具有佐剂活性的复合物
阅读：447发布：2020-05-29
专利汇可以提供具有佐剂活性的复合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种复合物，包含包括衍生自 丙烯酸 或其盐的单元的窄分子量分布的 聚合物 和(i)具有抗病原 生物 药理活性的物质或(ii)具有抗癌药理活性的物质或(iii)一种或多种选自 抗原 和免疫原的 试剂 ，该复合物可以用于 治疗 和/或诱导对于病原生物或癌的免疫，并可以用于诱导对于抗原或免疫原的免疫。，下面是具有佐剂活性的复合物专利的具体信息内容。
1.一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的聚合物，所述聚合物具有1.7或更小的多分散性、100,000或更小的分子量，并且所述聚合物包括通式(I)或其盐的单元：
1
其中R是氢、甲基或羧酸，R 是氢或C1-C6烷基；
和
(i)具有抗病原生物药理活性的物质，或
(ii)具有抗癌药理活性的物质，或
(iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
2.权利要求1的复合物，其中所述病原生物主要但不仅是细胞内生物。
3.权利要求2的复合物，其中病原生物是存在和/或保持在巨噬细胞源的细胞和/或其他抗原呈递细胞内的细胞内生物。
4.权利要求1的复合物，其中病原生物选自下列生物：
a)导致下列疾病的生物：浅部真菌病；癣；鹅口疮；马拉色菌感染；耳真菌病；和角膜真菌病；
b)导致侵入性和慢性真菌感染的念珠菌物种；曲霉物种；新型隐球菌；导致毛霉菌病的生物；镰刀菌物种；毛孢子菌物种；导致芽生菌病的生物；孢子丝菌物种；侧孢霉物种；
导致组织胞浆菌病的生物；导致非洲组织胞浆菌病的生物；导致球孢子菌病的生物；导致类球孢子菌病的生物；和马内菲青霉；
c)导致分枝杆菌病的生物；
d)导致血吸虫病的血吸虫科成员；
e)导致伤寒和副伤寒的生物；
f)导致弓形体病的生物；
g)导致人非洲锥虫病的生物；
h)导致美洲锥虫病的生物；
i)导致疟疾的生物；
j)导致HIV和HTLV感染的生物；
k)导致卡氏肺囊虫感染的生物。
5.权利要求1的复合物，其中所述病原生物导致利什曼病。
6.权利要求1-5中任一项的复合物，其中药理活性物质是两性霉素B。
7.权利要求1的复合物，其中抗原或免疫原直接或间接来自导致下列疾病的生物：肺结核、破伤风、炭疽、霍乱、白喉、麻疹、腮腺炎、风疹、甲型肝炎、乙型肝炎、流行性感冒、带状疱疹、脊髓灰质炎、狂犬病、天花、黄热病、水痘、带状疱疹、单纯疱疹、流行性感冒或利什曼病。
8.如权利要求1的复合物，其中抗原或免疫原直接或间接来自权利要求2-5中任一项所定义的生物。
9.如权利要求1-5中任一项所述的复合物，其中所述聚合物具有4,000-100,000的分子量。
10.如权利要求1-5中任一项所述的复合物，其中所述聚合物是聚(甲基丙烯酸)或其盐。
11.一种药物制剂，包含与药学适宜的载体混合或结合的如权利要求1-10中任一项所述的复合物。
12.如权利要求11所述的药物制剂，其包含递送系统佐剂。
13.如权利要求1-10中任一项所述的复合物或权利要求11或12所述的药物制剂的用途，用于制备治疗病原生物感染、诱导对病原生物的免疫应答、治疗癌症或诱导对癌的免疫应答、或诱导对抗原或免疫原的免疫应答的药物，其中向需要治疗的对象施用有效量的所述药物。
14.如权利要求13所述的复合物或制剂的用途，用于制备治疗病原生物感染和/或诱导对病原生物的免疫应答的药物，其中所述复合物包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质。
15.如权利要求13所述的复合物或制剂的用途，用于制备以任意临床形式治疗利什曼病和/或诱导对导致利什曼病的生物产生免疫应答的药物。
16.如权利要求13所述的复合物或制剂的用途，用于制备治疗癌症或诱导对抗原或免疫原的免疫应答的药物。
17.包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的聚合物的用途，所述聚合物具有1.7或更小的多分散性、100,000或更小的分子量，并且所述聚合物包括通式(I)或其盐的单元：
其中R是氢、甲基或羧酸，R1是氢或C1-C6烷基；
用于(i)与具有抗病原生物药理活性的物质一起来制备治疗病原生物感染或诱导对病原生物的免疫应答的药物、(ii)与具有抗癌药理活性的物质一起来制备治疗癌症或诱导对癌的免疫应答的药物、或(iii)与一种或多种选自抗原和免疫原的试剂一起来制备诱导对抗原或免疫原的免疫应答的药物，其中向需要治疗的对象施用有效量的所述药物。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述聚合物和所述其他物质一起施用或分别施用。
19.如权利要求17所述的聚合物的用途，用于制备治疗病原生物感染和/或诱导对病原生物的免疫应答的药物。
20.如权利要求17所述的聚合物的用途，用于制备以任意临床形式治疗利什曼病和/或诱导对导致利什曼病的生物产生免疫应答的药物。
21.如权利要求17所述的聚合物的用途，用于制备治疗癌症或诱导对抗原或免疫原的免疫应答的药物。
22.包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的聚合物的用途，所述聚合物具有1.7或更小的多分散性、100,000或更小的分子量，并且所述聚合物包括通式(I)或其盐的单元：
1
其中R是氢、甲基或羧酸，R 是氢或C1-C6烷基；
用作疫苗制备中的免疫增强佐剂。
23.如权利要求17或权利要求22所述的用途，其中所述聚合物具有如权利要求9或
10所定义的结构。
具有佐剂活性的复合物
技术领域
[0001] 本发明涉及具有佐剂性能的复合物。
背景技术
[0002] 对暴露在病原体中而产生的保护性免疫是两种不同的免疫应答联合完成的。它们分别是先天性应答和抗原特异性应答，后者也称作适应性应答。先天性免疫应答在感染早期发挥作用，它在几分钟内探测出来自侵入病原体的广泛信号并做出应答。相反，适应性免疫应答需要长达两周的时间才能发挥作用，但是它具有精确的抗原特异性，这对于完全消除病原体和产生免疫记忆是必需的。先天性免疫系统中病原体的抗原独立识别导致直接动员免疫效应物和调控机制，提供给宿主三种重要的生存优势：
[0003] (i)迅速启动先天性和适应性免疫应答，并建立抗原识别所需要的炎性和共刺激环境。
[0004] (ii)在适应性应答成熟时期建立抑制病原体的第一道防御。
[0005] (iii)控制适应性应答达到免疫应答的细胞或体液元件，这对于保护其免受特殊感染源感染是最有效的。
[0006] 因此，尽管接种的全部目的都是为激活抗原的特异性免疫，但在没有首先并有效激活先天性免疫应答的病原体探测机制的情况下，疫苗并不能最理想地完成这一任务。
[0007] 许多疫苗都包含抗原和佐剂。根据其功能，它们被广泛定义为：当联用时可以增强抗原体内免疫原性的物质。这样，佐剂成为大多数成功疫苗的重要组分，特别是以包括被杀灭的病原体和/或重组抗原的隔离片段的病原体亚单位为基础的疫苗。然而，由于对先天性免疫机制和抗原加工与抗原递呈的情况认识的增长，需要有新的和更复杂的佐剂。因此，传统的和新的佐剂逐渐被分成作为递送系统的佐剂和作为免疫增强剂的佐剂。然而，递送系统的主要功能是把疫苗组分集中到抗原呈递细胞上，免疫增强剂则通过包括类-Toll受体的特异性受体直接激活抗原呈递细胞。
[0008] 重要的是记住，传染原和大多数已许可的疫苗，特别地是减毒活疫苗和被杀死的全细胞疫苗制品，包含激活整个免疫应答所需要的所有组分。这是因为在这些疫苗中使用的病原体具有微粒形式的所有相关抗原，作为一个完整的细胞，也包含许多有效的免疫调节因子；即，分子模式的病原体。但是疫苗发展的趋势是去除这些产物，而成为更安全和更好的确定的亚单位疫苗并作为高度纯化的重组蛋白质制造出来。不幸的是，这些重组抗原的免疫原性常常很低，因为它们缺乏内在的免疫增强活性。因此在亚单位疫苗发展中的挑战是，再导入选择性信号以激发先天性免疫应答，以充分模拟自然传染或整个病原体细胞接种的途径。与完整细胞的疫苗相比，用于改善亚单位疫苗效能的递送系统和免疫增强剂应当是低廉、更有效和更安全的。
[0009] 尽管术语“递送系统”和“佐剂”在与疫苗相关的领域一般是可互换使用的，但常常要区分它们之间明显的区别和各自所具有的作用。所列举的疫苗“佐剂”包括许多的微粒递送系统，例如，乳剂、脂质体、免疫刺激复合物、病毒类粒子和微粒体，其作用的原理类型是促进抗原递送到负责诱导免疫应答的关键抗原呈递细胞上。但是，它们是较弱的免疫调节因子，因此需要加入免疫增强剂显著改善它们的性能。除非另有定义，此处的术语“佐剂”代表免疫增强剂。作为免疫增强剂的新的和改良型的佐剂，其发展的主要障碍在于安全性，因为如果可以接受用于临床，那么新的疫苗必须具有最低的不良反应。因此，尽管许多佐剂已经做过临床前和临床的广泛评估，但仅有来源于铝(一般称作“Alum”)的佐剂在北美成功获得作为疫苗佐剂应用的许可。Alum在产生细胞毒素CD8 T细胞免疫方面是较弱的。它优先介导偏重于Th2的免疫应答，而不是偏重于Th1的免疫应答。
[0010] 尽管在动物中使用天然的包含病原体相关性分子图式分子作为免疫增强剂佐剂的观点已经得到证明，但未来的趋势则是设计合成类似物。这主要是由于良好确定和标准化的合成免疫增强剂制造价格较低廉并且调节障碍较小。
