[0001] 本发明涉及一种隐丹参酮在制备防治肿瘤复发转移药物中的应用。

[0002] 目前现有的恶性肿瘤治疗手段局限于清除肿瘤细胞，但缺乏预防潜伏机体内的恶性肿瘤细胞复发转移的有效药物。恶性肿瘤的治疗一直是困扰人类的世界难题，其发病率和死亡率逐年攀升，尽管近年来国际上各个国家都对肿瘤领域投入了大量的资源进行相关研究，其势头仍未减。现有的肿瘤治疗手段以手术和放化疗为主，化学药物疗法存在针对范围窄，有效率不高；毒副作用较大病人无法耐受；仅能杀死肿瘤细胞但无法控制肿瘤复发、转移等等问题。目前市场上应用的无论化学药物、靶向药物及免疫治疗药物，都无法解决恶性肿瘤治疗后极易复发、转移这一突出问题。在预防和阻止肿瘤发生复发、转移方面缺乏有效治疗手段及药物。

[0003] 现代医学发展了各种辅助治疗手段，即在术前术后对患者进行放疗或化疗，以期减少术后患者的复发转移率，延长患者生存期。2008年发表的LACE-meta分析显示，非小细胞肺癌患者术后辅助化疗，大部分(51.2％)的肺癌术后患者仍会在5年内死于肺癌的复发转移。现有的化疗方案是以铂类为主的联合治疗方案。以非小细胞肺癌常用的培美曲塞为例，多数患者1年内发生复发、转移，70.3％的患者1年内死于肺癌复发、转移。靶向治疗以其精准和较低的毒副反应著称，然而，在肿瘤的治疗中，这也只是相对而言。

[0004] 1.中医药在控制恶性肿瘤复发转移方面有突出疗效

[0005] 长期的临床实践及循证医学证据表明，中医药在治疗肿瘤和预防肿瘤复发、转移方面有着独特的优势和特色。然而，由于中医药防治肿瘤的具体成分及机制不清，这一优势并不为国际广泛认可，限制了中医药在肿瘤治疗上的推广应用及发展。

[0006] 一直以来，肿瘤的治疗主要依靠现代医学的治疗手段，以手术、化疗、放疗、生物治疗为主体，中医中药治疗辅助。即便是多种治疗手段结合的综合治疗，肿瘤这一疾病的控制仍不甚理想，90％的病人最终死于肿瘤的复发、转移。中医中药在这一领域的发展潜力深厚，尚未得到充分挖掘。我们前期的循证医学研究发现，中医药治疗在预防肿瘤的复发转移方面有着无法替代的优势，但由于中医中药治疗恶性肿瘤多为中医整体观指导下的辨证论治，采用复方治疗，成分复杂，机制不明，使其应用受限。随着现代生物学实验研究技术的不断进步，机体复杂的网络调控系统逐步被发掘和应用，中医中药的实验研究有了新的进展和突破，我们运用现代医学研究手段及最新研究成果发现中医药在防治恶性肿瘤复发转移方面有突出作用。

[0007] 2.中医药通过干预肿瘤干细胞生物学行为预防肿瘤复发转移的研究进展[0008] 近年来越来越多的实验数据表明，恶性肿瘤细胞中存在着一类与胚胎干细胞相似具有“干性”特征的一类细胞，称为“肿瘤干细胞”(cancer stem cells)。肿瘤干细胞被认为具有自我更新、高致瘤性、分化潜能和多药耐药四大基本生物学特征，是恶性肿瘤发生复发、转移的根源所在。肿瘤干细胞导致肿瘤复发转移的具体机制主要与其诱导免疫耐受、促进上皮间质转化、通过细胞因子等与肿瘤微环境相互作用密切相关。

[0009] 3.隐丹参酮抗肿瘤作用的实验研究进展

[0010] 隐丹参酮是众多从丹参中提取出来的单体化合物中的一种，亦是新发现的一种对肿瘤细胞增殖存在抑制效果的化合物。它的菲醌结构中的菲环能够和细胞中的DNA结合，又因为吠喃环与菲醌结构相互作用后能够使细胞内自由基增多，导致DNA功能障碍，从而抑制肿瘤细胞DNA合成，抑制肿瘤细胞增殖。此外，CPT可以诱导肿瘤细胞分化和促进肿瘤细胞凋亡，从而在一定的程度上阻碍肿瘤细胞侵袭和防止其向远处转移，具有抗肿瘤细胞的活性。实验研究证明，隐丹参酮对肝癌HepG2细胞、宫颈癌Hela细胞、人胆管癌HCCC-9810细胞、肺癌腺细胞SPC-A-1细胞株、黑色素瘤细胞、前列腺癌细胞DU 145均有干预作用。现有的实验证据均证明其能够抑制肿瘤细胞的增殖，但对肿瘤干细胞的干预作用尚未见报道。

[0011] 本发明的一个目的在于提供一种隐丹参酮在制备防治肿瘤复发、转移药物中的应用。

[0012] 本发明的一个目的在于提供一种隐丹参酮在干预肿瘤干细胞中的应用。

[0013] 本发明的一个目的在于提供一种隐丹参酮在干预前列腺癌干细胞中的应用。

[0014] 为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

[0015] 通过比较中药单体对DU145细胞及前列腺癌干细胞的干预作用，研究隐丹参酮干预前列腺癌干细胞特异性生物学行为。

[0016] 本发明中隐丹参酮，英文名称：Cryptotanshinone，CPT；化学结构式：C19H20O3，Mw296.35。

[0017] 本发明含隐丹参酮的中药单体的制备方法如下：

[0018] 将隐丹参酮、姜黄素、藤黄酸，溶于二甲基亚砜(DSMO)中，制备成最终浓度为16.7mmol/L，25mmol/L，12.5mmol/L的溶液，-20℃保存备用。

[0019] 本发明成果是中医药在肿瘤治疗领域的创新性成果。经过长达5年时间的实验研究发现，本发明中的隐丹参酮的中药单体能从多个靶点控制肿瘤的生长、复发和转移，主要有以下几个方面：

[0020] (1)抑制肿瘤细胞增殖。隐丹参酮中药单体能够干扰肿瘤细胞增殖的细胞周期，诱导肿瘤细胞停滞在G1/G0期，从而起到抑制肿瘤细胞过度增殖的作用。

[0021] (2)调控肿瘤干细胞的功能。隐丹参酮中药单体能够通过调控肿瘤干细胞相关基因的表达，靶向地干预肿瘤干细胞自我更新过程中关键的转化调节信使，从而阻滞肿瘤干细胞的自我更新。此外，这种中药单体还能够通过改变肿瘤干细胞的生物学行为，抑制肿瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭能力，下调相关的基因表达，从而减少肿瘤转移灶的形成，起到控制复发转移的作用。

[0022] (3)抑制肿瘤相关炎症反应。隐丹参酮中药单体能够抑制炎症因子的表达，及相关炎症细胞浸润。

[0023] (4)调节肿瘤相关免疫反应。隐丹参酮中药单体能够促进DC细胞成熟分化及其抗原提呈能力。

[0024] 在针对干细胞的实验研究中证实了该隐丹参酮单体对肿瘤干细胞生物学行为的调控作用，阐明其发挥防治肿瘤复发转移作用的具体机制。

[0025] 综上，该隐丹参酮中药单体在抑制肿瘤细胞增殖，调控肿瘤干细胞的功能，抑制肿瘤相关炎症反应，调节肿瘤相关免疫反应等方面均发挥了很好的作用，能够用于肿瘤的治疗。并且该药物对肿瘤干细胞有调节其生物学行为从而抑制肿瘤复发转移的作用。

