获自酿造过程产生的生物质的脂肪粘结剂 |
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| 申请号 | CN201380033306.0 | 申请日 | 2013-06-21 | 公开(公告)号 | CN104379001A | 公开(公告)日 | 2015-02-25 |
| 申请人 | 戴姆有限公司; | 发明人 | 雷梅迪奥斯·曼塞博莫利纳; 弗兰塞斯克·哈维尔·卡斯塔内西特亚斯; 霍尔迪·库内卡斯特利亚纳; 约纳坦·桑塔斯古特雷斯; 玛格杰列娜·拉费卡斯马丁内斯; 玛丽亚·安赫莱斯·比阿特丽斯·米拉莱斯布拉利亚; 英马库拉达·马特奥斯-阿帕里西奥塞迭尔; 安赫莱斯·玛丽亚·埃拉斯卡巴列罗; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供富含多糖的组合物，所述组合物包含提取自来自 酿造 过程产生的副产物 生物 质 的酿酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁的β-葡聚糖、壳多糖和脱乙酰壳多糖，用于获得该组合物的方法及其用途。所述组合物发挥选择性的脂肪结合作用等生物学功能，因此其可以用于 预防 和/或 治疗 疾病 如超重、 肥胖症 、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、 高血压 和心 血管疾病 。其可以被配制成可食用、药物或兽医产品。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于获得组合物的方法，所述组合物包含从来自酿造过程产生的副产物生物质的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁提取的β-葡聚糖、壳多糖和脱乙酰壳多糖，所述方法包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 获自酿造过程产生的生物质的脂肪粘结剂技术领域[0001] 本发明涉及医学和营养学领域，并且尤其涉及用于重量控制和减少心血管负脂肪的饮食补充物。 背景技术[0002] 我们社会的不良饮食习惯和生活方式已经导致日益增加的公众健康问题。在目前根据推荐的每日饮食摄入的金字塔的分解内，发现最关键的点在于过度消耗饱和脂肪酸和 胆固醇。推荐的是关于能量摄入的7％的饱和脂肪酸和＜250mg/天的胆固醇，而现实分别 达到15％和350mg/天的值。能量摄入过度主要是由于过度消耗饱和脂肪所致，同时过度摄 入胆固醇是由过度消耗动物产品导致的。 [0003] 所有流行病学研究都承认过度放纵消耗富含脂肪的食物并且减少通过物理活动的能量支出导致多种流行的健康障碍，超重/肥胖症和高胆固醇血症被看作是最严重的。 除了有损生活质量以外，超重和肥胖症已与作为严重的不良健康状况的致病因素联系在一 起，所述不良健康状况包括心血管疾病、2型糖尿病、肌肉骨骼问题以及癌症。另一方面，据信导致动脉粥样硬化(atherosclerosis)的高胆固醇血症(hypercholesterolemia)是作 为发达国家中的主要死亡原因的冠心病的主要风险因素。 [0004] 综上，可有助于降低体重和降低胆固醇的非处方降脂剂正被日益探寻。作为结果，不管其变化的且不总是被完全证实的有效性如何，多种非处方降脂饮食补充物被推向市场。其中，以胶囊和片剂形式可获得的脱乙酰壳多糖(壳聚糖，chitosan)被宣称能够降低 胆固醇并且导致快速的减重。 [0005] 脱乙酰壳多糖是来源于壳多糖(几丁质，chitin)的多氨基糖。壳多糖，自然界中最丰富的可再生有机资源之一，主要存在于甲壳类的外骨骼中，在化学上是一种由利用 β-(1-4)-糖苷键连接的N-乙酰-D-葡糖胺单元和D-葡糖胺单元组成的线性聚合物，其 中N-乙酰-D-葡糖胺单元在该聚合物链中占优势。壳多糖的脱乙酰形式被称为脱乙酰壳 多糖。壳多糖通常是指具有超过40％的乙酰化程度[即，N-乙酰-D-葡糖胺的数量超过 40％而D-葡糖胺的数量小于60％]并且不溶于稀酸的共聚物。名称脱乙酰壳多糖被用于 在大多数情况中可溶于稀酸的具有低于40％DA[即，超过60％DD(脱乙酰化程度)，N-乙 酰-D-葡糖胺的数量小于40％而D-葡糖胺的数量超过60％]的共聚物。壳多糖和脱乙酰 壳多糖在化学上可以被认为是纤维素的类似物，其中碳-2处的羟基分别被乙酰胺基和氨 基替代。脱乙酰壳多糖具有独特的化学和生物学性质，这可归因于在其分子中多个氨基基 团的存在。这可以被用于各种过程(包括医学治疗)，并且脱乙酰壳多糖的优异的生物相容 性和生理学惰性使得这些是可能的。 [0006] 在许多水生生物(虾和蟹的壳以及鱿鱼和乌贼的骨板)中，在许多昆虫中，在陆生甲壳类(卷甲虫(Armadillidium vulgare)、平甲鼠妇(Porcellio scaber))中，在线虫中，在蘑菇中以及在一些微生物(酵母、真菌和藻类)中，发现作为支撑物质的壳多糖和脱乙酰 壳多糖。基于干重，水生贝壳含有约30-40％蛋白质，30-50％碳酸钙，和20-30％壳多糖。这些份额随甲壳类种类和季节而不同。传统上，壳多糖通过对蟹或虾壳进行脱钙和除蛋白来 制备，这分别涉及利用酸溶液溶解碳酸钙以及在碱性介质中或利用酶除去蛋白质。然后可 以通过利用热的碱溶液对壳多糖进行脱乙酰化以及脱色步骤来获得脱乙酰壳多糖。该脱乙 酰壳多糖制备方法具有多种不利的特性。例如，该方法需要昂贵的热能和具有潜在健康危 害的苛性碱。该方法还产生大量的废物，由此使得需要大量处理费用。此外，虾或蟹壳的供应高度依赖于季节和环境因素，这导致对生产能力的不可预知的限制并且导致要被用于医 药和农业用途的终产物的理化性质不一致。此外，来自虾壳的脱乙酰壳多糖可能在最终的 产品中存在抗原，其可能导致消耗者的变应性。因此，虽然脱乙酰壳多糖在临床上已被很好的耐受，但是其不能被推荐给对甲壳类敏感的人。这些问题可通过自不同来源提取脱乙酰 壳多糖来规避。 [0007] 现今，研究聚焦于自真菌细胞壁组分提取纯的脱乙酰壳多糖。为此，N.Nwe等研究了真菌细胞壁中脱乙酰壳多糖和葡聚糖之间的键以开发用于以高产率自真菌Gongroellabutleri制备非常纯的脱乙酰壳多糖的酶方法(N.Nwe等2010，“Production of fungal chitosan by enzymatic method and applications in plant tissue culture and tissue engineering：eleven years of our progress，present situation and future prospects(通过酶方法制备真菌脱乙酰壳多糖以及植物组织培养和组织工程中的应用： 我们十一年的进展、目前形式以及将来前景)”Biopolymers，Magdy Elnashar编辑，出版： 2010年9月28日，第7章第135-162页)。 [0008] EP 1483299描述了这样的方法，所述方法允许以受控的方式在壳多糖链不降解或转化的情况下将壳多糖与β-葡聚糖分离。该方法是基于用碱性溶液接触真菌黑曲霉 (Aspergillus niger)的细胞，用酸性溶液接触碱不可溶性部分，由此获得包含所述细胞壁衍生物的酸化的碱不可溶性部分的悬浮液，并且最终将其与β-葡聚糖酶接触从而获得壳 多糖产物，或将其与壳多糖脱乙酰酶接触从而获得脱乙酰壳多糖产物。 [0009] 脱乙酰壳多糖的一个应用是作为饮食降血脂补充物，其中由于人消化酶的有限水解，脱乙酰壳多糖实际上完整地沿消化系统通过到达大肠，有效地充当膳食纤维。认为脱 乙酰壳多糖通过与脂肪酸和胆汁酸的阴离子羧酸根结合而减少自胃肠道的脂肪吸收，并且 通过利用疏水键结合中性脂质(即，胆固醇、其他甾醇)干扰其乳化。已经在体内和体外 研究了脱乙酰壳多糖的降血脂潜力。体内研究包括在动物和人上进行的试验并且由多种 测定组成，主要有体重、血清脂质水平和粪便中的脂质浓度。明显地，报道的数据是矛盾 的。虽然动物试验大部分显示脱乙酰壳多糖对体重和胆固醇水平的降低作用(H.Yao等， “Effect of chitosan on plasma lipids，hepatic lipids，and fecal bile acid in hamsters human trials failed to show these effects(脱乙酰壳多糖对仓鼠中的血浆 脂质、肝脂质和粪便的胆汁酸的作用，人试验未显示这些作用)”J.Food Drug Anal.2006，vol.14，pp.183-189)，人试验未显示这些作用(M.D.Gades等，“Chitosan supplementation and fat absorption in men and women(男人和女人中的脱乙酰壳多糖补充和脂肪吸 收)”J.Am.Diet.Assoc.2005，vol.105，pp.72-77，C.N.Mhurchu等，“Effect of chitosan on weight loss in overweight and obese individuals：a systematic review of randomized controlled trials(在超重和肥胖个体中脱乙酰壳多糖对减重的作用：随机 化控制试验的系统综述)”Obes.Rev.2005，vol.6，pp.35-42)。 [0010] 脱乙酰壳多糖补充物制剂是类似但不相同的。脱乙酰壳多糖自身是原料壳多糖的化学脱乙酰化的产物，并且产物中脱乙酰化的程度随反应条件而变化。加工期间的一些 因素如脱乙酰化的程度和分子的分子量、壳多糖/脱乙酰壳多糖比、溶解度、离子强度、pH、粒度和温度影响脱乙酰壳多糖的制备及其性质。可以预期脱乙酰壳多糖的效率取决于其 理化性质。然而，在脱乙酰壳多糖的结合能力和测量的理化性质之间尚未建立关联。这尤 其在以下的研究中指出，该研究报道了11种所选择的脱乙酰壳多糖制剂的胆汁酸结合能 力、脂肪结合能力、溶胀能力、脱乙酰化程度和溶液粘度(K.Zhou等，“In vitro binding of bile acids and triglycerides by selected chitosan preparations and their physico-chemical properties(胆汁酸和甘油三酯通过所选择的脱乙酰壳多糖制剂的体 外结合及其理化性质)”Food Science and Technology 2006，vol.39，pp.1087-1092)。 [0011] 基于脱乙酰壳多糖的补充物作为“油捕捉剂”和“油磁体”被销售。对这些补充物中的一些的广告宣称可以给予消耗者不现实的预期。在其被宣称能够降低胆甾醇并且导致快速减重的同时，由于其同样捕获对人类健康有益的脂质系分子(如脂溶性维生素A、D、E、K、HDL胆固醇、植物甾醇以及多不饱和脂肪酸如ω3和6脂肪酸)的能力所致，它们可能同 时导致抗营养作用。 [0012] 发明概述 [0013] 本发明提供一种包含从来自酿造过程(酿造工艺，brewing process)产生的副产物生物质的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁提取的β-葡聚糖、壳多糖和 脱乙酰壳多糖的富含多糖的组合物(富多糖组合物，polysaccharide rich composition)，获得所述组合物的方法及其用途。因为本发明的组合物富含多糖(壳多糖、脱乙酰壳多糖 和β-葡聚糖)，所以在本说明书中其被称为“富含多糖的组合物”。“所述组合物”、“所述产品”和“本发明的组合物”也被无差别地用于指代本发明的组合物。 [0014] 因此，本发明的第一方面涉及一种用于获得富含多糖的组合物的方法，所述组合物包含从来自酿造过程产生的副产物生物质的酿酒酵母的细胞壁提取的β-葡聚糖、壳多 糖和脱乙酰壳多糖，所述方法包括以下步骤： [0015] i)在搅拌和50至95℃的温度下，准备具有浓度为0.25至3M的NaOH溶液的反应器； [0016] ii)将所述酿造过程产生的生物质添加到所述溶液中； [0017] iii)将所述条件保持至少1小时； [0018] iv)冷却所述溶液直至室温， [0019] v)通过至少一次添加酸性溶液或水来中和所述溶液，直至达到pH7，其中当进行超过一次的添加时，在添加之间进行将固体产物从所述溶液中分离的步骤； [0020] vi)将在步骤(v)中获得的固体产物从所述溶液中分离； [0021] vii)当通过添加酸性溶液进行步骤(v)中的中和时，所述固体产物用水进行至少一次洗涤并且分离所获得的固体产物；以及 [0022] viii)干燥所述固体产物直至恒重并微粉化。 [0023] 本发明的另一方面提供通过上述方法可获得的组合物。 [0024] 在人体发挥若干有益作用中，本发明的组合物可用作治疗剂或预防剂。因此，本发明的另一方面涉及本发明的组合物用作预防剂和/或治疗剂。特别地，所述组合 物可以用于在动物(包括人)中预防和/或治疗选自由以下各项组成的组中的疾病： 超重(overweight)、肥胖症、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)、高甘油三酯血症 (hypertriglyceridemia)、高血压和心血管疾病。本发明提供所述组合物在制备药物中的 用途，所述药物用于预防和/或治疗上述疾病。这可以被备选地表达为用于在动物(包括 人)中预防和/或治疗选自由超重、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压和心血管疾病组成的组中的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的所述动物施用有效量的本发 明的组合物。 [0025] 本发明的另一方面涉及本发明的组合物用作肠脂肪粘结剂(gut fat binderagent)。 [0026] 在另一方面中，本发明的组合物可以用作解毒剂(detoxifying agent)。 [0027] 在另一方面中，本发明的组合物可以用作免疫刺激剂(immunoestimulantagent)。 [0028] 本发明的另一方面涉及药物和/或兽医产品，所述药物和/或兽医产品包含有效量的上述组合物以及适量的药用或兽医用赋形剂。术语″有效量″当在本文中使用时，是 指在医学判断范围内高到足以递送所需益处但是又低到足以避免严重副作用的活性剂的 量。 [0029] 本发明的另一方面涉及可食用产品(edible product)，所述可食用产品包含有效量的本发明的组合物以及适量的其他可食用成分。 [0030] 发明详述 [0031] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁可以占到细胞干质量的20至30％。其主要由甘露糖蛋白和β-葡聚糖以及小量的壳多糖和脂质组成。这些组分的比例 可以根据菌株和培养条件而变化。如上所述，现有技术中存在从真菌细胞壁组分提取脱乙 酰壳多糖的方法。另一方面，现有技术也公开了自酵母(尤其是酿酒酵母)获得β-葡聚 糖的方法。WO 91/03495公开了用于制备可溶性葡聚糖以刺激血小板产生的方法。这些方 法之一以之前根据Jamas等US 4810646的方法过程自干燥的面包酵母(Baker’s yeast) 制备的整个葡聚糖颗粒开始，并且包括额外的步骤以溶解不溶性葡聚糖颗粒。描述于所述 专利申请的实施例2中的另一种方法涉及自所选的酿酒酵母菌株制备可溶性葡聚糖的一 系列处理。 [0032] 因此，虽然现有技术公开了自酵母获得(一方面)壳多糖/脱乙酰壳多糖和(另一方面)β-葡聚糖的方法，但是自真菌菌丝体的最终提取产物的质量和数量取决于真菌 来源、其生长条件(发酵介质组成：碳源和浓度、氮源和浓度及金属离子及其浓度；以及发酵条件：接种量、收获时间、发酵温度)；并且取决于提取过程的步骤。 [0033] 本发明提供用于获得富含多糖的组合物的工业方法。所述方法包括在之前的部分说明的步骤。在搅拌和50和95℃的温度下，准备具有浓度为0.25至3M的NaOH溶液的 反应器。在本发明特别的实施方案中，NaOH浓度选自0.25，0.50，0.75，1.0，1.1，1.2，1.3， 1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9和3M。特别地，NaOH的浓度为0.25至1.5M。更特别地，NaOH的浓度为0.25M。在另一个特别的实施方案 中，NaOH的浓度为1M。 [0034] 在本发明的另一个实施方案中，反应器中用NaOH溶液的处理在选自以下的温度下进行：50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72， 73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94和95℃。特别地，温度为65至85℃，并且更特别地为80℃。 [0035] 在本发明的一个实施方案中，在冷却所述溶液(步骤(iv))后，通过加入酸性溶液将其中和以达到pH 7并且将固体与溶液分离。特别地，酸性溶液是磷酸溶液、HCl溶液或 乙酸溶液。然后，用水对固体产物进行至少一次洗涤。在这些洗涤之间，将固体产物与溶液分离。 [0036] 在本发明的另一个实施方案中，中和步骤通过至少一次添加水(特别是蒸馏水)进行。当进行超过一次的添加时，在这些添加之间进行从溶液分离固体产物的步骤。当通 过添加水进行中和时，在中和之后不是必需要洗涤固体，但是如果需要更洁净的固体产物，则可以进行洗涤。 [0037] 在本发明的特别的实施方案中，所述方法包括在中和前的一个步骤，所述步骤在于在冷却后从溶液分离固体产物。分离例如通过离心进行。在工业规模，例如，批次2(或 第2批)在增加此步骤的情况下进行。 [0038] 在本发明的特别的实施方案中，酿造过程产生的生物质以1∶2至1∶5的量添加到反应器。特别地所述量为1∶3。这表示为湿生物质∶NaOH溶液。如实施例中可见， 以此方式制备批次2-4，其中生物质的添加量为1∶3(批次2和3)和1∶2(批次4)。在 干燥的产物中表示，所述实施例中使用的量将分别是1∶39和1∶23。 [0039] 因此，可以将酿造过程产生的副产物生物质添加到反应器中，其中NaOH溶液直接来自酿造过程。该生物质因为包含酿造过程的杂质所以是湿的(本文中称为″湿生物 质″)。 [0040] 也可以将干燥的酿造过程产生的副产物生物质添加到反应器中。因此，在另一个实施方案中，所述方法还包括在向NaOH溶液中添加生物质前，对酿造过程产生的生物质进 行预处理。所述预处理包括以下步骤：(a)筛分生物质以便将酿酒酵母生物质与酿造过程 的杂质分离；(b)干燥步骤(a)中获得的酿酒酵母生物质；以及(c)研磨步骤(b)中获得的 酿酒酵母产物。在此情况中，向反应器添加的干燥的酿酒酵母产物的量为1∶20至1∶40 重量/体积。特别地，所述量为1∶30w/v。如在实施例中可见，在生物质的添加量为1∶30 的情况下以此方式制备批次1。 [0041] 将反应器中的条件保持至少1小时。特别地，将条件保持5至20h，并且优选地保持16h。在另一个实施方案中，所述反应需要10h(见例如批次4)。 [0042] 将终产物干燥并最后微粉化。优选地，将所述产物放置在玻璃托盘中并且在真空炉中在60℃干燥至恒重，然后微粉化。干燥可以在真空下进行以减少工艺时间。在特别的 实施方案中，干燥通过喷雾干燥产物进行直至溶剂含量低于5重量％。 [0043] 本发明涵盖本文所述的特定条件的所有可能的组合。以下实施例(批次1-4)显示可以在不显著改变产物特性的情况下改变某些反应条件和方法步骤(如在实施例的第9.4 点中可见的)。 [0044] 作为该方法的结果，获得包含酿酒酵母的细胞壁的β-葡聚糖、壳多糖和脱乙酰壳多糖的组合物。在本发明的实施方案中，组合物中脱乙酰壳多糖、壳多糖和β-葡聚糖之比为1∶10∶80至1∶20∶150。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物在pH 3.5 在蒸馏水中的溶解度为650至800mg/l。在本发明的另一个实施方案中，组合物的碳、氢和 氮的原子质量百分比分别为36至44％(碳)、5.5至7％(氢)和0.2至0.8％(氮)。 [0045] 在本发明的特别的实施方案中，以0.25M的NaOH浓度，在80℃，在反应器中的干燥的酿酒酵母产物的量为1∶30w/v下，在16h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方 法。