[0011] 正如最早在1968年报道的那样，一些合成的聚阴离子聚合物可以保护用致死量脑膜炎病毒进行免疫性试验的小鼠，并且当其体外给予羧酸盐共聚物或其盐时，鼠科腹膜巨噬细胞产生出抑制囊状口腔炎病毒的因子(Merigan & Finkelstein.Interferon stimulating and in vivo antiviral effects of various synthetic anionicpolymers.Virology 1968；35：363-374)。
[0012] 最近，报道了藻酸盐(分离自海藻的聚合物)可以诱导TNF-α、IL-1和IL-6 释 放 (Otterlei M et al.Induction of cytokine production from human monocytesstimulated with alginate.J.Immunother.1991；10：286-291)。 藻 酸 盐 的
1-4-β-甘露糖醛酸部分也可以通过CD14/类Toll受体调节机制诱导TNF-α从单核细胞中释放。木质素衍生物和墨角藻多糖也可以诱导TNF-α从巨噬细胞中释放(Sorimachi K et al.Secretion of TNF-a from macrophages following induction with a ligninderivative.Cell Biol.Int.1995；19：833-838；Heinzelmann et al.Modulation ofLPS-induced monocyte activation by heparn-binding protein and fucoidan.Infect.Immun.1998；66；5842-5847)。当给猪尾猴注射时，硫酸墨角藻多糖和硫酸葡聚糖也显示可以显著提高IL-6、IL-8、MCP-1、M-CSF和G-CSF的循环水平(Sweeney EA等，Mobilization of stem/progenitor cells by sulphated polysaccharides does notrequire selectin presence.Proc.Natl.Acad.Sci.200；6；6544-6549)。
1-4-β-甘露糖醛酸部分也可以通过CD14/类Toll受体调节机制诱导TNF-α从单核细胞中释放。木质素衍生物和墨角藻多糖也可以诱导TNF-α从巨噬细胞中释放(Sorimachi K et al.Secretion of TNF-a from macrophages following induction with a ligninderivative.Cell Biol.Int.1995；19：833-838；Heinzelmann et al.Modulation ofLPS-induced monocyte activation by heparn-binding protein and fucoidan.Infect.Immun.1998；66；5842-5847)。当给猪尾猴注射时，硫酸墨角藻多糖和硫酸葡聚糖也显示可以显著提高IL-6、IL-8、MCP-1、M-CSF和G-CSF的循环水平(Sweeney EA等，Mobilization of stem/progenitor cells by sulphated polysaccharides does notrequire selectin presence.Proc.Natl.Acad.Sci.200；6；6544-6549)。
[0013] 趋化因子是一组异源性的可诱导促炎趋化细胞因子，包括TNF-α、IL-1和IL-6，包括MIP-1α和MIP-1β在内的β-趋化因子，在单核细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱型利细胞和淋巴细胞中作为化学诱导物(Luster AD.Chemokines-chemotactic cytokinesthat mediate inflammation.New Eng.J.Med.1998；338；436-446)。将趋化因子结合到各自的受体上会导致细胞激活的串联过程，包括肌醇三磷酸的产生、细胞内钙的释放及蛋白激酶C的激活。由此，趋化因子激活了可控制趋化性的细胞机制。这样，它们在向其蓄积区域补充白细胞和产生局部免疫应答中发挥了关键性的作用。
[0014] 然而，由上述聚合物导致的促炎细胞因子过度释放，这意味着它们具有非常大的毒性而不能安全施用于人。因此，尽管许多聚合物都显示出具有免疫调节的性质，但由于它们从天然来源中分离、分离的重现性、实验室中合成型聚合物的合成及当施用于动物时聚合物的毒性等问题，它们从未被有效开发应用于人的治疗中。
发明内容
[0015] 本发明提供一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和
[0016] (i)具有抗病原生物药理活性的物质，或
[0017] (ii)具有抗癌药理活性的物质，或
[0018] (iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
[0019] 本发明也提供一种药物制剂，包括将本发明的复合物与药学上适宜的载体混合或结合。
[0020] 本发明进一步提供一种用作药物的本发明的复合物。
[0021] 本发明还提供一种复合物，用于治疗病原生物感染和/或诱导对病原生物产生免疫应答，其中该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0022] 本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗病原生物感染的方法，包括向对象施用治疗有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0023] 本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中诱导对病原生物产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0024] 本发明进一步提供一种用于治疗癌症的复合物，其中该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0025] 本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗癌症的方法，包括向对象施用治疗有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0026] 本发明进一步提供一种在需要治疗的对象中诱导对癌症产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0027] 本发明进一步提供一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和一种或多种选自抗原和免疫原的试剂，用于诱导对抗原或免疫原产生免疫应答。
[0028] 本发明进一步提供一种在对象中诱导对抗原或免疫原产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0029] 本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于和具有抗病原生物药理活性的物质一起治疗病原生物感染和/或诱导对病原生物产生免疫应答。
[0030] 本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗病原生物感染的方法，包括向对象施用治疗有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0031] 本发明进一步提供一种在需要治疗的对象中诱导对病原生物产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0032] 本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于和一种或多种选自抗原和免疫原的试剂一起诱导对抗原或免疫原产生免疫应答。
[0033] 本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中诱导对抗原或免疫原产生免疫应答的方法，包括向对象施用治疗有效量的窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0034] 本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于和具有抗癌药理活性的物质一起治疗癌症和/或诱导对癌产生免疫应答。
[0035] 本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗癌症的方法，包括向对象施用治疗有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0036] 本发明进一步提供一种在需要治疗的对象中诱导对癌产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0037] 本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于在疫苗的制造中作为免疫增强佐剂。
