通常，关节软骨是一种受损后不会自然再生的组织。近来，已尝试通过在 实验室中再生一部分受损组织来重建受损的生物学组织。这种方法称为“组织 工程”，已受到广泛关注。
组织工程涉及能够于生物学组织特异性相互作用的生物相容性材料的开 发以制备功能性组织等价物。组织工程的基本概念是，从患者收集所需组织， 由组织样本分离细胞，使细胞增殖，将增殖的细胞接种到可生物降解的聚合物 支架上，体外培养细胞预定的时间，然后将细胞/聚合物构建物移植回患者体内。 移植后，移植支架中的细胞利用通过体液的扩散获取的氧气和营养，增殖分化 形成新的组织，支架则发生溶解。
用于再生生物学组织的支架通常包括用作基质的材料，使细胞粘附材料表 面并形成三维组织。这种材料应是无毒、生物相容且可生物降解的。满足上述 物理性质要求的最常用的可生物降解聚合物包括：有机聚合物，例如聚乙醇酸 (PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚氨基酸、聚酐、聚原 酸酯；天然水凝胶，例如胶原、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖；合成水 凝胶，例如聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反 丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)[P(PF-co-EG)以及它们的共聚物。
研究上述聚合物来构建多孔支架。然而，常规制造技术一般导致支架的多 孔性低以至于不能充分支持细胞生长。支架表面的空隙常常发生阻塞，营养不 能充分供给细胞，细胞难以生长进入支架内。近来，组织工程领域中显微制造 技术的应用使得微米级分辨率的复杂支架的开发成为可能。这些支架称为“显 微射流支架”，具有允许支架内流体流动的显微通道网络。该显微通道网络有 助于向支架的不同部分提供营养物质和可溶因子。
支架还可用半透膜进行包封。美国专利公开第2006/0147486号涉及用半 透膜包封的多孔支架。半透膜选择性地将营养物质从支架外部导入支架，同时 将组织细胞产生的代谢废物排泄到支架外部。该公开描述了使细胞在支架内生 长的体外方法，用于再生生物学组织。
美国专利6,627,422描述了一种半透膜包封的纱基质中含有细胞的装置。 在这种情况下，半透膜允许植入的细胞接受营养物质，并且允许植入细胞产生 的治疗性分子扩散至宿主细胞。该装置用于细胞疗法：包封的细胞向宿主分泌 内源性蛋白质。该装置可用作人造生物器官(例如，分泌胰岛素的人造胰腺)
虽然营养物质扩散增加的支架构建技术取得了一些进展，但是，一旦移植 到患者体内，支架的营养供应有限。事实上，在体内营养物质和氧通过邻近椎 间盘的椎骨终板中的血管而被递送至盘细胞。在退行性盘疾病中，椎骨终板功 能受损，不能使足够的营养物质扩散到植入的细胞支架。
可使用不同细胞类型来构建关节软骨。可使用从现有软骨活检获取的关节 软骨的原代分化细胞(即软骨细胞)。这些细胞常常来自自体来源，因为异源细 胞或来自尸体的细胞存在病原体转移的固有风险。间充质细胞干细胞(MSC)是 一种骨髓中发现的胚胎样细胞，能够分化形成不同类型的间充质组织，尤其是 软骨组织；因而成为软骨工程技术的另一细胞来源。
然而，这些细胞来源存在许多问题。椎间盘的软骨细胞难以获取，因为自 体细胞是从患者椎间盘获取的，需要侵入性手术(背部外科手术)进行活组织检 查。如果从健康椎间盘获取细胞，则危害健康盘的功能。如果在椎间盘切除 术期间从受损盘收集细胞，则会提供来自变性组织的异常细胞。而且，软骨细 胞因为去分化而难以培养扩增。对于来自其他软骨组织的软骨细胞，耳弹性软 骨容易收集，但仅能产生透明软骨而不能产生椎间盘中的纤维软骨。MSC也 存在一些缺点，因为需要进行骨髓活组织检查。虽然组织工程技术需要大量细 胞，却难以获取足够量的成人干细胞。
许多文献报道了刺激间充质干细胞形成软骨或去分化软骨细胞的培养条 件。这些条件是：高密度微量培养；低氧；补充生长因子，例如骨形态发生蛋 白(BMP)，尤其是BMP-2、-4、-6和-7，转化生长因子β(TGF-β)，和/或胰岛素 生长因子I(IGF-I)；补充抗坏血酸；在特定基质上培养，例如藻酸盐；机械应 激下培养，例如间歇性流体静压(IHP)(Watt，1988；Dozin等，1992；Sullivan 等，1994；Denker等，1999；Zur Nieden等，2005；Zhou等，2004；Majumdar 等，2001；Barry等，2001；Elder等，2005；Mow等，1992；Domm等，2000)。
很少有研究报道人表皮成纤维细胞(HDF)转换形成软骨细胞样细胞。美国 专利6,489,165涉及高密度微量培养和低氧条件下HDF转化形成软骨细胞样细 胞。French MM等(2004)报道，当细胞在蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖上生长并补 充胰岛素生长因子I(IGF-I)时，HDF转化形成软骨细胞。
盘变性疾病
盘变性疾病(DDD)每年需要4500位脊柱外科医生进行700,000例手术， 并且大多数盘疾病发生在年轻患者中。因此，开发治疗该疾病的有效且安全的 方案是至关重要的。
椎间盘(IVD)是一种复杂的结构，包括三种独特的组织：环、核和软骨终 板。环是良好有序多层结构的胶原纤维。核主要由糖胺聚糖(亲水聚合物)构成)。 软骨终板提供营养物质。上述组织的组合使正常盘执行两种相反功能：稳定和 弯曲。
椎间盘吸收冲击，维持运动并保持稳定。类似于其他软骨，椎间盘(用作 两个椎骨间的连接件)的内在修复能力较低，因为其无血管，只有由终板被动 扩散供应营养。因此，一旦变性过程被激活，最终认为是一不可逆的状况。一 旦受损，变性盘隆起或突出，因而需要切除。
目前，盘变性疾病导致的慢性腰背疼痛患者的常用外科治疗方法是椎间盘 切除术或脊柱融合术。椎间盘切除术是一种合适的手术，通过环内开窗术常规 进行以切除变性核：能够切除突出核(疝切开术)和残余的变性椎间核片段。虽 然该过程对于减轻和缓解神经系统(根部或马尾)是理想的，却不适于脊柱手术， 因为它可引起潜在的致残性疾病，导致需要额外进行侵入性外科手术(如融合 或关节成形术)的变性级联反应。椎间盘切除术能够短时间缓解神经根疼痛， 但却导致盘高度降低，神经-孔狭窄，处理水平不稳定，(对)背痛(的治疗) 结果差，和/或诸如椎管狭窄或小平面疼痛的并发症。
脊柱融合是腰背部疼痛的最优选治疗方法。在该外科手术中，切除整个盘， 通过插入移植物(例如，保持架、骨移植物和/或固定装置)将两个相邻椎骨联合 到一起(融合)。该手术适用于晚期盘变性患者。每年单在美国就有超过200,000 例脊柱融合术，但是由于运动缺失，脊柱融合术改变了椎间盘的生物机械性质 并增加对融合盘附近的盘上的应力和应变。实际上，椎间盘切除术和融合术加 剧了患病盘、相邻盘和周围组织(例如小平面关节)的病症，导致进一步的变性。
这些手术的失败要求探寻开发非融合技术，例如盘或盘核假体。出现了用 人造盘的盘关节成形术来治疗盘变性患者。其优点在于，保持运动功能，降低 相邻区段变性的发生率，避免融合相关并发症，并允许尽早恢复功能。今天， 市售两种类型的装置：整体盘置换和核置换，但这两种装置都具有较大的缺陷。 整体盘置换是大块金属假体来置换整个盘：环、核和终板。这些假体采用侵入 性前路(经腹膜或腹膜后)手术，需要血管外科手术。已报道移出、磨损碎片、 相邻椎间盘变性、小平面关节的关节病以及该类型假体沉陷等问题。人造核替 代品保留剩余的盘组织及其功能。其设计使其能够通过后路途径植入，但这种 核假体的主要限制在于，仅适用于盘变性处于早期或中期的患者，因为它需要 存在有能力的天然环。植入物挤压仍然是主要的考虑。作为一种水凝胶基装置， 它易碎，因而不能抵抗腰椎的显著的(outstanding)生物机械约束(剪切应力)。 对于惰性材料，可随时间丧失其机械性质，报道存在撕裂和破裂。仅置换核并 保留受损环可产生植入物挤出或盘脱出复发的病症。
组织工程和再生医学是治疗DDD的新手段。采用许多方法使组织再生。 这些方法可归为三类：1)采用无添加细胞的生物材料来发送信号，吸引细胞和 促进再生；2)仅使用细胞以形成组织；和3)细胞与生物材料支架联用，支架 用作组织形成的框架。虽然多年来使用自体软骨细胞移植术(ACT)来修复关节 软骨，盘修复的组织工程技术仍然处于萌芽期。正在进行广泛的研究，动物试 验已表明组织工程化椎间盘的可行性。更有趣的是，近来的试验临床研究表明， ACT是椎间盘脱出的有效治疗方法。用于盘修复的ACT的主要缺点在与，需 要进行盘组织活检。因此，需要一种改良的方法来恢复盘解剖学结构和改善其 功能，因而仍然需要软骨修复的改良方法。本发明力图满足这些和其他目的并 为本领域长久以来的需求提供解决方案。
发明概述
本发明涉及任何类型的软骨生物学修复的方法和组合物，例如包括椎间和 关节软骨。更具体地但非排他性地，本发明涉及采用可植入装置实现软骨生物 学修复的方法和组合物，所述装置是惰性结构和活体结构的组合，惰性结构用 作体内生物反应器，活体结构包括软骨细胞或软骨细胞样细胞，例如在具体的 实施方式中，来自示例性的人表皮成纤维细胞(HDF)的细胞。更具体地但非排 他性地，本发明涉及结合惰性结构和活体核(living core)的混合(hybrid)构 建物。在某些方面，所述惰性结构不仅用作递送系统以供养活体核组件并使其 生长，而且用作细胞分化的诱导物。在本发明的实施方式中，所述惰性结构包 括两种可膨胀的球囊样生物聚合物，即包封在外膜(类似球囊)内的内膜(也类似 球囊)。因此，惰性结构包括两种大致同心的可膨胀膜。这两种膜可进一步限 定为第一包封膜，结构上位于第二包封膜之内。在具体的实施方式中，形状可 为大致球形、大致椭圆形、大致圆形、大致圆球形、大致扁圆形、大致扁球形、 大致珠滴形、球囊样等等。在其他具体的实施方式中，形状是个体特异性的， 符合个体关节或椎间盘区域中残余空穴的形状和尺寸。