利用这些条件获得的组合物的化学性质描述于以下实施例的第2部分中。特别地，组合物中脱乙酰壳多糖、壳多糖和β-葡聚糖之比为1∶14∶116；所述组合物在pH 3.5在蒸 馏水中的溶解度为710mg/l；并且组合物的碳、氢和氮的原子质量百分比分别为40.32％、 6.35％和0.24％。 [0046] 在本发明的特别的实施方案中，以0.25M的NaOH浓度，在80℃，在反应器中的酿酒酵母湿生物质的量为1∶3下，在16h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方法。在中和步骤前，从冷却后的溶液分离产物。在特别的实施方案中，获得的产物具有在第9.4部分批次2中描述的性质。 [0047] 在本发明的特别的实施方案中，以0.25M的NaOH浓度，在80℃，在反应器中的酿酒酵母湿生物质的量为1∶3下，在16h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方法。在水解后，通过添加酸性溶液直接中和混合物(没有首先离心反应混合物下)。在中和后，将混 合物离心然后洗涤。在特别的实施方案中，获得的产物具有第9.4部分批次3中描述的性 质。 [0048] 在本发明的特别的实施方案中，以0.32M的NaOH浓度，在80℃，在反应器中的酿酒酵母湿生物质的量为1∶2下，在10h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方法。在水解后，通过添加酸性溶液直接中和混合物(没有首先离心反应混合物下)。在中和后，将混 合物离心然后洗涤。在特别的实施方案中，获得的产物具有第9.4部分批次4中描述的性 质。 [0049] β-葡聚糖由于其激活免疫系统的能力而被称为生物学反应调节剂。此外，欧洲食品安全局(European Food Safety Authority)(EFSA)以最新的科学观点推断在β-葡 聚糖的消耗和血液胆固醇浓度的降低之间可以建立因果关系。进行研究的食品成分是 β-葡聚糖，其是可溶性谷物纤维。关于重量控制，向EFSA提交的参考文件都没有证明 β-葡聚糖消耗对体重的作用，因此专家小组推断在β-葡聚糖消耗和正常体重的保持或 实现之间没有建立因果关系(Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to beta glucans and maintenance of normal blood cholesterol concentrations(ID 754，755，757，801，1465，2934)and maintenance or achievement of a normal body weight(ID 820，823)pursuant to Article 13(1)of Regulation(EC)(根 据规定(EC)的条款13(1)的对关于β葡聚糖和正常血液胆固醇浓度(ID754，755，757， 801，1465，2934)以及正常体重的保持或实现(ID 820，823)的健康宣称的证明的科学意 见)No 1924/2006EFSA Journal 2009；vol.7(9)pp.1254[18pp.])。 [0051] 以下工作实施例证明本发明的组合物涉及在改善摄入的脂质特征(profile)的能力方面的显著提高。在本发明的特别的实施方案中，所述组合物具有是其重量至少10倍的 脂肪结合能力，这是通过由以下组成的测定确定的：i)在37℃以及恒定搅拌下将棉籽油与 组合物在酸性溶液中接触两个小时；ii)将溶液离心以便将与组合物结合的棉籽油与存在 于上清中的未结合的棉籽油分离；iii)将上清与己烷混合并且对混合物进行离心；和iv) 回收经离心的混合物的上部相，允许己烷蒸发，并且对未结合的棉籽油进行称重。该测定还在实施例的第3部分中详细说明。 [0052] 以下工作实施例还证明，与用作对照组的市售的类似脂肪粘结剂产品相比，用本发明的产品饲喂的动物显示较少的重量增加。能量效率(g体重增加/kcal摄取的饲料) 是这样的值，其清楚地显示产品在降低吸收方面的效力。在此情况中，与对照相比，本发明的产品降低作为总饲料效率测量的总脂肪吸收。本发明的产品的消耗在动物中不显示明显 的粪便排泄的增加。在市售产品(Chitosan S)的组中不是这样。Chitosan S产品达到排 泄和干物质的极高值。这个与在本发明的产品的情况中发生的不同的事实表明在Chitosan S产品的情况中，存在非选择性的作用，Chitosan S产品并非特异性地结合脂肪而是还结合许多更多的营养物。因此，本发明的产品具有这样的优点，即没有由其他市售的脂肪粘结剂产品所呈现的抗营养作用，如实施例中所显示的。选择性脂肪结合是令人关注的，因为饱和脂肪酸的排泄在DAMM产品消耗后显著增加。实施例1中描述的方法生产的产品在下文中 以及在本文中也被称为“DAMM产品”或″批次1″。单不饱和脂肪酸的排泄增加(尽管结 果不是统计学显著的)，而多不饱和脂肪酸的排泄并不增加。 [0053] 本发明的产品的脂肪结合作用也已在人体内被证明。在人中的功能临床试验的结果显示在治疗3个月后重量下降0.7kg并且腰围减小2cm。在摄取所述产品后，观察到总体 脂减少0.82％。观察到使体脂在腹部区域中的累积减少的体脂的再分布。这与减少心血管 风险因素、高血压和糖尿病的潜在益处相关。在有这些结果的情况下，可以推断所述产品促进减重，在3个月的治疗后，重量总体减少2.1kg而腰围减小2cm(考虑到安慰剂组整体显 示1.4kg的增加)。这些结果是临床相关的，因为重量和腰围减小的结果是在没有特别限制 饮食的情况下并且在短的治疗时间内(3个月)获得的。 [0054] 除了在选择性地减少膳食脂肪吸收方面的作用以外，本发明的组合物还在葡萄糖的代谢中显示生物功能性。在动物模型的口服葡萄糖耐受试验中，血糖峰值(特别地在正 餐后即刻的时间)与阴性对照相比显示下降并且显示与阳性市售对照相同的级数。 [0055] 本发明的产品还显示其可以用作解毒剂，因为其捕获不同的相关毒物毒剂：黄曲霉毒素B1真菌毒素、水银、多氯化联苯(PCB 209)和呋喃。 [0056] 对获得所述组合物的方法的不同重复产生均质的产品，其保持相同的所提及的生物功能。因此，本发明的方法和产品的一个优势在于最终产品的性质和有用性不依赖于原 料，因为其利用提取自甲壳类的壳多糖/脱乙酰壳多糖发生。另外的及相关的优势在于，通过本发明的方法，整年内可以获得相同的材料；并且提取的组合物没有存在于提取自甲壳 类的组合物中的重金属内含物如镍、铜。 [0057] 在另一个实施方案中，获得富含多糖的组合物的方法包括第二次热碱处理(second thermoalcaline treatment)以便改变壳多糖的脱乙酰化程度。因此，在对获自 第一个反应的固体产物进行中和和分离后，以浓度为25至50％的NaOH，在40至80℃的温 度，并且在反应时间为30至240分钟的情况下，对所述产物进行第二次处理。特别地，NaOH的浓度选自25％、37.5％和50％。选择的反应温度为在40、60和80℃之间；并且选择的时 间为在30、120、135和240分钟之间。如在以下工作实施例(第7部分)中所显示的，该处 理所产生的产物可以用作解毒剂，因为其能够捕获不同的相关毒物毒剂：黄曲霉毒素B1真 菌毒素、水银、多氯化联苯(PCB 209)和呋喃。 [0058] 在另一个实施方案中，获自该第二次热碱处理的部分可用作免疫刺激剂，如在以下工作实施例中所显示的(第7部分)。具体地，在体内研究中，补充的动物由于具有氧化 活性的激活细胞的百分比增加而显示更大的针对细菌感染的保护能力。可用作免疫刺激剂 的特别的组合物是通过用25％NaOH在40℃水解起始产物达30分钟获得的(如通过实施 例的第1部分中说明的方法获得的)组合物。 [0059] 本发明还提供药物和/或兽医产品，所述药物和/或兽医产品包含有效量的本发明的组合物以及适量的药用或兽医用赋形剂。在这点上，所述药物产品可以被制备成以片 剂、丸剂、胶囊、微胶囊、粒剂、混悬剂、糖浆、干粉、液体制剂等的形式经口施用。考虑到所述组合物的特定目的，赋形剂的选择以及最适当的配制方法在药物技术领域的普通技术人员 的能力范围内。口服施用是优选的。 [0060] 术语″药用″当在本文中使用时属于这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，所述化合物、材料、组合物和/或剂型在良好医学判断的范围内适合用于与对象(例如人)的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症，具有合理的收益/风险比。各种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的″。合适的载体、赋形剂等可见于标准药物教科书。类似地，术语“兽医用”是指适用于与非人动物的组织接触。 [0061] 本发明的组合物也可以被包含在多种可食用产品中，所述可食用产品如乳制品、酸奶、凝乳、干酪(例如酸奶酪(quark)、奶油、加工的、软的和硬的)、发酵乳、奶粉、基于奶的发酵产品、冰激凌、基于发酵谷物的产品、基于奶的粉末、饮料、调味品和宠物食品。术语“可食用产品”以其最广的含义用于本文中，包括可以被动物摄取的任何类型、任何呈现形式的产品，但是排除药物和兽医产品。其他可食用产品的实例有肉制品(例如肝浆、法兰 克福香肠和意大利香肠或肉酱(meat spread))、巧克力酱(chocolate spread)、馅料(例 如巧克力糖(truffle)、奶油)和糖霜、巧克力、糖果(例如焦糖、软糖或太妃糖)、烘烤食 品(蛋糕、糕点)、沙司和汤、果汁和人造稀奶油。特别感兴趣的可食用产品有饮食补充物 和婴儿配方奶粉(infant formulas)。在本发明的意义上，饮食补充物还包括营养药物 (nutraceuticals)，其已知是对人类健康具有医药作用的食物提取物。动物食物用饲料也 包括在本发明的范围内。本发明的组合物也可以用作其他食物产品中的成分。因此，在本 发明的另一方面中，提供可食用产品，所述可食用产品包含本发明的组合物以及适量的可 食用成分。优选地，本发明的组合物是饮食补充物。如果根据本发明的组合物被用作饮食 补充物，其可以被原样地施用，或者可以与合适的可饮用液体如水、酸奶、奶或果汁混合，或者可以与固体或液体食品混合。