[0038] 本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于在疫苗的制造中作为免疫增强佐剂，其中所述疫苗包含诱导产生免疫应答的抗原或免疫原。
[0039] 在制造疫苗的方法中，本发明进一步提供一种改进，包括使用一种窄分子量分布的聚合物作为免疫增强佐剂，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
[0040] 定义
[0041] 此处所述的术语“包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物”表示一种包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的聚合物，例如本文所述聚合物中的一种，例如包含衍生自甲基丙烯酸或其盐的单元的聚合物，如聚甲基丙烯酸或其盐，例如其钠盐。该聚合物可以是丙烯酸的均聚物或共聚物，例如丙烯酸或甲基丙烯酸或它们的盐。
[0042] 聚合物具有窄分子量分布，具体而言多分散性为1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地说，多分散性越小越好。由此，通常优选多分散性小于1.2。
[0043] 聚合物通常具有这样的分子量以使得存在于血液中时，在通过肾以后聚合物基本都保留在循环血液中，没有或只有少量聚合物经过肾小球器官的过滤。肾过滤(也称为肾小球过滤)大分子是其一项功能，尤其是根据分子的大小和形状进行过滤，而部分也依赖于分子量。一般地，对于任意特定的聚合物，存在阈分子量或窄范围的分子量，低于该分子量则发生肾过滤，高于该分子量则不发生或很少发生肾过滤。任意特定聚合物的阈分子量可以通过标准试验例如用放射标记聚合物来确定。
[0044] 作为一般性的指导，该聚合物的分子量一般为例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。该聚合物的分子量一般为例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。该聚合物可具有如上较大分子量和较小分子量的组合范围的分子量。例如，该范围包括但不限于，
80,000至4,000、75,000至5,000、65,000至10,000、55,000至10,000及45,000至10,000。
进一步的实例包括的范围例如是50,000至4,000，例如40,000至25,000。一般优选分子量范围为45,000至10,000。
80,000至4,000、75,000至5,000、65,000至10,000、55,000至10,000及45,000至10,000。
进一步的实例包括的范围例如是50,000至4,000，例如40,000至25,000。一般优选分子量范围为45,000至10,000。
[0045] 此处术语“PMAA-Na”表示聚甲基丙烯酸，钠盐。除非另有说明，它表示实施例A1-A4制备的聚甲基丙烯酸，钠盐。
[0046] 此处术语“复合物”表示包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和其他所述物质的联合体，该联合体各组分之间主要是非共价结合的，例如包括一种或多种离子、静电和范德华力。尽管根据本发明的复合物各组分之间主要是非共价结合的，但其中也会有一些共价结合。附图说明
[0047] 附图1：
[0048] 附图1显示的是在RPMI中细胞与PMAA-Na培养后红细胞的溶解。
[0049] 人红细胞的2％v/v溶液与PMAA-Na(“药物”)溶液在RPMI 1640介质中在37℃培养1小时和24小时。在1小时或24小时后当PMAA-Na浓度高达2,000μg/ml时未观察到显著毒性。该图显示了3个人类供体(A、B和C)的结果。附图1a显示供体A的结果，附图1b显示供体C的结果，附图1c显示供体B的结果。培养1小时后得到的结果如圆所示，培养24小时后得到的结果如菱形所示。
[0050] 附图2
[0051] 附图2显示的是在RPMI中与PMAA-Na培养后全血中红细胞的溶解。
[0052] 全人血(供体D)的2％v/v溶液与PMAA-Na(“药物”)溶液在RPMI 1640介质中培养。当使用人全血的PMAA-Na浓度高达500μg/ml，在1小时(如交叉所示)、6小时(如三角形所示)或24(如圆所示)后均未观察到显著毒性。
[0053] 附图3
[0054] 附图3显示的是PMAA-Na对来源于人单核细胞的巨噬细胞(附图3a)和人原代腹膜巨噬细胞(附图3b)的毒性的缺失。
[0055] 附图3a显示的是当来源于人单核细胞的巨噬细胞在包含浓度为0至2,000μg/ml的PMAA-Na的介质中培养所得到的结果。将细胞培养71小时，然后加入噻唑蓝(MTT，Sigma5mg/ml)。使用PMAA-Na的结果如闭合方块所示，作为对照组的聚(L-赖氨酸)结果如圆所示。在MTT测定和锥虫蓝测定中当PMAA-Na的最高浓度为2,000μg/ml时，对MDMs仍然是没有毒性的。
[0056] 附图3b显示的是当人腹膜细胞在包含浓度为0至2,000μg/ml的PMAA-Na的介质中培养所得到的结果。将细胞培养71小时，然后加入MTT。使用PMAA-Na的结果如闭合方块所示，使用作为对照组的聚(L-赖氨酸)结果如圆所示。PMAA-Na在浓度高达500μg/ml时对腹膜巨噬细胞仍然是没有毒性的。在浓度为500μg/ml到2,000μg/ml之间时在MTT测定和锥虫蓝测定中观察到较小的毒性。
[0057] 附图4
[0058] 附图4显示的是在不含内毒素的PMAA-Na的作用下MIP-1β从人腹膜巨噬细胞中释放。
[0059] 来自3个供体(A、B和C)的人腹膜巨噬细胞在不含内毒素的PMAA-Na(500μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的MIP-1β。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml(EU/ml)。附图4a显示供体A的结果，附图4b显示供体B，附图4c显示供体C。在PMAA-Na存在的条件下，MIP-1β具有显著的释放。
[0060] 附图5：
[0061] 附图5显示的是在不含内毒素的PMAA-Na作用下TNF-α从人腹膜巨噬细胞中释放。
[0062] 来自2个供体(A和B，分别为附图5a和5b)在不含内毒素的PMAA-Na(500μg/ml和2,000μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的TNF-α。在两种浓度的PMAA-Na存在的条件下，TNF-α具有显著的释放。
[0063] 附图6
[0064] 附图6显示的是在用介质对照组或PMAA-Na培养的单一供体人腹膜巨噬细胞中趋化因子和细胞因子释放。
[0065] 人腹膜巨噬细胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的促炎症反应趋化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8以及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。图中所示为取自3个不同的人类供体(A、B和C)细胞的结果。介质对照组的结果用空白方块表示，PMAA-Na的结果用黑方块表示。MIP-1α的释放如附图6a所示，TNF-α由附图6b表示，MIP-1β由附图6c表示，IL-8和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β如附图6d所示，IL-8如附图6e所示，IL-6如附图6f所示。所述趋化因子和细胞因子从组织抗原呈递细胞中的释放达到某一水平，该水平可以促进人体的药理学Th1应答，而没有高到导致人体有显著的有害不良作用。
[0066] 附图7
[0067] 附图7显示的在不含内毒素的PMAA-Na的作用下MIP-1β从来源于单核细胞的巨噬细胞中释放。
[0068] 来源于单核细胞的巨噬细胞在浓度为100μg/ml、500μg/ml和2,000μg/ml的PMAA-Na中培养。来自3个不同人供体A、B和C的细胞的结果分别如附图7a、7b和7c所示。并未观察到MIP-1β的释放。因此与源自基于组织体区室中巨噬细胞源的细胞相比，PMAA-Na对于来源于血单核细胞的细胞具有不同的免疫调节效果。
[0069] 附图8：
[0070] 附图8显示的是在PMAA-Na而不是市售的PMAA-Na作用下MIP-1β从人腹膜巨噬细胞中释放。
[0071] 人腹膜巨噬细胞分别在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)和如本文所描述制备的PMAA-Na中培养。市售的PMAA-Na中的一个具有与实施例A1-A4制备的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)(即附图中的PMAA-Na)相同的MWt。PMAA-Na在每种情况下都是500μg/ml。