在某些方面，本发明例如从干细胞、软骨细胞等体外产生天然组织。更具 体地但非排他性地，本发明涉及使人成纤维细胞生长和分化形成软骨细胞样细 胞的方法。将细胞，在某些实施方式中是自体细胞，置入由一种或多种生物聚 合物构成的支架基质(例如以模拟天然基质)。支架可体外接种，并且在某些 方面可向细胞、基质或两者提供生长因子。将支架置于生物反应器内，生物反 应器是用于灌注基质的系统并允许向支架施加机械力。施加力之后，有助于细 胞分化，尤其是形成软骨。
在具体的实施方式中，本发明利用某些细胞分化形成的软骨细胞样细胞。 在具体的实施方式中，例如，在特定培养条件下，例如低氧(Nicoll等，2001)、 高密度微量培养、在特定基质如聚集蛋白聚糖上培养(French等，2004)，HDF 分化形成软骨细胞样细胞。在具体的实施方式中，模拟椎间软骨细胞体内环境 的因素是促使HDF的软骨形成分化的强效刺激物，所述因素包括：1)三个维 数；2)低氧张力(<5％)；3)机械应力；和4)间歇性流体静压。在具体的实施方 式中，测定接种到三维藻酸盐珠培养基中的HDF的细胞活力和软骨形成分化。 在另一实施方式中，鉴定氧张力对藻酸盐珠中培养的HDF分化的作用。在另 一实施方式中，表征流体静压对藻酸盐珠中培养的HDF分化的作用。
细胞分化形成软骨细胞或软骨细胞样细胞可以任何合适的方式进行，包括 装置植入个体之前体外分化或装置植入个体之前体外分化以及植入后的体内 分化。
在具体的实施方式中，本发明装置提供了关节体内再生方法，所述关节包 括椎间盘、肘关节、膝关节、肩关节、髋关节、颞下颌关节等。在本发明的某 些方面，活体腔室包括接种在生物材料中的软骨细胞样细胞(例如来自HDF 的细胞)的细胞基质构建物。在某些实施方式中，可体外启动活体腔室的培养 和分化。将活体核接种到惰性生物材料中并植入，细胞在体内继续增殖和分化。
在某些实施方式中，本发明的应用所聚焦的软骨是椎间盘软骨。在本发明 的具体方面，本发明所用细胞经受机械应变而发生软骨形成分化。因此，本发 明的实施方式提供了椎间惰性结构作为体内生物反应器，用于诱导活体核的生 长和分化。在其他实施方式中，本发明提供了将惰性结构和活体核组合起来的 混合(hybrid)构建物，可采用最小侵入性外科手术将其植入躯体间空间中。
本发明的示例性目的是提供一种方法，该方法旨在修复变性椎间盘，例如 恢复椎间盘解剖学结构并改善其功能。在本发明的具体方面，提供了修复受损 盘的方法，该方法采用由含有惰性(材料)的装置和活体核组成的混合构建物， 所述惰性装置旨在供养内部活体核并使其分化。因此，惰性结构可用作营养物 质和生长因子的递送系统，用作生物反应器，使自体表皮成纤维细胞分化形成 软骨细胞样细胞。在机械应力(例如间歇性流体静压和/或流体剪切应力)下，细 胞将获取中央部核细胞和外周环细胞的特征。示例性的成纤维细胞衍生的软骨 细胞样细胞可从皮肤收集，例如通过活组织检查，然后接种到三维聚合物支架 上，用于修复盘。在特定方面，该过程不再需要侵入性技术来获取自体软骨细 胞。本发明的某些方面，混合构建物结合了惰性生物材料和活体细胞，生物材 料用作营养递送系统，活体细胞可方便地从皮肤收集，其优点在于，能够自我 维持或重塑并可采用最小侵入性后路外科手术恢复盘功能。
在本发明的某些方面，从关节或椎间隙切除受损软骨，并将混合构建物安 装到上述切除形成的空间内。在本发明的一些实施方式中，采用最小侵入性外 科手术植入装置。在具体的实施方式中，采用示例性的外科技术。在椎间盘的 一般实施方式中，如果必须切除两个相邻椎骨间的椎间盘(例如腰椎中)，从患 者背部后路进行外科手术的侵入性较小。该最小侵入性手术能够通过环内小孔 (环切除术)进行躯体间空间的刮除术，切除盘核变性片段。利用该环中小孔， 本发明采用新型椎间修复包，所述修复包可滑过上述切口并膨胀到在躯体间空 间内进行核切除所形成的区域内。在具体的实施方式中，切除受损盘和安装组 织工程化构建物在同一个后路手术中进行，从而尽可能降低风险、外科手术并 发症和再次介入的发生率以及手术时间。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种可植入的装置，该装置包括细胞 /支架组合物(composition)和包封装置，所述包封装置包括第一大致同心膜； 位于所述第一大致同心膜同心外部的第二大致同心膜；所述第一大致同心膜内 的第一容积；位于所述第一大致同心膜之外、所述第二大致同心膜之内的第二 容积；以及从第二容积提取材料的结构，其中，所述第一大致同心膜是半透膜 并容纳细胞/支架组合物。如果各膜的中心基本上邻近，就认为膜相互间大致同 心。
在本发明的某些方面，除本发明可植入装置外还向个体提供另一种疗法。 例如，在植入装置之前、期间和/或之后，可给予个体一种或多种抗生素。示例 性的术后疗法包括非甾体抗炎药(NSAID)、单纯止痛药(镇痛药)、和/或(需要 时)肌松药，然后可能是术后功能恢复，例如术后第一、第二、第三周或更长 时间。
在一些实施方式中，提供了用于软骨修复的混合构建物，所述构建物包括 由惰性材料构成的包封装置和由软骨细胞样细胞构成的活体核。包封装置用作 软骨工程技术的体内生物反应器。它通过提供生长因子和营养物质并传递生理 学负荷状况(physiologic loading regimen)，使软骨细胞体内生长和分化。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种可植入装置，该装置包括细胞/ 支架组合物和包封装置，所述包封装置包括：具有内侧和外侧的第一膜；具有 内侧和外侧的第二膜，所述第一膜被包封在第二膜内侧；位于第一膜内侧的第 一容积；位于第一膜外侧、第二膜内侧的第二容积；以及向第二容积添加流体、 从第二容积去除流体、或实现这两种作用的结构，其中，所述细胞/支架组合物 位于第一膜内侧，所述第一膜具有以下一种或多种特征：半渗透性；生物相容 性；可生物降解性；和可重吸收性；所述第二膜具有以下一种或多种特征：生 物相容性、流体密封性、氧气可渗透性；可重吸收性；可生物降解性；和可膨 胀性。
在一个具体的实施方式中，支架由合成聚合物、天然水凝胶或合成水凝胶 构成。在另一个具体的实施方式中，合成聚合物是聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸 -共-乙醇酸、聚-ε-己内酯或聚(甘油-癸二酸酯)(PGS)。在另一个具体的实施方 式中，合成聚合物是聚磷腈(polyphosphazene)、聚酐或聚原酸酯。在具体的 实施方式中，天然水凝胶包括胶原、透明质酸、海藻酸、琼脂糖、壳聚糖、纤 维蛋白、明胶或它们的共聚物。在另一个实施方式中，合成水凝胶包括聚(环 氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(乳酸)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二 醇)(poly(propylenefumarate-co-ethylene glycol))或它们的共聚物。
在本发明的某些方面，装置中的细胞是软骨细胞或软骨细胞样细胞，例如， 所述软骨细胞或软骨细胞样细胞分泌选自下组的分子：聚集蛋白聚糖、II型胶 原、Sox-9蛋白、软骨连接蛋白和基底膜蛋白多糖。在具体的例子中，细胞由 成纤维细胞和/或干细胞分化。示例性的成纤维细胞是表皮成纤维细胞、腱成纤 维细胞、韧带成纤维细胞、滑液成纤维细胞、包皮成纤维细胞或它们的混合物。
在具体的方面，第一膜由可生物降解的、生物相容的、可重吸收的聚合物 构成。在其他方面，第一膜由聚丙烯酸酯、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨 酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚磷腈、聚丙烯腈、 聚(丙烯腈/共氯化乙烯)或它们的衍生物、共聚物或混合物构成。在具体的方面， 第一膜由聚电解质络合产生。在具体的方面，第二膜包括聚乙醇酸(PGA)、聚 乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚二 氧六环酮(PDO)、聚乙烯、聚(甘油癸二酸酯)(PGS)或它们的衍生物、共聚物或 混合物。在其他实施方式中，第二膜的重吸收速率比第一膜的重吸收速率慢。
在具体的实施方式中，可植入装置包含一种或多种营养剂、生长因子和/ 或药物。在一些情况下，可植入装置可进一步限定为包含含有一种或多种营养 剂、生长因子和/或药物的基础细胞培养基。在具体的实施方式中，培养基补充 有胎牛血清(FBS)、抗坏血酸和/或地塞米松。在某些情况下，营养剂、生长因 子和/或药物可位于支架中、第一容积中、第二容积中，或它们的组合。生长因 子选自：骨形态发生蛋白2(BMP-2)，BMP-4，BMP-6，BMP-7，软骨衍生 的形态发生蛋白(CDMP)，转化生长因子β(TGF-β)，胰岛素生长因子I(IGF-I)， 成纤维细胞生长因子(FGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，FGF-2，血小 板衍生的生长因子(PDGF)，以及它们的混合物，在具体的实施方式中，药物可 进一步限定为一种或多种抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂。