[0026] 本发明的有益效果如下：

[0027] 本发明的中药单体组成成分单一、明确，本发明发现该中药单体用于杀伤肿瘤细胞的同时，能够较好的预防肿瘤的复发转移，其抗肿瘤疗效确实可靠，且机制明确、清晰。该成分具体防治肿瘤复发转移的作用，主要通过抑制肿瘤细胞中一类具有强耐药性、高致瘤性和具有自我更新能力的肿瘤干细胞的增殖和生长，改变其引起复发、转移的生物学行为来实现。附图说明

[0028] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

[0029] 图1.1示出细胞生长形态，其中A示出SSM培养基DU145细胞生长形态(×100)。B示出SFM培养基TumorSphere第三代第7天生长形态(×100)。

[0030] 图1.2示出标记同型和抗体双标。其中A1为DU145标记同型，A2为DU145抗体双标，B1为第一代干细胞标记同型，B2为第一代干细胞抗体双标，C1为第三代干细胞标记同型，C3为第三代干细胞抗体双标。

[0031] 图2.1示出隐丹参酮干预后DU145细胞生存率。

[0032] 图2.2示出莪术醇干预后DU145细胞生存率。

[0033] 图2.3示出姜黄素干预后DU145细胞生存率。

[0034] 图2.4示出贝母素甲干预后DU145细胞生存率。

[0035] 图2.5示出藤黄酸干预后DU145细胞生存率。

[0036] 图2.6示出隐丹参酮干预后DU145-CSC细胞生存率。

[0037] 图2.7示出藤黄酸干预后DU145-CSC细胞生存率。

[0038] 图3.1示出蛋白芯片扫描图，其中A为CSC(芯片编号：4000016508)蛋白芯片扫描图，B为CT-CSC(芯片编号：4000016509)蛋白芯片扫描图。

[0039] 图3.2示出隐丹参酮干预后PI3K/AKT、JAK/STAT信号通路差异蛋白表达图。

[0040] 图3.3隐丹参酮干预后RAS/MAPK/ERK信号通路差异蛋白表达图。

[0041] 图4.1示出两组瘤体体积比较。

[0042] 图4.2示出两组瘤体以及瘤体重量比较，其中A为两组瘤体照片，B为两组瘤体重量，*P<0.05。

[0043] 图4.3示出两组小鼠体重比较。

[0044] 图5.1示出Western Bolt检测两组FAK和p-FAK蛋白表达水平。其中FAK表达，p-FAK表达*P﹤0.01，VS Control。

[0045] 图5.2示出Western Bolt检测两组PYK2和p-PYK2蛋白表达水平。其中PYK2表达，p-PYK2表达#P﹤0.05,*P﹤0.01，VS Control。

[0046] 图5.3示出Western Bolt检测两组AKT和p-AKT蛋白表达水平。其中p-AKT表达*P﹤0.01，VS Control。

[0047] 图5.4示出Western Bolt检测两组CERB和p-CERB蛋白表达水平。其中p-CERB表达*P﹤0.01，VS Control。

[0048] 图5.5示出Western Bolt检测两组BCL-2和p-BCL-2蛋白表达水平。其中p-BCL-2表达**P﹤0.001，VS Control。

[0049] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

[0050] 实施例1 DU145前列腺癌细胞系的肿瘤干细胞培养、纯化及鉴定

[0051] (一)DU145前列腺癌细胞系的肿瘤干细胞培养及纯化

[0052] 通过对DU145前列腺癌细胞系的体外培养，获得前列腺癌干细胞样细胞并进一步纯化、富集，对照观察DU145细胞与前列腺癌干细胞样细胞形态差异。

[0053] 1材料

[0054] 1.1细胞

[0055] 人源前列腺癌DU145细胞，购自中科院上海细胞生物研究所。

[0056] 1.2主要试剂

[0057] MEM培养基购自Gibco公司；

[0058] 胎牛血清购自Gibco公司；

[0059] 胰酶购于Hyclone公司；

[0060] 青链霉素购自Hyclone公司；

[0061] PBS购于Hyclone公司；

[0062] DMEM-F12培养基购于Hyclone公司；

[0063] 大豆胰酶抑制剂购于Solarbio公司；

[0064] 牛血清白蛋白(BSA)购于Amresco公司；

[0065] B27购于Invitrogen公司；

[0066] 胰岛素(insulin)购于Sigma公司；

[0067] 碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)购于PeproTech公司；

[0068] 重组表皮生长因子(EGF)购于PeproTech公司；

[0069] KnockOutTM血清替代物购于Gibco公司；

[0070] 0.1％台盼兰染料，购于碧云天生物科技有限公司。

[0071] 1.3主要耗材

[0072] 培养瓶(25cm2，75cm2)，购于corning公司；离心管(15ml，50ml)，购于corning公司；低吸附6孔板，购于corning公司。

[0073] 1.4仪器设备

[0074] 5％CO2 37℃恒温细胞培养箱(Sanyo公司)；水浴锅(Vivo公司，vws20)；倒置显微镜(Nikon TE2000-U)。

[0075] 2方法

[0076] 2.1DU145前列腺癌细胞系的培养方法

[0077] 含血清培养基(serum-supplemented medium,SSM)培养基配置：10％胎牛血清+MEM培养基+1％青链霉素双抗。

[0078] DU145细胞的复苏：将DU145细胞从液氮中取出，37℃水浴1min，加入1ml含血清培养基，离心弃上清(1000r/min，5min)，加入1ml，吹匀后加入4ml培养基，置于25cm2培养瓶中，在5％CO2 37℃恒温细胞培养箱中培养，隔日换液。

[0079] DU145细胞的传代：观察5％CO2 37℃恒温细胞培养箱中培养的DU145细胞48h后细胞贴壁生长80％，弃去培养基，加入1ml PBS洗涤1次弃去，加入1ml胰酶置于培养箱中3min，显微镜下观察细胞回缩，加入1ml培养基中和胰酶，将将细胞悬液移入15ml离心管1000rpm低速离心5min，弃上清，加入1ml培养基吹匀后，细胞计数后1:3传代置于25cm2培养瓶中，放入5％CO2 37℃恒温细胞培养箱中培养。

[0080] DU145细胞的细胞计数：用酒精清洁细胞计数板表面及盖玻片，然后用擦镜纸擦干。用PBS重悬消化后DU145细胞，吹打成单细胞悬液，目测细胞浓度过高时，进行合适比例稀释，取稀释后细胞悬液20ul，加入到计数板与盖玻片之间，静置2min，倒置显微镜10×物镜计数，计算：原液中细胞密度＝(四个大方格细胞数之和/4)×104×稀释倍数。

[0081] DU145细胞的细胞冻存：细胞冻存液配置：90％胎牛血清+10％DSMO，取对数生长期的细胞消化后，将将细胞悬液移入15ml离心管1000rpm低速离心5min，弃上清，加入配置好的冻存液重悬细胞，调整冻存液中细胞最终浓度106/ml分装于无菌冻存管中，标明细跑名称、冻存日期及操作者。将冻存管放入-80℃冰箱过夜，取出移入液氮中。

[0082] 2.2基于DU145前列腺癌细胞的前列腺癌干细胞悬浮球状培养(Tumor Spheres Formation)2.2.1培养方法

[0083] 无血清培养基(serum-free medium，SFM)的配置：DMEM-F12培养基+10ng/ml b-FGF+20ng/mlEGF+1:50B27+5ug/ml+insulin+0.4％BSA+2％KnockOut+1％Pen/Strep，滤器过滤，4℃保存。

[0084] 来源于DU145前列腺癌细胞的前列腺癌干细胞(DU145-CSC)的培养：将对数生长期DU145细胞传代后重悬于无血清培养基(serum-free medium,SFM)中，充分混匀后接种于低吸附6孔板，每孔含细胞5×104/ml共2ml，观察DU145细胞在SFM中形成干细胞微球(TumorSpheres)的过程。