36小时后收集培养的上清液。结果显示没有MIP-1β的释放。附图8a和8b分别显示了两个人供体A和B的结果。
36小时后收集培养的上清液。结果显示没有MIP-1β的释放。附图8a和8b分别显示了两个人供体A和B的结果。
[0072] 附图9：
[0073] 附图9显示的是在PMAA-Na但不是市售的PMAA-Na作用下TNF-α从人腹膜巨噬细胞中释放。
[0074] 人腹膜巨噬细胞分别在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)和如本文所描述制备的PMAA-Na中培养。市售的PMAA-Na中的一个具有与我们合成制备的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)(附图中的PMAA-Na)相同的MWt。PMAA-Na在每种情况下都是500μg/ml。36小时后收集培养的上清液。结果显示没有TNF-α的释放。附图9a和9b分别显示了两个人类供体A和B的结果。
[0075] 附图10，11和12
[0076] 附图10，11和12显示的是在用两性霉素B或两性霉素B-PMAA-Na复合物培养后红细胞的溶解。
[0077] 方法如附图1所述。该对比是在临床级两性霉素B(ampho B，结果如空白方块所示)和由如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物(amphoB-PMAA-Na，结果如空白圆所示)之间做出的。用于测试化合物的母液在MGM中制备。在培养1小时(附图10)、6小时(附图11)和24小时(附图12)后测定人红细胞的溶解。每种情况下都使用来自3个不同供体(A、B和C)的细胞。每条线代表一个人供体的结果。
[0078] 附图10a、10b和10c分别显示了供体A、B和C的细胞在培养1小时后的结果。附图11a、11b和11c分别显示了供体A、B和C的细胞在培养6小时后的结果。附图12a、12b和12c分别显示了供体A、B和C的细胞在培养24小时后的结果。
[0079] 在培养1小时后，没有观察到两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性。在培养6小时后，两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性远远小于临床级两性霉素B的毒性。当培养时间增加到24小时后，临床级两性霉素B的毒性增加到100％，但两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性没有进一步的增加。
[0080] 附图13：
[0081] 附图13显示的是在两性霉素B-PMAA-Na复合物培养后单个供体的红细胞溶解。
[0082] 方法如附图11所述，两性霉素B-PMAA-Na复合物如实施例C中所述制备。在浓度高至1,000μg/ml的各浓度两性霉素B-PMAA-Na复合物(“药物”)下培养1小时和24小时后测定红细胞溶解的程度。培养1小时后所得到的结果如空白方块所示，培养24小时后的结果如黑圆圈所示。
[0083] 附图14：
[0084] 附图14显示的是在培养PBMN细胞1、2和6天后两性霉素B-PMAA-Na复合物毒性的缺失。
[0085] RPMI介质中的PBMCs在包含两性霉素B-PMAA-Na复合物的培养基中培养，其中两性霉素B-PMAA-Na复合物(“药物”)如实施例3中所述制备且浓度为0-70μg/ml。在加入MTT(5mg/ml)之前，该细胞培养1天或2天或6天。在培养1天、2天或6天后，当化合物浓度最高70μg/ml时，其在MTT测定和锥虫蓝测定中对PBMcs仍然没有毒性。附图14显示的分别是3个代表性人供体的结果。每条线表示一个供体。附图14a、14b和14c分别显示在培养1天、2天和6天后的结果。
[0086] 附图15：
[0087] 附图5显示的是在培养来源于单核细胞的巨噬细胞2和3天后两性霉素B-PMAA-Na复合物的毒性。
[0088] 来源于单核细胞的巨噬细胞(MDM)在包含浓度为0-125μg/ml的化合物(“药物”)的培养基中培养。在加入MTT前，将细胞培养2天或3天。使用两性霉素B得到的结果如空白圆所示，使用如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的结果如空白方块所示。附图15a显示培养2天后的结果，附图15b显示培养2天后的结果。在培养2天或3天后，当浓度都高达125μg/ml时，该化合物在MTT测定和锥虫蓝测定中其毒性都小于临床级两性霉素B。
[0089] 附图16：
[0090] 附图16显示的是在用两性霉素或两性霉素B-PMAA-Na复合物处理后墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的存活率。
[0091] 用于实验的墨西哥利什曼原虫前鞭毛体保存在Schneider′s Drosophila生长介质(Invitrogen)中，该介质中加入15％胎牛血清(在56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。临床级两性霉素B对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.14μg/ml(附图16d)。临床级两性霉素B对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是1.49μg/ml(附图16d)。使用如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的三个实验的结果如附图16a、16b和16c所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.10至0.19μg/ml(附图16a、16b和16c)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是1.02至1.49μg/ml(附图16a、16b和16c)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
[0092] 附图17：
[0093] 附图17显示的是在用两性霉素或两性霉素B-PMAA-Na复合物处理后杜氏利什曼原虫前鞭毛体的存活率。
[0094] 用于实验的杜氏利什曼原虫前鞭毛体保存在Schneider′s生长介质199中，该介质中加入15％胎牛血清(在56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。临床级两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.08μg/ml(附图17d)。临床级两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是1.91μg/ml(附图
17d)。使用如实施例C中所描述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的三个实验结果如附图
17a、17b和17c所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.10至0.17μg/ml(附图17a、17b和17c)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是0.98至1.28μg/ml(附图17a、17b和17c)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
17d)。使用如实施例C中所描述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的三个实验结果如附图
17a、17b和17c所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.10至0.17μg/ml(附图17a、17b和17c)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是0.98至1.28μg/ml(附图17a、17b和17c)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
[0095] 附图18&19：
[0096] 附图18显示的是在来源于人单核细胞的巨噬细胞中两性霉素B-PMAA-Na复合物对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长的抑制作用。附图19显示了当使用临床级两性霉素B或AmBiosome(脂质体两性霉素B，Gilead Sciences，Great Abingdon，Cambridge，UK)时相应的抑制作用。