在本发明的某些方面，所述结构包括一个或多个管道和/或一个或多个导 管和/或一个或多个储器。在具体的例子中，所述结构可进一步限定为包括第一 管道、第二管道、任选的第一储器、任选的第二储器中的一种或多种。在具体 的实施方式中，第一和第二管道各自包括位于第二容积内的第一末端，所述第 一和第二管道各自包括连接于第一和第二储器或两者的第二末端。第一和/或第 二管道由与第二膜相同的材料构成，在一示例性的情况下，所述第一和/或第二 管道由硅酮橡胶构成。
在本发明的一种实施方式中，提供了一种修复个体关节(例如椎间盘)中的 受损软骨的方法，该方法包括将本发明的装置递送到个体的各个关节(例如椎 间盘)。在一个具体的方面，该方法还包括在合适的离体条件下制备细胞/支架 组合物。在本发明另一个具体的实施方式中，制备细胞/支架组合物被定义为在 合适的条件下将一种或多种细胞暴露于(subject to)支架。在本发明的某些方 面，制备细胞/支架组合物持续不少于约2-3天。在一个具体的实施方式中，合 适的条件允许细胞增殖，例如，允许刺激软骨形成分化。在示例性的实施方式 中，合适的条件可进一步限定为高密度微量培养(micromass culture)，低氧张力 下(约1.0％-7.5％)，机械应力下，和/或给予补充有生长因子、抗坏血酸和/或地 塞米松的培养基。
在一个具体的实施方式中，细胞/支架组合物经受机械应力，所述机械应 力可以是流体静压、流体剪切应力或其组合。在一个具体的实施方式中，机械 应力是间歇性的。在具体的情况下，机械应力是流体剪切应力，支架是微射流 支架。
在其他具体的实施方式中，递送步骤被限定为采用最小侵入性手术植入装 置。在一示例性情况下，将装置植入患者之后，使第二膜膨胀以填充关节(例 如椎间盘)中的空隙。在另一示例性情况下，在将装置递送至个体椎间盘之前， 从个体切除至少一部分内源性椎间盘。在具体的实施方式中，本发明所涉及的 关节可以是椎间盘、膝关节、肩关节、肘关节、髋关节、或颞下颌关节等。
在本发明的某些方面，装置结构包括：具有第一和第二端的第一管道，所 述第一管道的第一端位于第二容积内；具有第一和第二端的第二管道，所述第 二管道的第一端位于第二容积内；第一储器；和第二储器，其中，将装置递 送至个体椎间盘和使第二膜膨胀之后，所述第一和第二管道的第二端分别连接 于所述第一和第二储器。在一个具体的实施方式中，所述第一和第二储器位于 个体皮下。本发明方法还可包括密封第一膜、密封第二膜、或进行上述两者操 作。在一个具体的实施方式中，至少一部分第二容积发生交换。在一个示例性 的实施方式中，本发明方法还包括通过第一储器去除至少一部分的第二容积。 在另一具体的方面，该方法包括去除来自第一或第二储器的流体，将流体分别 递送至第二或第一储器，或在去除第一或第二储器的流体的同时将流体分别递 送至第二或第一储器。
在某些情况下，将细胞/支架组合物插入第一膜，然后将装置递送至个体， 或者，将装置递送至个体之后将细胞/支架组合物插入第一膜。在一个具体的实 施方式中，将第一膜插入第二膜，然后将装置递送至个体，或者，将装置递送 至个体之后将第一膜插入第二膜。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种制备细胞/支架组合物的方法， 其中，所述细胞是软骨细胞或软骨细胞样细胞，该方法包括：将能够分化形成 软骨细胞样细胞的细胞提供给支架；使细胞经受机械应力；和任选地使细胞接 触适合于软骨细胞或软骨细胞样细胞的分化形成过程的一种或多种生长因子。 在一个具体的实施方式中，机械应力是间歇性的。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种试剂盒，其包括本发明的装置， 所述装置被容纳在一种或多种合适的容器中。在具体的实施方式中，试剂盒还 包括细胞，所述细胞是软骨细胞、软骨细胞样细胞、或能够分化形成软骨细胞 或软骨细胞样细胞的细胞。
在另一个实施方式中，提供了一种可植入的装置，该装置包括：包封在膜 内的细胞/支架组合物，所述膜具有内侧和外侧；和用于交换至少一部分的膜内 流体的结构，所述膜具有一种或多种以下特征：半渗透性；生物相容性；可生 物降解性；和可重吸收性。
在另一个实施方式中，提供了一种用于软骨修复的混合构建物，该构建物 包括：包含惰性材料的包封装置；和包含软骨细胞样细胞的活体核，所述包封 装置包封所述活体核。
在另一个实施方式中，提供了软骨工程技术的体内生物反应器，其包括可 包封细胞的装置，其中，所述细胞能够分化形成软骨细胞或软骨细胞样细胞， 所述细胞包封提供了适合所述细胞体内生长和分化的条件，所述条件包括提供 在所述细胞上的生理学负荷状况。在一个具体的实施方式中，生理学负荷状况 包括来自个体脊柱的力。
上述内容广泛地列出了本发明的特征和技术优点，因而能更好地理解下文 对本发明的详细描述。本发明的其他特征和优点将在后文中描述，这些特征和 优点形成本发明权利要求书的内容。本领域技术人员应理解，所述概念和具体 实施方式可方便地用作改进和设计其他结构的基础，用于执行与本发明相同的 目的。本领域技术人员还应理解，这些等价结构也不背离所附权利要求书所述 的本发明的精神和范围。结合附图，参考以下描述，将更好地理解认为是本发 明特征的新型特点，包括组成和操作方法方面，以及其他目的和优点。然而， 应清楚指出，每幅图仅仅是为了阐述和说明的目的，而不应理解为对本发明的 限制。本发明引用了许多参考文献和文件，全部将其纳入本文作为参考。
附图简要说明
为了更全面地理解本发明，现在将结合附图参考以下说明。
图1显示了示例性的L4-L5椎间隙的剖面图。
图2显示了椎间隙的后路途径，包括示例性的脱出组织和变性盘组织。
图3显示了进行盘切除的环缺损位置的示例性实施方式。
图4显示了本发明实施方式中的腹部截面和引流系统，包括示例性的中线 切口和示例性的HR储器(Holter-Rickham reservoirs)(CS有限公司(Codman & Srrartleff，Inc.)；Raynham，马塞诸塞州)。
发明详述
如本说明书中所用，“一个(a)”或“这个(an)”可表示一个或多个。如 权利要求书中所用，当与“包括”联用时，词语“一个”可表示一个或一个以上。 如本文所用“另一个”可表示至少第二个或更多个。在具体的实施方式中，本发 明各方面可“基本上包括”或“包括”本发明的一个或多个序列。本发明的一些实 施方式可包括或基本上包括一种或多种元件、方法步骤和/或本发明的方法。认 为本文所述的任何方法或组合物可参照本文所述的任何其他方法或组合物来 实施。
I.定义
本文所用的术语“生物反应器”是指能够实现生物转化的系统。在具体的实 施方式中，细胞以受控方式进行培养并通过特异性反应过程发生转化。在本发 明的一些方面，生物反应器能够调节一种或多种以下参数：温度、介质pH、 气体交换、机械刺激、pO2、PCO2和湿度。在具体的实施方式中，生物反应器 中存在灌注系统(灌注-生物反应器)，提供恒定的营养供给和有效去除废弃产 物。机械应力是软骨细胞功能的重要因素。关节运动期间间歇性地同时发生机 械应力的组合，包括细胞和组织变形、压缩力和剪切力、流体流动以及流体静 压的变化。在某些方面，这些状态由生物反应器重现。
本文所用术语“导管”是指空心管道，可以是柔性或刚性，用于从体内某区 域引流流体。
本文所用术语“软骨细胞样细胞”是指不是原代软骨细胞，而是由干细胞 (例如间充质干细胞)衍生的细胞，或由其他细胞系(例如成纤维细胞)衍生的细 胞。软骨细胞样细胞具有软骨细胞(软骨的细胞)的表型。这表示它们不仅具 有软骨细胞的形状(例如，多角形和/或菱形细胞)，而且能够聚集和产生软骨基 质组分，例如硫酸化蛋白聚糖或II型胶原。因此，软骨细胞样细胞的示例性标 记物包括聚集蛋白聚糖(一种硫酸软骨素和硫酸角质素蛋白聚糖)、II型胶原、 Sox-9蛋白质、软骨连接蛋白和基底膜蛋白多糖(一种硫酸类肝素蛋白多糖)中 的一种或多种。
本文所用术语“共聚物“是指包括两种或多种不同单体的聚合物(聚合物： 包含大分子的天然来源或合成的化合物，由一系列的重复简单单体连接形成)。
本文所用术语“去分化”是指专门化的细胞或组织退化到较简单、胚性程度 较高的非专门化形式。当软骨细胞离体单层生长时，它们缺乏体内环境(尤其 是三维和机械应力)，并经历称为去分化的形态学和分子变化。该过程涉及形 态学改变，以及软骨细胞特异性基因的表达改变为正常情况下成纤维细胞中基 因的表达。
本文所用术语“椎间盘切除术”是指通过环内开窗术切除部分或所有变形 核的手术。它可采用手术显微镜通过最小侵入性方法进行。该手术过程通过切 除压缩的脱出(突出)核来缓解根部。它可通过环内肌腱切断(孔)来切除变性的 剩余核。具体地说，椎间盘切除术实际上是切除变性核片段的疝切除术。
本文所用术语“包封”是指包封在边界，例如膜囊内。
本文所用术语“流体剪切应力”是指流体在表面上的运动，导致剪切应力的 产生。剪切应力是应力平行于表面时的应力状态。微射流支架允许流体在微通 道内流动。流体流动在接种到支架中的细胞上诱导流体剪切应力。
本文所用术语“密封”是指例如通过融合或封口，使不透液体。具体地说， 密封膜不允许内部的液体从膜流出，虽然允许氧气和二氧化碳通过膜(例如氧 气进入膜，二氧化碳离开膜)。
本文所用术语“流体静压”是指静止时由液体(例如水)产生或传递的压力。 椎间盘在不同的负荷运动期间暴露于宽范围的盘内流体静压，躺下或放松静坐 期间最小(约0.25MPa)，弯腰提重物(lifting weights with a round back)时最大 (约2.5-5MPa)。这些不同的负荷幅度根据其幅度，通过改变盘基质周转而影响 椎间盘。进行了许多研究来确定体外应用于细胞以在体外诱导细胞软骨形成分 化的间歇性流体静压(IHP)的最佳方案。测试了不同的方案。在这些研究中，应 用的IHP在0.5Mpa-5Mpa的振幅范围内，频率范围0.01-1Hz。在具体的实施 方式中，包封装置被设计成能够在体内将流体静压传递至细胞基质构建物。在 不同的负荷运动期间，填充了液体(介质)的外部包封被压缩；在这种压缩下， 一些液体介质扩散通过半渗透内膜，从而灌溉细胞-基质构建物并在细胞-基质 构建物内产生流体静压。在该系统中，将合适的生理学流体静压应用于细胞- 基质构建物，有利于细胞的软骨形成分化。
