生产液体曲的方法 |
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| 申请号 | CN200680023996.1 | 申请日 | 2006-07-20 | 公开(公告)号 | CN101218338B | 公开(公告)日 | 2012-04-04 |
| 申请人 | 朝日啤酒株式会社; | 发明人 | 杉本利和; 小路博志; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种通过优化用于曲霉的液体培养基的组成而生产具有高酶活性的液体曲的方法。一种生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，所述方法包括，在含有其表面完全或部分被粗皮 覆盖 的谷类作为培养原料并且补充氮源的液体培养基中培养白色曲霉和/或黑色曲霉。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，所述方法包括，在液体培养基中培养白色曲霉和/或黑色曲霉，所述液体培养基含有(i)表面完全被谷皮覆盖的大麦，以及(ii)选自硝酸钾、硝酸钠、酵母细胞、酵母细胞的处理产物、谷类谷皮和谷类麸皮中的至少一种氮源，其中所述酶包括葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。 |
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| 说明书全文 | 生产液体曲的方法技术领域[0001] 本发明涉及生产液体曲的方法，具体而言，涉及生产具有增强的酶活性的液体曲的方法。 背景技术[0002] 至于用于生产酒精饮料的日本酒曲，存在固体曲，将其培养以便将丝状真菌的孢子接种至已经用蒸煮等处理的原料，以及存在液体曲，将其培养以便通过将原料及其它营养源加入到水而制备液体培养基，然后将曲霉或预培养的曲霉的菌丝体等接种到所述液体培养基。 [0003] 在包括例如日本清酒、烧酒、酱油、发酵的大豆酱、甜日本清酒等的发酵食品和饮料诸如酒精饮料的常规生产中，用固体培养方法制备称为固体曲已经是广泛使用的。固体培养方法是将曲霉诸如白曲菌(Aspergilluskawachii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)等的孢子分散在固体原料诸如蒸汽-蒸煮的谷物上以使曲霉在固体表面生长的培养方法。 [0004] 例如，对于烧酒的生产，已经广泛地使用了固体曲诸如白曲菌和泡盛曲霉。然而，因为固体培养方法是原料和曲霉不均匀分散的培养体系，所以难以使诸如温度、含水量、和多种营养成分的因素均匀，并且固体培养方法在培养控制中是非常复杂的。另外，经常在开放条件下进行日本酒曲的生产，依据质量控制需要小心以便防止其它细菌的污染。因此，所述固体培养方法不适合于大规模生产。 [0005] 相反，液体培养法容易培养控制和质量控制，所以它适于有效率的生产。然而，由于以下原因，例如，酶活性不足以酿造烧酒，所以由液体培养的曲霉获得的培养产品很少用作烧酒曲。由液体培养法获得的培养产品可以是由液体培养法获得的培养产品本身(在下文中，也称为“液体曲”)，而且也可以是培养液体、细胞、及其浓缩物，或其干燥产品。 [0006] 除上述原因之外，由液体培养法得到的培养产品不用于生产发酵食品和饮料诸如烧酒的主要原因是：在液体培养中曲霉产生酶诸如淀粉酶和纤维素酶的行为已知是非常不同于在固体培养中的行为，并且还已知其生产能力是总体不良的(见非专利文献1和2)。 [0007] 在酒精饮料诸如烧酒的生产中，通常由同时发生的糖化作用和发酵产生醇。因此，来自曲霉的影响葡萄糖向曲霉供应的糖分解酶，特别是葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶，是酒精发酵中的关键酶。然而，众所周知葡糖淀粉酶的活性在由液体培养法得到的培养产品中是非常低的，并且其生产行为也非常不同于固体培养中的生产行为(见非专利文献3至6)。 [0008] 作为改善曲霉的葡糖淀粉酶活性的方法，报道了培养曲霉同时将应激给予菌丝体生长上的方法(见专利文献1)以及将烘焙的谷类加入到曲霉培养液的方法(见专利文献2)。专利文献1中公开的方法在多孔膜上或在具有空气间隙的包含的固定试剂中进行培养，以使新的编码葡糖淀粉酶的基因glaB表达，因此增强酶活性。因此，所述方法要求严格的控制或特定的培养装置，因而它是不实用的。专利文献2中公开的方法利用烘焙谷类作为至少一部分原料在液体培养基中培养曲霉，所述方法需要烘焙谷类的附加的生产步骤。 [0009] 本发明的发明人提供涉及利用液体培养基培养曲霉的方法的发明，所述液体培养基含有曲霉几乎不分解的糖类(见专利文献3)。通过用本发明液体培养曲霉，可以方便地和廉价地获得可以用于生产发酵食品和饮料诸如日本清酒的具有高活性的糖分解酶诸如葡糖淀粉酶的曲霉培养产品。 [0010] 另一方面，最近，已经详细进行了酸-稳定的α-淀粉酶的分子生物学分析(见非专利文献7)。所述分析报道如下：白色曲霉具有分别负责两个不同性状即酸-不稳定的α-淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的两种不同的淀粉酶基因。各自基因的表达行为相互非常不同。在液体培养中，酸不稳定的α-淀粉酶是充分产生的，而几乎不产生对于酿造烧酒是关键酶的酸稳定的α-淀粉酶。 [0011] 对于生产烧酒，在低-pH环境下进行酿造用于防止烧酒醪液腐败。酸不稳定的淀粉酶在烧酒酿造中很少有助于糖酵解，因为它在低pH条件下迅速失活。因此，对生产烧酒不可缺少的是，以高收率生产酸稳定的α-淀粉酶，所述酸稳定的α-淀粉酶被认为在通过液体培养曲霉的烧酒酿造中促进糖酵解。 [0012] 已经详细地研究和报道了酸稳定的α-淀粉酶在液体培养曲霉中的生产行为。然而，所述方法使用含有蛋白胨和柠檬酸盐缓冲溶液的合成培养基，并且需要100小时以上的培养时间，所以将难以应用于实际的烧酒酿造(见非专利文献8至10)。 [0013] 如上所述，通常认为酸稳定的α-淀粉酶是基本上不能通过液体培养生产的酶，因而，具有高的酸稳定的α-淀粉酶活性的液体曲还没有开发。 [0014] 专利文献1：JP 11-225746A [0015] 专利文献2：JP 2001-321154A [0016] 专利文献3：JP 2003-265165A [0017] 非 专 利 文 献 1：Iwashita K. 等：Biosci.Biotechnol.Bioche.，62，1938-1946(1998) [0018] 非专利文献2：Yuichi Yamane等：Journal of the Brewing Society ofJapan，99，84-92(2004) [0019] 非专利文献3：Hata Y.等：J.Ferment.Bioeng.，84，532-537(1997)[0020] 非专利文献4：Hata Y.等：Gene.，207，127-134(1998) [0021] 非专利文献5：Ishida H.等：J.Ferment.Bioeng.，86，301-307(1998)[0022] 非专利文献6：Ishida H.等：Curr.Genet.，37，373-379(2000) [0023] 非 专 利 文 献 7：Nagamine K. 等：Biosci.Biotechnol.Biochem，67，2194-2202(2003) [0024] 非专利文献8：Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.，76，105-110(1993)[0025] 非专利文献9：Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.，77，483-489(1994)[0026] 非 专 利 文 献 10：Shigetoshi Sudo 等：Journal of the Brewing Society ofJapan，89，768-774(1994) 发明内容[0027] 本发明要解决的问题 [0028] 本发明的发明人已经发现，充分具有生产烧酒等所必需的酶诸如葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶等的活性的液体曲，可以通过在含有作为培养原料的谷类的液体培养基中培养曲霉而生产，所述谷类表面完全或部分被谷皮覆盖，并且已经提出专利申请(见，日本专利申请号2004-350661和日本专利申请号2004-352320的说明书)。 [0029] 然而，在这些方法中除葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶之外的酶的生产行为还是未知的。 [0030] 本发明的目的是开发增强液体曲中的淀粉分解酶诸如葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶以及其它酶的酶活性的方法。具体而言，本发明的目的是提供通过优化液体培养基的组成而生产具有高酶活性的液体曲的方法。解决问题的方法 [0031] 考虑到在液体曲中实现更高的酶的生产，本发明的发明人关于上述培养原料和多种营养源的组合效果进行了广泛研究，并且发现可以通过在液体培养基中结合特定的氮源并且另外使所述氮源与硫酸盐和磷酸盐的至少一种同时存在而改善葡糖淀粉酶即淀粉分解酶、纤维素酶即纤维素分解酶、和酸性羧肽酶即蛋白水解酶的生产能力，因而完成了本发明。 [0032] 即，根据本发明的第一方面，提供生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，所述方法包括，通过利用其表面完全或部分被谷皮覆盖的谷类作为培养原料，在含有氮源的液体培养基中培养白色曲霉和/或黑色曲霉。 [0033] 根据本发明的第二方面，提供根据第一方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述氮源包括硝酸盐。 [0034] 根据本发明的第三方面，提供根据第一方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述氮源包括选自由酵母细胞或其处理的产物、谷类谷皮和谷类麸皮、或这些的混合物和硝酸盐组成的组的至少一种。 [0035] 根据本发明的第四方面，提供根据第一方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述液体培养基以0.05至2.0％(重量/体积)的浓度含有硝酸盐。 [0036] 根据本发明的第五方面，提供根据第二方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述液体培养基还含有磷酸盐。 [0037] 根据本发明的第六方面，提供根据第五方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述液体培养基以0.05至1.0％(重量/体积)的浓度含有磷酸盐。 [0038] 根据本发明的第七方面，提供根据第五方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述液体培养基还含有硫酸盐。 [0039] 根据本发明的第八方面，提供根据第七方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述液体培养基以0.01至0.5％(重量/体积)的浓度含有硫酸盐。 [0040] 根据本发明第九方面，提供根据第一方面的生产具有增强的酶活性的液体曲的方法，其中所述酶包括选自由淀粉分解酶、纤维素分解酶和蛋白水解酶组成的组的一种或两种或更多种。 [0042] 根据本发明的第十一方面，提供通过根据第一至第十方面的任何一项的方法获得的液体曲。 [0043] 根据本发明的第十二方面，提供生产酶制剂的方法，所述方法包括利用根据第十一方面的液体曲。 [0044] 根据本发明的第十三方面，提供通过根据第十二方面的生产方法获得的酶制剂。 [0045] 根据本发明的第十四方面，提供生产酶的方法，所述方法包括，通过利用其表面完全或部分被谷皮覆盖的谷类作为培养原料，在含有氮源的液体培养基中培养白色曲霉和/或黑色曲霉而生产所述酶。 [0046] 根据本发明的第十五方面，提供根据第十四方面的生产酶的方法，其中所述氮源包括硝酸盐。 [0047] 根据本发明的第十六方面，提供根据第十四方面的生产酶的方法，其中所述氮源包括选自由酵母细胞或其处理的产物、谷类谷皮和谷类麸皮、或这些的混合物和硝酸盐组成的组的至少一种。 [0048] 根据本发明的第十七方面，提供根据第十四方面的生产酶的方法，其中所述液体培养基以0.05至2.0％(重量/体积)的浓度含有硝酸盐。 [0049] 根据本发明的第十八方面，提供根据第十五方面的生产酶的方法，其中所述液体培养基还含有磷酸盐。 [0050] 根据本发明的第十九方面，提供根据第十八方面的生产酶的方法，其中所述液体培养基以0.05至1.0％(重量/体积)的浓度含有磷酸盐。 [0051] 根据本发明的第二十方面，提供根据第十八方面的生产酶的方法，其中所述液体培养基还含有硫酸盐。 [0052] 根据本发明的第二十一方面，提供根据第二十方面的生产酶的方法，其中所述液体培养基以0.01至0.5％(重量/体积)的浓度含有硫酸盐。 [0053] 根据本发明的第二十二方面，提供根据第十四方面的生产酶的方法，其中所述酶包括选自由淀粉分解酶、纤维素分解酶和蛋白水解酶组成的组的一种或两种或更多种。 [0054] 根据本发明的第二十三方面，提供根据第十四方面的生产酶的方法，其中作为原料的谷类包括稻、小麦、大麦、荞麦、稗、谷子、黍、高粱或玉米。 [0055] 发明效果 [0056] 根据本发明，将作为氮源的特定有机物质和/或无机物质加入到含有作为培养原料的谷类的液体培养基，所述谷类的表面完全或部分用谷皮所覆盖，还向其加入硫酸盐和磷酸盐，并且将曲霉在所述液体培养基中培养，不仅显著改善液体曲中的淀粉分解酶的生产能力，而且以高收率产生含有纤维素分解酶和蛋白水解酶的液体曲。另外，认为，甚至除了上述酶，也普遍改善了由曲霉产生的酶的生产能力。 [0057] 当利用根据本发明生产的液体曲生产发酵食品和饮料诸如烧酒时，可以预期，由于纤维素分解酶的高活性使醪液粘度变小，所以进行良好的发酵，由此增加醇的收率。另外，由于蛋白水解酶的高活性，氨基酸的生产增加，由此可以生产具有令人满意风味的发酵食品和饮料。 [0058] 另外，与固体培养相比，可以严格控制液体培养，所以可以以低成本生产具有品质稳定性的液体曲。 [0059] 此外，本发明中使用的谷类是未碾磨的或碾磨成至少有谷皮保持在表面上的程度。因而，可以预期原料可利用性和收率的改善。 [0061] 图1显示培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性，所述培养产物各自通过利用硝酸钾作为氮源用液体培养基培养而获得。黑条各自表示葡糖淀粉酶活性(U/ml)，并且白条各自表示酸稳定的α-淀粉酶活性(U/ml)。 [0062] 图2显示培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性，所述培养产物各自通过利用无机氮物质和无机盐用液体培养基培养而获得。黑条各自表示葡糖淀粉酶活性(U/ml)，并且白条各自表示酸稳定的α-淀粉酶活性(U/ml)。 [0063] 图3显示培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性，所述培养产物各自通过利用酵母细胞或酵母自溶物作为氮源用液体培养基培养而获得。黑条各自表示葡糖淀粉酶活性(U/ml)，并且白条各自表示酸稳定的α-淀粉酶活性(U/ml)。 [0064] 图4显示培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性，所述培养产物各自通过利用无机氮物质、无机盐、和酵母细胞的组合用液体培养基培养而获得。黑条各自表示葡糖淀粉酶活性(U/ml)，并且白条各自表示酸稳定的α-淀粉酶活性(U/ml)。 [0065] 图5显示培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性，所述培养产物各自通过利用大麦麸、酵母细胞、和无机氮物质的组合作为氮源用液体培养基培养而获得。黑条各自表示葡糖淀粉酶活性(U/ml)，并且白条各自表示酸稳定的α-淀粉酶活性(U/ml)。 [0066] 图6显示培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性，所述培养产物各自通过利用大麦谷皮和酵母细胞的组合作为氮源用液体培养基培养而获得。黑条各自表示葡糖淀粉酶活性(U/ml)，并且白条各自表示酸稳定的α-淀粉酶活性(U/ml)。 [0067] 图7显示曲霉培养产物的多种酶的活性，所述培养产物各自通过利用硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐用液体培养基培养而获得。从(A)至(D)分别地显示葡糖淀粉酶(GA)、酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)、纤维素酶(CEL)和酸性羧肽酶(ACP)的活性(U/ml)。 [0068] 实施本发明的最佳实施方案 [0069] 在下文中，将详细地描述本发明。 [0070] 根据本发明生产液体曲的方法包括在液体培养基中培养曲霉的步骤，所述液体培养基通过向其加入诸如谷类的原料和氮源而制备，以生产具有增强的酶活性的液体曲。 [0071] 更具体而言，在本发明中，用含有谷类的液体培养基培养曲霉，所述谷类的表面完全或部分被谷皮覆盖，因而，糖化谷类中的淀粉需要花费时间，抑制了糖类进入培养体系的释放速率，由此增强液体曲的酶活性。另外，通过所述曲霉高度地生产多种酶，因为所述液体培养基含有特定的营养源。 [0072] 这里，通过曲霉生产的酶的实例包括，但是不必限于，淀粉分解酶诸如葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，纤维素分解酶诸如纤维素酶和β-萄糖苷酶，和蛋白水解酶诸如酸性羧肽酶和酸性蛋白酶。 [0073] 在本发明中，用作培养原料的谷类的实例包括大麦、稻、小麦、荞麦、稗、谷子、黍、高粱、玉米等。每一培养原料需要具有其表面完全或部分被谷皮覆盖的形式。可以使用未碾磨的原料或等于或大于以下碾磨比的原料，在所述碾磨比将它碾磨以便谷皮至少保持在谷粒的表面上，并且也可以使用天然稻、天然大麦等。在稻、天然稻的情况下，可以使用具有全部谷壳的稻和具有部分谷壳的稻。 [0074] 例如，当所述谷类是大麦时，可以使用碾磨比为100％的未碾磨的原料，或假如未碾磨原料的碾磨比规定为100％，通过从未碾磨原料的碾磨比减去大麦的谷皮比(一般7至8％)而确定的碾磨比的原料，即，具有不小于大约92％至93％的碾磨比的原料。 [0075] 这里，术语“碾磨比”指的是在碾磨所述谷类以后保留的百分比。例如，术语“碾磨比为90％”指的是谷类的表面层部分上的10％的谷皮等被刮去。此外，在本发明中，术语“天然大麦”包括未碾磨的大麦到谷皮保持在谷粒表面的碾磨大麦的那些，即，碾磨比为90％或以上的原料。另外，术语“谷皮”指的是覆盖谷类颗粒表面的外部部分。 [0076] 上述培养原料的任何一种是单独使用的，或者它们的两种或多种组合使用的，用于制备下列液体培养基。即，将作为培养原料的谷类在与在下文中所描述的氮源组合的情况下与水混合，以制备液体培养基。将所述谷类的混和比调节到以下程度，在曲霉的培养产物中选择性产生并积累诸如淀粉分解酶、纤维素分解酶、和蛋白水解酶的酶。 [0077] 例如，当大麦用作培养原料时，通过将1至20％(重量/体积)的天然大麦加入到水而制备液体培养基。当未碾磨的大麦用作天然大麦时，更优选，加入8至10％(重量/体积)而制备液体培养基。当95％-碾磨的大麦作为用作原料的天然大麦时，更优选，加入1至4％(重量/体积)而制备液体培养基。 [0078] 另外，当除去谷壳的天然稻用作培养原料时，通过将1至20％(重量/体积)的天然稻加入到水中而制备液体培养基，加入量优选5至13％(重量/体积)，更优选8至10％(重量/体积)。 [0079] 当使用其它谷类时，通过将1至20％(重量/体积)的谷类加入到水中而以同样方式制备液体培养基。 [0080] 以该方式，最适合的混和量根据要使用的原料的碾磨程度、要使用的日本酒曲菌株、原料种类等而改变，所以可以在考虑这些的情况下适当选择。 [0081] 当使用的培养原料的量超过上限值时，培养基的粘度升高，并且对于需氧培养曲霉所需的氧气或空气的供应变得不足而使培养进程不良，它不是优选的。另一方面，当使用的原料的量不满足下限值时，不能以高收率生产合乎需要的酶。 [0082] 可以在培养以前将包括在培养原料中的淀粉凝胶化。凝胶化淀粉的方法不受特别限制，并且可以根据任何常规方法进行，包括蒸汽方法和焙烧方法。在随后描述的消毒液体培养基的步骤中，如果通过在高温和高压下杀菌而将淀粉加热至胶凝温度或更高，通过这样一种处理同时进行淀粉的凝胶化。 [0083] 在液体培养基中，除上述培养原料之外，还包括有机物质、无机物质等作为氮源。那些氮源不受特别限制，只要曲霉生长并充分地产生合乎需要的酶。有机物质的实例包括酵母细胞或其处理的产物(诸如分解的酵母细胞，酵母提取物等)，谷类谷皮，谷类麸皮等。 无机物质的实例包括硝酸盐。 [0084] 所述硝酸盐包括硝酸钾、硝酸钠等，并且硝酸钾是特别优选的。 [0085] 所述氮源的任何一种可以单独使用，或者有机物质和/或无机物质的两种或多种可以组合使用。 [0086] 所述氮源的添加量不受特别限制，只要促进曲霉的生长，然而，0.1至2％(重量/体积)，优选0.5至1.0％(重量/体积)作为有机物质，并且作为无机物质的硝酸盐的添加量是0.05至2.0％(重量/体积)，优选0.1至2.0％(重量/体积)，更优选0.2至1.5％(重量/体积)。 [0087] 以超过上限值的量添加氮源不是优选的，因为抑制了曲霉的生长。另一方面，氮源的添加量低于下限值也不是优选的，因为不促进酶生产。 [0088] 在本发明中用作氮源中的一种的酵母的实例包括用于酿造或食品生产过程的啤酒酵母、葡萄酒酵母、威士忌酒酵母、烧酒酵母、清酒酵母和面包酵母，以及下列属的酵母细胞：酵母菌属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、复膜孢酵母(Saccharomycopsis)、类酵母属(Saccharomycodes)、毕赤酵母(Pichia)、管囊酵母(Pachysolen)等。 [0089] 酵母细胞自身可以用作氮源，并且也可以以分解的酵母细胞或酵母提取物的形式使用。可以通过将酵母细胞进行下列处理而获得分解的酵母细胞酵母提取物，所述处理诸如自溶法(利用原本存在于酵母细胞中的蛋白水解酶增溶细胞的方法)、酶解法(加入由微生物或植物获得的酶制剂等增溶的方法)、热水提取法(通过将酵母细胞在热水中浸渍某一时段而增溶的方法)、酸或碱分解法(加入多种酸或碱增溶的方法)、物理破碎法(用超声处理破碎和高压匀浆法，或者通过与固体诸如玻璃珠混合并搅拌而破碎的方法)、以及冻融法(通过至少一次的冷冻和融化而破碎的方法)。 [0091] 另外，在本发明中，谷类谷皮，即谷类的外种皮部分，可以用作氮源，并且一般使用用作培养原料的相同种类的谷类的谷类谷皮。那些谷类麸皮和谷类谷皮可以与其它氮源组合使用。 [0092] 在本发明中使用的液体培养基中，除了如上所述的培养原料和氮源，还可以包括硫酸盐和磷酸盐。通过组合利用那些无机盐，可以增强淀粉分解酶、纤维素分解酶、蛋白水解酶等的酶活性。 [0094] 那些无机盐的任何一种可以单独使用，或它们的两种或多种组合使用。 [0095] 另外，将液体培养基中的无机盐浓度调整到如下程度，即，在曲霉的培养产物中选择性产生并积累诸如淀粉分解酶、纤维素分解酶、和蛋白水解酶的酶的程度。例如，硫酸盐的浓度是0.01至0.5％，优选0.02至0.1％，并且磷酸盐的浓度是0.05至1.0％，优选0.1至0.5％，条件是，每一数值是重量/体积。 [0096] 可以单独使用上述无机盐，或者可以组合使用它们的两种或多种。 [0097] 除了上述作为营养源的氮源和无机盐，可以任选将有机物质和无机盐加入到所述液体培养基。不特别限制添加剂，只要它们是一般用于培养曲霉的物质。所述有机物质的实例包括麦麸、玉米浆、豆饼和脱脂大豆。所述无机盐的实例包括水溶性化合物诸如铵盐、钾盐、钙盐、镁盐等。可以同时使用两种或多种有机物质和/或无机盐。 [0098] 不特别限制其添加量，只要促进曲霉的生长。有机物质的添加量优选大约是0.1至5％(重量/体积)，并且无机盐的添加量优选是大约0.1至1％(重量/体积)。 [0099] 以超过上限值的量添加营养源不是优选的，因为抑制了曲霉的生长。另一方面，营养源的添加量低于下限值也不是优选的，因为不促进酶生产。 [0100] 通过将上述培养原料和氮源与水混合而获得的用于曲霉的液体培养基可以任选进行灭菌处理，并且不特别限制处理方法。所述方法的实例包括高温和高压灭菌方法，并且在该情况下，可以在121℃将灭菌进行15分钟。 [0101] 将灭菌的液体培养基冷却到培养温度，然后将白色曲霉和/或黑色曲霉接种至液体培养基。 [0102] 在本发明中使用的曲霉的实例优选包括能产生下列酶的曲霉：淀粉分解酶诸如葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和α-淀粉酶，纤维素分解酶诸如纤维素酶和β-萄糖苷酶，和蛋白水解酶诸如酸性羧肽酶和酸性蛋白酶。曲霉的具体实例包括白色曲霉诸如白曲霉(Aspergillus kawachii)，和黑色曲霉诸如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和黑曲霉(Aspergillus niger)。 [0103] 接种至培养基中的曲霉的形式是任意的，并且可以使用曲霉的孢子和菌丝体的任何一种。 [0104] 那些曲霉可以用于单菌株培养或用于与两种或多种同源或异源菌株的混合培养。可以使用预培养中获得的孢子或菌丝体的形式。然而，优选使用菌丝体，因为对于对数生长期需要较短的时间周期。 [0105] 不特别限制接种到液体培养基中的曲霉的量，但是孢子的量可以在约1×104至6 1×10/ml液体培养基的范围内。对于菌丝体，优选接种约0.1至10％预培养液体。 [0106] 曲霉的培养温度优选是25至45℃，更优选30至40℃，但是不特别限制，只要生长不受有害影响。如果培养温度低，则随着曲霉生长变慢而趋于被传染性微生物污染。因而，培养时间适当地在24至72小时范围内。 [0107] 培养装置可以是能实施液体培养的任何培养装置。曲霉必须有氧培养。因而，所述培养应当在氧气或空气可以供给到培养基中的有氧条件下进行。另外，优选搅拌所述培养基以便原料、氧气、和曲霉可以在培养期间均匀分布在所述装置中。只要保持有氧培养环境，搅拌条件和通气量可以在任何条件下进行，并且因而可以根据培养装置、培养基粘度等适当选择。 [0108] 通过用上述培养方法培养，可以高度生产诸如淀粉分解酶、纤维素分解酶、和蛋白水解酶等的酶。结果，获得具有用于酿造烧酒的酶活性的液体曲。 [0109] 根据本发明的液体曲包括通过离心分离等从培养产物获得的培养液，其浓缩物，其干燥产物等，以及培养产物本身。 [0110] 如上所述，根据上述培养方法，可以高度生产诸如淀粉分解酶、纤维素分解酶、和蛋白水解酶的酶。 [0111] 因此，本发明第十四方面中描述的产生酶的方法与上述生产液体曲的方法相同。 [0112] 通过本发明的生产方法获得的液体曲可以适合地用于生产发酵食品和饮料诸如烧酒。可以使用液体曲代替固体曲，例如，在制造日本清酒的情况下，在制备酵母或醪液阶段；在制造烧酒的情况下，在制备醪液阶段；在制造酱油的情况下，在堆垛阶段；在制造日本豆酱的情况下，在制备阶段；在制造甜日本清酒的情况下，在制备阶段；在制造甜米酒的情况下，在制备阶段。 [0113] 另外，得到的液体曲的一部分可以用作随后生产液体曲的起子。通过用这样的方式连续生产液体曲，可以实现稳定生产并且可以同时提高生产效率。 [0114] 当通过利用上述液体曲生产发酵食品和饮料诸如烧酒时，全部步骤可以在液相中进行。例如，当生产烧酒时，通过全部步骤在液相中生产发酵食品和饮料的方法是，通过用耐热的酶制剂溶解，将作为原料的玉米、小麦、稻、马铃薯、甘蔗等在大约80℃加热以液化，将上述液体曲和酵母加入到其中以使醪液进行酒精发酵，然后将它在常压或减压等之下蒸馏。 [0115] 通过本发明的方法获得的液体曲具有高的酶活性，所以所述液体曲可以用于酶制剂和药物诸如消化剂。在该情况下，可以将得到的曲霉培养产物浓缩并纯化至所需程度以便向其加入适当的赋形剂、增稠剂、甜味剂等而形成剂型。 [0116] 另外，通过利用曲霉的淀粉分解酶基因的启动子区域等，可以在曲霉的培养产物中高度生产合乎需要的杂蛋白。 [0117] 实施例 [0118] 虽然在下文中参考实施例等将更具体地描述本发明，但是本发明不局限于这些的实施例等。 [0119] 实施例1 [0120] 在液体曲生产中添加无机氮物质 [0121] 如下所述研究当作为无机氮物质的硝酸钾加入到液体培养基时的效果。 [0122] 首先，制备三种类型的液体培养基，其中分别将天然大麦加入到：无添加的水(对照)，含0.2％(重量/体积)硝酸钾的水，和含0.4(重量/体积)硝酸钾的水，以便将天然大麦的量调节到2％(重量/体积)。 [0123] 各自将100ml液体培养基放入500-ml有挡板的锥形烧瓶中并高压灭菌，将预先培养在液体培养基中的白色曲霉(白曲霉IFO4308)接种以便对于所述液体培养基将其量调节成1％(体积/体积)。作为天然大麦，使用95％碾磨的澳大利亚制造的斯特林大麦(在下文中的实施例中基本上是准确的)。 [0124] 然后在37℃的温度和100rpm的振荡速度下将培养进行48小时。在培养完成以后，测量每一个得到的培养产物的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。液体培养基中培养曲霉获得的培养产物的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性对硝酸钾的使用量的依赖性表示在表1和图1中。 [0125] 为了测量葡糖淀粉酶的酶活性，使用糖化力分数定量试剂盒(由Kikkoman制造)。为了测量酸稳定的α-淀粉酶的酶活性，稍微修改“Nagamine K.等：Biosci.Biotechnol.Biochem，67，2194-2202(2003)”中描述的方法。即，通过用酸处理培养产物而灭活酸不稳定的α-淀粉酶，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman制造)测量酸稳定的α-淀粉酶活性。更具体而言，将9ml的100mM乙酸缓冲液(pH 3)加入到1ml的培养溶液，在37℃将酸处理进行1小时，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman制造)测量。 [0126] 如表1和图1所示，在0.2％添加的方案和0.4％添加的方案中，其中向其加入硝酸钾作为无机氮物质而培养液体培养基，与不添加的对照方案相比，酶葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的活性显著地改善，并且葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶之间的平衡是良好的。 [0127] [表1] [0128] [0129] 实施例2 [0130] 在液体曲生产中添加多种无机物质 [0131] 如下所述研究当添加多种无机物质时的效果。 [0132] 将作为无机氮物质的硝酸钾或硝酸钠，和作为无机盐的磷酸二氢钾以表2中所示的组成加入到水中。从相当于2.0％硝酸钾的摩尔浓度即20mM计算硝酸钠的添加量，并将其共混成1.7％，以便硝酸根离子浓度变成相同的。将没有无机氮物质也没有无机盐的水用作对照。 [0133] 向如上所述制备的原料水中以2％(重量/体积)的浓度添加作为培养原料的天然大麦，并且制备4种类型的液体培养基。在与实施例1中的相同条件下进行白色曲霉的液体培养。然后，用实施例1中相同的方法测定葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。表2和图2显示所述结果。 [0134] [表2] [0135] [0136] 如表2和图2中所示，在向其添加无机氮物质和无机盐的方案中，与没有添加的对照方案相比，提高了酶葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的活性。 [0137] 实施例3 [0138] 在液体曲生产中添加酵母细胞或酵母自溶物 [0139] 通过利用向其添加酵母细胞或酵母自溶物(即，酵母提取物)的液体培养基生产液体曲。 [0140] (1)要添加的酵母细胞或酵母自溶物的制备 [0141] 将从酿造啤酒的步骤回收的啤酒酵母在下列条件下处理，由此获得在液体曲生产中使用的啤酒酵母细胞和酵母自溶物(1)和(2)。 [0142] 酵母细胞：通过借助于在5,000×g离心15分钟将啤酒酵母脱水至大约70％的含水量而获得的啤酒酵母细胞 [0143] 酵母自溶物(1)：通过在等量水中悬浮啤酒酵母细胞并在52℃将混合物处理18小时而获得的酵母自溶物。 [0144] 酵母自溶物(2)：通过在等量的1％乳酸中悬浮啤酒酵母细胞并在52℃将混合物处理18小时而获得的酵母自溶物。 [0145] (2)通过利用向其添加酵母的液体培养基制备液体曲 [0146] 将如上所述制备的每一种酵母细胞和酵母自溶物(1)和(2)加入到水中以便分别具有0.20％、0.50％和1％(体积/体积)的浓度，由此制备原料水。将作为培养原料的天然大麦添加到每一种原料水中以便具有2％(重量/体积)的浓度，由此制备液体培养基。在与实施例1中的相同条件下进行白色曲霉的液体培养。然后，根据实施例1中相同的方法测定葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。 [0147] 作为对照，通过仅将天然大麦仅以2％(重量/体积)的浓度添加至水中而制备液体培养基(即1号方案)，然后以和实施例1中的相同方式向其接种白色曲霉以进行液体培养。以同样方式确定得到的液体曲的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。表3和图3显示所述结果。 [0148] [表3] [0149] [0150] *单位是体积/体积 [0151] (3)结果 [0152] 如表3和图3所示，与没有添加的对照方案(即1号方案)相比，在向其添加酵母细胞自身的全部实验方案中以及向其添加酵母自溶物的实验方案中，葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性都提高。特别是，7号实验方案显示良好的结果。另外，在每一个实验方案中，葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性与酵母细胞或酵母自溶物的添加量成比例提高。 [0153] 实施例4 [0154] 无机氮物质和/或无机盐与酵母细胞的组合添加 [0155] 以如表4中所示的方式组合硝酸钾、磷酸二氢钾、和酵母细胞，并加入到水中以制备原料水。使用的酵母细胞是通过借助于离心将来自酿造啤酒步骤回收的啤酒酵母脱水至大约70％的含水量而获得的啤酒酵母细胞自身(即，实施例3中制备的酵母细胞)。作为对照(即，1号方案)，使用没有添加的原料水。 [0156] 将天然大麦以2％(重量/体积)的浓度加入到用表4中所示的组合制备的原料水。用和实施例1中一样的方法将白色曲霉接种至液体培养基以进行液体培养。分别测定这些液体培养基中的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。表4和图4显示所述结果。 [0157] [表4] [0158] [0159] 如表4和图4所示，与没有添加的对照方案(即，1号方案)的那些相比，全部实验方案中的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性都非常高。特别是，在15至18号实验方案中，两种酶的活性非常高。从所述结果，认为无机氮物质和/或无机盐与酵母细胞的组合使用改善了液体培养基中的养分平衡，所以丝状真菌活跃地生产所述酶。 [0160] 实施例5 [0161] 大麦麸、酵母细胞、和无机物质的组合 [0162] 以表5中所示的方式组合大麦麸和酵母细胞，硝酸钾和磷酸二氢钾，并加入到水中以制备用于液体培养基的原料水。使用的大麦麸是从70％碾磨的大麦(斯特林，澳大利亚制造)的碾米步骤回收的一种，并且包含大麦谷皮和麸皮。使用的酵母细胞是通过借助于离心将来自酿造啤酒步骤回收的啤酒酵母脱水至大约70％的含水量而获得的啤酒酵母细胞自身(即，实施例3中制备的酵母细胞)。作为对照，使用没有添加的原料水。 [0163] 将天然大麦以2％(重量/体积)的浓度加入到采用如表5中所示的组合而制备的原料水中。用和实施例1中一样的方法将白色曲霉接种至液体培养基以进行液体培养。以同样方式分别测定这些液体培养基中的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。表 5和图5显示所述结果。 [0164] [表5] [0165] [0166] o：加入0.2％(重量/体积)的硝酸钾和0.3％(重量/体积)的磷酸二氢钾的实验方案。 [0167] 如表5和图5所示，与没有添加的对照方案(即，1号方案)的那些相比，全部实验方案中的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性都非常高。特别是，在4号实验方案中，两种酶的活性非常高，并且平衡是良好的。从所述结果，认为大麦麸与酵母细胞的组合使用改善了液体培养基中的养分平衡，所以丝状真菌活跃地生产所述酶。 [0168] 应当注意，大麦麸或酵母细胞与无机氮物质和无机盐的组合使用(即，8号和9号方案)显示良好的结果。 [0169] 实施例6 [0170] 大麦谷皮和酵母细胞的组合添加 [0171] 将硝酸钾、磷酸二氢钾、大麦谷皮、和酵母细胞以如表6中所示的方式组合，并加入到原水中以制备用于液体培养基的原料水。使用的大麦谷皮是通过用2mm-网眼筛筛分从70％碾磨大麦的碾米步骤获得的大麦麸，然后仅回收大麦谷皮，而获得的那些。另外，使用的压缩酵母是通过借助于离心将啤酒酵母脱水至大约70％的含水量而获得的啤酒酵母细胞自身(即，实施例3中制备的酵母细胞)，所述啤酒酵母从酿造啤酒的步骤回收。作为对照，使用没有添加的未净化的原水(即，1号方案)。 [0172] 将天然大麦以2％(重量/体积)的浓度加入到采用如表6中所示的组合而制备的原料水。用和实施例1中一样的方法将白色曲霉接种至液体培养基以进行液体培养。分别测定这些液体培养基中的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性。表6和图6显示所述结果。 [0173] [表6] [0174] [0175] 如表6和图6所示，与没有添加的对照方案(即，1号方案)的那些相比，全部实验方案中的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性都非常高。特别是，在6至9号实验方案中，两种酶的活性非常高，并且平衡是良好的。从所述结果，认为大麦谷皮与酵母细胞的组合使用改善了液体培养基中的养分平衡，所以丝状真菌活跃地生产所述酶。 [0176] 实施例7 [0177] 在生产液体曲中添加硫酸盐的效果 [0178] 通过如下所述的方法生产液体曲，并确定其酶活性。 [0179] 1.预培养方法 [0180] 将8g的65％碾磨的大麦(斯特林，澳大利亚制造)和100ml的水装入500-ml带挡板的锥形烧瓶并在121℃高压灭菌15分钟。在被冷却以后，将白色曲霉(白曲霉NBRC4308)6 以1×10/ml接种到预培养培养基中并在37℃和100rpm通过振荡培养24小时。将所述培养基定义为预培养培养基。 [0181] 2.主培养方法 [0182] 将100ml的液体培养基分别制备为五个实验方案，各自以表7中所示的组成比含有2.0％(重量/体积)的98％的碾磨大麦(天然大麦，斯特林，澳大利亚制造)，0.2％(重量/体积)的硝酸钾，0.3％(重量/体积)的磷酸二氢钾，0.1％(重量/体积)的七水合硫酸镁，和0.082％(重量/体积)的六水合氯化镁。