[0097] 用墨西哥利什曼原虫无鞭毛体感染保存在RPMI 1640(Invitrogen)中的来源于人单核细胞的巨噬细胞，该介质中加入10％人血清(在56℃下加热灭活1小时)和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。用寄生物/细胞的平均数乘以受感染细胞的百分比作为感染指数。使用如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的四个实验结果如附图18a-18d所示。临床级两性霉素B的抑制作用如19a所示，AmBiosome(Gliead Sciences)如19b所示。对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长具有50％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为0.18至0.32μg/ml(附图18a至18d)，而临床级两性霉素B为0.14μg/ml(附图19a)或Ambisome为0.45μg/ml(附图19b)。对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长具有90％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为1.18至1.55μg/ml(附图18a至18d)，而临床级两性霉素B为0.95μg/ml(附图19a)或Ambisome为3.89μg/ml(附图19b)。
[0098] 附图20：
[0099] 附图20显示的是两性霉素B-PMAA-Na复合物和AmBiosome对人巨噬细胞中细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长抑制作用的比较。
[0100] 附图20显示了如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物(如空白方块所示；IC50＝0.3μg/ml)和AmBisome(脂质体两性霉素B，Gilead Sciences，GreatAbingdon，Cambridge，UK)(如黑圆圈所示；IC50＝1.7μg/ml)对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体的相对活性的斜度对比。可以看出，两性霉素B-PMAA-Na制剂的杀灭曲 线比AmBisome的杀灭曲线更陡。
[0101] 附图21&22：
[0102] 附图21和22显示的是在来源于人单核细胞的巨噬细胞中，两性霉素B-PMAA-Na复合物(4个实验，如附图21a-21d所示)、临床级两性霉素B(附图22a)和AmBiosome(Gilead Sciences，同上)(附图22b)对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长的抑制作用。
[0103] 用杜氏利什曼原虫无鞭毛体感染保存在RPMI 1640(Invitrogen)中的来源于人单核细胞的巨噬细胞，该介质中加入10％人血清(在56℃下加热灭活1小时)和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。用寄生虫数/细胞的平均数乘以受感染细胞的百分比作为感染指数。对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长具有50％抑制作用时，由如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为0.30至0.71μg/ml(附图21a至21d)，而临床级两性霉素B为0.54μg/ml(附图22a)或Ambisome为1.96μg/ml(附图22b)。对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长具有90％抑制作用时，由如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为2.18至3.18μg/ml(附图21a-21d)，而临床级两性霉素B为2.31μg/ml(附图22a)或Ambisome为＞8μg/ml(附图22b)。
[0104] 附图23：
[0105] 附图23显示的是用不同的化合物培养24小时后，干扰素-γ从人腹膜巨噬细胞中释放。
[0106] 在巨噬细胞生长培养基中培养人腹膜细胞，其中该培养基包含所示浓度的各个化合物。所用的化合物是如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物、临床级两性霉素B、市售的PMAA-Na及如实施例A1-A4中所述制备的PMAA-Na。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。24小时后收集培养的上清液。用EIA(R&D系统)测定干扰素-γ。在两性霉素B-PMAA-Na制剂(100μg/ml)存在下Th1促进细胞因子、干扰素-γ从腹膜巨噬细胞中的释放显著地高于仅有细胞的对照组、临床级两性霉素B、市售的PMAA-Na或PMAA-Na。
[0107] 附图24：
[0108] 附图24显示的是在用结核菌素PMAA-Na复合物培养后细胞中PMBC的增殖。
[0109] PBMCs再悬浮于加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的链霉素的RPMI1640中。结核菌素PMAA-Na复合物(也称为结核菌素PPD-PMAA-Na)如实施例L2中所述制备。由鲎变形细胞溶解物测定法(Pyrotell，Associates of CapeCod，US)测定：所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。
[0110] 将细胞(105个细胞/孔)和各个化合物(如所示浓度的结核菌素PPD和结核菌3
素-PMAA-Na)按一式两份混合并在37℃/5％CO2下培养4天。按照1μ Ci/孔加入[H]-胸苷(特定活性20-30Ci/mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培养18小时。然后收集细胞并用液体闪烁计数器测定其增殖。结果用平均数/分(cpm)±sem表示。
素-PMAA-Na)按一式两份混合并在37℃/5％CO2下培养4天。按照1μ Ci/孔加入[H]-胸苷(特定活性20-30Ci/mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培养18小时。然后收集细胞并用液体闪烁计数器测定其增殖。结果用平均数/分(cpm)±sem表示。
[0111] 附图24a显示的是供体A的细胞在用结核菌素-PMAA-Na制剂培养6天后PBMC增殖的结果。附图24显示了当用1μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖显著提高。甚至当用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖会进一步提高(P＝0.001)。
[0112] 附图24b显示的是供体B的细胞在用结核菌素-PPD和结核菌素-PMAA-Na制剂培养5天后PBMC增殖的结果。与用10μg/ml的结核菌素抗原相比，用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养的T淋巴细胞增殖显著提高(P＝0.002)。这表明与结核菌素抗原对其本身的作用相比，结核菌素-PMAA-Na更能显著提高T淋巴细胞的增殖(P＝0.001)。
[0113] 附图25：
[0114] 附图25显示的是用供体A的抗原刺激人PMBCs24小时IFN-γ的产生。
[0115] 分离人PBMCs并在加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的链5
霉素的RPMI中调节为2×10 个细胞/孔。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。PBMCs和所述化合物(结核菌素和结核菌素-PMAA-Na复合物，也称为结核菌素PPD-PMAA-Na，如实施例L2中所述制备，浓度如图所示)在由人干扰素-γ单克隆抗体(R&DSystems，UK)包被的ELISpot PVDF-backed微量培养板的孔中混合。用未受激的细胞作为阴性对照组，用重组人干扰素-γ作为阳性对照组。该培养板在37℃/5％CO2下培养
24小时。然后根据厂商的说明书使微量培养板显像并得到阳性斑的数目以计算干扰素-γ的量。每个斑代表一个干扰素-γ分泌细胞。
霉素的RPMI中调节为2×10 个细胞/孔。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。PBMCs和所述化合物(结核菌素和结核菌素-PMAA-Na复合物，也称为结核菌素PPD-PMAA-Na，如实施例L2中所述制备，浓度如图所示)在由人干扰素-γ单克隆抗体(R&DSystems，UK)包被的ELISpot PVDF-backed微量培养板的孔中混合。用未受激的细胞作为阴性对照组，用重组人干扰素-γ作为阳性对照组。该培养板在37℃/5％CO2下培养
24小时。然后根据厂商的说明书使微量培养板显像并得到阳性斑的数目以计算干扰素-γ的量。每个斑代表一个干扰素-γ分泌细胞。