[0085] DU145-CSC的传代：大豆族酶抑制剂配置：100mlDMEM-F12+100ug大豆族酶抑制剂，滤器过滤，4℃保存。低吸附6孔中悬浮球状培养的DU145-CSC每7天传代一次，将TumorSpheres悬液移至15ml离心管，1000rpm低速离心5min后弃上清，加入SFM后吸管吹匀，加入胰酶置于消化培养箱中3min，再以等量大豆胰酶抑制剂中和后离心，以新的SFM培养基重悬，以每孔含细胞5×104/ml接种于低吸附6孔板，以此方法传代至第三代进行富集纯化，待进一步表型检测。

[0086] 3结果

[0087] 3.1经培养纯化后前列腺癌干细胞样细胞TumorSpheres的形成实验

[0088] 在SSM中，DU145细胞呈贴壁生长，见图1.1A。当接种于低吸附培养板的SFM中，可见一部分细胞开始凋亡坏死，剩余少部分细胞悬浮并形成较松散的细胞团，5-7天时可见细胞形成干细胞微球(TumorSpheres)。镜下观察TumorSpheres呈圆球体，微球内细胞连接紧密，具有折光性，传代三次以上TumorSpheres获得相对纯化，通过形态观察可以认为DU145细胞经SFM条件下培养，可形成前列腺癌干细胞样细胞，并具有自我更新特性(如图1.1B所示)，其纯度需进一步以表型检测进行评价。

[0089] (二)源于DU145前列腺癌细胞系的肿瘤干细胞的表型流式鉴定

[0090] 对经悬浮球状培养获得的前列腺癌干细胞样细胞进行评价，主要是干细胞表型评价，验证该细胞为前列腺癌干细胞。

[0091] 1材料

[0092] 1.1细胞

[0093] DU145前列腺癌细胞以及经SFM条件下培养纯化至第三代形成的前列腺癌干细胞样细胞微球(Tumor Spheres)。

[0094] 1.2主要试剂

[0095] 含血清培养基(serum-supplemented medium,SSM)为：10％胎牛血清+MEM培养基+1％青链霉素双抗；

[0096] 无血清培养基(serum-free medium,SFM)的配置：DMEM-F12培养基+10ng/ml b-FGF+20ng/mlEGF+1:50B27+5ug/ml+insulin+0.4％BSA+2％KnockOut+1％Pen/Strep；

[0097] PE-CD24，购于BD公司；APC-CD44，购于BD公司；

[0098] PE Rat IgG2b,k Isotype Control，购于BD公司；

[0099] APC Rat IgG2b,k Isotype Control，购于BD公司；

[0100] 4％多聚甲酸固定液，购于Solarbio公司。

[0101] 1.3主要仪器设备

[0102] FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)；B600-A型低速离心机(白洋淀制造厂)。

[0103] 1.4主要实验耗材

[0104] 灭菌流式管，购于BD公司；低吸附6孔板，购于corning公司；培养瓶(25cm2，75cm2)，购于corning公司；离心管(15ml，50ml)，购于corning公司。

[0105] 2方法

[0106] 2.1流式细胞术CD44+CD24-/low表型检测

[0107] ①分别收集DU145细胞与TumorSphere细胞，方法同前，消化细胞，1000rpm离心5min后重悬于1ml PBS；

[0108] ②将细胞悬液振匀后把细胞稀释5-10倍，进行计数，调整每样本细胞数为1×106/ml；

[0109] ③将抗体加入新流式管底部，PE-CD24及其同型PE Rat IgG2b,k  Isotype Control、APC-CD44及其同型APC Rat IgG2b,k Isotype Control加入分别0.5ul；

[0110] ④在含抗体的流式管中，加入各组细胞悬液各100ul，振荡器上振匀；

[0111] ⑤室温孵育30min，避光；

[0112] ⑥每组7样本，共14管样品。孵育后每管加入2-3ml预冷PBS，振匀后1000rpm离心5min洗涤，弃上清，加入300-400ul多聚甲醛固定；

[0113] ⑦振匀，200目滤膜过滤至新流式管后上流式细胞仪检测DU145细胞与+ -/lowTumorSphere细胞中的CD44CD24 表面标记表达水平。

[0114] 另，【抗体标记方法如下】：

[0115] 1)PE-CD24抗体、APC-CD44抗体双标：DU145细胞组及TumorSpheres细胞组各3样本，共6样本；

[0116] 2)PE-CD24抗体、APC-CD44同型：DU145细胞组、TumorSpheres细胞组各1样本；

[0117] 3)APC-CD44抗体、PE-CD24同型：DU145细胞组、TumorSpheres细胞组各1样本；

[0118] 4)APC-CD44同型、PE-CD24同型：DU145细胞组、TumorSpheres细胞组各1样本；

[0119] 5)不加抗体：DU145细胞组、TumorSpheres细胞组各1样本。

[0120] 共14管样品。

[0121] ⑧统计分析方法：使用SPSS15.0统计软件进行数据分析，实验结果用 表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，当p<0.05认为有统计学意义，组间比较具有差异性。

[0122] 3结果

[0123] 3.1流式细胞术CD44+CD24-/low表型检测结果

[0124] 以SSM培养基中培养的DU145细胞作为对照组，其CD44+CD24-/low表面标记检测结果为(35.45±5.05)％；而于SFM中所培养的TumorSpheres微球样本，第一代CD44+CD24-/low表面标记检测结果为(60.23±5.13)％，第三代CD44+CD24-/low表面标记检测结果为(74.16±6.25)％，三组表型比例差异显著(P<0.01)。结果表明TumorSpheres培养的微球高表达前列腺癌干细胞表型，随着传代纯度提高。由此通过表型检测可以认为TumorSpheres很大程度上属于前列腺癌干细胞样细胞。

[0125] (三)源于DU145前列腺癌细胞的肿瘤干细胞的动物成瘤实验鉴定

[0126] 1材料

[0127] 1.1细胞

[0128] DU145前列腺癌细胞以及经SFM条件下培养纯化至第三代形成的前列腺癌干细胞样细胞微球(Tumor Spheres)。

[0129] 1.2动物

[0130] 15只雄性NOID/SCID小鼠，6周龄，体重20-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]，在北京大学医学部实验室无特定病原体(specific－pathogen free,SPF)的饲养间饲养。

[0131] 1.3主要试剂

[0132] 含血清培养基(serum-supplemented medium,SSM)为：10％胎牛血清+MEM培养基+1％青链霉素双抗；

[0133] 无血清培养基(serum-free medium,SFM)的配置：DMEM-F12培养基+10ng/ml b-FGF+20ng/mlEGF+1:50B27+5ug/ml+insulin+0.4％BSA+2％KnockOut+1％Pen/Strep；

[0134] Matrigel基质胶，购于BD公司。

[0135] 1.4主要仪器设备

[0136] 5％CO237℃恒温细胞培养箱(Sanyo公司)；水浴锅(Vivo公司，vws20)；倒置显微镜(Nikon TE2000-U)。

[0137] 1.5主要实验耗材

[0138] 培养瓶(25cm2,75cm2)，购于corning公司；离心管(15ml，50ml)，购于corning公司；低吸附6孔板，购于corning公司；1ml注射器，购于BD公司。

[0139] 2方法

[0140] ①将15只NOD/SCID小鼠称重标记，分为三组，分别为2×105组、2×104组、2×103组；

[0141] ②分别收集对数期生长的DU145细胞与第三代TumorSphere细胞，重悬于PBS中制成细胞悬液，与Matrigel按1：1混合，制备终浓度为2×106/ml、2×105/ml、2×103/ml的细胞悬液置于冰上；

[0142] ③用1ml的注射器给小鼠左右腋下分别接种同等数量级DU145及TumorSphere细胞，即左腋下接种DU145细胞，右腋下接种TumorSphere细胞，每侧接种0.1ml。