分别将这五种液体培养基装入500ml的带挡板的锥形烧瓶并在121℃高压灭菌15分钟。 [0183] 在冷却以后，将1ml的预培养液体接种至主培养基，并通过在37℃和100rpm的振荡将所述全部培养48小时。注意，六水合氯化镁的添加量是由相当于0.1％的七水合硫酸镁的摩尔浓度即8.12mM计算的，以便各自实验方案中的培养基的镁浓度变得相同。 [0184] [表7] [0185] [0186] 3.测定酶活性的方法 [0187] 在培养完成以后，测定作为淀粉分解酶的葡糖淀粉酶(GA)和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。 [0188] 通过利用糖化力分数定量试剂盒(由Kikkoman制造)而测定葡糖淀粉酶(GA)活性。 [0189] 为了测定酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)活性，将Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.，76，105-110(1993)，Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.，77，483-489(1994)，和 Shigetoshi Sudo等：Journal of the Brewing Society of Japan，89，768-774(1994)中描述的方法稍微修改。即，通过用酸处理培养产物而灭活酸不稳定的α-淀粉酶活性，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman制造)测量酸稳定的α-淀粉酶活性。更具体而言，将9ml的 100mM乙酸缓冲溶液(pH 3)加入到1ml的培养溶液，在37℃将酸处理进行1小时，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman制造)测量。 [0190] 同时，测定作为纤维素分解酶的纤维素酶(CEL)的活性和作为一种蛋白水解酶的酸性羧肽酶(ACP)的活性。 [0191] 用二硝基水杨酸(DNS)法，通过将还原糖类的量定量的方法测量纤维素酶(CEL)活性，所述糖类通过水解作为底物的羧甲基纤维素(CMC)而产生。更具体而言，将1ml的培养溶液添加到1ml的1％CMC底物溶液(将Sigma-Aldrich生产的low viscosityTM溶解在100mM乙酸缓冲溶液(pH5)中)，并且在40℃将所述全部精确地进行10分钟的酶反应。然后，向所述混合物添加4ml含有0.75％二硝基水杨酸、1.2％氢氧化钠、22.5％四水合酒石酸钠钾和0.3％一水合乳糖的DNS试剂，并且将所述全部充分混合，从而终止所述反应。为了定量反应终止溶液中还原糖类的量，将反应终止的溶液在沸水浴中精确加热15分钟。随后，在所述溶液冷却至室温以后，测定540nm的吸光度，从而定量相当于葡萄糖的还原糖类的量。一个单位的纤维素酶(CEL)活性表示为每分钟产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖类所需的酶量。 [0192] 通过利用酸性羧肽酶测量试剂盒(由Kikkoman制造)测定酸性羧肽酶(ACP)活性。 [0193] 图7显示测定结果。 [0194] 4.结果 [0195] 如图7A中所示，葡糖淀粉酶活性在实验方案2即向其添加硫酸镁的方案中显著地提高。另外，如图7C和7D所示，在实验方案2即向其添加硫酸镁的方案中也提高了纤维素酶和酸性羧肽酶的活性。另一方面，在向其添加氯化镁(一种相同的镁盐)的实验方案3中活性没有提高，所以暗示硫酸根充当酶生产能力中的这些有益效果的主要原因。 [0196] 另外，在向其添加硫酸镁但是不添加硝酸钾或不添加磷酸二氢钾的实验方案4和5中没有观察到酶生产能力中有益效果。因此，发现当硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐同时结合时，酶生产能力显著地改善。 [0197] 如上所述，当通过利用向其添加表面被谷皮覆盖的谷类(例如，天然大麦)、硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐的液体培养基培养曲霉时，除生产烧酒等所需要的酶诸如葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶之外，还可以生产以高收率含有纤维素酶即纤维素分解酶和酸性羧肽酶即蛋白水解酶的液体曲。 [0198] 由于纤维素分解酶的高收率，可以预期在生产烧酒期间醪液粘度减小或醇收率增加，并且如果烧酒醪液中的氨基酸组分由于蛋白水解酶的高收率而增加，则可以生产具有令人满意风味的烧酒。 [0199] 另外，根据本发明的方法，预期通过曲霉生产的酶，诸如淀粉分解酶、纤维素分解酶和蛋白水解酶，除在这里测定的那些以外，一般以高收率生产。 [0200] 工业实用性 [0201] 根据本发明，可以不仅显著地改善液体曲中的淀粉分解酶的生产能力，而且生产以高收率含有纤维素分解酶和蛋白水解酶的液体曲。另外，与固体培养相比，可以严格控制液体培养，所以可以以低成本有效地生产具有品质稳定性的液体曲。 [0202] 通过利用根据本发明生产的液体曲用于生产发酵食品和饮料诸如烧酒，可以增加醇收率和氨基酸生产量，由此可以有效地生产各自具有令人满意风味的发酵食品和饮料。 [0203] 而且，本发明中使用的谷类是未碾磨的或碾磨至其中至少谷皮保留在表面上的程度。因而，原料可利用性和收率的改善是可以预期的。 |
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