[0116] 附图25显示了产生IFN-γ细胞数目。附图25表明：与单独使用结核菌素抗原相比，结核菌素PPD-PMAA-Na制剂刺激人原代T淋巴细胞释放干扰素的效果更加显著。当使用50μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂和100μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂时，观察到干扰素-γ分泌物从T淋巴细胞中释放增加。
[0117] 附图26：
[0118] 附图26显示的是用临床级两性霉素B、AmBisome或两性霉素B-PMAA-Na静脉注射处理后和未处理的对照物和空白脂质体对照组中，杜氏利什曼原虫无鞭毛体在小鼠肝巨噬细胞中的存活率。
[0119] 使用如附图26中所示浓度的不同化合物。无鞭毛体/500肝细胞的数目用显微镜来计数，结果用未治疗对照物的百分比来表示。相对于对照组，如实施例C中所述制备的1mg/kg两性霉素B-PMAA-Na对杜氏利什曼原虫无鞭毛体具有显著的杀灭活性(P＜0.0001)。该结果表明，两性霉素B-PMAA-Na制剂在内脏利什曼原虫病的动物模型中是有效的。
[0120] 附图27：
[0121] 用MTT测定法测定的不同分子量的PMAA-Na构造物对于红细胞的毒性。
[0122] 附图27a-27c表明，如实施例N中所述制备的具有不同分子量的PMAA-Na构造物对于单个供体的红细胞的毒性的缺失。对于每种情况，PMAA-Na构造物的浓度以μg/ml给出，而红细胞的溶解以百分比形式给出。方块表示PMAA-Na构造物的分子量为19kDa时的结果，三角形表示28kDa的PMAA-Na构造物的结果，倒三角形表示37kDa的PMAA-Na构造物的结果(n＝3)。附图27a显示了在PMAA-Na构造物培养1小时后红细胞(RBCs)的溶解，附图27b显示了5小时后RBCs的溶解，附图27c显示了24小时后RBCs的溶解。在培养1小时、5小时和24小时后，2mg/ml的PMAA-Na构造物都不会导致红细胞溶解。而且该结果不受PMAA-Na构造物分子量的影响。
[0123] 附图28：
[0124] 用MTT测定法测定不同分子量的PMAA-Na构造物对外周血单核细胞(PMBCs)的毒性。
[0125] 在附图28a和28b中，用如实施例N中所述制备的PMAA-Na构造物的浓度对PMBCs的百分比来作图。方块表示PMAA-Na构造物的分子量为19kDa时的结果，三角形表示28kDa的PMAA-Na构造物的结果，圆表示37kDa的PMAA-Na构造物的结果(n＝3)。附图28a显示了用PMAA-Na构造物培养1天后PMBCs的存活率，附图28b显示了用该构造物培养2天后PMBCs的存活率。在培养1天和2天后，浓度为2mg/ml的该构造物对外周血单核细胞并没有毒性。结果没有收到所制PMAA-Na构造物的分子量的影响。
[0126] 附图29：
[0127] 附图29显示的是在不同条件下贮存，两性霉素B-PMAA-Na复合物对红细胞毒性的效果。
[0128] 附图29a显示的是如实施例C中所述制备并以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后的PMAA-Na复合物对红细胞(RBCs)的毒性的缺失。将不同浓度的该复合物与RBCs培养1小时，测定RBCs的溶解百分比。附图29a表明，两性霉素B-PMAA-Na复合物在以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后对红细胞没有毒性。
[0129] 附图29显示的是如实施例C中所述制备并在4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后的两性霉素B-PMAA-Na复合物与RBCs培养1小时后的结果。溶解率用百分比表示。用新制备的临床级两性霉素B为参照物作对比。培养进行了1小时和6小时；培养1小时的结果如图所示。附图29表明，两性霉素B-PMAA-Na复合物在4℃下的5％葡萄糖中贮存7个月后对红细胞没有毒性。
[0130] 附图30：
[0131] 附图30显示的是在不同条件下贮存后两性霉素B-PMAA-Na复合物对利什曼原虫无鞭毛体和前鞭毛体的抑制作用。
[0132] 附图30a显示的是根据实施例C制备并以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后的两性霉素B-PMAA-Na复合物对墨西哥利什曼原虫细胞内无鞭毛体生长的抑制作用。用感染指数对复合物的浓度作图。LD50为0.21μg/ml。
[0133] 附图30b显示的是用根据实施例C制备并在4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后的两性霉素B-PMAA-Na复合物在MDMs中培养细胞内无鞭毛体2小时后，墨西哥利什曼原虫无鞭毛体的存活率。
[0134] 用存活率百分数对复合物的浓度作图。用新制备的、临床级两性霉素B为参照物作对比。该复合物的LD50为0.4μg/ml，两性霉素B的LD50为0.3μg/ml。该复合物的结果如实心方块所示，两性霉素B的结果如空白圆所示。
[0135] 两性霉素B-PMAA-Na的活性在以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后或4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后没有受到影响。
[0136] 附图31：
[0137] 附图31显示的是不同菌株的新型隐球菌(Cryptococcus neoforman)的抑制作用，其中该新型隐球菌感染了来源于人单核细胞的巨噬细胞。
[0138] 在使用如实施例C中所述制备的不同浓度的两性霉素B-PMAA-Na复合物(实心方块)三天后，并用两性霉素B为参照物(空白圆)作对比，测定其抑制作用。计算受感染和未感染的巨噬细胞的数目及革兰氏阳性酵母CFU的数目。用CFU的平均数/受感染细胞的百分比，其结果为感染指数。由此也可以确定LD50值。
[0139] 附图31a显示的是新型隐球菌新型变种(C.neoformans var neoformans)临床分离物1的抑制作用，附图31b显示的是新型隐球菌新型变种NCPF3003的抑制作用，附图31c显示的是新型隐球菌gattii变种临床分离物的抑制作用，附图31d显示的是新型隐球菌gattii变种临床分离物的抑制作用。两性霉素B的LD50(0.9-1.4μg/ml)和两性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.7μg/ml)相似。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗隐球菌的活性。
[0140] 附图32：
[0141] 附图32显示的是不同的新型隐球菌菌株的存活率，其中该菌株感染了来源于人单核细胞的巨噬细胞。
[0142] 在使用如实施例C中所述制备的不同浓度的两性霉素B-PMAA-Na复合物(实心方块)三天后，用两性霉素B为参照物(空白圆)作对比，测定其存活率。
[0143] 用所述生物感染来源于人单核细胞的巨噬细胞，附图32a显示的是新型隐球菌新型变种NCPF 3003的结果，附图32b显示的是新型隐球菌新型变种临床分离物的结果，附图32c显示的是新型隐球菌gattii变种NCPF 3216的结果，附图32d显示的是新型隐球菌gattii变种临床分离物的结果。两性霉素B和两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50在4个实验中都是相似的，也类似于附图31a-31d所示的4个实验。对于新型隐球菌新型变种，两性霉素B的LD50是0.9-1.4μg/ml，两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50与之相似，为
1.6-2.7μg/ml。对于新型隐球菌gattii变种，两性霉素B的LD50是0.06-1.0μg/ml，两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50与之相似，为0.1-0.5μg/ml。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗隐球菌的活性。
1.6-2.7μg/ml。对于新型隐球菌gattii变种，两性霉素B的LD50是0.06-1.0μg/ml，两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50与之相似，为0.1-0.5μg/ml。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗隐球菌的活性。
[0144] 附图33：
[0145] 在用不同浓度的两性霉素B(参照物)或两性霉素B-PMAA-Na复合物处理1天后，附图33a显示的是白色念珠菌ATCC 90028的存活率，附图33b显示的是光滑念珠菌ATCC90030的存活率。