[0143] 具体分组如下：

[0144] 第一组：2×105组，5只小鼠分别左腋下接种DU145细胞2×105个，右腋下接种TumorSphere细胞2×105个；

[0145] 第二组：2×104组，5只小鼠分别左腋下接种DU145细胞2×104个，右腋下接种4
TumorSphere细胞2×10个；

[0146] 第三组：2×103组，5只小鼠分别左腋下接种DU145细胞2×103个，右腋下接种TumorSphere细胞2×103个；

[0147] ④第7、14、21、30、35天观察小鼠成瘤，第7天开始后，用手触及小鼠双侧腋下，发现结节生长后记录成瘤时间，待瘤体增大后，可用游标卡尺测量瘤体大小。比较Tumor Spheres和DU145在小鼠体内的成瘤速度和成瘤率。

[0148] ⑤统计分析方法：使用SPSS15.0统计软件进行数据分析，实验结果用 表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，当P﹤0.05认为有统计学意义，组间比较具有差异性。

[0149] 3结果

[0150] 在双腋下分别接种Tumor Spheres和DU145细胞后，第7天开始后，用手触及小鼠双侧腋下，发现结节生长后记录成瘤时间，待瘤体增大后，可用游标卡尺测量瘤体大小。比较Tumor Spheres和DU145在小鼠体内的成瘤速度和成瘤率。第12天检查时，2×105数量级Tumor Spheres侧均成瘤，DU145侧仅1只成瘤。见表1.1。

[0151] 表1.1第12天成瘤率比较

[0152]

[0153] 第21天检查成瘤情况发现，2×105数量级5只小鼠双侧均成瘤，2×104数量级5只小3
鼠两种细胞各成瘤4只。2×10数量级5只小鼠Tumor Spheres成瘤2只，而DU145细胞未有成瘤。2×105数量级组成瘤侧比较瘤体体积，Tumor Spheres侧(106.6±26.4)mm3明显大于DU145侧(66.2±26.1)mm3，有统计学差异(P＜0.05)。2×104数量级组Tumor Spheres侧(105.3±44.1)mm3明显大于DU145侧(61.4±23.1)mm3，但统计学无差异(P＞0.05)。见表
1.2、表1.3。

[0154] 表1.2第21天成瘤率比较

[0155]

[0156] 第30天检查检查成瘤情况发现，2×105数量级和2×104数量级的所有小鼠双侧腋下均成瘤，2×103数量级5只小鼠Tumor Spheres成瘤5只，DU145细胞成瘤1只，见表1.4。

[0157] 表1.4第30天检查成瘤状态

[0158]

[0159] 第35天成瘤情况与第30天相同，处死2×105数量级和2×104数量级小鼠，比较双侧腋下瘤重大小。发现两数量级小鼠Tumor Spheres成瘤后的瘤重要大于DU145瘤重，且2×105数量级组差异存在统计学意义(P＜0.05)。见表1.5。

[0160] 表1.5第35天测瘤重

[0161]

[0162] 由此可见，Tumor Spheres成瘤时间要早于DU145细胞，且随着时间推移，增殖速度也快于DU145细胞。成瘤率来看，2×103数量级最能体现，第30天时Tumor Spheres成瘤率为100％，而DU145细胞为20％，存在统计学差异(P＜0.05)。证实Tumor Spheres具有肿瘤干细胞特性。

[0163] 实施例2中药单体对DU145细胞及前列腺癌干细胞的增殖干预作用研究[0164] 1材料

[0165] 1.1细胞

[0166] DU145前列腺癌细胞以及经SFM条件下培养纯化至第三代形成的前列腺癌干细胞DU145-CSC。

[0167] 1.2主要试剂

[0168] 含血清培养基(serum-supplemented medium,SSM)为：10％胎牛血清+MEM培养基+1％青链霉素双抗；

[0169] 无血清培养基(serum-free medium,SFM)的配置:DMEM-F12培养基+10ng/ml b-FGF+20ng/mlEGF+1:50B27+5ug/ml+insulin+0.4％BSA+2％KnockOut+1％Pen/Strep；

[0170] Cell-counting kit-8试剂盒，购于日本同仁化学。

[0171] 1.3药品

[0172] 隐丹参酮(编号110852，规格20mg),贝母素甲(编号110750，规格20mg)，姜黄素(编号110823，规格20mg)，莪术醇(编号100185规格100mg)，藤黄酸编号(111966规格20mg)，标准品均购于中国食品药品检定研究院。

[0173] 1.4主要仪器设备

[0174] 倒置显微镜(Nikon TE2000-U)；酶标仪公司(Synergy HT,Biotek公司)。

[0175] 1.5主要实验耗材

[0176] 灭菌流式管，购于BD公司；低吸附6孔板，购于corning公司；培养瓶(25cm2,75cm2)，购于corning公司；离心管(15ml，50ml)，购于corning公司；96孔板及低吸附96板，购于corning公司。

[0177] 2方法

[0178] 2.1中药单体制备

[0179] 将隐丹参酮、姜黄素、藤黄酸，溶于二甲基亚砜(DSMO)中，制备成最终浓度为16.7mmol/L，25mmol/L，12.5mmol/L的溶液；将贝母素甲溶于甲醇中，制备成最终浓度为
100mmol/L的溶液；将莪术醇溶于乙醇中，制备成最终浓度为500mmol/L的溶液，-20℃保存备用。

[0180] 2.2 CCK-8法分别检测隐丹参酮、姜黄素、莪术醇、贝母素甲、藤黄酸对DU145及(或)DU145-CSC的干预作用

[0181] ①获取对数生长期的DU145细胞及培养7天后的三代DU145-CSC，方法同前，将DU145细胞浓度调整为5×104/ml，细胞悬液为每孔200ul，1×104/孔接种于96孔板，将DU145-CSC细胞浓度调整为1×105/ml，细胞悬液为每孔100ul，1×104/孔接种于低黏附96孔板；

[0182] ②24h后将DU145细胞弃去培养液，分别加入含隐丹参酮，贝母素甲，姜黄素，莪术醇，藤黄酸的培养基200ul/孔，设隐丹参酮梯度浓度分别为50umol/L，25umol/L，12.5umol/L，6.25umol/L，3.125umol/L，1.5625umol/L，0.78125umol/L 0.390625umol/L；贝母素甲梯度浓度为100umol/L，50umol/L，25umol/L，12.5umol/L，6.25umol/L，3.125umol/L，1.5625umol/L，0.78125umol/L；姜黄素浓度梯度为25umol/L，12.5umol/L，6.25umol/L，
3.125umol/L，1.5625umol/L，0.78125umol/L0.390625umol/L，0.1953125umol/L；莪术醇梯度浓度为500umol/L，250umol/L，125umol/L，62.5umol/L，31.25umol/L，15.625umol/L，
7.8125umol/L，3.90625umol/L；藤黄酸浓度梯度为12.5umol/L，6.25umol/L，3.125umol/L，
1.5625umol/L，0.78125umol/L 0.390625umol/L，0.1953125umol/L，0.096umol/L，各浓度均设6复孔；48h后镜下观察DU145-CSC已成微球，不弃原来培养基，在96孔板中加入分别加入含隐丹参酮、藤黄酸的培养基100ul/孔，各单体终浓度梯度同上，各浓度均设6复孔。

[0183] ③分别于加药后6h、12h、24h、48h、72h、96h加入CCK-8试剂，DU145细胞加入每孔10ul，DU145-CSC细胞加入每孔20ul，2h后上酶标仪检测，记录吸光度值A检测细胞不同时间、不同药物浓度的抑制率。

