[0001] 本发明涉及一种耐酸的大肠杆菌工程菌，属于遗传工程领域。

[0002] 作为一种重要的大宗化工产品，丙酸主要用途有作酯化剂、硝酸纤维素的溶剂、增塑剂、化学试剂和配制食品原料等。丙酸盐是丙酸的重要衍生物，是国际上公认的性能安全可靠的谷物、饲料和食品的防霉剂。随着饲料工业和食品工业的发展，丙酸的用量正逐年增加，其产量已远不能满足工业需求。

[0003] 丙酸的生产方法有化学合成法和发酵法，化学合成法是以石油化工产品为原料，经过加温加压催化剂等合成，微生物发酵法是丙酸菌在常温常压下利用农副产品等代谢产生丙酸，目前工业生产方法主要是化学合成法。在当前全世界面临环境污染、能源短缺的情况下，用微生物发酵法来大规模生产丙酸是一条值得探索的新途径。微生物发酵法制备丙酸主要菌种为丙酸杆菌，但由于丙酸对丙酸杆菌的细胞生长和代谢活性有较强的抑制作用，因此产酸率很低。因此，如何有效地消除或减轻丙酸对微生物的反馈抑制作用是提高丙酸生产效率的重要科学问题之一，其中提高微生物对丙酸的耐受性能是一项重要的策略。

[0004] 由于缺少有效的基因操作工具，目前尚不能实现对产酸丙酸杆菌的基因操作，无法在产酸丙酸杆菌中验证关键酶对菌体耐酸的作用。大肠杆菌作为细菌的模式菌株，有成熟的基因操作工具和技术，是验证蛋白耐酸相关性的理想宿主。同时，大肠杆菌的发酵过程中多伴随有乙酸的产生，因此也常受到酸性环境的压力，对其耐酸的研究也十分普遍。

[0005] 本发明在大肠杆菌中过量表达产酸丙酸杆菌中耐酸相关酶基因(sec)以提高大肠杆菌的耐酸性，为大肠杆菌和产酸丙酸杆菌的耐酸和发酵提供了指导。

[0006] 本发明的目的是提供一种耐酸的大肠杆菌工程菌，是以大肠杆菌为宿主，过量表达了产酸丙酸杆菌的Secretion neighborhood ATPase。

[0007] 所 述 secretion neighborhood ATPase 的 氨 基 酸 序 列 如 NCBI GenBank:AFV90672.1所示。

[0008] 编码所述secretion neighborhood ATPase的基因sec的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 所述产酸丙酸杆菌耐酸相关蛋白secretion neighborhood ATPase通过蛋白质组学的技术手段分析，含量在产酸丙酸杆菌耐酸菌株比原始菌株有显著的提高。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，以E.coli BL21(DE3)为宿主。

[0011] 在本发明的一种实施方式中，以pACYCDuet-1为载体。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述酸是丙酸或乙酸。

[0013] 在本发明的另一种实施方式中，所述酸是1g/L或2g/L的丙酸，或2g/L、4g/L的乙酸。

[0014] 本发明还提供一种构建所述耐酸的大肠杆菌工程菌的方法，是PCR扩增得到sec目的片段，与载体pACYCDuet-1通过酶切位点Nco I与Hind III连接得到重组表达载体pACYCDuet-sec，将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中得到secretion neighborhood ATPase过量表达的重组菌E.coli BL21(DE3)-sec。

[0015] 在培养基中添加丙酸1、2g/L或乙酸2、4g/L培养所得重组菌E.coli BL21(DE3)-sec，结果发现该重组菌相比对照菌，在丙酸1、2g/L或乙酸2、4g/L条件下的存活率均有较大水平的提高。

[0016] 将Secretion neighborhood ATPase蛋白在大肠杆菌中过量表达，所得工程菌提高了对丙酸和乙酸的耐受性。大肠杆菌的发酵过程中多伴随有乙酸的产生，因此也常受到酸性环境的压力。提高大肠杆菌的耐酸性可以缓解大肠杆菌被酸的侵蚀，延长其生长发酵的周期，提高菌体密度，有利于产物的生产。

[0017] 实施例1secretion neighborhood ATPase的确定

[0018] 收集产酸丙酸杆菌原始菌株与耐酸突变株对数中期同步培养的菌体细胞，分别提取胞内蛋白，通过蛋白质组学的技术手段比较发现，一个蛋白点在耐酸菌株中的含量与原始菌株相比有3倍以上上调，将此点挖出经MALDI-TOF/MS质谱鉴定，确定此蛋白为secretion neighborhood ATPase。Secretion neighborhood ATPase可能与菌体耐酸性能相关。

[0019] 实施例2耐酸大肠杆菌工程菌的构建

[0020] 以NCBI上secretion neighborhood ATPase的氨基酸序列为依据设计引物，以产酸丙酸杆菌P.acidipropionici全基因组序列为模板，PCR扩增得到sec目的片段，序列如SEQ ID NO.1所示。目的基因通过酶切位点Nco I与Hind III连接至表达载体pACYCDuet-1上，得到重组表达质粒pACYCDuet-sec。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，涂布至含有氯霉素抗性的LB固体培养基中。随机挑选转化子进行菌落PCR验证，得到阳性转化子，通过进一步分离质粒进行双酶切验证确定得到了大肠杆菌重组菌E.coli BL21(DE3)-sec。

[0021] 实施例3重组菌与对照菌耐酸实验

[0022] 将E.coli BL21(DE3)-1( 对 照 菌 株，含 有 质 粒pACYCDuet-1) 与 E.coli BL21(DE3)-sec分别接种LB培养基，过夜培养后测量菌浓，作为种子液。取相同OD600的上述种子液接种LB培养基，37℃培养至OD600＝6.0时分别加入终浓度1mg/mL的IPTG进行诱导，30℃诱导培养2h后在每种菌株的培养基中分别添加1g/L丙酸、2g/L丙酸、2g/L乙酸、4g/L乙酸及不添加有机酸。添加1g/L丙酸、2g/L丙酸、2g/L乙酸、4g/L乙酸后培养基的pH分别为4.75、4.35、4.15和3.85。30℃继续培养至稳定期，取发酵液进行梯度稀释后，分别
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取稀释10、10、10、10 的稀释液5μL点至LB固体平板上，37℃培养过夜后进行菌落计数。
平板菌落计数法是研究菌体耐酸性常使用的统计方法，可有效反映体系中受酸性环境胁迫后存活的活菌数，排除衰亡、裂解的细胞对检验结果的影响。进行菌落计数后计算菌株的存活率，结果如表1。sec基因的过量表达使菌体对两种浓度的丙酸和两种浓度的乙酸的耐酸性均有了非常显著的提高。

[0023] 存活率＝添加有机酸后存活的菌落数/未添加有机酸的菌落数*100％[0024] 表1重组菌与对照菌在不同酸中的存活率

[0025]

[0026] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。