[0147] 对于白色念珠菌，两性霉素的LD50(0.9-1.8μg/ml)和实施例C制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50(1.6-2.3μg/ml)相似(附图33a)，而附图33b显示的是光滑念珠菌的结果。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗念珠菌的活性。
具体实施方式
[0148] 如上所述，本发明涉及包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物的各种用途，用于治疗病原生物感染、治疗癌症、和/或作为免疫增强佐剂，还涉及一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物药理活性的物质或(ii)具有抗癌药理活性的物质或(iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
[0149] 本发明基于我们如下的观察：包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物可以诱导β-趋化因子MIP-1α和MIP-1β的释放和干扰素-γ从人原代组织巨噬细胞即抗原呈递细胞中释放，而不诱导释放中毒量的促炎细胞因子。该聚合物在高浓度下对人细胞也是无毒的。根据本发明所述的方法制备上述供试聚合物。不与任何理论相联系，我们认为：上述观察表明，包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物可以作为Th1免疫增强佐剂，其刺激包含类Toll受体在内的细胞表面受体，即，作为增强抗原免疫刺激性质的物质。
[0150] 我们在实验中已经证明，包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物确实可以作为Th1免疫增强佐剂。所述复合物包含一种抗原(即结核菌素纯蛋白衍生物BP)和如本文所述生产的甲基丙烯酸钠盐均聚物(PMAA-Na)，与比结核菌素抗原对其本身的作用相比，该复合物能导致T淋巴细胞的更多地增殖，而且与单独使用结核菌素抗原相比，它也能增加干扰素-γ分泌物从T淋巴细胞中分泌。
[0151] 因此，包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物可以作为免疫增强佐剂与在常规疫苗中使用的抗原和/或免疫原联合使用，例如，所需要的抗原和免疫原直接或间接来源于治疗性和/或预防性疫苗所对抗的生物。这些抗原和抗体是例如来自天然源即直接来自相关生物的抗原和/或免疫原、亚单位抗原和免疫原和间接来自相关生物的由重组DNA技术和/或化学合成制备的抗原和免疫原。该聚合物可以和适当的抗原和/或免疫体配制成疫苗组合物。可以与递送系统佐剂一样，加入载体和赋形剂。所述聚合物和抗原和/或免疫原以本发明复合物的形式使用，或联合使用，见下文。
[0152] 用于上述疫苗中的疫苗、抗原和免疫原的例子包括但不限于，直接对抗白喉(diptheria)、破伤风、伤寒、百日咳、麻疹、风疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、H.流行性感冒eg b型、髓膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、霍乱、狂犬病、脑炎(各种类型)、黄热病和流行性感冒的疫苗，抗原和免疫原用于和适合用于这些疫苗。可以根据本发明使用这些抗原和免疫原。
[0153] 但是，包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物不仅在与抗原和免疫原联用时具有免疫增强的作用，而且即使不与抗原和免疫原联用，它也能促进对于病原生物的保护性Th1免疫应答，例如该病原生物主要但不仅是细胞内生物，特别是对于存在并主要保持在巨噬细胞源的细胞和/或包括树突细胞在内的其他抗原呈递细胞的生物的保护性Th1免疫应答。可以通过施用本发明该聚合物和具有抗病原生物的药理活性的物质(这里称做“药物”)来完成，例如，该病原生物主要但不仅是细胞内生物，特别是存在并主要保持在巨噬细胞源的细胞和/或包括树突细胞在内的其他抗原呈递细胞的生物，该物质尤其可以杀灭或以其他方式分裂上述的生物。生物的杀灭或分裂导致抗原物质的释放。该聚合物的存在能够加强对该抗原的免疫应答，因为进入到该已发生变化的细胞环境中的树突细胞能吸收并处理释放的抗原。然后树突细胞引发CD4+T细胞激活，促进产生效应子细胞毒性T细胞应答。上述效应中的某些能直接治疗性抵抗在残余的慢性受感染细胞中的任何生物和在这些细胞环境中的生物。对于未来再感染，其他效应子细胞毒性T细胞应答也能提供基于疫苗的保护性应答。由此可以实现药理学治疗、治疗性接种和保护性接种。
[0154] 因此，本发明也涉及包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物，用于和具有抗病原生物的药理活性的物质联用，治疗病原生物感染和/或诱导对于病原生物的免疫应答。本发明也涉及一种在需要这种治疗的对象中治疗病原生物感染和/或诱导对于病原生物的免疫应答的方法，包括向对象施用包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物的药理活性的物质。
[0155] 该聚合物和药理活性物质优选是本发明复合物的形式，或者可选择地，它们可以联用，见下文。
[0156] 诱导免疫应答的病原体主要是在细胞内复制和/或存留的那些，特别是在基于组织的巨噬细胞和其他抗原呈递细胞内复制和/或存留的那些，例如树突细胞。这些生物和由这些生物导致的疾病和病症如下列所示：
[0157] a)导致下列疾病和病症的生物：浅部真菌病，包括癣菌病；癣；鹅口疮；马拉色菌感染，包括变色糠疹、马拉色菌毛囊炎、脂溢性(seborrhoeic)皮炎和柱顶孢霉感染(Scytalidium infection)；耳真菌病；和角膜真菌病。
[0158] b)导致侵入性和慢性真菌感染的念珠菌物种，包括白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌；曲霉物种，包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉；新型隐球菌；毛霉菌病，例如，由犁头霉、根霉和根毛霉物种所导致；镰刀菌类；毛孢子菌物种；芽生菌病；孢子丝菌物种；侧孢霉物种；组织胞浆菌病，例如由荚膜组织胞浆菌荚膜变种(Histoplasmacapsulatum var.capsulatum)所导致；非洲组织胞浆菌病，例如由荚膜组织胞浆菌杜氏变种所导致；芽生菌病，例如由皮炎芽生菌所导致；球孢子菌病，例如由粗球孢子菌所导致；类球孢子菌病，例如由巴西类球孢子菌所导致；和由马内菲青霉导致的感染。
[0159] c)导致分枝杆菌病的生物，例如，由诸如结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌的分枝杆菌科成员导致的肺结核和麻风病。
[0160] d)可导致血吸虫病的血吸虫科成员，例如埃及血吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、间插血吸虫及湄公血吸虫。
[0161] e)导致伤寒和副伤寒的生物，例如A、B、C和D血清型沙门菌科成员。
[0162] f)导致弓形体病的生物，例如鼠弓形体。
[0163] g)导致人非洲锥虫病的生物，例如布氏冈比亚锥虫或布氏冈比亚锥虫。
[0164] h)导致美洲锥虫病的生物，例如，克氏锥虫。
[0165] i)导致疟疾的生物，例如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。
[0166] j)导致HIV和HTLV感染的生物，例如HIV-1、HIV-2、HTLV-I和HTLV-II。
[0167] k)导致卡氏肺囊虫感染的生物。
[0168] l)导致利什曼原虫病的生物，例如内脏型的，如黑热病(kala azar)，或者表皮型的，如杜氏利什曼原虫病和墨西哥利什曼原虫病。
[0169] 用于治疗这些疾病和病症的药理活性物质(药物)是本领域众所周知的，例如参见Principles and Practice of Infectious Diseases，Mandell G.L，Bennett J.E.，& Dolin R著，第5版，Churchill Livingstone.(2000)，Manson′s Tropical Diseases，Cook & Zumla著，第21版，Saunders.(2003)，及其他已经开发出来的药物。
[0170] 这些具有对抗病原生物的药理活性的物质的例子包括但不限于克霉唑、5-氟胞嘧啶、氟康唑、灰黄霉素、依曲康唑、酮康唑、咪康唑、吡嗪酰氨、环丙沙星、利福平、氨硫脲、环丝氨酸、氯法齐明、氨苯砜、rothionamide、美曲磷脂、羟氨喹、吡喹酮、联用型复方新诺明、乙氨嘧啶、磺氨多辛、螺旋霉素、美拉胂醇、硝呋替莫、氨酚喹、氯奎甲氟喹、甲氟喹、伯氨喹、氯胍、奎宁、叠氮胸苷、依法韦伦、印地那韦、病毒唑、阿糖腺苷、左旋咪唑及阿昔洛韦。