在本文中，饮食补充物可以是片剂、丸剂、胶囊、粒剂、粉剂、混悬剂、香囊、锭剂、糖果、棒、糖浆和相应的施用形式的形式，通常是单位剂量的形式。优选地，本发明的组合物以在胶囊中的或形成丸剂(在药物产品的常规制备方法中制备的)的 粉末的形式施用。在另一个优选的实施方案中，所述组合物以容易溶解在可饮用液体中的 瓶盖内的粉末的形式呈现。适用于本发明的组合物的施用方案可以由本领域技术人员确 定。本发明的组合物可以这样施用：一天一次，一周一次，每周若干天或每天若干次。 [0062] 根据本发明的组合物可以被配制成可食用的药物或兽医产品，其中所述组合物是唯一的活性剂或所述组合物与一种或多种其他活性剂混合和/或与药用或兽医用赋形剂 (在药物或兽医产品的情况下)或适当的添加剂(在可食用产品的情况下)混合。 [0063] 因此，要理解，不管施用形式如何(即，可食用的、药物或兽医产品)，受试者都可以受益于本发明的产品的功能。生物功能是本说明书中说明的那些并且包括脂肪结合作用及其相应的在预防和/或治疗疾病如超重、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压和心血管疾病中的用途。生物功能还有葡萄糖结合作用、解毒作用和免疫刺激作用。 [0064] 以下部分通过体外以及动物和人的体内测定详细描述了获得本发明的组合物的方法，以及组合物性质，包括其脂肪结合作用。提供以下实施例和附图作为举例说明，并且它们不意在限制本发明。获得的结果证明：当与其他脂肪粘结剂市售产品相比时，本发明的组合物具有改善的特征。 [0065] 除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。在本发明的实施中，可以使用与本文中所述的那些 类似或等同的方法和材料。在整个说明书和权利要求中，词语″包含″及其变体不意在排 除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。在对说明书检查后，本发明的其他目的、优势和特征对于本领域技术人员将是明显的，或者可以通过实施本发明得到。此外，本发明涵盖本文所述的特别的和优选的实施方案的所有可能的组合。 [0066] 附图简述 [0067] 图1显示与之前在实验室规模获得的产品(C60，上图)相比的DAMM产品(下图)1 的 H-NMR分析。 [0068] 图2显示DAMM产品(图2A)和纯的壳多糖(来自蟹壳的壳多糖，Sigma，C3641)(图2B)的衍射图(X射线)。 [0069] 图3显示浅棕色细粉形式的最终产品。 [0070] 图4显示产物批次4(上图)、批次3(中图)和批次2(下图)的1H-NMR分析。实施例 [0071] 实施例1.获得富含多糖的组合物(“DAMM产品”)的方法 [0072] 用作起始物料的酿酒酵母源来源于酿造过程中的八次重复使用。用1mm的筛网对酿造过程副产品进行筛分以便将酿酒酵母生物质与酿造过程的杂质分离。在加热器中干燥 获得的酿酒酵母生物质并且碾磨以获得粉末。 [0073] 利用湿度分析仪IR Sartorius MA30确定酵母生物质的湿度。制备反应介质，用蒸馏水加载反应器，将搅拌调节在150rpm，添加获得1M NaOH溶液所需量的NaOH，然后在 80℃加热反应介质。称重酵母生物质以使干酵母生物质/反应介质体积之比为1/30。将 酵母生物质添加到热的反应介质中，并且将反应保持16h。经过反应时间后，冷却产品至室温。随后，将反应体积卸载到惰性容器。将连续离心的运行条件调整至120秒的旋转时间 和2秒的卸载(排出)时间。进行离心，在室温，使用蠕动泵(流速3l/min)，用来自所述容 TM 器的反应产物向离心机(Centrifuge GEA Westfalia CTC 1(WhisperFuge ))进料。在此 第一次离心后，将获得的固体收集在容器中并且用蒸馏水中和。为此，连续地添加蒸馏水的体积，进行恒定的搅拌并且控制混合物的pH。混合物的终体积为约50％反应体积并且pH 值为9至10。对获得的中和的混合物的体积再次进行离心，并且重复如上所述的中和-离 心过程，直至达到pH7。五轮离心/中和足以实现pH7。在搅拌下用蒸馏水洗涤pH7的终产 品，直至固体完全分开。此溶液的终体积约为反应体积的25％。如上所述地在室温并且在 流速3l/min下对获得的混合物体积再次离心。通过不连续离心对以上步骤中获得的产物 进行离心，其中使用Eppendorf离心机5804R。最后，利用以下运行条件和喷雾干燥器技术 条件对获得的产品进行喷雾干燥： 与产品接触的材 料＝不锈钢AIS 316；外部材料：AISI 304； 旋转 3 rpm＝24400rpm；旋转功率＝3.5kW旋转；最大空气流率(进气)＝990m/h；进气的最高 温度＝250℃；进气电池的最大功率＝27kw；用于进液的蠕动泵：自动/手动速度。 [0074] 在以下实验中，此部分中描述的方法所产生的产品也被称为“DAMM产品”或″批次1″。 [0075] 使所述方法扩展到中试规模，使NaOH浓度从1M至0.25M变化。进行体外脂肪结合测试以按比例地评估产品的生物功能的保持，得到积极结果。 [0076] 实施例2.产品表征 [0077] 在图1中，1H-NMR分析显示：与之前在实验室规模获得的产品(上图)(该产品在图中被称为“C60”)相比，在中试规模获得的DAMM产品(下图)呈现相同的官能团。图2 显示DAMM产品(图2A)和纯的壳多糖(图2B)的衍射图(X射线)。图3显示DAMM产品的 外观。 [0078] 化学分析显示DAMM产品的脱乙酰壳多糖、壳多糖和β-葡聚糖之比为1∶14∶116，并且碳、氢和氮的原子质量百分比分别为40.32％、6.35％和0.24％。该产 品在pH 3.5在蒸馏水中的溶解度为710mg/l。 [0079] 实施例3.脂肪结合作用：体外选择性测定 [0080] 利用以下脂质进行通过GLC-MS对脂肪结合以及脂肪捕获中的选择性进行测定： [0081] ·橄榄油+胆固醇(25mg胆固醇/ml的橄榄油) [0082] ·棉籽油 [0083] ·鱼油+反油酸(2.5mg反油酸/ml鱼油) [0084] 使用这些脂肪而不使用其他脂肪的理由为： [0085] -它们是脂质的复杂混合物，因此获得关于对不同类型的脂肪酸的更大或更小的亲和性的信息。此外，情形接近于真实摄入。 [0086] -对于测试对二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的亲和性程度来说，使用鱼油是所希望的，由于DHA和EPA的显著的健康益处，希望避免其固定化。 [0087] -利用橄榄油在测定中引入胆固醇提供关于结合来自动物来源的最有害的脂肪之一的能力的信息。 [0088] -利用这些产品，总计16种对心血管健康或多或少有益或有害的脂肪酸的捕获亲和性程度被评估。 [0089] 测试的“脂肪粘结剂”产品有DAMM产品、具有82％脱乙酰化程度的来自Primex(“Chitoclear”，Iceland)的市售的脱乙酰壳多糖(“Qs Primex”)和来自 Laminaria(Laminaria digitata Sigma，L9634)的葡聚糖。 [0090] 使用的方案如下：对于要测试的每种脂肪粘结剂产品，用HCl 0.5M制备pH 2的12ml溶液(w/v)。将3g脂质添加到该溶液并且在37℃在300rpm搅拌3小时。然后利用 0.1M NaOH将溶液的pH先增加至pH 6.2然后增加至6.5的最大pH并且在搅拌下在37℃保 持2.5h。然后将溶液在2000g在37℃离心以分离未与产品结合的脂肪。利用移液管将未 结合的脂肪除去，小心不要吸出水相。用0.5M HCl酸化该溶液以溶解脂肪粘结剂产品并且 尽可能多地释放脂肪。将水相用5ml己烷萃取三次并且最后合并三份有机萃取物，在40℃ 在被称重过的容器中蒸发。最后称重干燥的脂肪以定量脂肪粘结剂能够结合的脂肪的量。 结果显示在表1中。 [0091] 表1 [0092]橄榄油+胆固醇 ％结合的脂肪 mg结合的脂肪/100mg Qs Primex 29.4±6.1 2015.8±398.8 葡聚糖(Laminaria) 17.0±5.7 1129.5±374.8 DAMM产品 24.1±4.9 1615.6±328.0 棉籽油 ％结合的脂肪 mg结合的脂肪/100mg Qs Primex 11.3±1.2 746.8±82.7 葡聚糖(Laminaria) 13.8±5.3 944.2±359.5 DAMM产品 17.3±7.3 1161.2±490.9 鱼油+反油酸 ％结合的脂肪 mg结合的脂肪/100mg Qs Primex 78.7±8.4 5364.4±613.5 葡聚糖(Laminaria) 12.9±3.9 894.1±268.5 DAMM产品 14.9±6.0 998.2±409.0 [0093] 在鱼油+反油酸的情况中，与Qs Primex相比，DAMM产品显示明显较低的脂肪结合能力。此结果非常有关，因为希望避免鱼油组分(DHA和EPA)的固定化，由于它们是有益 于健康的。 [0094] 在选择性脂肪结合的实验中，给出了％提高的最终值。该值这样获得：每种脂肪酸的％减去由未处理的对照呈现的％。结果显示在表2、3和4中。符号是正还是负取决 于每种脂肪的健康或毒性。在下表中，“tr”是指痕量；unsat＝不饱和的；sat＝饱和的； monounsat＝单不饱和的；polyunsat＝多不饱和的。 [0095] 表2 [0096] [0097] 表3 [0098] [0099] 表4 [0100] [0101] 涉及关于摄入(并且因此饮食)的脂质特征的更实质性提高的产品是DAMM产品。 [0102] 实施例4.脂肪结合作用：体内动物测定 [0103] 4.1体内动物测定 [0104] 进行动物研究以评估选择性脂肪结合的能力。选择的动物模型是雌性DunkinHartley豚鼠，因为该模型具有非常类似于人特征的脂质代谢特征，尤其是在HDL、LDL和 VLDL胆固醇的情况中。豚鼠为5-6周龄并且重300-400g。将动物分成不同的组，每组n＝ 8： [0105] -阴性对照组，使用纤维素(没有脂肪结合能力的产品)； [0106] -阳性组，使用燕麦麸 (“Crusca di Avena”，可溶纤维；具有假定的减少脂肪吸收的能力)； [0107] -使用Chitosan S产品(低分子量，50-1.000kDa，较小的粘度，DG 70％最小，Primex，Iceland)的组； [0108] -使用Chitosan L产品(高分子量，500-5.000kDa，DG 70％最小，Primex，Iceland)的组。 [0109] 测定需要35天，包括7天的驯化和28天的实验。动物在单独的开放式笼子中，经受12h光/暗循环，水和饲料随意获取。为了使观察的差异最大化，定制的高卡路里饮食添 加到饲料中并且富含脂肪和简单糖类：4.7kcal对3.8kcal。对于要测试的各种产品(纤维 素/ /DAMM产品/Chitosan S/Chitosan L)的12％的添加，使用基本饲料以使 各种实验产品的可能作用最大化。结果显示在表5中。 [0110] 表5 [0111] [0112] 饲料效率(g/100g)是以g/100g的摄入饲料计的动物重量增加。以g/100kcal计的饲料效率是以克/100kcal摄入计的动物体重增加。结果的比较通过横向分析 组(cross-sectional analysis groups)进行。使用的统计检验是Duncan多重比较 (p≤0.05)。显示不同字母的样品显示统计学显著性差异。 [0113] 如在表5中可见的，Chitosan L产品对重量增加的作用和效率(带下划线的结果)异常高，接近有毒性。Chitosan L对动物引起相关的肠道问题和腹泻。因此，可以说 Chitosan L产生了不想要的抗营养作用。此事实表明将该组包括在分析中掩饰结果。因 此，决定将Chitosan L组从统计分析中排除。 [0114] 概述在表5中的结果显示，与对照组 和纤维素相比，用DAMM产品饲喂的动物显示更小的体重增加。能量效率(增加的g/kcal的摄入饲料)是这样的值，其清 楚地显示在减少吸收方面的产品效力。以kcal计的值消除了由于饲料的组成不同而导致 的饲料之间可能的差异。因此，与纤维素和阳性对照相比，DAMM产品减少了作为总饲料效率(增加的体重g/kcal摄入)测量的总脂肪吸收。Chitosan S显示比DAMM产品大的减少， 但是DAMM产品表现出最小的数值偏差。可以观察到， 和阴性对照具有类似的 表现。 [0115] 4.2.粪便分析 [0116] 该研究之后是粪便的分析，其是作为对产品减少脂肪吸收的能力的认可并且说明优先结合一种脂肪还是另一种脂肪的能力。要分析的值有： [0117] -粪便产生：可以用于推断运行机制以及对消费者的潜在危害 [0118] -表观吸收：计算为吸收的干物质的克数/100g消耗的干饲料 [0119] -总排泄：计算为排泄的干物质的克数/100克消耗的干物质 [0120] -粪便中脂肪酸的分析：计算为在实验的不同周内排泄的脂肪酸的浓度和量 [0121] 结果的比较通过横向分析组进行。使用的统计检验是Duncan多重比较(p≤0.05)。结果表示为每只豚鼠每天(n＝8)排泄的新鲜粪便的克数(在排泄的情况 下)，并且表示为每只豚鼠每天(n＝8)的以干重计的粪便克数(在干物质的情况下)。结 果显示在表6中。 [0122] 表6.显示不同字母的样品显示统计学显著性差异。 [0123] [0124] 消耗DAMM产品并不意味着动物粪便排泄的显著增加。将此外推至潜在的人消耗，意味着在这方面上将没有不便。同样重要的是注意到大便具有良好的外观。在Chitosan S 组中不能说成是这样的(见表6)。 [0125] 在开始周，在任何情况中都没有统计学显著性差异。在第1周，在“排泄”中，DAMM产品并没有与任何其他组有不同。与Chitosan S组相比，DAMM产品在干物质的值方面确实显示不同。在第4周，DAMM组、纤维素组和 组显著区别于Chitosan S组。因此， 消耗具有DAMM产品的饲料，虽然稍微增加排泄，但其不是统计学显著性的，这与Chitosan S产品不同。这是一个有趣的点，因为增加的粪便排泄不是负面的，但总是如果在正常参数内发生，对于Chitosan S产品则不是这样。 [0126] Chitosan S产品达到排泄和干物质的极高值。此事实(与在DAMM产品下发生的不同)表明存在非选择性的作用，而是通过物理方法的作用：Chitosan S产品并不特异 性地结合脂肪，而是结合许多更多的营养物。因此，排泄增加并且重量增加较小。考虑到 Chitosan S组获得的干物质的高值，看来明显的是，其生物功能性是由于食物团粘度的增 加所致。这是物理方法，其涉及增加脂肪去除以及减小吸收的可能性。因此，Chitosan S是不具有特异性脂肪结合能力的产品，其可能导致抗营养作用。 [0127] 因为阴性对照(纤维素)、商品 组和DAMM组的干物质的值非常相似(没有显著性差异)并且在另一方面，重量增加值(如所示)是不同的，可以推断，在DAMM 组中脂肪排泄实际更高。Chitosan S组值再次证实物理方法的排泄结果的非特异性。 [0128] 4.3.粪便的脂质组成 [0129] 最后，分析动物粪便的脂质组成从而评估它们关于特定脂质的排泄程度是否存在差异。根据Duncan的多重比较检验(p≤0.05)进行统计分析。 [0130] 在第0周，在各组之间没有差异，所以对于所有状态和每个组来说，基线是相同的。在第4周的脂肪酸分析显示在表7(其中结果被表示为mg脂肪酸/g粪便)中和表8(其 中结果被表示为每只动物每天排泄的mg脂肪酸)中。 [0131] 表7：表示为mg脂肪酸/g粪便的结果 [0132] [0133] C18：1反式(反式异构体的总和) [0134] TSFA：总的饱和脂肪酸 [0135] MUFA：总的单不饱和脂肪酸(无反式) [0136] PUFA：总的多不饱和脂肪酸(无反式) [0137] TUFA：总的不饱和脂肪酸 [0138] 与阴性对照(纤维素)相比，DAMM产品显示更高的对健康具有潜在的负面效果的脂肪酸(饱和的)的值。相反，大多数的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸不显示显著差 异。 [0139] 表8：表示为每只动物每天的排泄的mg脂肪酸的结果。 [0140] [0141] 在DAMM产品消耗后，饱和脂肪酸的排泄显著增加。单不饱和脂肪酸的排泄增加(虽然结果不是统计学显著的)，而多不饱和脂肪酸的排泄没有增加。 [0142] 鉴于这些结果，DAMM产品表明更高的饱和脂肪酸：C14：0/C16：0/C18：0/C20：0/C22：0(肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸)的排泄。这是正面的，因为饱和脂肪酸吸收的减少表示饮食营养特征的改善。作为此减少的结果，发现总饱和脂肪酸(TSFA)的吸收的统计学显著减少。 [0143] 关于亚油酸(C18：2n6)和α-亚麻酸(C18：3n3)，在DAMM组中没有观察到统计学显著的增加。这代表了选择性脂肪结合产品的另一个令人关注的生物功能，因为亚油酸和 亚麻酸是必需脂肪酸并且对健康是重要的。为了加强观察到的值，结果证实总多不饱和脂 肪酸和不饱和脂肪酸的排泄没有增加。相反地，总的脂肪酸吸收存在净减少，因此DAMM产 品是这样的产品，其减少脂肪吸收但是并不增加对健康有益的脂肪酸的排泄。 [0144] 在选择性方面， 产品具有良好的表现(类似于DAMM产品)，如在被表示为mg脂肪酸/克粪便的值的统计结果中可见的。然而，在每日排泄水平方面，其表现并 不理想：其排泄值低，这解释了在饲料效率和重量增加值方面观察到的效果的缺乏。关于脂肪酸分析，Chitosan S产品所显示的与对于产品 所报道的相反：脂肪结合能力 不是选择性的，并且它通过其高的粪便产生导致大量的排泄的脂肪。 [0145] 实施例5.脂肪结合作用：人中的功能临床测定 [0146] 研究是利用平行组的临床的、随机化的、双盲、安慰剂对照的研究，用来研究在重量控制方面DAMM产品作为饮食补充物的效力和安全性。样本量为60名患者，其被分成30名参与者的两个平行研究组，一个接受溶解在水中的活性物质(DAMM产品)，而另一个 2 接受溶解在水中的安慰剂。募集的患者是体重指数介于超重和肥胖之间(25-34.99Kg/m) 的成人，其没有饮食性疾病并且在之前的三个月没有遵循或曾经遵循过低卡路里饮食。由 于上述要求，募集是不容易的，患者必须是首次来咨询的人，并且即使不是，其也必须是肯定没有被规定节食或某些类型的饮食干预的人。募集的困难导致多中心试验。临床方案 由巴塞罗那医院伦理委员会、马德里临床诊断研究中心和马德里肥胖欧洲医学院(Ethics Committee of Hospital Clínic de Barcelona、Centro Clínico Diagnóstico of Madrid和Instituto Médico Europeo de la Obesidad of Madrid)批准。 [0147] 目的是证明食用DAMM产品改善人体重(最终BMI)。为了提供对患者的发展的足够的追踪，研究达12周(84天)，并且在42天进行中间评估。研究募集了60名参与者(11 名男性和49名女性，平均年龄为48岁(22至65岁))。其中的44人完成了所述研究。在 放弃研究的患者中，他们中的大多数是由于个人原因。向参与者给出关于健康的地中海式 的饮食(Mediterranean-type diet)(热量适当的)的总体饮食建议，参与者在开始实验阶 段前的1个月遵循所述建议，记录饮食中出现的偏差。在参与者的个人背景特征或临床基 本特征方面，ANOVA分析没有产生统计学显著的差异。因此，试验结束时获得的结果是不受患者分布影响的产品效果的结果。 [0148] DAMM产品被提供在适用于液体瓶的螺旋盖中。研究的产品有(每个螺旋盖的组成)： [0149] -实验产品：1g DAMM产品+35mg“caramelina”着色剂(E-102/124/132 16％) [0150] -对照：安慰剂：1g微晶纤维素+17.5mg着色剂(E-102/124/132 16％) [0151] 每个对象将2个盖溶解在500ml水的瓶子中并且连同午饭服用，并且将1个盖溶解在500ml的瓶子中并且连同晚饭服用。每日重复该过程达12周。在实验阶段期间，每名 参与者到研究中心进行3次就诊，在0时刻的一次就诊(就诊0或基线)、中间就诊以及在 研究结束时的一次就诊。在每次就诊中，分析不同的参数，如重量和高度测量，人体测量检测(腰围和臀围)，体脂百分比(通过双能X射线吸光测定法测量的)，以及血液测试。 [0152] 表9.关于重量的结果(kg)。SD＝标准偏差；MSE＝平均标准误差 [0153] [0154] 组内比较：在服用DAMM产品3个月后，显示重量下降0.7kg。基线和最终值之间的差异是统计学显著的，其中p＝0.027。在安慰剂组中，存在统计学显著的差异，但是这是对重量增加而言的，其中p＝0.000。 [0155] 组间比较：通过比较接受DAMM产品和接受安慰剂的参与者的重量差异，发现这些差异是统计学显著的，其中p＝0.000。 [0156] 表10.关于腰围的结果(cm)。SD＝标准偏差；MSE＝平均标准误差 [0157] [0158] 组内比较：在服用DAMM产品后腰围减小。在腰围的基线和最终值之间的2cm减小的差异是统计学显著的，其中p＝0.013。对于安慰剂组，没有观察到统计学显著的差异。 [0159] 组间比较：通过比较接受DAMM产品和接受安慰剂的参与者的腰围差异，发现这些差异是统计学显著的，其中p＝0.015。 [0160] 表11.关于体脂的结果(％)SD＝标准偏差；MSE＝平均标准误差 [0161] [0162] 在服用DAMM产品后观察到总体脂下降0.82％。此下降具有统计学显著性的趋势，其中p＝0.067。对于安慰剂组，没有观察到统计学显著的体脂差异。 [0163] 在DAMM产品组中观察到男性样(android)(身体上部)脂肪减少1％，但是此差异不是统计学显著的，p＝0.101。所述产品还降低体脂百分比，即损失0.8％的体脂并且减 少几乎1％的男性样脂肪。这些结果不是统计学显著的，因为样本量没有大到足以检测各 组间的差异，但是具有临床重要性。体脂和男性样脂肪百分比的下降对应于体脂的再分布，减少了其在腹部区域的累积。这与在减小心血管风险因素、高血压和糖尿病方面的潜在益 处相关。在N更大的情况下，可能可以发现显著的差异。在服用DAMM产品后以及在安慰剂 组中，没有观察到臀围和女性样(gynoid)脂肪(身体下部)的统计学显著的变化。利用这 些结果，可以推断，DAMM产品促进减重，在治疗3个月时，重量减小约2.1kg并且腰围减小 2cm。这些结果在临床上是有意义的，因为重量和腰围减小的结果是在没有特殊的限制性饮食的情况下以及在短的治疗时间内(3个月)获得的。对给予参与者的产品的调查揭示，它 们是味道令人满意并且具有怡人气味的产品。 [0164] 实施例6.葡萄糖结合作用：动物模型中的口服葡萄糖耐受测试 [0165] ″口服葡萄糖耐受测试”(OGTT)实验允许分析特定化合物响应于葡萄糖摄取的作用。虽然有这样的称呼(“口服”)，该实验也可以通过胃内施用来进行，如在此情况中。方案如下：24只重250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食过夜(14至16h)。移走食物 并且将动物重新放置在干净的笼子中以防止摄入大便。在所有实验期间，无限制地提供水。 在禁食后的实验当天，对动物进行称重。以预定剂量将要测试的化合物与所选剂量的葡萄 糖混合以最后胃内施用1ml治疗剂(treatment)/200g动物(即2g葡萄糖/kg动物)。瓜 尔胶由于被承认是葡萄糖粘结剂而被用作阳性对照。测试组如下： [0166] -阳性对照：瓜尔胶(6mg/ml)+葡萄糖(400mg/ml)至1ml/200g动物)；n＝8 [0167] -阴性对照：葡萄糖(400mg/ml至1ml/200g动物)；n＝8 [0168] -DAMM组：DAMM产品(6mg/ml)+葡萄糖(400mg/ml至1ml/200g动物)；n＝8 [0169] 在溶液制备后，使用 Elite确定所有动物的基础血糖值(对应于0时刻)。通过向每组动物进行胃内施用来施用不同的治疗剂。在向每组中的第一只动物施 用后激活计时器。在时间15、30、60和120min确定葡萄糖水平。在最后一次血糖测量后， 根据伦理委员会(Ethics Committee)的指示，恢复对动物的饲喂。 [0170] 表12.结果被表示为以mg/dl计的平均值±S.D.；AUC是指增加的曲线下面积；同一行中的具有不同字母的结果指示基于Duncan多变量检验的显著差异(其中p＜0.05)。 [0171] [0172] 在动态值的第一点观察到的各值之间的差异显示统计学显著性：这是在检测组间差异方面更关注的点，因为它是峰值，其中糖浓度的增加相对于之前的点(基线)更显著。 这里，餐后时间是葡萄糖峰显示更大的增加并且因此代表大的健康风险的时间。在没有获 得统计学显著性的情况下，清楚可见的是，在时间90和120min，阳性对照和DAMM产品的曲 线的相对位置存在反转。 [0173] 与使用瓜尔胶的阳性对照相比，DAMM产品在葡萄糖减少方面并不显示更大的作用，但是结果是令人满意的，因为DAMM产品能够控制葡萄糖水平。DAMM产品相对于瓜尔胶 具有相关的优势，因为后者非常显著地增加溶液的粘度，因此它对葡萄糖进行的是″机械 捕捉″，这解释了血液峰值的这种减小。形成对比的是，DAMM产品不改变溶液的粘度，溶液的粘度是食品技术中非常相关的因素。所述产品因为葡萄糖峰较低而适用于糖尿病患者， 并且因为所述峰值随着时间的过去更加持续而适用于体育运动。 [0174] 实施例7.解毒作用 [0175] 分析DAMM产品针对不同毒物毒素的螯合(隔离)能力。测试获得自以DAMM产品开始的第二次热碱处理的不同级分(fraction)的解毒能力。各级分的名称指示所述第二 次热碱处理的具体处理条件。对于所有情况，使用以下计算来确定螯合的化合物的％：螯合的化合物的％＝100(1-XFx/Xref)x100 [0176] XFx是各级分x的实验化合物浓度，而Xref是理论化合物浓度。通过下式确定每mg的DAMM产品级分的螯合的化合物的量： [0177] (Xref-XFx)x Vx/Mr＝X ng螯合的化合物/mg DAMM产品级分 [0178] Vx是级分的体积而Mr是测试的化合物的分子量。 [0179] 7.1.黄曲霉毒素B1分析 [0180] 黄曲霉毒素B1(AFB1)是由曲霉属(genus Aspergillus)的成员如黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的真菌毒素的亚型。 其可能是多种食物的污染物。AFB1的代谢导致一种最强力的致癌物。为了进行分析，将各 个DAMM产品级分以1mg/ml的浓度分配(在独立的实验中)到试管中的蒸馏水中。将0.9ml 的AFB1的标准液(0.9mg的AFB1)添加至17.9ml的终体积。测试悬浮液中的AFB1的理论 终浓度为50.3μg/ml(50.3ppm)。将三个相同的试管制备成对照，其中不添加DAMM产品级 分。将混合物在37℃在以300rpm搅拌下温育3小时。然后通过0.45μm孔径的注射器过 滤产品。最后通过HPLC-FD测定螯合的AFB1。 [0181] 7.2.水银(Hg)分析 [0182] 将各个级分以1mg/ml的浓度分配(两次重复)在试管中的蒸馏水中(20mg的各级分，用19ml的蒸馏水)。然后，加入1ml氯化汞溶液(0.560mg的Hg)，达到20ml的测试 溶液的终体积。Hg在测试溶液中的理论终浓度为28.00μg/ml(28.00ppm)。将三个相同的 试管制备成对照，其中不添加DAMM产品级分。将混合物在37℃在以300rpm搅拌下温育3 小时。然后通过0.45μm孔径的注射器过滤产品。最后测定螯合的Hg。Hg螯合值惊人地 好，如表13中所示。 [0183] 7.3.多氯化联苯 [0184] 将化合物PCB 209(十氯代联苯)用作在环境中发现的那些多氯化联苯(PCB)的模型，因为其是最丰富和有毒性的一种。将各级分以1mg/ml的浓度分配(两次重复)在试 管中的二氯甲烷中(10mg的各级分，用10ml的二氯甲烷)。将0.1ml的PCB 209储液(55μg PCB 209)添加到之前的溶液中。PCB 209在测试溶液中的理论终浓度为5.5μg/ml。将三 个相同的试管制备成对照，其中不添加DAMM产品级分。将混合物在30℃在以300rpm搅拌 下温育3小时。然后通过0.45um孔径的注射器过滤产品。最后测定螯合的PCB 209。 [0185] 7.4.呋喃 [0186] 将各级分以1mg/ml的浓度分配(在独立的实验中)到试管中的二氯甲烷中(10mg的各级分，用10ml的二氯甲烷)。将0.1ml的呋喃储液(55μg呋喃)添加到之前的溶液 中。呋喃在测试溶液中的理论终浓度为5.5μg/ml。将三个相同的试管制备成对照，其中不添加DAMM产品级分。将混合物在30℃在以300rpm搅拌下温育3小时。然后通过0.45μm 孔径的注射器过滤产品。最后测定螯合的呋喃。所有分析的毒素的结果显示在表13中。 [0187] 表13 [0188] [0189] 如在表13中可见，不是所有级分针对所有毒素进行测试。尽管事实如此，但是它们不能被忽视，因为对于对特定的毒素具有活性来说，它们可能是令人感兴趣的。例如，级分4对于AFB1和Hg相当好；级分8、10、15、19和20对AFB1具有活性并且对于Hg非常好； 并且级分12、13、14、17和18虽然不表现AFB1捕获但是可以非常好地捕获Hg。 [0190] 7.6.级分的生物利用度 [0191] 对于解毒作用进一步地，下个点是检验这些级分对于所需用途的适用性：用于防止存在于食物中的毒素被吸收。为此，测试了它们具有低的被肠上皮吸收的生物利用度。 在Transwell平板中进行评估，所用方法是基于在通过MIF(迁移抑制因子)蛋白质诱导的 Caco-2细胞的模型中的M细胞的分化。 [0192] 制备M细胞 [0193] 在Transwell平板上培养Caco-2细胞。在37℃、5％CO2将细胞培养14天直至完2 全分化。在培养期间监测跨上皮电阻(TEER)直至250Ω.cm 的值(当以0.3μg/ml上清 的浓度添加MIF蛋白质时)。将其在37℃和5％CO2温育5h。 [0194] DAMM产品级分的DTAF(二氯三嗪基氨基荧光素)标记 [0195] 将各级分碾磨直至获得细粉。将20-25mg粉末稀释在1ml硼酸盐缓冲液pH 9中。在室温对混合物进行10min的超声处理。然后，加入1ml DTAF 1mg/ml并且保持恒定搅拌 过夜。将最终的溶液在4000rpm离心10分钟，并用5ml PBS连续洗涤。