[0184] 2.3计算方法

[0185] 抑制率(％)＝[(阴性对照组A-空白对照组A)-(实验组A-空白对照组A)]/(阴性对照组A-空白对照组A)×100％。

[0186] 增值率(％)＝1-抑制率＝[(实验组A-空白对照组A)/(阴性对照组A-空白对照组A)]×100％。

[0187] 3结果

[0188] 3.1 CCK-8细胞毒性检测法检测不同活血中药单体对DU145细胞增殖的干预作用[0189] 3.1.1 CCK-8细胞毒性检测法检测隐丹参酮对DU145细胞增殖的干预作用[0190] 不同浓度的隐丹参酮作用于DU145细胞24h、48h、96h后，用Bio-Tech酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.1所示。隐丹参酮作用于DU145细胞量效关系与时效关系来看，基本呈浓度与时间依赖性，其中48小时IC50为6.91uM，在6.25-50uM干预72h时后抑制作用达到最强。

[0191] 3.1.2 CCK-8细胞毒性检测法检测莪术醇对DU145细胞增殖的干预作用[0192] 不同浓度的莪术醇作用于DU145细胞24h、48h、72h后，用Bio-Tech酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.2所示。从量效关系来看，莪术醇在3.9-500uM浓度之间干预DU145细胞，抑制率均在50％左右，药效并未呈现典型的浓度依赖性。同时，从时效关系看，24小时、48小时、72小时不同浓度的莪术醇细胞增殖抑制率也在50％左右，药效也未呈现典型的时间依赖性，48小时IC50无法计算。以上结果可以看出莪术醇对DU145细胞的增殖抑制作用不强。

[0193] 3.1.3 CCK-8细胞毒性检测法检测姜黄素对DU 145细胞增殖的干预作用[0194] 不同浓度的姜黄素作用于DU145细胞6h、12h、24h、48h、72h、96h后，用酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.3所示，在6h-72h内，0.20uM-12.5uM的姜黄素对DU145细胞没有抑制作用，在12.5uM-25uM之间姜黄素对DU145细胞有抑制作用，48小时IC50为19.99uM，且随着时间的延长，对细胞增殖的抑制作用越明显。

[0195] 3.1.4 CCK-8细胞毒性检测法检测贝母素甲对DU 145细胞增殖的干预作用[0196] 不同浓度的贝母素甲作用于DU145细胞6h、12h、24h、48h、72h、96h后，用酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.4所示。从图中可以看出，0.78uM-100uM的贝母素甲作用于DU145细胞6h、12h、24h、48h、72h、96h后，其抑制率在90％以上，表明贝母素甲对DU145细胞增殖并没有明显的抑制作用。

[0197] 3.1.5 CCK-8细胞毒性检测法检测藤黄酸对DU 145细胞增殖的干预作用[0198] 不同浓度的藤黄酸作用于DU145细胞6h、12h、24h、48h、72h、96h后，用酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.5所示。可以看出藤黄酸对DU145细胞增殖有明显的抑制作用，呈浓度依赖性，其中48小时IC50为0.65uM，且在48h和72h对DU145细胞的增殖作用最明显，抑制率接近100％。

[0199] 3.2 CCK-8细胞毒性检测法检测不同活血解毒中药单体对DU145-CSC细胞增殖的干预作用

[0200] 3.2.1 CCK-8细胞毒性检测法检测隐丹参酮对DU 145-CSC细胞增殖的干预作用[0201] 不同浓度的隐丹参酮作用于DU145-CSC细胞6h、12h、24h、48h、72h、96h后，用Bio-Tech酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.6。从隐丹参酮作用于DU145细胞量效关系与时效关系图中可以看出，隐丹参酮对DU145-CSC细胞增殖有明显的抑制作用，基本呈浓度和时间依赖性，其中48小时IC50为4.093uM，在6.25uM-25uM干预72-96h后，抑制率接近100％。

[0202] 3.2.2 CCK-8细胞毒性检测法检测藤黄酸对DU 145-CSC细胞增殖的干预作用[0203] 不同浓度的藤黄酸作用于DU145-CSC细胞6h、12h、24h、48h、72h、96h后，用酶标仪测得的吸光值，最后计算的细胞生存率如图2.7所示。可以看出藤黄酸对DU145-CSC细胞增殖有明显的抑制作用，呈浓度和时间依赖性，其中48小时IC50为0.388uM，在1.56uM-12.5uM浓度作用48h后抑制率接近100％。与DU145细胞相比，藤黄酸对DU145-CSC有着更强的细胞增殖抑制作用。

[0204] 实施例3隐丹参酮干预前列腺癌干细胞特异性生物学行为网状调控机制研究[0205] 前列腺癌干细胞自身受到多基因、多条信号通路的调控，而且这些信号通路组成一个以JAK/STAT、PI3K/AKT、Ras/MAPK为核心的互有交通的网络体系。从实施例2看到隐丹参酮可以抑制前列腺癌干细胞的细胞增殖等生物学行为。为了探索隐丹参酮干预前列腺癌干细胞特异性生物学行为网状调控机制，我们应用蛋白芯片技术比较DU145-CSC与隐丹参酮干预后CT-CSC的蛋白磷酸化的差异表达。

[0206] 1材料

[0207] 1.1细胞

[0208] 经SFM条件下培养纯化至第三代形成的前列腺癌干细胞样细胞微球(Tumor Spheres)和种板后4.09uM隐丹参酮干预7天的第三代前列腺癌干细胞样细胞微球。

[0209] 1.2主要试剂

[0210] 含血清培养基(serum-supplemented medium,SSM)为10％胎牛血清的MEM培养基；

[0211] 无血清培养基(serum-free medium,SFM)的制备由DMEM-F12加入牛血清白蛋白(BSA)，碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)，重组表皮生长因子(EGF)，B27，胰岛素(insulin)，KnockOutTM，青链霉素Pen/Strep；

[0212] CSP100芯片Full Moon，USA。

[0213] 1.3主要仪器设备

[0214] 4度离心机，预冷Fresco 17，Thermo Scientific，USA；

[0215] 常温离心机，Pico21，Thermo Scientific，USA；

[0216] 酶标仪，PE Victor,PE，USA；

[0217] 涡旋振荡器Vortex 5，QILINBER，China

[0218] 摇床TS-2，Kylin-Bell Lab Instruments,China

[0219] 芯片小型离心机ChipMate PMC－082，Tomy，Japan；

[0220] 芯片扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，USA)；软件GenePix Pro 6.0(Axon Inxtruments,USA)。

[0221] 1.4主要实验耗材

[0222] 灭菌流式管，购自BD公司；培养瓶(25cm2,75cm2)，购自corning公司；离心管(15ml，50ml)，购自corning公司；低吸附6孔板，购自corning公司。

[0223] 2方法

[0224] 2.1样品蛋白质抽提和标记

[0225] A.蛋白质抽提

[0226] 1)每个样本管加入Full Moon提供的细胞裂解磁珠；使用涡旋器涡旋30s，冰上静置10min，重复此步骤4次；

[0227] 2)13200rpm，4℃，离心15min，将上清移至新离心管中；重复此步骤3次；

[0228] 3)最后一次离心，将上清移入一个干净的试管中。进行下一步骤实验或者-80℃储存。

[0229] 4)使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

[0230] B.蛋白质标记

[0231] 1)使用前将Biotin Reagent简单离心，每1mg Biotin Reagent加入100μLDMF(N,N-Dimethylformamide)，终浓度为10μg/μL，标记为Biotin/DMF。

