到80-90％后，瞬时转染YFP-ratα1与YFP-silkwormα两个质粒到PY17细胞系，每类细胞传代三盘到10cm的盘中，生长到90％左右后用buffer A(BufferA为pH7.4终浓度为30mM组氨酸，250mM蔗糖，1mMEDTANa2*2H2O的混合溶液)溶液收集；匀浆搅拌15次后超声处理；800g离心10min后收集沉淀；再在4℃，45000g高速离心45min获得细胞膜沉淀；接着在100g速度条件下离心10min，用buffer A溶解后测定蛋白浓度，并用buffer A稀释到蛋白浓度为1～2mg/mL，得待测样品；每个样品准备6个管子，其中3个管子加入哇巴因至终浓度为1mM，另3个管子加入等体积的水，每管加入含5～10μg蛋白的待测样品；然后加入丙甲菌素(alamethicin)，加入量按每10μg蛋白加入1μL丙甲菌素，然后于室温下静置10min。

[0044] 准备如表1所示的反应混合体系：

[0045] 表1、反应混合体系

[0046]混合体系 Tris-HCl(pH7.2) MgCl2 NaCl/KCl EGTA-Tris NaAzide Ouabain(或水)储存浓度 200mM 10mM 500/100mM 10mM 50mM 5mM
终浓度 20mM 1mM 100/20mM 1mM 5mM 1mM
体积(μl) 100 100 200 100 100 200

[0047] 向每个管子中加入800μL表1所示反应混合物，然后加入2000μL的5mM哇巴因溶液或等体积的水，37℃水浴锅内孵育45min；反应结束后每个管子中加入900μL浓度为8％的TCA停止反应，然后放入冰中静置10min；稀释标准的磷酸缓冲液(Bio Mol AK-111)，稀释后的浓度分别为：80μM，40μM，20μM，10μM；分别将反应产物吸取20μL后加入到96TM
孔板中，之后加入200μL的BIOMOL GREEN Reagent(Bio Mol,CAT#AK-111)试剂；室温静置20分钟，在OD620nm下检测吸光值；根据检测结果计算酶的活性并将结果转换成酶活性的标准单位(μMol/mg protein/hour)，结果如图5(A)和5(B)所示。结果显示，以哇巴因作为钠钾ATP酶的特异性底物，酶活测定结果显示转染大鼠钠钾ATP酶的PY17细胞系比转染家蚕钠钾ATP酶的活性要高(其中转染E-YFP空载体的PY17细胞系酶活性作为阴性对照)。酶活测定完毕后利用YFP抗体分别检测两个含有YFP标签的大鼠与家蚕钠钾ATP酶基因的表达情况，Western杂交定量结果如图5(C)和5(D)所示，结果显示大鼠的钠钾ATP酶基因表达量要高于家蚕钠钾酶。最后统计单位表达量的钠钾ATP酶的酶活性发现，结果显示大鼠与家蚕的钠钾ATP酶的活性相似。

[0048] 五、BmNKA的功能验证

[0049] 利用以BmCP231作 为特异 启动子，EGFP为 报告基 因的将 重组载体BmCP231-DsRed-SV40，3xP3EGFP](公 开号 为102604954A 的中 国 专 利)构 建 含有BmNKA基因的重组表达载体，具体是将BmNKA基因ORF(SEQ ID NO.7)替换重组载体BmCP231-DsRed-SV40,3xP3EGFP]的DsRed，重组载体的结构如图6(A)所示。然后将含有BmNKA基因的重组表达载体显微注射G0代蚕卵中，并通过绿色荧光筛选筛转基因阳性个体，结果如图6(B)所示。最后通过Southern杂交实验以EGFP为探针检测家蚕BmNKA基因插入拷贝数，结果如图6(C)所示。结果显示，阳性转基因个体是以以单拷贝形式插入到家蚕基因组中，而非转基因家蚕无阳性插入信号，在分子水平证明本次转基因实验成功。饲育家蚕转基因阳性个体与非转基因(阴性对照)至上蔟时期，然后测量蚕丝纤维的力学性能，结果见表2所示。

[0050] 表2、不同蚕丝纤维力学性能参数比较

[0051]

[0052] 注：**和***分别表示P<0.01和P<0.001(学生t检验),

[0053] 结果显示，转基因蚕的丝纤维韧性，杨氏模量及最大抗拉强度与非转基因蚕相比均急剧下降。之后利用红外光谱仪对再生丝纤维蛋白溶液的二级构象进行观察，结果如图7所示。结果显示，转基因蚕的蚕丝蛋白的无规则卷曲结构增加(空心箭头)，而二级结构中的α螺旋与β折叠含量较非转基因相比急剧减少(黑色箭头)。表明了转基因蚕的蚕丝蛋白二级结构的变化是蚕丝纤维力学性能降低的直接原因，这种结构的变化是由于家蚕前部丝腺内腔钠钾离子浓度变化产生的。由于在家蚕前部丝腺中过量表达钠BmNKA使蚕丝的力学性能降低，为了获得性能得到提升的蚕丝纤维，下一步我们将通过转基因干涉的技术在家蚕前部丝腺减少或降低BmNKA基因的表达量，以期获得新型的蚕丝纤维。

[0054] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。