将不同标记的级分 添加到Transwell平板的上部并且温育3h。 [0196] 进行测定，利用荧光剂模式孔扫描520(Em)-490(Ex)。使用各级分的1/50和1/100稀释物。一式两份地进行分析，求平均值。在每种情况中，评估在肠上皮的模型中级分的渗透的％。生物利用度的结果以及之前的捕获结果显示在表14中。 [0197] 表14 [0198] [0199] 级分之间存在明显重叠，显示更大的捕获和更少的吸收，这对解毒目的是理想的。 [0200] 实施例8.免疫刺激作用 [0201] 进行一系列实验以确定所述产品对免疫系统的作用： [0202] -″噬菌体测试″：定量测定肝素化血液中的单核细胞和粒细胞的吞噬活性。 [0203] -″突释测试(Burst Test)″：测定肝素化血液中的单核细胞和粒细胞的氧化活性。 [0204] 将Wistar大鼠分成两个组，每组n＝8；一个使用实验产品而另一个使用对照。实验产品是通过用25％NaOH在40℃水解30分钟获得的之前第7部分的级分2。测定进行三 周。将大鼠保持在12h光/暗周期，食物和饮水不限制。基础饲料是相同的，并且用要测试 的产品改性： [0205] -对照饮食：标准大鼠饮食(Teklad Global Diet，2014)； [0206] -实验饮食：标准大鼠饮食(Teklad Global Diet，2014)，补充以1.2g的实验产品。免疫刺激剂量为100mg实验产品/kg动物(30mg/天) [0207] 在实验期间，有规律地监测动物重量和消耗的饲料，以及指示各组中的免疫系统的状态的值。通过利用异氟烷(isoflurane)对动物进行麻醉并且除去隐静脉的血液样品， 在第0天和第12天(总共持续22天)进行样品收集。最后一天将动物麻醉并处死，通过 心脏穿刺获得最大体积的血液。 [0208] 8.1.噬菌体测试 [0209] 噬菌体测试允许测定显示吞噬能力的淋巴细胞的百分比和被表现所述活性的各淋巴细胞吞噬的细菌的数目。 [0210] 在冰浴中将100μl的血液冷却至0℃并且加入20μl的荧光标记的大肠杆菌(Escherichia coli)的冷悬浮液。将样品在37℃在水浴中温育10min。然后将样品冷却。 添加100μl的螯合剂溶液以除去未被内化但是附着于细胞表面的细菌。加入3ml的洗涤 缓冲液并且将样品在250g在4。℃离心5min。弃上清并加入裂解缓冲液。温育样品以除 去非免疫细胞。将200μl的DNA标记溶液添加到获得的白细胞级分中。在从标记起计不 到1h后，通过流式细胞术分析细胞。白细胞的DNA标记(其在红光范围内发射荧光)允许 区分事件(细胞)，即将白细胞与其他细胞区分。利用各细胞类型的光折射性质，绘制允许 区分嗜中性粒细胞和单核细胞的直方图。通过噬菌体测试获得的结果显示在表15中。 [0211] 表15.噬菌体测试的结果 [0212] [0213] 由于血液不足而没有获得第0天的结果。对于在第12天n＝3(由于样品不足而将血液样品集中在一起)，并且在第22天n＝9，结果被表示为平均值±S.D.。显示不同字 母的来自同一天并且在同一列的样品显示统计学显著的差异(p＜0.05)。 [0214] 可以观察到，第12天的样品数目没有大到足以在细胞数目方面在各种处理之间建立统计学显著的差异。然而，观察到，与对照样品相比，在实验组中，嗜中性粒细胞和单核细胞的平均荧光在统计学显著增加。在第22天，刺激的嗜中性粒细胞和单核细胞的百分比 (即，能显示吞噬活性的细胞的数目)没有差异。关于单核细胞，与对照组相比，实验产品显著增加其活性(p＜0.01)。因此，在各处理之间显示吞噬能力的单核细胞的百分比没有差 异，但是用实验产品饲喂的那些动物的单核细胞显示每个刺激的单核细胞吞噬或摄入更大 数目的细菌大肠杆菌的能力。 [0215] 8.2.突释测试 [0216] 突释测试允许测定免疫系统细胞表现氧化活性的能力，即利用依赖氧的机制除去加强物(booster)颗粒的潜力。 [0217] 对于各个样品，将100ul的血液添加到3个不同的试管中，将所述试管在冰浴中在0℃冷却。将20μl的缓冲液(阴性对照)添加到3个试管中的一个，而将用于氧化活性的 不同的加强物添加到其他试管中：大肠杆菌颗粒和蛋白激酶C的配体-佛波醇13-肉豆蔻 酸酯12乙酸酯(phorbol13-myristate 12acetate)(PMA)作为高对照。将样品混合并且在 37℃在水浴中温育10min。加入20μl的去氢罗丹明123底物(DHR)，其可以被氧化而产生 绿色荧光。将其温育10min以上。加入2ml的裂解溶液并且将样品在25℃温育以除去红细 胞。将其用缓冲液洗涤。向获得的白细胞级分中添加200ul的DNA标记溶液。在从标记起 计的不到1h后，通过流式细胞术分析细胞。第0天和第12天的样本量没有大到足以确定 各种处理之间的统计学显著的差异。因此，数据分析主要集中于处理的最后一天。 [0218] 基于结果，当使用高刺激(PMA)时，在嗜中性粒细胞的活性方面没有观察到显著差异。然而，在实验组中，存在增加单核细胞中检测到的荧光强度的趋势，这表明了增加其活性的趋势。当样品经受颗粒刺激物(大肠杆菌)时，用实验产品饲喂的动物显示轻微而 不显著的嗜中性粒细胞的百分比增加的趋势，显示氧化能力。关于单核细胞，实验组显示细胞的百分比更高，显示氧化能力(p＜0.05)。因此，如在噬菌体测试中那样，消耗实验产品的主要作用是增加单核细胞的反应。突释测试的结果显示在表16中。 [0219] 表16.突释测试的结果(第22天，对于大肠杆菌颗粒) [0220] [0221] 总之，实验产品在增加免疫反应方面具有显著作用。此活性主要集中于产品增加单核细胞针对潜在感染过程的反应的能力。其摄入表明嗜中性粒细胞的吞噬活性增加和单 核细胞的吞噬活性统计学显著增加的趋势。其并不增加表现活性的白细胞的比例，而是已 经表现活性的那些有能力摄入更大数目的病原体。当经受颗粒刺激物如大肠杆菌时，所述 产品增加表现氧化活性的单核细胞的比例。因此，所述产品增加由单核细胞摄入的细菌的 量，这可以使得能够实现更大数目的表现氧化活性的单核细胞。外推至人食用，检测到相同的生物功能性将用到每日5-6克。 [0222] 实施例9.工业放大 [0223] 通过工业过程获得不同批次的产品并将其与如实施例1中所述那样获得的产品(″DAMM产品″并且在本文中被称为批次1)比较。 [0224] 对于工业放大，使用酿造过程产生的酿酒酵母副产品湿生物质作为原料。 [0225] 9.1.批次2 [0226] 在将产品在105℃干燥后，湿生物质中的干物质的量约为17％。在这17％中，13％对应于不溶性固体(酿酒酵母细胞)而4％对应于可溶性固体。 [0227] 准备反应介质，用300kg蒸馏水加载反应器，并且加入4kg的NaOH。将一百千克的湿生物质添加到反应介质，这意味着湿生物质：反应介质之比为1∶3。考虑到湿生物质含 有13％的酵母，如果表示为干燥的酵母∶反应介质，则该比率将是1∶39。NaOH的终浓度 为0.25M。 [0228] 将混合物加热直至80℃并且使其在恒定搅拌下在此温度反应16h。在达到反应时间后，将产品冷却直至室温。通过使用Gea Westfalia离心机(型号SC 6-01-576， Hidrostop)将混合物离心以便分离基础基质中的不溶性级分。通过使用100至300l/h的 流速来进行离心。将所得的残余物再次用370l的蒸馏水重悬，并且通过加入3M HCl中和 直至pH＝7.1。随后，对混合物进行离心，如上所述。最后通过加入360l的水并离心来洗 涤残余物。通过喷雾干燥来干燥获得的产品。为此，将含水悬浮液保持在喷雾干燥器中，其中通过加入4.5l的水并且在该过程期间不断搅拌。入口温度和出口温度分别为180℃和 93-94℃。该过程产生的产品是细粉，在本文中称为批次2。 [0229] 9.2.批次3 [0230] 在变动很小的情况下，通过遵循用于批次2的方法获得产品。具体地，在用0.25M NaOH在80℃水解16h后，直接通过添加3M HCl中和混合物(在没有先对反应混合物进行离心的情况下)。在中和后，将混合物离心，并且程序遵循如上所述的。因此，与批次2相比，该程序允许省去一个离心步骤，这优化了工业成本。所得的产品在本文中被称为批次3。 [0231] 9.3.批次4 [0232] 湿生物质中的干物质的量约为18％。在这18％中，11％对应于不溶性固体(酿酒酵母细胞)而7％对应于可溶性固体。 [0233] 在变动很小的情况下，如对于批次3所述的那样获得产品。准备反应介质，用300kg的蒸馏水加载反应器，并且加入5.7kg的NaOH。使用143kg的湿生物质而不是100kg。 将其添加到反应介质，这意味着湿生物质∶反应介质之比为1∶2。考虑到湿生物质含有 11％的酵母，如果表示为干燥的酵母∶反应介质，则该比率将是1∶23。NaOH的终浓度为 0.32M。水解时间从16h减少至10h。因此，与批次3相比，该程序导致水解时间减少。所得 的产品在本文中被称为批次4。 [0234] 9.4.产品表征 [0235] 遵循 官 方方 法AOAC 991.43(AOAC官 方 方法 991.43.Total，Soluble andInsoluble Dietary Fiber in foods(食物中的总的、可溶性和不溶性膳食纤维).酶-重 量分析法，MES-TRIS缓冲液)测定膳食纤维。通过具有折射率检测器的HPLC对单糖进行 量化。结果显示在表17中。 [0236] 表17(以干重计的％) [0237]参数 批次1 批次2 批次3 批次4 方法 膳食纤维 44.18％ 47.53％ 51.64％ 51.46％ AOAC 991.43 单糖 ＜0.5％ ＜0.5％ ＜0.5％ ＜0.5％ HPLC/RI [0239] 瓶1：外切-1，3-β-葡聚糖酶(100U/ml)加上β-葡糖苷酶(20U/ml)悬浮液，2.0ml。将8ml的200mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)添加到瓶1(即将瓶中的内含物稀释至 10ml)。将其分成适当大小的等分试样，并且保存在-20℃在聚丙烯管中，并且在使用期间在冰上。 [0241] 瓶3：GOPOD试剂缓冲液。缓冲液(48mL，pH 7.4)，对羟基苯甲酸和叠氮化钠(0.4％w/v)。用蒸馏水或去离子水将瓶3的内含物稀释至1.01。 [0242] 瓶4：GOPOD试剂酶。葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)。将瓶4的内含物溶解在瓶3的经稀释的内含物(见前述试剂)中。 然后将此试剂混合物(GOPOD试剂)分成所需体积的等分试样用于保存。 [0243] 瓶5：D-葡萄糖标准溶液(5ml，1.00mg/ml)，在0.2％w/v苯甲酸中。 [0244] 瓶6：对照酵母β-葡聚糖制剂(～2g，瓶子标签上的标示β-葡聚糖含量)。 [0245] 测量寡糖、蔗糖和游离D-葡萄糖中的总葡聚糖(α-葡聚糖+β-葡聚糖)加上D-葡萄糖 [0246] (a)总葡聚糖的溶解和部分水解：使用Retsch离心式磨机碾磨样品以通过0.5mm筛网。将碾磨的样品(100mg)添加到20x 125mm Fisher Brand培养管中。轻敲管以保证 所有样品都落到管底部。将1.5ml的浓HCl(37％v/v)添加到各管，盖住各管并且在涡流混 合器上剧烈搅拌。将管置于30℃的水浴中达45min并且每15min在涡流混合器上搅拌一 次(以保证β-葡聚糖完全溶解)。将10ml的水添加到各管，盖住管并且在涡流混合器上 搅拌。松开盖子并且将管置于沸水浴(～100℃)中。5min后，将盖子上紧并且继续温育 2h。将管冷却至室温，小心的松开盖子，并且加入10ml的2N KOH。定量地将每管的内含物 转移到100ml容量瓶中，其中使用200mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)洗涤所述管，并且调整体 积。通过倒置将其充分混合。将各悬浮液的等分试样在1500g离心10min。 [0247] (b)测量蔗糖和游离D-葡萄糖中的总葡聚糖加上D-葡萄糖：将经过离心的提取物的0.1ml等分试样(一式两份)转移到玻璃试管的底部(16x100mm)。将外切-1，3-β-葡 聚糖酶(20U/ml)和β-葡糖苷酶(4U/ml)在200mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的0.1ml混 合物添加到各管的底部；将管在涡流混合器上混合并且在40℃温育60min。将3.0ml的葡 萄糖氧化酶/过氧化物酶混合物(GOPOD)添加到各管并且在40℃温育20min。在510nm，相 对于空白试剂，测量所有溶液的吸光度。 [0248] 测量在蔗糖和游离D-葡萄糖中的α-葡聚糖加上D-葡萄糖 [0249] 将碾磨的样品(100mg)添加到20x125mm Fisher Brand培养管中。轻敲管子以保证所有样品都落到管底部。向各管中加入磁力搅拌棒(5x15mm)之后加入2ml的2M KOH，并 且通过在冰/水浴中在磁力搅拌器上搅拌约20min将团粒(pellet)重悬。在搅拌下，向各 管加入8ml的1.2M乙酸钠缓冲液(pH 3.8)。立即加入0.2ml的淀粉葡糖苷酶(1630U/ml) 和转化酶(500U/ml)，并且充分混合，并且将管置于40℃的水浴中。将管在40℃温育30min，同时在涡流搅拌器上进行间断混合。定量地将各管的内含物转移到100ml容量瓶中并且用 水调整至体积。将其充分混合，并且将溶液的等分试样在1500g离心10min。将稀释或未稀 释的上清的0.1ml等分试样(一式两份)转移到玻璃试管中，加入0.1ml的乙酸钠缓冲液 (200mM，pH 5.0)加上3.0ml的GOPOD试剂，并且在40℃温育20min。在510nm，相对于空白 试剂，测量所有溶液的吸光度。 [0250] 空白试剂由0.2ml的乙酸钠缓冲液(200mM，pH 5.0)+3.0ml葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂组成。D-葡萄糖标准品由0.1ml D-葡萄糖标准品(1mg/ml)+0.1ml的乙酸钠缓 冲液(200mM，pH 5.0)+3.0ml葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂组成。 [0251] 计算 [0252] 总葡聚糖(％w/w)＝ΔE x F x 100/0.1x 1/1000x 100/W x 162/180＝ΔE xF/W x 90. [0253] α-葡聚糖(％w/w)＝ΔE x F x 1000x 1/1000x 100/W x 162/180＝ΔE x F/W x 90(终体积100ml)＝ΔE x F/W x 9.27(终体积10.3ml) [0254] β-葡聚糖＝总葡聚糖-α-葡聚糖 [0255] 其中：ΔE＝反应吸光度-空白吸光度。 [0256] F＝将吸光度转换为μg D-葡萄糖的因子，对于100μg的D-葡萄糖标准品，该因子＝100(μg D-葡萄糖标准品)/GOPOD吸光度。 [0257] 100/0.1＝体积校正因子；对于总葡聚糖(酵母)，(分析100ml中的0.1mL)。 [0258] 1000＝体积校正因子；对于α-葡聚糖(分析100ml中的0.1ml)。 [0259] 1/1000＝从μg到毫克的转换。 [0260] 100/W＝转换回到100mg的样品(即％w/w)。 [0261] W＝分析的样品的重量。 [0262] 162/180＝从所测定的游离D-葡萄糖转换为如在β-葡聚糖中出现的脱水葡萄糖的因子 [0263] 结果显示在表18中。应当注意的是，虽然结果以总葡聚糖的％给出，但是所述酶方法可以量化来自其他非葡聚糖寡糖的葡萄糖。 [0264] 表18(以干重计的％) [0265] [0266] β-葡聚糖(1-3，1-6)被包括在″膳食纤维″类中，因为它们是非可消化的多糖。此类还尤其包括壳多糖/脱乙酰壳多糖。相反α-葡聚糖是可消化的多糖并且因此其没 有被包括在″膳食纤维″中。在所有批次中，单糖的量是可忽略的。与批次2相比，在批 次3(其中在第一次离心前对产品进行中和)中，β-葡聚糖的含量得以保持，但是提取的 α-葡聚糖较少。这不是问题，因为产品生物功能性归因于包括β-葡聚糖和壳多糖/脱乙 酰壳多糖的膳食纤维。 [0267] 元素组成(3次重复的平均值) [0268] 批次2：0.27％N，42.99％C，6.67％H [0269] 批次3：0.50％N，43.79％C，6.77％H [0270] 批次4：0.75％N，42.82％C，6.83％H [0271] 这些值与通过不同方法获得的那些大致相同。将1mg的样品在1200℃进行燃烧并且利用微型分析仪进行分析。 [0272] NMR [0273] 生成1H-NMR谱，将样品以20mg/ml的浓度溶解在D2O中，并且用30μl的DCl酸化，以完全溶解样品。加入5μl的TMSP溶液(20mg/ml，在D2O中)作为内标(0ppm)。在70℃完 成谱以避免水信号与脱乙酰壳多糖的H1信号之间的重叠。使用Bruker Avance 600MHz，利 用以下分析条件：zgpr(90的脉冲，其中水信号预饱和)，累积的数目：128；谱宽度：12ppm； 预饱和2-4。 [0274] 图4显示批次2、3和4的NMR谱。3.5-4ppm之间的区域显示所有与多糖(葡聚糖，壳多糖，脱乙酰壳多糖)的质子相关的峰，其是谱中最强的，因为它们是产物的主要成分。在所有谱图中，在大约5.3ppm处，都可以看到脱乙酰壳多糖的H1。就在水信号前可以 看到β质子信号，并且在水信号后可以看到α质子。在谱图的此区域中，信号的强度非常 类似，所以不同的多糖在这三个批次中的比例应当非常类似。同时，该谱图与批次1的NMR 谱(图1)一致。 [0275] 申请中引用的参考文献 [0276] N.Nwe等2010，“Production of fungal chitosan by enzymatic method andapplications in plant tissue culture and tissue engineering：eleven years of our progress，present situation and future prospects(通过酶方法制备真菌脱乙酰 壳多糖以及植物组织培养和组织工程中的应用：我们十一年的进展、目前形势以及将来前 景)”Biopolymers，Magdy Elnashar编辑，出版：2010年9月28日，第7章135-162页 [0277] H.Yao等，“Effect of chitosan on plasma lipids，hepatic lipids，and fecal bile acid in hamsters human trials failed to show these effects(脱乙酰壳多糖对仓鼠中的血浆脂质、肝脂质和粪便的胆汁酸的作用人试验未显示这些作用)”J.Food Drug Anal.2006，vol.14，pp.183-189 [0278] M.D.Gades等，“Chitosan supplementation and fat absorption in men andwomen(男人和女人中的脱乙酰壳多糖补充以及脂肪吸收)”J.Am.Diet.Assoc.2005， vol.105，pp.72-77 [0279] C.N.Mhurchu等，“Effect of chitosan on weight loss in overweight andobese individuals：a systematic review of randomized controlled trials(在超重和肥胖个体中脱乙酰壳多糖对减重的作用：随机化控制试验的系统综述)”Obes.Rev.2005， vol.6，pp.35-42 [0280] K.Zhou等，“In vitro binding of bile acids and triglycerides by selected chitosan preparations and their physico-chemical properties(通过选择的脱乙酰壳多糖制剂的胆汁酸和甘油三酯的体外结合及其理化性质)”Food Science and Technology 2006，vol.39，pp.1087-1092 [0281] EP1483299 [0282] WO 91/03495 [0283] US 4810646。 |
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