[0232] 2)每个样本各取25μg蛋白样品进行标记，使用Labeling Buffer稀释样品至总体积为67μL。

[0233] 3)每管加入3.0μL Biotin/DMF，终体积70μL；室温混合均匀，室温下震荡反应2hr。

[0234] 4)加入30μL中止液。室温下震荡反应30min。

[0235] 5)将样品储存在-80℃或进行下一步骤。

[0236] 2.2芯片杂交

[0237] A.芯片封闭

[0238] 1)将蛋白质芯片从冰箱取出，室温平衡45min。

[0239] 2)在100×15mm培养皿中加入30mL封闭溶液，将蛋白质芯片完全浸没。确定芯片表面与条码向上，将培养皿放到摇床上，室温55rpm封闭45min。

[0240] 3)使用Milli-Q水按照下面步骤全面洗涤：

[0241] a)将芯片放入50mL圆形离心管，加入45mLMilli-Q，盖紧盖子。

[0242] b)用手上下颠倒或者震摇管子10s，倒掉Milli-Q。

[0243] c)离心管中换入新的Milli-Q，震摇管子10s，倒掉Milli-Q。

[0244] d)重复10次。

[0245] 4)甩掉芯片表面的多余Milli-Q水，马上进入下一步反应。

[0246] B.杂交

[0247] 1)在一个试管中，加入6mL Coupling Solution，加入生物素标记的蛋白(25μg)。简单混合均匀。标记为Protein Coupling Mix。

[0248] 2)将芯片放入干净的培养皿，芯片表面向上，缓慢的将6mL Protein Coupling Mix加到芯片表面。将芯片完全浸没，盖上Coupling Chamber；室温在摇床上以35rpm反应2h。

[0249] 3)将芯片移到一个盛有30mL 1×Wash Solution的100×15mm培养皿中，室温在摇床上以55rpm反应10min，倒掉洗液，重复此步3次。

[0250] 4)使用Milli-Q水按照下面步骤全面洗涤：

[0251] a)将芯片放入50mL圆形离心管，加入45mLMilli-Q，盖紧盖子。

[0252] b)用手上下颠倒或者震摇管子10s，倒掉Milli-Q。

[0253] c)离心管中换入新的Milli-Q，震摇管子10s，倒掉Milli-Q。

[0254] d)重复10次。

[0255] 5.甩掉芯片表面的多余Milli-Q水，马上进入下一步反应。

[0256] C.检测

[0257] 1)向60mL of Detection Buffer加入60μL of Cy3-Streptavidin(0.5mg/mL)。

[0258] 2)在一个100×15mm培养皿中加入30mL of Cy3-Streptavidn Solution。

[0259] 3)将芯片没入Cy3-Streptavidin solution。室温避光，在摇床上55rpm反应20min。

[0260] 4)将芯片移入一个新的盛有30mL 1×Wash Solution的100x15mm培养皿中；室温在摇床上55rpm反应10min。重复此步骤3次。

[0261] 5)使用Milli-Q水按照下面步骤全面洗涤：

[0262] a)将芯片放入50mL圆形离心管，加入45mLMilli-Q，盖紧盖子。

[0263] b)用手上下颠倒或者震摇管子10s，倒掉Milli-Q。

[0264] c)离心管中换入新的Milli-Q，震摇管子10s，倒掉Milli-Q。

[0265] d)重复10次。

[0266] 6)离心干燥芯片表面。

[0267] 7)扫描芯片。

[0268] 3结果

[0269] 3.1杂交后的芯片使用GenePix 4000B扫描仪进行扫描，扫描获得的结果如下，见图3.1。

[0270] 3.2对扫描获取的芯片图像，使用GenePixPro 6.0软件读取原始数据，并进行进一步分析。

[0271] GenePix Pro 6.0软件获取的原始数据，每个位点有六次重复，因此使用Grubbs’算法对数据进行处理，剔除离散数据后，计算每个蛋白位点的荧光信号的均值、SD、CV。在芯片上大部分抗体为配对抗体(131个抗体)，即每个磷酸化位点有2个抗体，1个抗体识别该磷酸化位点的磷酸化状态，另一个抗体识别该位点的非磷酸化状态。具有配对抗体的131个磷酸化位点的磷酸化水平的计算：用其磷酸化信号值比上对应的非磷酸化信号值。

[0272] 为了便于理解芯片上各蛋白在信号通路中的分布，我们将“CSC”VS“CT-CSC”比较组进行比较得到差异蛋白，将其对应的swissprot号通过在线数据库KEGG分别映射到肿瘤相关信号通路，设置了cut off值：1.2(即ratio＞1.2和ratio＜0.833的蛋白，用粉色填充在通路中展示，表示这些蛋白的磷酸化水平发生了变化,分别是以JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK/ERK为信号通路表达存在差异(见图3.2、3.3)。具体来说，JAK/STAT信号通路中JAK1(Phospho-Tyr1022)、JAK2(Phospho-Tyr221)、STAT3(Phospho-Tyr705)等蛋白磷酸化水平下调；PI3K/AKT信号通路中FAK(Phospho-Tyr861、Phospho-Tyr397)、Pyk2(Phospho-Tyr402)、Akt(Phospho-Ser473)、CREB(Phospho-Ser133)、BCL-2(Phospho-Ser70)、BCL-XL(Phospho-Ser62)等蛋白磷酸化水平下调；RAS/MAPK/ERK信号通路中PDGF Receptor beta(Phospho-Tyr751)、Raf1(Phospho-Ser259)、MEK-2(Phospho-Thr394)、Myc(Phospho-Thr358)等蛋白磷酸化水平下调。

[0273] 实施例4隐丹参酮对DU145肿瘤干细胞样细胞体内干预作用的研究

[0274] 实施例4以人前列腺癌细胞株DU145为研究对象，利用悬浮球状培养富集的肿瘤干细胞样细胞异种移植于NOD/SCID小鼠腋下建立成瘤模型，然后观察隐丹参酮对DU145肿瘤干细胞样细胞体内成瘤的干预作用。

[0275] 1材料

[0276] 1.1细胞

[0277] 经SFM条件下培养纯化至第三代形成的前列腺癌干细胞样细胞微球(Tumor Spheres)。

[0278] 1.2动物

[0279] 8只雄性NOID/SCID小鼠，6周龄，体重22-27g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]，在北京大学医学部实验室无特定病原体(specific－pathogen free,SPF)的饲养间饲养。

[0280] 1.3主要试剂

[0281] 无血清培养基(serum-free medium,SFM)的配置：DMEM-F12培养基+10ng/ml b-GF+20ng/mlEGF+1:50B27+5ug/ml+insulin+0.4％BSA+2％KnockOut+1％Pen/Strep；

[0282] Matrigel基质胶，购于BD公司；10％中性福尔马林固定液。

[0283] 1.4药品制备

[0284] 将100mg CT溶于4ml DSMO中，制成25mg/ml的原溶液，将吐温80、聚乙二醇、纯水混合制成溶剂，稀释CT终浓度为0.625mg/ml，-20℃保存备用。

[0285] 1.5主要仪器设备

[0286] 5％CO2 37℃恒温细胞培养箱(Sanyo公司)；水浴锅(Vivo公司，vws20)；倒置显微镜(Nikon TE2000-U)。

[0287] 1.6主要实验耗材

[0288] 培养瓶(25cm2,75cm2)，购于corning公司；离心管(15ml，50ml)，购于corning公司；低吸附6孔板，购于corning公司；1ml注射器，购于BD公司。

[0289] 2方法

[0290] ①收集第三代TumorSphere细胞，重悬于PBS中制成细胞悬液，与Matrigel按1：1混合，制备终浓度为2×106/ml的细胞悬液置于冰上。

[0291] ②用1ml的注射器给小鼠左腋下接种TumorSphere细胞，每只接种0.1ml，每只小鼠接种2×105个细胞。

[0292] ③接种7天后，记录小鼠腋下结节，用游标卡尺测量瘤体大小，瘤体长至50mm3左右，把8只小鼠分为两组，4只为CT干预组，4只为阴性对照组。按照0.2ml/只，腹腔注射，隔日一次，给药28天，每周测量瘤体大小，给药28天后处死小鼠，取瘤体称重，-80℃保存瘤体组织下一步Western Blot检测。