本文所用术语“低氧”是指缺乏氧气。在具体的方面，指氧张力小与约20％。
本文所用术语“关节”是指骨骼的两根骨头联结的体内区域。
本文所用术语“膜”是指柔软材料层，其分割不同类型和/或区域的生物材 料。它可由天然和/或合成材料构成，例如，可能能够渗透溶液中的物质。
本文所用术语“微射流支架”是指包括微通道系统的材料。
本文所用术语“最小侵入性外科手术”是指通过个体中的一个或多个小切 口进行的外科手术。例如，在某些方面，最小侵入性外科手术采用专门的技术， 带显微镜的袖珍照相机，小型光纤信号灯和/或高清晰度监视器。对于个体来说， 最小侵入性外科手术是指与常规开放式手术相比，对身体的创伤较小、失血较 少、手术疤痕较小以及对镇痛药的需要较少。相对于常规开放式手术，最小侵 入性手术后个体能更快离开医疗机构，更快回到正常生活。
本文所用术语“储器”是指用作注射室的装置。在具体的实施方式中，储器 类型可以是本领域常规用于将药物(例如，在脑膜炎或室炎的情况下，抗生素) 递送到脑室系统(因而称为“脑室造瘘术”)，递送到静脉内(肿瘤学目的的化疗)、 或递送到蛛网膜下脊柱间隙内(吗啡以缓解疼痛)的类型。在具体的方面，考虑 了一种药物递送系统。它包括几个部分：1)硅酮基(称为“硅橡胶”)材料顶层， 允许重复穿孔而不丧失其防水特征；2)不锈钢基质，避免针损伤下层组织；3) 连接导管的硅橡胶末端。导管也可由硅橡胶构成。其远端可进入目标部位切割 成适当的尺寸，而其近端则连接于储器末端。示例性的系统具有1-2cm3的腔室， 因而称为“储器”(储罐)。
本文所用术语“支架”是指例如支持细胞生长和/或迁移的多孔可生物降解 的聚合物构建物。
本文所用术语“接种”是指将细胞植入支架中。细胞将粘附于支架，然后在 支架中生长分化。
II.本发明的一般实施方式
在本发明的一般实施方式中，提供了一种装置及其使用方法，所述装置包 括包封在多层膜内的软骨细胞样细胞的细胞-基质构建物。虽然至少部分地通 过本发明方法可修复任何组织，包括任何软骨组织，但是在具体的实施方式中， 修复椎间盘软骨或关节。本发明示例性方法采用活体核和惰性核或结构的组 合，从而提供混合结构。在本发明的具体方面，活体核包括软骨细胞样细胞(例 如来自HDF的细胞)的细胞-基质构建物，惰性结构包括活体核，采用最小侵入 性外科手术植入患者体内。
本发明提供了采用自体人表皮成纤维细胞(HDF)作为细胞源进行软骨生 物学修复的方法。本发明还提供了一种装置，该装置包括包封在多层膜内的细 胞(例如软骨细胞样细胞)的细胞-基质构建物。在具体的实施方式中，本发明涉 及采用特殊装置实现细胞体内生长与分化。通过机械应力，在具体的方面，间 歇性流体静压(IHP)和/或流体剪切应力，诱导软骨形成分化。在本发明的一般 实施方式中，采用HDF作为细胞源，工程构建新的椎间盘软骨，因为这些细 胞容易收集和生长。想法是诱导这些细胞分化形成软骨细胞样细胞。已存在一 些HDF软骨分化形成软骨细胞样细胞的例子。然而，这些研究仅在体外进行， 使细胞分化的技术基于使用特异性生长因子，低氧或特定的基质如聚集蛋白聚 糖。
因为其设计，该装置允许一种或多种以下过程：1)营养物质和氧气扩散至 活细胞；和/或2)负荷转移到细胞上。机械力，尤其是IHP是成纤维细胞软骨 形成分化的关键。已知IHP是诱导和维持软骨细胞表型的最强效刺激。当从软 骨收集软骨细胞用于体外工程构建新的软骨时，这些细胞需要扩增，但这可导 致软骨细胞去分化。已表明IHP可使细胞重新分化形成软骨细胞。采用软骨细 胞在体外工程构建软骨的人常常采用机械应变，尤其是IHP作为分化诱导剂。 然而，没有文献报道IHP对HDF软骨形成分化的作用。
在本发明的实施方式中，所述装置至少包括两个部件：1)细胞-基质构建 物，其中，所述细胞(例如HDF)被接种到支架中(可冲走没有粘附于支架的细 胞)；2)包封装置。在具体的实施方式中，体内包封装置包括两种同心膜。1) 内膜是半透膜，包裹细胞-支架构建物(这种半透膜可渗透小分子，因而允许营 养物质和氧气的扩散以及废物的消除，但不可渗透大分子如胶原和葡萄糖胺聚 糖；这些形成天然细胞外基质的大分子被保留在支架内；和2)外膜是不可渗透 流体但可渗透氧气，它可扩张和膨胀以通过最小侵入性后路外科手术植入(在 具体的实施方式中，一旦膨胀将充满椎间盘切除术的空腔，例如准确匹配该空 腔)。外膜充满滋养细胞的介质。外壳内包封的流体形成将IHP转移至活细胞 的流体环境。大约在手术后个体能够站立并开始重新行走的这一天，他对脊柱 施加一定的负荷，尤其是对器械化的脊柱高度(instrumented level)施加负荷。 因此，活体核在生理学负荷下通过充满介质的包壳接受正确的周期性流体静压 状况，这有利于HDF的生长和转化。因此，在某些方面，患者植入装置后大 约1天内即可行走，植入装置后约2天、约3天、约4天、约5天或约更多天 的时间内即可行走。
在一个具体的实施方式中，充满介质的外膜连接引流系统以有规律地更换 介质。通过机械应力，尤其是间歇性流体静压(IHP)和/或流体剪切应力在体外， 然后在体内诱导HDF软骨形成分化。示例性的共培养条件如下所述：高密度 微量培养、补充BMP-2、抗坏血酸、以及低氧。
本发明解决了该领域中的许多问题。营养剂和生长因子通过原位介质提供 给细胞-基质构建物。这可避免营养剂从周围天然组织(终板)的扩散问题，这种 扩散常因为这些结构的变性而不充分。将对HDF的软骨形成分化重要的生长 因子加入到介质中。在具体的实施方式中，采用HDF而无需使用收集软骨细 胞的侵入性技术。在体外使HDF或任何其他细胞预先分化一段时间，然后在 体内继续生长和分化。外部包壳中充满流体的包封装置将提供适合HDF软骨 形成分化的生理学负荷和压缩力。
III.混合构建物
本发明采用混合构建物来修复关节(例如椎间盘)中的软骨。混合构建物的 示例性实施方式如本文所述，在某些方面，混合构建物是可植入的装置，用于 植入哺乳动物，例如人、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊等。在具体的方面，混 合构建物至少包括活体核和惰性结构，所述活体核包含细胞和支架。
A.细胞/支架组合物
活体核也称为细胞/支架组合物，它是一种细胞-基质构建物，包括接种在 支架(也可称为基质)中的细胞。在一个具体的实施方式中，支架包括藻酸盐珠； 微射流支架(微射流支架可由任何可生物降解的生物聚合物构成：有机可生物 降解的聚合物，例如聚(L-乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸 (PLGA)；天然水凝胶，例如胶原、HA、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、胶原/HA 组合、壳聚糖/GAG组合、胶原/GAG组合；和/或合成水凝胶，例如聚(环氧乙 烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共- 乙二醇)(P(PF-co-EG))。在具体的实施方式中，使用细胞粘附配体如肽或多糖。 肽序列能够结合细胞受体。这些肽包括示例性的氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸(RGD)、精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(REDV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘 氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)、或异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸 (IKVAV)，它们可附连于支架，其中可加入配体和/或生长因子以调节细胞命运。 事实上，生长因子可结合在支架内或包含在外膜的介质中。支架材料是可生物 降解的，生物降解的速率是可操纵的。
根据本发明，如上所述，机械应力下HDF在体外或在体内或者先在体外 再在体内分化形成软骨细胞样细胞。如上所述，重要的共培养条件包括高细胞 密度培养；生长因子(BMP-2)；和/或抗坏血酸。低氧张力并在含胰岛素生长因 子I(IGF-I)的聚集蛋白聚糖上培养的条件下，HDF也可分化形成软骨细胞样细 胞。如上所述，使用生物反应器在体外诱导HDF增殖和分化。在本发明的具 体方面，使用本发明的惰性结构在体外诱导分化。在本发明具体的实施方式中， 藻酸盐珠中的HDF或接种在微射流支架中的HDF或接种在任何其他聚合物支 架中的HDF被包封在半透膜中，半透膜是惰性结构的一部分。半透膜的作用 是包封软骨细胞-基质构建物以浓缩ECM蛋白质的产生。该膜允许例如氧气、 营养剂/废物和二氧化碳通过。
在具体的实施方式中，支架是指支持细胞生长和/或迁移的可生物降解的 多孔聚合物构建物。在具体的实施方式中，这种材料是无毒、生物相容且可生 物降解的。