[0293] ④使用SPSS15.0统计软件进行数据分析，实验结果用 表示，两组间均数比较采用t检验，当P<0.05认为有统计学意义，组间比较具有差异性。

[0294] 3结果

[0295] 3.1隐丹参酮干预DU145-CSC异种移植成瘤模型的瘤体体积监测

[0296] 我们将富集纯化第三代DU145-CSC细胞100ul(2×105)接种到NOD/SCID小鼠体内，隐丹参酮干预4周，每周使用游标卡尺测量瘤体体积，观察其对DU145-CSC体内成瘤的干预作用。结果显示CT对DU145-CSC细胞成瘤具有抑制作用，与阴性对照组相比瘤体体积具有统计学差异(P<0.05)(见图4.1)。

[0297] 3.1隐丹参酮干预DU145-CSC异种移植成瘤模型的瘤重检测

[0298] 如上所述，我们将富集纯化第三代DU145-CSC细胞100ul(2×105)接种到NOD/SCID小鼠体内，隐丹参酮干预4周后处死，称量瘤重，观察其对DU145-CSC体内成瘤的干预作用。结果显示CT对DU145-CSC细胞成瘤具有抑制作用，两组瘤重具有统计学差异(P<0.05)(见图
4.2)，与阴性对照组相对照，隐丹参酮的抑瘤率为35.4％。

[0299] 3.2隐丹参酮对DU145-CSC异种移植成瘤模型的小鼠体重影响监测

[0300] 如上所述，我们将富集纯化第三代DU145-CSC细胞100ul(2×105)接种到NOD/SCID小鼠体内，隐丹参酮干预4周，每周称量体重，观察其对DU145-CSC异种移植成瘤模型的小鼠体重影响，了解隐丹参酮干预动物的安全性。结果两组小鼠在干预前和干预后体重均呈下降趋势，两组之间没有差异(见图4.3)，体重下降可能与肿瘤消耗有关，也不排除有机溶剂腹腔注射对小鼠存在影响，不能说明隐丹参酮本身对小鼠体重有影响。

[0301] 实施例5隐丹参酮对DU145肿瘤干细胞样细胞体内干预作用机制的研究[0302] 实施例4已经证明隐丹参酮对DU145肿瘤干细胞样细胞体内成瘤有干预作用，且体外实验部分已经证实隐丹参酮可以通过对前列腺癌干细胞JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK为核心的信号通路的网状调控实现了其对前列腺癌干细胞特异性生物学行为的多靶点复杂干预。实施例5旨在从体内干预部分探索隐丹参酮的作用机制。

[0303] 1材料

[0304] 1.1组织

[0305] 实施例4中冻存于-80℃的瘤体组织。

[0306] 1.2主要试剂

[0307] 甲醇，购自北京化工厂；无水乙醇，购自北京化工厂；

[0308] RIPA裂解缓冲液，购自普利莱基因技术有限公司(C1053)；

[0309] Piece BCA Protein Assay Kit，购自Thermo Scientific公司(23225)；

[0310] 4X分离胶缓冲液，购自普利莱基因技术有限公司(B1004)；

[0311] 30％丙烯酰胺-双丙烯酰胺，购自普利莱基因技术有限公司(B1000)；

[0312] 4X浓缩胶缓冲液，购自普利莱基因技术有限公司(B1003)；

[0313] 过硫酸铵(Ammonium persulphate,APS)，购自普利莱基因技术有限公司(B1004)；

[0314] 10X SDS-PAGE电泳缓冲液，购自普利莱基因技术有限公司(B1005)；

[0315] 10X蛋白电转移缓冲液，购自普利莱基因技术有限公司(B1006)；

[0316] TEMED，购自普利莱基因技术有限公司(A1006)；

[0317] 10X封闭洗涤缓冲液，购自普利莱基因技术有限公司(B1009)；

[0318] 蛋白酶抑制剂混合物，购自普利莱基因技术有限公司(P1265)；

[0319] 5X SDS PAGE Sample Loading Buffer，购自普利莱基因技术有限公司(B1012)；

[0320] 彩色预染蛋白质分子量标准品，购自碧云天生物技术研究所(P0068)；

[0321] 脱脂奶粉，购自美国BD公司(232100)；

[0322] 丽春红染液，购自碧云天公司；

[0323] Piece SuperSignal West Pico，购自Thermo Scientific公司(NCI5079)；

[0324] Bcl-2(124)mouse mAb购自美国Cell Signaling Technology公司(15071S)；

[0325] Phospho-CERB(Ser133)(87G3)RabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(9198S)；

[0326] p-pyk2(Y402)RabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(3291S)；

[0327] Pyk2(5E2)Mouse mAb购自美国Cell Signaling Technology公司(3480S)；

[0328] P-FAK(Y397)RabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(8556S)；

[0329] P-Bcl-2(S70)(5H2)RabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(2827S)；

[0330] FAKRabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(3285S)；

[0331] CREB(48H2)RabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(9197S)；

[0332] AKT(pan)(C67E7)RabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(4691S)；

[0333] Phospho-Akt(Ser473)(D9E)XPRabbitmAb购自美国Cell Signaling Technology公司(4060S)；

[0334] 1.3主要仪器设备

[0335] 5％CO2 37℃恒温细胞培养箱(Sanyo公司)；水浴锅(Vivo公司，vws20)；倒置显微镜(Nikon TE2000-U)。-80℃冰箱(Thermo Scientific公司)；高速冷冻离心机(Sigma公司)；Bio-Rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；电转移槽(Bio-Rad公司)；电泳仪(Bio-Rad公司)；酶标仪(Synergy HT,Biotek公司)。

[0336] 1.4主要实验耗材

[0337] 滤纸，购自美国Bio-Rad公司；Immobilon-P Transfer Membrane，购自美国Millipore公司。

[0338] 2方法

[0339] (1)总蛋白提取

[0340] ①称取100mg瘤体组织，剪碎，预冷的PBS洗2遍，加入1mlRIPA裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂+蛋白磷酸酶抑制剂混合物(比例49：1：0.5),在冰上用玻璃匀浆器匀浆20-40次，冰浴30min,每隔5min震荡混匀30s。

[0341] ②高速12000g 4℃离心10min，将上清液转移至新EP管中，获得总蛋白产物，并分装储存于-80℃冰箱。进行下一步蛋白含量检测。

[0342] (2)BCA法测定蛋白浓度

[0343] ①准备标准品

[0344] 取9个1.5ml EP管，按下表加入稀释液，以PBS稀释，取BSA溶液(2mg/ml)，按下表加入原液与稀释液。(见表5.1)

[0345] 表5.1 BCA标准品浓度检测

[0346]

[0347] ②准备工作液

[0348] 依据样品数量，制备BCA工作液，试剂A及试剂B混合液二者比例为50:1，充分混匀。

[0349] (标准液+未知液)×复孔数目×每样本加入工作液体积＝总工作液体积；

[0350] ③准备96孔板，按样品：工作液＝1:8的比例，加入每孔25ul标准品或样本，各浓度标准品或样本设置2复孔。

[0351] ④每孔加入200ul BCA工作液；

[0352] ⑤将96孔板置于振荡器上震荡30s，37℃恒温放置30min(培养箱)，恢复至室温；

[0353] ⑥上酶标仪检测，检测波长为562nm，以蛋白含量(ug)为横坐标，吸光值A为纵坐标，作出标准曲线。

[0354] ⑦根据样本吸光值A在标准曲线上可获得相应蛋白含量(ug)，除以样本稀释液总体积，乘以样本稀释倍数，为样品实际浓度(ug/ul)。

[0355] (3)Western Blot实验步骤

[0356] 1)洗涤3个大培养皿、制胶玻璃板及1L量筒，烘干，晾至室温，洗涤电泳槽；

[0357] 2)制备1X电泳缓冲液，共配制1L，其中100ml浓缩电泳缓冲液。

[0358] 3)制备10％APS：0.1g过硫酸铵+1ml超纯水；

[0359] 4)制备分离胶(见表5.2)