在示例性的实施方式中，支架采用藻酸盐。藻酸盐是一种从海藻分离的天 然多糖。它是由D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸(guluronate)单体组成的多糖。 当与钙离子交联时，形成可生物相容的、可生物降解的凝胶。藻酸盐是一种公 知的组织再生疗法的基质材料。其比其他水凝胶更广泛地用于评价水凝胶支架 用于软骨工程的体内潜力。本发明可使用藻酸盐巨珠(1-3mm大小)或藻酸盐微 珠(250-500μm)。优选藻酸盐微珠。这些较小的珠具有较高的表面-体积比，允 许必需营养物质的良好转运，它们的脆性也较低。藻酸盐是生物相容的，由美 国食品药品管理局批准用于人体。
HDF可接种在藻酸盐巨珠(如下所述)或优选地藻酸盐微珠中。本领域已知 各种技术来产生藻酸盐微珠。通常由静电液滴产生方法制备。例如，HDF可按 照下述方法接种到藻酸盐微珠中。将藻酸盐粉末(西格玛，圣路易斯，密苏里 州)以2.2％w/w的浓度溶解到WFI水中，然后与HDF在培养介质中的混悬液 混合，获得最终浓度1.5％w/w藻酸盐和107细胞/毫升。然后通过静电液滴产 生方法制备藻酸盐微珠。简言之，通过注射泵使细胞/藻酸盐悬液以14，0ml/h 的恒定流速挤压通过带正电荷的钝不锈钢针，在胶凝浴(gelling bath)(1.5w/v CaCl2)中收集液滴。随着钠离子与钙离子发生交换，藻酸盐液滴硬化并与包封 的细胞形成不溶性微珠。微珠在胶凝浴中保留30分钟以完成胶凝作用。
在具体的实施方式中，也可采用微射流支架。它们是具有微米级分辨率的 复杂支架。这些支架提供微通道网络，允许流体在支架内流动。该微通道网络 有助于向支架的不同部分提供营养物质和可溶因子。这些支架可由不同的生物 聚合物构成。它们可以是合成聚合物，例如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚 乳酸-共-乙醇酸(PLGA)；合成水凝胶，例如聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯 醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))， 或可生物降解的弹性体聚(甘油-癸二酸酯)(PGS)。本发明中，用半透膜包封 微射流支架。半透膜允许含营养物质和生长因子的介质灌注到支架内。通过在 微通道网络内循环，介质在接种到支架中的细胞上施加流体剪切应力。机械力 是HDF软骨形成分化的关键。
B.惰性结构
在本发明中，混合构建物采用惰性结构作为其组成的一部分。惰性结构的 作用可以是生物学上的(递送营养物质和/或生长因子)和/或机械上的(将机械力 转移到细胞/支架组合物上；该力可包括IHP和/或流体剪切应力)。通过转移机 械应变和向细胞/支架组合物提供介质(通过半透膜灌注)，惰性结构可用作“体 内生物反应器”。
在某些实施方式中，惰性结构的作用包括以下一种或多种：1)密封包裹活 体核；2)用作半透膜，在一定生理-化学条件下(例如，流体静压、渗透浓度、 温度等)允许某些分子(例如营养物质、生长因子等)扩散通过，有时专门称为“易 化扩散”；3)向活体腔室转移负荷和分享动态机械应力(流体静压)，用于诱导细 胞分化；和/或4)用作体内生物反应器。
在具体的实施方式中，可认为惰性结构是包封装置。在某些实施方式中， 它被设计成将机械应力施加到接种在三维支架组合物中的细胞上。包封装置的 外膜充满流体(介质)。包封在包壳内的流体形成将循环的流体静压转移至活细 胞的流体环境。当患者站立时，他对其脊柱施加一定负荷，通过充满流体的外 部包壳将负荷转移到活细胞。该膜提供适合细胞(例如HDF)软骨形成分化的生 理学负荷和压缩力。在细胞嵌入微射流支架的情况下，微通道内循环的介质也 对细胞施加流体剪切应力。流体剪切应力是诱导细胞软骨形成分化的另一种 力。
在具体的实施方式中，膜通常为球囊形，在其他实施方式中，膜通常相互 同心。在其他具体的实施方式中，惰性结构包括两种可膨胀的球囊样生物聚合 物，即外球囊“E”和包封在外球囊内的内球囊“I”。因此，惰性结构包括两个能 够相继膨胀并具有膨胀活性的同心包壳。在某些方面，装置可采用数量为X的 膜，其中，X是大于0的任意整数。即，X个球囊可以像洋葱那样层状同心安 装，每一层限定具有特定功能的空间(例如，用于废弃物、介质、氧气和/或用 于连接移植物与天然组织)。
在一个实施方式中，外球囊、层或包壳“E”包括可生物相容的弹性、可膨 胀、密封、可扩张、和/或可重吸收(时间T1，其中T1是“E”完全吸收所需的时 间)的材料，一旦安装到空腔内可密封。在具体的实施方式中，外球囊“E”可具 有或具有一种或多种以下活性：1)接受包封细胞的第二内球囊或层或包壳 “I”(以细胞-基质构建物、或细胞溶液或移植物的形式)；2)用介质(例如液体)膨 胀或扩张其壁(例如通过溶胀(swelling))以填充椎间盘切除术导致的空腔；和 3)闭合环缺损以防止构建物受力时它从肌腱切断切口从躯体间空间“脱出”或伸 出。
在一个实施方式中，内球囊或层“I”包括可生物相容的、弹性、可膨胀、 半渗透性、和/或可重吸收(时间T2根据本发明的一个方面，外部腔室介质(例如液体)或溶胀壁(例如水合水凝 胶)“E”和内部半渗透包壳提供了能供养(feed)内部活体核的营养物质和生长 因子的递送系统。这些包壳也可将机械力，包括流体静压转移至活体核。
惰性结构是旨在包裹、供养和分化由细胞(例如HDF)组成的活体核的包封 装置。
在优选的实施方式中，惰性结构包括两种可扩张的球囊样生物聚合物膜， 即外膜“E”和包封在外膜中的内膜“I”。因此，惰性结构包括两个旨在相继膨胀 的同心包壳。在静止位置，两个包壳“I”和“E”为扁平(flat)、可变形、成形 (shaped)和相互匹配。一旦植入它们都可密封。在具体的实施方式中，可通 过选择组织工程系统来确定惰性结构组成。
外部包壳“E”包括的材料是可膨胀的(以通过最小侵入性后路途径平面植 入，然后填装活体核，然后用介质溶液膨胀)；弹性(将负荷共享转移到活体核)； 可扩张(允许其扩张和填充椎间盘切除术导致的空腔)；可渗透氧气但不可渗透 流体：相对低氧是HDF转化的有利参数，只是天然盘内的氧气张力适当较低； 可生物降解的(允许移植物与剩余的天然盘重新连接)；可生物相容(以尽可能减 少炎症反应)；可重吸收的(时间T1)；或它们的组合。
在具体的实施方式中，“E”可位于关节内，例如，在一对相邻椎骨之间、 剩余的盘组织内的躯干间空间刮除术产生的空腔内。其也可机械维持负荷下的 盘高度。在其他实施方式中，“E”接纳包裹活体核的第二内部球囊“I”。“E”可用 流体溶液(例如介质)膨胀以在腔室(由锥间盘切除术产生的空腔)中向外周延 伸至剩余的盘组织并充满空腔。“E”被构造成允许例如在等压方案下更换介质 (例如，去除代谢废物和/或补充营养物质和/或生长因子)。在某些方面，“E”通 过在循环流体静压下(有利于细胞分化形成软骨细胞样细胞)将共享负荷转移到 活体核上，用作体内生物反应器。在具体的实施方式中，“E”的构型由于其特 征而导致相对低氧(低氧或低氧模拟剂，如乳酸盐，诱导HDF转化形成软骨细 胞样细胞)。“E”还可闭合环缺损(肌腱切断开口)，以防止构建物在负荷下通过 肌腱切断切口从躯体间空间“脱出”或伸出。
在本发明的某些方面，内膜“I”具有以下性质：生物相容性；弹性；可膨 胀性(在消耗介质的同时，活体核生长并扩张至外膜内壁)；半渗透性(营养物质、 生长因子等的受控释放)；可生物降解性(因而不会干扰已修复组织的长期性 能)；和可重吸收性(时间T2这两个膜(“E”和“I”)限定两个容积VE和VI。这两个独立的容积可具有不同 的形状(球形、圆柱形、锥形等)，取决于椎体间空腔的外形和共享负荷。在具 体的实施方式中，装置符合空腔形状。
容积VE可限定为分离膜“E”和膜“I”的空间。在具体的实施方式中，它包 含将要例如通过半透膜“I”递送至细胞的营养物质和生长因子(介质)。它还可用 作负荷支承结构，能够将机械应变，例如循环的流体静压状况或高流体剪切应 力(由于其高水分含量)转移至活体核(诱导细胞如HDF软骨形成分化)。
容积V1可定义为由内部半透膜“I”向外限定的空间，包括由软骨细胞样细 胞，例如从HDF衍生的细胞构成的活体核。
直到活体核有活力(例如，能够自我维持)，有规律地更换包封在VE中的 介质以除去代谢导致蓄积的任何有毒废物(例如自由基和/或乳酸)以及细胞生 长产生的其他细胞碎屑或碎片。更换介质允许补充营养物质和/或生长因子。在 具体的实施方式中，该过程周期性进行，例如每周或每月一次或多次，例如， 每周至少一次，例如每周两次。在其他具体的实施方式中，需要为“E”配制其 他特征以引流VE。在某些方面，引流系统可由一根或多根管道和一个或多个 储器组成，在具体的实施方式中，引流系统包括两根管道和两个储器。第一根 管道用于去除用过的介质，第二根管道用于注入新的介质。每根管道(或导管) 包括密封连接于VE的近端和连接于储器的远端。这些导管可由与“E”相同的材 料构成或由硅酮橡胶构成。其长度可以是任何合适的长度，只要它们能够从储 器连接至装置。它们可约为10-15厘米，根据手术部位的深度和解剖学数据(患 者形态学)以合适的长度切割其远端进行术前设置。其外径可以是任何合适的 长度，但在具体的实施方式中，外径约为2.5毫米，因而足够小以从肌腱切断 孔伸出，不会压制或损伤相邻的根部，内径1.2毫米。
导管可在椎间盘切除术结束时植入，植入后，使生物反应器膨胀和密封， 然后进行皮肤缝合。它们可连接于各个管道(导管)的远端。然后，皮下放置各 储器，使其由通过皮肤的针(经皮穿刺)触及。
在一个实施方式中，可用“I”预先包封工程化活体核，然后滑入“E”。在消 耗介质的同时，活体核扩张至包壳“E”的内壁。包壳“E”重吸收，移植物与剩余 的天然盘重新连接。
1.内部半透膜
内部包壳包括活体核，包括受控释放系统(以通过其半渗透性用介质供养 活体核)，是可扩张的(消耗介质的同时，活体核扩张至外膜内壁)，和/或是可生 物降解的(从而不会干扰修复组织的长期性质)。