[0360] 表5.2分离胶配制

[0361]

[0362] 5)洗涤制胶板固定架，将烘干后的1mm制胶玻璃板安装好固定于固定架上卡紧，注意玻璃板朝内侧无划痕；酒精洗涤梳子(15齿)，并用超纯水洗涤；最好提前校对是否符合电泳槽；

[0363] 6)将适当体积蛋白样本加入5×SDS Loading Buffer，并于95-100℃金属浴加热器中加热5min变性，加热一次即可；样本与Loading Buffer为4:1，即20ul样本，5ul Loading Buffer；

[0364] 7)灌分离胶：加入TEMED 3ul，混匀后灌胶，制胶板向后倾斜45°，移液器亦呈45°角将配制好的分离胶经制胶板一角加入约4.5ml，即距离玻璃板上缘3cm处；1min后以超纯水水封，从左至右缓慢加入，直至加满制胶板，防止气泡产生；

[0365] 8)等待凝胶20min，当水与胶之间出现清晰折射线，取下制胶板，弃去上层纯水，并用干净餐巾纸吸去多余的水；

[0366] 9)在等待凝胶的过程中，制备浓缩胶，制备方法如表5.3所示：

[0367] 表5.3浓缩胶配制

[0368]

[0369] 10)加入浓缩胶前加入2ul TEMED，立即混匀，将2ml浓缩胶依前法加于分离胶之上，排出气泡，灌满制胶板后平稳插入梳子，等待15min，胶凝固后取下制胶板，插入垂直电泳槽，从内至外加入电泳缓冲液，平稳拔出梳子，开始上样，加样前可以先冲洗下加样孔，将加样器抵住加样孔后的玻璃板缓慢加样，从左至右，两外侧加样孔加入蛋白质分子Marker，根据样本数量选择居中几个加样孔上样。

[0370] 11)SDS-PAGE电泳：

[0371] 上样完毕并加好电泳缓冲液后进行电泳，设置浓缩胶电压为80V(10-15mA)，约30min；分离胶电压为120V(20mA)，约60-90min，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行下一步转膜。

[0372] 12)转膜：

[0373] 等待电泳过程中准备2张滤纸，1张PVDF膜，面积均与胶相等；配制转膜缓冲液，如表5.4所示：

[0374] 表5.4转膜缓冲液制备

[0375]

[0376] PVDF膜先以甲醇浸泡15s，然后用超纯水洗涤1min，与滤纸一起置于转膜缓冲液中平衡15min以上。

[0377] 当终止电泳后取出制胶板，用专用撬板小心撬开玻璃板，获得凝胶后按照折线轻轻裁掉浓缩胶，置于电转液中平衡15min；等待期间配500ml 1X封闭液；洗涤电转移槽及海绵、夹子；

[0378] 从阳极至阴极的叠放顺序为：海绵垫→滤纸→PVDF膜→凝胶→滤纸→海绵垫，合起夹子，置于电转移槽中，夹子阴极(黑色)对着槽的黑色面，夹子阳极(白色面)对着槽红色面。准备一盆纯净冰，和一个小冰袋，将冰袋置入电转移槽中，加入电转缓冲液，使夹子没入槽即可，将电转移槽放入冰中。设置电转移电压100V(350mA)，约1h，终止后取出夹子，将膜取出，置于摇床上于丽春红染液中浸泡3-5min；纯净水洗涤30s。

[0379] 13)免疫杂交反应

[0380] ①将洗涤后的膜放入封闭液(20ml封闭液+1g脱脂奶粉；磷酸化蛋白需要5％BSA)中，室温下摇床上晃动封闭1h；

[0381] ②离心管内配制一抗稀释液，以封闭液稀释，β-Catenin及胞浆内参β-Actin，1:1000，将膜封入封闭袋，加入一抗稀释液约6-8ml，室温于摇床上孵育1h；或4℃孵育过夜，终止后以封闭液在脱色摇床上洗涤3次，每次5-10min；

[0382] ③离心管内配制二抗稀释液6-8ml，1:2000，室温于摇床上继续孵育1h；终止后以封闭液在脱色摇床上洗涤3次，每次5-10min；

[0383] 14)化学发光

[0384] ①塑料泡沫上铺一张干净保鲜膜，将PVDF膜铺于保鲜膜上，试剂A与B各1ml混匀，混合发光液均匀加于PVDF膜上的蛋白面，0.1ml/cm2，避光2-5min；弃去发光液，将保鲜膜另一侧翻转盖在PVDF膜上，展平。

[0385] ②检测成像前将BIO-Rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统及相机电源打开预冷，将膜放入明场(EPI)，成像软件中调整位置，将系统调为“Chemi Hi Sensitivity”，进行拍照，并导出图片。

[0386] 15)统计分析

[0387] Image J软件分析不同条带光密度值，进行统计分析处理。

[0388] 相对光密度值＝(处理组目标蛋白光密度值/处理组内参蛋白光密度值)/(空白组目标蛋白光密度值/空白组内参蛋白光密度值)

[0389] (3)统计方法及数据分析

[0390] 使用SPSS15.0统计软件进行数据分析，实验结果用 表示，两组间均数比较采用t检验，当P<0.05认为有统计学意义，组间比较具有差异性。

[0391] 3结果

[0392] 3.1两组FAK/AKT/Bcl-2信号通路相关蛋白表达水平检测结果

[0393] 3.1.1 FAK和p-FAK蛋白表达水平检测

[0394] 隐丹参酮干预组小鼠瘤体组织中FAK和p-FAK的表达显著低于对照组，差异有统计学意义(P﹤0.01)，见图5.1。

[0395] 1.2 PYK2和p-PYK2蛋白表达水平检测

[0396] 隐丹参酮干预组小鼠瘤体组织中PYK2和p-PYK2蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P﹤0.05)，见图5.2。

[0397] 1.3 AKT和p-AKT蛋白表达水平检测

[0398] 隐丹参酮干预组小鼠瘤体组织中AKT的蛋白表达和对照组无明显差异，p-AKT蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P﹤0.01)，见图5.3。

[0399] 1.4 CERB和p-CERB蛋白表达水平检测

[0400] 隐丹参酮干预组小鼠瘤体组织中CERB的蛋白表达和对照组无明显差异，p-CERB蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P﹤0.01)，见图5.4。

[0401] 1.5 BCL-2和p-BCL-2蛋白表达水平检测

[0402] 隐丹参酮干预组小鼠瘤体组织中BCL-2的蛋白表达和对照组无明显差异，p-BCL-2蛋白表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P﹤0.001)，见图5.5。

[0403] 3结论

[0404] 3.1通过表型鉴定及成瘤能力检测可以认为DU145前列腺癌细胞系能够培养分离前列腺癌干细胞(DU145-CSC)，且高表达CD44+CD24-/low表型，并具有自我更新、抗凋亡能力和成瘤能力；DU145-CSC细胞中以PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT为核心的互有交通的网络调控体系的激活状态调控其特异性生物学行为；

[0405] 3.2隐丹参酮可以干预DU145-CSC的生物学行为，在体外抑制DU145-CSC的增殖，体内可以抑制DU145-CSC荷瘤小鼠的成瘤。隐丹参酮干预DU145-CSC生物学行为与其对PI3K/AKT、RAS/MAPK、JAK/STAT为核心的网状体系的调控有关。

[0406] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。