在具体的实施方式中，内膜是包裹细胞-支架组合物的半透膜。该半透膜 可渗透小分子，因此允许营养物质和氧气扩散以及废物的消除；但该膜不可渗 透大分子如胶原和葡萄糖胺聚糖。因此，这些形成天然细胞外基质的大分子被 保留在支架内。该膜还将细胞-基质构建物与宿主环境隔离，保护宿主免于针 对生物聚合物支架的炎症和免疫反应。
可使用各种聚合物和聚合物掺混物来制造该膜，包括但不限于聚丙烯酸酯 (包括丙烯酸共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰 胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈、聚丙烯腈、聚(丙 烯腈/共氯化乙烯)、PTFE以及它们的衍生物、共聚物或混合物。
在一个实施方式中，半透膜由聚电解质络合产生：聚阴离子(PA)和聚阳离 子(PC)通过带相反电荷的聚合物间的相互作用形成聚电解质络合物(PEC)。阴 离子组分可以是生物相容性聚合物，例如但不限于：海藻酸钠、硫酸纤维素、 羧甲基纤维素或透明质酸，阳离子组分可由聚合物，例如但不限于壳聚糖、聚 (L-赖氨酸)、聚(L-鸟氨酸)、聚(亚甲基-共-胍)、聚(乙烯胺)、聚(乙撑亚胺)、聚 (DADMAC)或聚(N-乙烯吡咯烷酮)构成。
为了实现用半渗透性PEC膜对细胞-基质构建物的包封，先将细胞-基质构 建物浸渍到阴离子溶液中，然后再到阳离子溶液中。反应一段时间(该时间根 据阴离子和阳离子组分的性质而变化)后，形成机械稳定的半透膜。根据反应 条件(聚合物浓度、反应时间)，支架紧密包裹在膜内或由间隙与膜隔离。
容积V1可定义为其外部由内部半透膜“T”限定的空间，包括例如从HDF 衍生的软骨细胞样细胞构成的活体核。
2.外膜
外膜是可扩张的，弹性和/或可膨胀的，以通过最小侵入性后路外科手术 植入，然后膨胀至精确匹配椎间盘切除术的空腔。该膜不渗透流体但可渗透氧 气，可填充向细胞提供营养物质和生长因子的介质。包壳内包封的流体形成将 IHP转移至活细胞的流体环境。当患者站立时，他对其脊柱施加一定负荷，该 负荷通过充满流体的膜将负荷转移到活细胞。该膜机械坚固以支撑负荷。
外膜可由生物相容性、可生物降解的聚合物构成。可用于制造该膜的各种 聚合物包括但不限于：聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸 (PLGA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚二氧六环酮(PDO)、聚乙烯、聚(甘 油癸二酸酯)(PGS)以及它们的衍生物、共聚物或混合物。在一个实施方式中， 该膜由可扩张的、生物相容的、可生物降解的聚氨酯构成。
该膜与宿主周围组织直接接触，具有生物相容性以避免宿主炎症反应。可 采用各种技术来改善该膜的生物相容性，例如用透明质酸涂覆膜。
IV.本发明采用的细胞
在本发明的某些实施方式中，可采用任何细胞，只要这些细胞能够分化形 成软骨细胞或软骨细胞样细胞。在具体的实施方式中，细胞事实上是软骨细胞， 虽然也可由干细胞(例如间充质干细胞)或成纤维细胞(例如皮肤成纤维细胞、腱 成纤维细胞、韧带成纤维细胞或滑液成纤维细胞)衍生获得。可采用自体细胞， 虽然在可选的实施方式中，也可采用同种异体细胞；在具体的实施方式中，检 测了同种异体细胞是否会引起疾病(assayed for disease)，并被认为适合人体 传播。在本发明的某些方面，细胞是自体细胞，虽然在可选的实施方式中，细 胞也可以是同种异体细胞。在细胞不是自体细胞的情况下，在本发明中使用之 前，可先通过本领域标准方法处理细胞以除去潜在的危险物质、病原体等。在 具体的方面，可用一种或多种核酸转染细胞，例如用生长因子，包括BMP-2、 -4、-6和/或-7转染细胞。
在具体的方面，采用一种或多种以下方法有利于人表皮成纤维细胞的软骨 细胞样分化：将细胞接种到藻酸盐中；将细胞接种到细胞外基质蛋白如聚集蛋 白聚糖或基底膜蛋白聚糖中，低含氧量条件(例如低氧或一种或多种低氧模拟 剂，例如乳酸盐、甲磺酸去铁胺(DFX)、氯化钴(COCl2)、或镍)；高密度微量 培养；存在一种或多种生长因子(包括例如骨形态发生蛋白(BMP)，至少包括 BMP-2；转化生长因子β(TGF-β)；胰岛素生长因子I(IGF-I)；和成纤维细胞生 长因子(FGF)，尤其是基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和FGF-2，血小板衍生 的生长因子(PDGF)，软骨衍生的形态发生蛋白(CDMP)；存在抗坏血酸、地塞 米松、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)，刺猬蛋白：声波刺猬(sonic hedgehog， SHH)和印度刺猬(Indian hedgehog，IHH))。可采用在机械应力下培养。高密度 微量培养是模拟肢体形成过程中软骨形成开始的过程中发生的细胞浓集阶段 的培养技术。
在本发明的具体方面，采用人表皮成纤维细胞，至少因为它们可被非侵入 性获得，例如从直径仅约3mm(在具体的实施方式中)的皮肤穿刺活检(例如环 形活检皮肤样本)获取。并且，人表皮成纤维细胞在培养中容易扩增并在特定 培养条件下分化形成软骨细胞样细胞。
根据本发明，从患者皮肤组织(6mm)穿刺活检收集自体HDF。在实验室中， 用剪刀剥离皮下脂肪和深度真皮。将剩余的组织切碎并在4℃、0.25％胰蛋白 酶下培养过夜。然后，机械分离皮肤和表皮片段。切碎活检皮肤片段，用该碎 片启动外植体培养。将从外植体收集的成纤维细胞在补充有10％小牛血清的杜 尔贝科氏MEM培养基(Dulbecco′s MEM，DMEM)中，37℃、8％CO2下培养。 在具体的方面，这些细胞扩增，然后分化形成软骨细胞。
一些方面可采用市售HDF，例如从实验室(例如级联生物学(Cascade Biologies)购买的HDF。细胞可以是成熟HDF或新生HDF。例如，新生包皮成 纤维细胞是非常方便的细胞来源。这些细胞可商业使用，便于获得且容易生长。
V.细胞生长和分化形成软骨细胞或软骨细胞样细胞
机械应力和/或应变是软骨形成的重要因素。本发明方法采用一种或多种 机械应力，在具体的实施方式中，采用间歇性流体静压(IHP)作为软骨形成分化 的诱导剂。已知IHP是诱导和维持软骨细胞表型的强效刺激。近来的研究表明， IHP刺激与BMP-2一起培养的鼠胚胎成纤维细胞的软骨诱导。IHP也可诱导 HDF的软骨形成分化。已知HDF在低氧张力下可分化形成软骨细胞样细胞。 因此，根据本发明的一个实施方式，机械应力，尤其是IHP和流体剪切应力诱 导在三维基质和低氧张力中培养的成纤维细胞的软骨形成分化。
机械应力可体外、体内、离体、先体外后体内进行，或它们的组合。在一 个实施方式中，分化在体外开始，然后接种在基质中的软骨细胞样细胞体内植 入后继续生长和分化。在本发明的具体方面，惰性结构旨在提供生理学负荷状 况以诱导HDF体内分化。
在本发明具体的方面，诱导细胞分化形成软骨细胞或软骨细胞样细胞。这 种分化可在体内递送之前发生，例如在支架上进行，或者在体内递送之后进行。 在具体的实施方式中，细胞经历有利于分化形成软骨细胞的条件。在另一个具 体的实施方式中，条件包括机械应力。对明显受到高流体剪切或压力负荷的血 管内皮细胞和软骨细胞的机械应力基因调节进行了广泛的研究。在本发明具体 的实施方式中，机械应力刺激HDF软骨形成分化。这种机械应力可以是任何 类型，虽然在具体的实施方式中，它包括流体静压和/或流体剪切应力。在其他 具体的实施方式中，应力是恒定的或间歇性的。
在本发明中，机械应力，尤其是循环流体静压和流体剪切应力可诱导接种 在三维基质中的成纤维细胞的软骨形成分化。刺激HDF软骨形成分化的共培 养条件的选择建立在本领域已知数据的基础上。已知多种示例性因素，例如高 密度细胞培养、用BMP-2和抗坏血酸培养、低氧张力培养可刺激软骨形成， 在本发明中仅仅用作除机械应力外的辅助因素的例子。
椎间盘软骨细胞难以收集。因为自体细胞是从患者椎间盘获取的，所以需 要侵入性手术(背部外科手术)进行活组织检查。如果从健康盘获取细胞，则危 害正常盘的功能。如果在椎间盘切除术期间从受损盘获取细胞，则提供了来自 变性组织的异常细胞。而且，软骨细胞因为去分化而难以培养扩张。其他软骨 来源(例如耳部弹性软骨)的软骨细胞容易收集，但只是产生透明软骨而不是盘 中的纤维软骨。常用于组织工程的干细胞也存在一些缺点，因为它们需要进行 骨髓活组织检查。组织工程技术需要大量的细胞，却难以获取足够量的成人干 细胞。
采用自体HDF作为细胞来源方式的原理如下所述：1)例如，从直径仅 3.0mm的环形皮肤样本的穿刺活检中非侵入性地获取HDF；2)不存在被另一供 体污染的风险(例如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、克罗伊茨费尔特-雅各布 病等)；和3)HDF容易培养扩增并在特定培养条件下分化形成软骨细胞样细胞。 也可采用其他成纤维细胞群，例如肌腱或韧带。在一个实施方式中，优选自体 成纤维细胞。
刺激HDF软骨形成分化的共培养条件的选择建立在本领域已知数据的基 础上。不同的因素支持软骨形成，例如包括高细胞密度培养，与生长因子BMP-2 和抗坏血酸培养，和接种到藻酸盐基质中。体内应用之前，细胞/支架组合物中 的细胞在体外生长和/或分化至少两天或更多天。在某些情况下，可检查或监测 细胞以确保至少一些细胞发生分裂。除去未分裂和/或未直接或间接粘附与支架 的细胞。
在其他实施方式中，HDF嵌在水凝胶中，在具体的实施方式中，水凝胶 是天然水凝胶，例如胶原、透明质酸(HA)、胶原/HA的组合、藻酸盐、壳聚糖； 合成水凝胶，例如合成水凝胶，例聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙 烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)(P(PF-共-EG))、多肽或其他可 生物降解的聚合物如聚(L-乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸 (PLGA)；或上述聚合物的任意组合。然后采用任何本领域中合适的体外生物反 应器施加循环流体静压。
VI.修复受损软骨的方法
在某些实施方式中，本发明包括修复任何受损软骨的方法，虽然在具体的 方面，所述软骨是椎间盘或任何关节中的软骨。通常，在盘实施方式中，如果 必须切除两个相邻椎骨间的椎间盘(例如腰椎中)，从患者背部后路进行外科手 术的侵入性较小。该最小侵入性手术能够通过环内小孔(肌腱切断术)进行躯体 间空间的刮除术，切除盘核变性片段。因为环开口较小，本发明提供的椎间构 建物可滑过上述切口，然后扩张到在躯体间空间内进行核切除所形成的空间 内。切除受损盘和安装构建物可以相同的后路途径进行。
如上所述，惰性结构由两个可扩张的球囊“I”和“E”构成。在静止位置，两 个球囊“I”和“E”为扁平、可变形、成形或相互匹配。一旦球囊“I”位于球囊“E” 内，它们两个通过环孔被安装到椎间隙内，然后相继膨胀形成两个独立容积 (VE>VI)，其形状(球形、圆柱形、锥形等)取决于椎体间空腔的外形和共享负荷。
在具体的方面，待填充的第一球囊是内球囊“I”，无论剩余空腔的容积如 何。容积VI代表接收和容纳活体核的构建物的核。一旦填充了活体核，球囊“I” 被密封。即，一旦包壳“I”位于包壳“E”内，两者都通过环孔而被设置到椎间隙 内，然后相继膨胀。“I”是首先通过植入活体核来进行操作(instrumented)然 后密封的。然后，用介质溶液膨胀外球囊“E”直到其容积VE形成符合或遵循天 然盘刮除后剩余部分内表面的外形。剩余盘的内表面可以是核组织的剩余部分 或天然环的内壁，取决于刮除程度。
在安装椎间构建物的第二个实施方式中，“E”位于椎间隙内，然后将“I”置 于“E”内，如上所述被相继填充。在第三个实施方式中，“E”位于椎间盘切除术 空腔内，然后将预先包封的活体核置于“E”内，再用介质填充“E”。
可在外球囊“E”安装之前评价椎间盘切除术导致的空腔容积，从而选择和 注入合适的流体容积。空腔容积的测定包括：将流体(例如水)引入其中直到空 腔充满，然后通过注射器从空腔抽出流体，从而基本上准确地计算空腔容积。
在某些方面，惰性结构组成取决于组织工程系统的选择，取决于制造材料、 孔特征、吸收性和机械性质，例如非降解性聚合物、可降解的聚合物或天然衍 生的水凝胶(例如，胶原、纤维蛋白、琼脂糖、藻酸盐等)。
活体核或腔室(VI)由从自体人表皮成纤维细胞(HDF)衍生的软骨细胞样细 胞构成，例如，从患者皮肤收集并接种到支架(例如藻酸盐珠、或微射流支架、 或任何其他聚合物支架)中，并从支撑性腔室(VE)供给。混合构建物结合了惰性 生物材料和活细胞，生物材料用作营养递送系统，活细胞可方便地从皮肤收集， 该混合构建物的优点在于，能够自我维持或重塑并可采用最小侵入性后路外科 手术恢复盘功能。体积VE可限定为分隔层“E”和层“I”的空间，其包含将要递送 至细胞的营养物质和生长因子(介质)(递送系统)。该容积可以是液体介质填充 产生的结果，或者是水合后壁溶胀(扩张型亲水生物材料如水凝胶)导致的结果 (介质由高比率的水构成)。
生长因子可递送通过半渗透性内膜“I”。生长因子的例子包括例如：软骨 衍生的形态发生蛋白(CDMP)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子 β(TGF-β)、和胰岛素生长因子I(IGF-I)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍 生的生长因子(PDGF)。
机械应变，例如高流体剪切和/或压力负荷，被转移到内层“I”上，因此通 过外层“E”和外部容积VE传递到VI上。
然后安装引流系统，各导管通过肌腱切断孔从椎间隙伸出，小心保持其离 开相邻的根部，或者至少沿根部定位而没有任何有害冲突。
从手术部位插管(introducer)到离开皮肤开孔的皮下位置，创建贯穿肌肉 的路径。各管道“隧穿”到上述肌肉路径内，然后连接于相应的储器。两个储器 远离中间的皮肤切口，离开中线2或3厘米，皮下定位使其容易触及和鉴别。 闭合各个皮肤切口。
通常，进行这种最小侵入性后路途径之后，要求患者在术后能够走动的时 候尽早站立。因此，植入物接受生理学负荷下正确的循环流体静压状况，这对 于HDF生长和转化是关键的。
周期性地更换介质，例如每周或每月一次或多次。引流系统允许提供容积 VE，容积VE具有适当量的新介质以继续供应活体核，而且维持足够的容积， 既而维持正确的压力状况。患者面向下躺下。用针同时刺穿各个储器。在每个 针塞上注射器，向下推动活塞缓慢注入新的介质，同时相同量的流体通过抽吸 从另一注射器吸出，使得内压保持几乎相同，并避免容积VE陷落，或者相反 向容积VI递送过高的压力，导致活体核不可逆的损伤。当流出液体的颜色和 性质与流入液体相同时停止该过程。将取出的用过的介质样品用于细菌学、病 理学和化学目的的分析。
当活体核能够自我维持并填充椎间盘切除术的腔室时，取出管道和储器。 或者，在局部麻醉下仅取出一个或两个储器，管道则在其远端打结。在另一可 选的实施方式中，储器和管道都留在原位。
在具体的实施方式中，进行随访(follow-up)MRI，例如手术后几周或几 个月内(例如，手术后约6周)，以评价移植物生长和记录盘治愈。
在另一个实施方式中，工程化活体核被预先包封，如上所述释放。
上述这些功能通过本发明惰性结构实现，惰性结构依赖于具有两种不同性 能的两个同心膜。外部包壳能够机械维持负荷下的盘高度；是可膨胀的(以通 过最小侵入性后路途径植入和接纳介质溶液)；具弹性(以将共享负荷转移到移 植物上)；是可扩张的(允许其溶胀和填充椎间盘切除术导致的空腔)；是密封的 (以避免任何介质渗漏、瘢痕组织挤压进入髓管内、或通过环缺损-肌腱切断- 的脱出复发)；是可生物降解的(包壳发生吸收以使移植物重新连接于剩余的天 然盘组织)；并且具有生物相容性(尽可能降低炎症反应)。外科手术结束时，可 用连接于一个或几个Rickham储器的一根或多根导管进行引流，所述储器在外 科手术结束时皮下插入。
这些储器旨在去除代谢蓄积的任何毒性废物(例如，自由基或乳酸)以及细 胞生长产生的任何其他细胞碎屑。它们还为容积VE提供了适当量的新介质以 连续供应活体核，而且维持足够的容积，既而维持正确的压力状况。当活体核 能够自我维持并填充椎间盘切除术的腔室时，将它们取出。
应理解，混合构建物的各个部件和特征以及修复受损软骨的方法和使 HDF生长形成上述软骨细胞样细胞的方法可以各种方式进行组合，以提供在本 发明范围内的其他实施方式。
VII.本发明的可选实施方式
在另一个实施方式中，装置不是具有(例如)两个大致球形的同心包壳，而 是由唯一的(unique)外部包壳“E”构成，同样具有上述特征(尤其是可扩张性 和/或可膨胀性)，接纳未包裹的活体核(未被膜包封或包裹)。事实上，在该实施 方式中，活体核是细胞基质构建物，直接位于“E”内。然后，用介质液体溶液 扩张容积VE直到匹配空腔。
这样，在另一个实施方式中，装置不是具有两个“同心”球囊，而是由唯一 的外部球囊“E”构成，同样具有上述特征(尤其是可扩张性和/或可膨胀性)，用 于容纳工程化的活体核。一旦活体核在膜“E”内释放，用介质液体溶液扩张容 积VE直到膜“E”到达空腔边界。既没有屏障也没有膜包裹移植物。消耗介质的 同时，活体核扩张至球囊/层/膜“E”的内壁。包壳重吸收，移植物与剩余的天然 盘重新连接。”
实施例
本实施例中描述了本发明中使用的材料和方法的示例性实施方式。本领域 技术人员应理解，本实施例中所述的技术代表发明人发现可很好地用于实施本 发明的的技术，因而认为构成优选的实施方式。然而，本领域技术人员应理解， 根据本发明，在所述具体的实施方式中可进行许多改变，仍然获得类似的结果 而不背离本发明的精神和范围。
实施例1示例性材料和方法
本实施例中描述了本发明中使用的材料和方法的示例性实施方式。
细胞培养
采用从患者收集的自体HDF构建植入物，采用新生儿(neonatal)包皮成 纤维细胞进行临床前研究，因为这是实现试验目的较方便的细胞来源。采用从 患者收集的自体细胞进行进一步的研究表明，这些细胞作用良好。
新生儿包皮HDF从级联生物学公司(Cascade Biologies，波特兰，奥勒冈 州)购得，在体外用含10％FBS(英吉利公司)和抗生素的DMEM(英吉利公司 (Invitrogen，Carlsbad，美国加利福尼亚州)进行扩增。将HDF悬浮液接种到 海藻酸盐中或单层培养介质中，如下所述。
为产生藻酸盐凝胶培养物，将细胞以高密度(107个细胞/毫升)悬浮在2％ (重量/体积)中等粘度的藻酸盐(西格玛公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯St. Louis，密苏里州)中，25毫升液滴在100mM CaCl2、0.9％NaCl溶液中发生交 联。然后用含10％FBS和抗生素的DMEM彻底冲洗所得藻酸盐珠。将藻酸盐 珠浸渍到补充有100ng/ml重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和50mg抗坏血酸 的含10％FBS和抗生素的DMEM中。条件如下：选择高细胞密度以及与BMP-2 和抗坏血酸一起培养，因为已知它们能够刺激软骨诱导形成((Watt，1988；Dozin 等，1992；Sullivan等，1994；Denker等，1999；Zur Nieden等，2005；Zhou 等，2004)。
为了产生单层培养物，将HDF接种到氧含量20％、含10％FBS但没有 BMP-2和抗坏血酸的DMEM塑料瓶中。这些细胞用作对照。
5％和20％O2下培养
将嵌有细胞的藻酸盐珠在5％O2、5％CO2和90％N2的环境下在O2-/CO2- 调节培养箱(低氧张力)中培养，或者在20％O2、5％CO2和75％N2下在CO2-调 节的培养箱中(大气氧张力)中培养，持续3周。然后，进行软骨形成分化的评 价(例如，参见实施例3)。
流体静压
将嵌有细胞的藻酸盐珠分成加压组和对照组，将各组分别置于可渗透氧气 和二氧化碳的各个柔性聚乙烯/尼龙袋中。用15毫升介质填充袋，热密封以排 出所有空气。
将加压组尼龙袋置于设计用于施加循环流体静压的新开发的装置内(Elder 等，2005)。该装置允许比较在相同的三维培养条件下比较宽生理学范围的负 荷状况。该装置包括大圆柱形不锈钢基壳(base)，通过压缩干涉(intervening)O 形环的螺栓连接于盖。液压缸焊接于盖，使其内部与腔室内部连通。液压缸 和腔室完全充满水，因而通过对液压缸活塞施加一定的力(MTS伺服液压控制 测试仪产生)可实现快速流体静压。通过将腔室浸渍到温度调节循环水浴中维 持稳定的37℃。将对照组的尼龙袋置于相同水浴的独立的充满水的不锈钢腔 室中。
选择施加压力的幅度和频率在生理学范围内(Mow等，1992)，过去已证实 能够刺激多功能间充质细胞的软骨形成分化(Elder等，2005)和去分化的软骨 细胞重新分化(Domm等，2000)。测试短时间和长时间加压，通过定量和定性 评价软骨形成测定短时间和长时间流体加压之间成功的软骨诱导流体静压模 式。
示例性状况包括：
1.0Hz正弦流体静压波形，施加的最小压力0.3Mpa，最大5.0Mpa。对于 短时间加压，每天1小时加压细胞，持续7天。对于长时间加压，每天4小时 加压细胞，持续7天。每天，完成负荷后立即将培养物从加压容器中取出，返 回组织培养箱内的水浴中。
采用本领域标准技术评价循环流体静压下以及特定条件下(例如低氧、软 骨形成介质、高细胞密度)培养的HDF的细胞存活率和软骨形成分化。
在另一个实施方式中，通过循环流体静压和剪切应力诱导成纤维细胞转化 形成软骨细胞。在该情况下，将细胞接种到微射流支架中。
进行软骨形成分化的评价(例如，参见实施例3)。
实施例2
HDF在藻酸盐珠中的细胞存活率的评价
在本发明具体的方面，通过光学显微镜和/或存活率测试评价软骨形成介 质中培养的HDF在藻酸盐珠中的存活率。采用光学显微镜研究HDF的形态和 增殖。在示例性的存活率测试中，将藻酸盐珠溶解在溶解缓冲液(0.55M柠檬 酸钠、1.5M NaCl和0.5M EDTA)中，离心细胞并用胶原酶处理团粒1小时。 将细胞重新悬浮在DMEM中，采用Neubauer室和台盼蓝排斥方法测定存活率。
实施例3
软骨形成分化的评价
在具体的实施方式中，通过I型、III型和V型胶原的产生来鉴定HDF， 通过II型、IX型、XI型胶原和硫酸化蛋白聚糖的产生来鉴定软骨细胞。
通过蛋白质印迹法测定硫酸化葡胺聚糖(sGAG)含量以及I型和II型胶原 的产生，评价软骨形成分化。胶原合成速率通过掺入[3H]-脯氨酸进行测定。
总的DNA和sGAG含量
采用55mM柠檬酸钠、0.9％NaCl溶液从藻酸盐回收藻酸盐珠中的细胞。 然后使细胞在300μl 0.5％v/v诺乃(Nonidet)P-40缓冲液(50mM Tris-Cl，100 mM NaCl，5mM MgCl2)中裂解。将细胞溶解产物转移到微量离心管中，离心， 采用Hoescht染料方法(DNA定量试剂盒，西格玛公司(Sigma，圣路易斯，密 苏里州)，以小牛胸腺DNA为标准品，在100μl上清液等分试样中测定DNA。 除去多余的细胞裂解缓冲液，使sGAG在100μl 2％v/v木瓜蛋白酶中消化，60℃ 下20mM乙酸钠(pH6)中过夜。然后采用从牛气管中纯化得到的4-硫酸软骨素 作为标准品，通过二甲基亚甲蓝沉淀方法测定总的sGAG含量(布莱肯甘油氨 基聚糖分析法(Blyscan Glycoaminoglycan Assay)，生物色彩有限公司(Biocolor， Ltd.))。
I型和II型胶原的蛋白质印迹
将各样品的5个珠溶解在400ml缓冲液(55mM柠檬酸钠，150mMNaCl) 中。为实现胶原溶解，加入100μl 0.25M乙酸和100μl胃蛋白酶溶液(1mg/ml50 mM乙酸：P-6887，西格玛公司)，并将混合液在4℃下保持24小时。然后，加 入100μl10x储备液TBS(1M Tris，2M NaCl和50mM CaCl2，pH8)和100ml 胰弹性蛋白酶(1mg/ml TBS；西格玛E-6883)，样品在37℃下孵育30分钟。将 样品在9000xg下离心10分钟。收集上清液。将25μl牛I型胶原、牛II型胶 原(西格玛)或样品(各自总蛋白含量为5mg；用Bio-Rad蛋白分析法定量)与6μl 样品缓冲液混合，95℃下变性5分钟，并加载到7％丙烯酰胺凝胶上。进行电 泳。将凝胶转移到印迹膜上。膜在封闭缓冲液(配制在TBST缓冲液中的10％ 的奶粉)中封闭过夜，然后与鼠单抗抗-I型胶原抗体(COL-1，ab6308，艾碧公 司(Abeam Inc))或鼠单抗抗-II型胶原抗体(5B2.5，ab3092，艾碧公司)在4℃下 孵育过夜。用TBST缓冲液冲洗膜。加入羊抗鼠生物素结合的第二抗体(1：500)1 小时，然后以1：1000的稀释度加入抗生物素蛋白链菌素-HRP1小时。用艾玛 西亚公司(Amersham)的ECL进行印迹显影。
[3H]-脯氨酸掺入的测定
在测定胶原产生速率的藻酸盐珠中，除去介质并更换补充有10％ FBS、抗 生素、25mg抗坏血酸、[3H]脯氨酸(10μCi/ml)、和100μg/ml β-氨基-丙腈(β-APN) 的DMEM以抑制胶原交联的形成。孵育24小时后，测定掺入胶原的[3H]脯氨 酸。将珠在1ml木瓜蛋白酶溶液[0.125mg/ml(2.125单位/ml，西格玛)，0.1M Na2HPO4，0.01M EDTA，pH6.5]中65℃下消化过夜。200ml的各样品加入到 2ml闪烁液中，用闪烁计数器进行测定。
将500μl的各样品与500μl PBS混合，用于测定DNA含量。用超声束处 理样品和空白(含ml PBS)15秒。加入0.5ml RNAse和0.5ml链霉蛋白酶，37℃ 下孵育30分钟。然后，加入0.5ml溴化乙锭，样品孵育30分钟，用荧光计进 行测定。
相对于总的DNA含量，将[3H]-脯氨酸的掺入标准化。
实施例4
研究的示例性设计
在本发明的具体方面，在三维藻酸盐珠培养物中测定接种的HDF的细胞 存活率和软骨形成分化。具体地说，采用上述示例性方法，将接种在藻酸盐珠 中、20％ O2下软骨形成介质(补充有BMP-2和抗坏血酸的介质)中培养的HDF 的细胞存活率和软骨形成分化与20％ O2下、补充有10％ FBS的DMEM中单 层培养的HDF进行比较。
在本发明的另一方面，测定氧张力对藻酸盐珠中培养的HDF分化的作用。 在2种不同的氧张力下，使接种在藻酸盐珠中的HDF在软骨形成介质中培养3 周：1)5％O2、5％CO2和90％N2的低氧张力，在O2-/CO2-调节培养箱中；和2) 20％O2、5％CO2和75％N2的大气氧张力，在CO2-调节培养箱中。
采用上述示例性方法比较软骨形成分化。
在本发明的其他实施方式中，测定流体静压对藻酸盐珠中培养的HDF分 化的影响。软骨形成介质中接种在藻酸盐珠中的HDF经受不同的刺激：1)每 天1小时流体静压，持续7天(1.0Hz正弦流体静压，最小0.3Mpa，最大5.0Mpa) 和20％O2；2)每天4小时流体静压，持续7天(1.0Hz正弦流体静压，最小0.3Mpa， 最大5.0Mpa)和20％O2；3)每天1小时流体静压，持续7天(1.0Hz正弦流体静 压，最小0.3Mpa，最大5.0Mpa)和5％O2；每天4小时流体静压，持续7天(1.0 Hz正弦流体静压，最小0.3Mpa，最大5.0Mpa)和5％O2。
采用上述示例性方法评价软骨形成分化。
参考文献
说明书中提及的所有专利和出版物代表本发明所属领域的技术人员的水 平。所有专利和出版物的内容在相同的程度上以参考的方式结合在本文中，如 同各个出版物具体且单独地以参考的方式结合在本文中。
专利
美国专利6,489,165
美国专利6,627,422
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虽然详细描述了本发明及其优点，但应理解可进行各种改变、替代和变更 而不背离所附权利要求书限定的精神和范围。而且，本发明的范围不是由说明 书中描述的过程、机器、制造、物质组成、方式、方法和步骤的具体实施方式 所限定的。本领域普通技术人员由本发明的描述应理解，根据本发明可采用目 前现有或将来开发的能够基本上实现与本文所述的对应实施方式相同的功能 或实现基本相同结果的过程、机器、制造、物质组成、方式、方法或步骤。因 此，所附权利要求旨在将这些过程、机器、制造、物质组成、方式、方法或步 骤包括在其范围内。
相关申请的交叉引用
本发明要求2006年2月7日提交的题为“椎间盘修复方法”的美国临时专 利申请第60/771,172号的优先权，还要求2006年3月24日提交的题为“用于 椎间盘修复的多层多室三维聚合物支架(Multi-Layered Multi-Compartmental Three-Dimensional Polymeric Scaffold For Intervertebral Disc Repair)的美国临时 专利申请第60/785,478的优先权，将这两份申请的全部内容纳入本文作为参考。