[0171] 根据本发明的一个方面的用途，治疗不需要是完全成功的，即对生物产生免疫应答来治疗对象或完全清除该生物，可以提供有效的“第二线”防御。效应子细胞毒性T淋巴细胞应答的产生可以清除所有残留的生物，因为它们将直接治疗留在慢性受感染细胞中的生物。必须要杀灭一些生物，因此可以释放出抗原。本发明的一个优点在于即使该治疗不能完全清除这些生物，但对于未来再感染，效应子细胞毒性T淋巴细胞的诱导作用仍可以提供基于保护性疫苗的应答。由此可以实现药理学治疗、治疗性接种和保护性接种。
[0172] 相同的考虑也适用于癌症。本发明涉及复合物的用途，该复合物包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，尤其是可以杀灭或部分杀灭或以其他方式分裂变异的、即癌变的细胞的细胞毒素剂。细胞的杀灭或分裂导致抗原性物质的释放，抗原性物质中的一些可以被巨噬细胞和抗原呈递细胞当作非自身抗原“观察”到。该聚合物的存在能够增强对于该抗原的免疫应答，这是因为进入到已发生变化的细胞环境中的树突细胞能吸收并处理释放的抗原。然后树突细胞一氟CD4+细胞激活，该激活能促进效应子细胞毒性T淋巴细胞应答的产生。上述应答中的某一些能直接治疗其他癌细胞并以此对于癌复发和任何其他的残留癌肿微小转移的生长提供基于保护性疫苗的应答。这些应答在具有大量巨噬细胞和抗原呈递细胞的癌症中达到最大化。尤其是在淋巴瘤和白血病中。由此可以实现药理学治疗、治疗性接种和保护性接种。
[0173] 具有抗癌药理活性的物质是本领域众所周知的，而且新的活性剂正在开发中，见 例 如 Cancer：Principles and practice of oncology.V.T.DeVita，S Hellman & S.A.Rosenburg，Lippincott Williams & Wilkins出版，第6版，2001。抗癌剂的例子包括但不限于阿柔比星、放线菌素D、安吖啶、氮胞苷、博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、氮烯唑氨、柔红霉素、羟基脲、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、tresulfan、长春碱、长春新碱、crisantaspase。
[0174] 如上所述，通常优选的是，上述聚合物、具有抗病原生物的药理活性的物质或具有抗癌药理活性的物质(两者都称为“药物”)以本发明的复合物形式施用。经抗原呈递细胞吸收后该复合物比单独使用上述药物更为有效，而且可以确定的是，上述药物和聚合物同时存在于相同的细胞中，这样，当上述药物杀灭生物并释放出抗原时，该聚合物可以在原处等待以产生能够加强Th1免疫应答的微环境。但是，该聚合物和药物也可以是在相同的药物制剂中、或在独立的制剂中联合使用。在后者中，一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但一般优选两种制剂基本上同时施用。
[0175] 一般优选地，该聚合物和抗原和/或免疫原以本发明的复合物的形式施用。但是，该聚合物和抗原和/或免疫原也可以在在相同的药物制剂中、或在独立的制剂中联合使用。在后者中，一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但一般优选两种制剂基本上同时施用。
[0176] 本发明的一种复合物包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和
[0177] (i)具有抗病原生物的药理活性的物质，或
[0178] (ii)具有抗癌药理活性的物质，或
[0179] (iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
[0180] 病原生物、具有对抗病原生物的药理活性的物质、具有抗癌药理活性的物质、抗原和免疫原可以是例如如上所述的物质。
[0181] 本发明的复合物或包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物可以是药物制剂的形式，其中所述制剂包含上述复合物和药学上适宜的载体。该制剂可以是或视为常规的药物制剂或疫苗，或两者都是，这取决于它的组分，特别是物质(i)、(ii)和(iii)的性质。如果试图用于诱导免疫应答，作为递送系统佐剂，也可以含有例如明矾。
[0182] 如果包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物与如上所述的物质(i)、(ii)和(iii)联用，而不是以所述物质的复合物的形式施用，那么该聚合物与物质(i)、(ii)和(iji)可以制备在相同的药物制剂中或制备成独立的制剂，在每种情况下都要加入药学上适宜的载体。如果在独立的制剂中，一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但优选两种制剂基本上同时施用。
[0183] 如上所述，本发明包括对于病原生物导致的疾病、病症和癌症的常规药物治疗和诱导对上述疾病、病症和癌症免疫应答。可以理解的是，在需要治疗的对象中诱导的免疫应答，优选是治疗性和/或预防性的免疫应答。治疗性免疫应答可以帮助治疗疾病或病症。该应答可以是短期的应答。预防性免疫应答提供长期的保护，例如可以防止疾病或病症复发、或继发性感染或再感染、或癌症微小转移的产生和发展。这些应答通常称作治疗性和预防性“接种”。
[0184] 包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物和具有对抗病原生物的药理活性的物质的用途已经在利什曼病的情况中举例说明，所述用途包括治疗由病原生物导致的疾病以及可同时诱导免疫应答。利什曼病中的感染可以是内脏型的，如黑热病，或者表皮型的。内脏利什曼病是一种传播性的原虫感染。许多年来，常规治疗包括将5价锑每天一次静脉或肌肉注射，共28天。但是，自1990年以来，在印度大规模锑治疗的失败导致引入了两性霉素B脱氧胆酸盐(AmB)作为有效的抗利什曼病药物。通过两性霉素B静脉给药，按照0.75-1mg/kg/天的剂量每天1次或更典型地为隔日给药，共注入15-20次，获得了97％长期治愈率。上述治疗的疗程很长，往往伴随着较高的医疗负担和大量的花费。结果，由于经常伴随不利事件的发生，常常导致患者不配合治疗或放弃治疗。
[0185] 脂质的两性霉素B复合物在基于组织的巨噬细胞中蓄积。它们对于对抗大量在人巨噬细胞中生长的酵母和真菌是非常有效的。据显示，两性霉素B的脂质制剂对内脏利什曼病具有较高水平的效力，当给药5-10天时，其治愈率大于90％。Sundar等已经表明，短程治疗，即用脂质体两性霉素B(AmBisome；Gilead Sciences)按照1.5mg/kg/天的剂量每天1次给药5天，可以治愈93％的患者。在另一个重复的实验中，个体输注总剂量5mg/kg的脂质体两性霉素B治愈了91％的患者。而它只有很少的不良反应。(Sundar，S et al.Treatment of Indian visceral leishmaniasis with singleor daily infusion of low dose liposomal amphotericin B：a randomised trial.Brit.Med.J.2001，323：
419-422.Sundar，S. 等 .Single-dose liposomal amphoteri cin B inthe treatment of visceral leishmaniasis in India：amulticenter study.Clin.Inf.Dis.2003：37；
800-804)。因此在印度，人们认为单剂量脂质体两性霉素B疗法对于治疗内脏利什曼病是安全和有效的。然而，即使是单剂量，该疗法也是很昂贵的，而且其在实践中的一个缺点是，脂质的两性霉素B在长期的贮存中是不稳定的，特别是在热带的高温下，而许多的内脏利什曼病都发生在热带。
419-422.Sundar，S. 等 .Single-dose liposomal amphoteri cin B inthe treatment of visceral leishmaniasis in India：amulticenter study.Clin.Inf.Dis.2003：37；
800-804)。因此在印度，人们认为单剂量脂质体两性霉素B疗法对于治疗内脏利什曼病是安全和有效的。然而，即使是单剂量，该疗法也是很昂贵的，而且其在实践中的一个缺点是，脂质的两性霉素B在长期的贮存中是不稳定的，特别是在热带的高温下，而许多的内脏利什曼病都发生在热带。
[0186] 在利什曼病中促进痊愈和清除寄生虫的免疫应答是由干扰素γ介导的Th-1应答控制的。虽然巨噬细胞可以有效地吸收利什曼原虫，但它们不会被生物的吸收激活；因此并没有释放出促炎趋化因子、促炎细胞因子和干扰素γ。与巨噬细胞相反，树突细胞可以吸收利什曼寄生虫并使其发育成熟，然后促进细胞免疫应答的发展。在动物模型中已经显示，如果可以激活受感染的巨噬细胞，那么接着就可以杀灭寄生虫。因此，两个不同的过程，即抗原加工和细胞成熟/激活必须联合用于有效的细胞疫苗应答中。如微生物所表明的那样，具有抗原性组分和树突细胞激活/成熟组分的物质可以促进树突细胞发生Th1介导的应答。而脂质的两性霉素B制剂不具有免疫调节或佐剂的活性。
[0187] 如实施例中具体所述制备根据本发明的两性霉素B和聚(甲基丙烯酸，钠盐)(PMAA-Na)的复合物并进行试验。该复合物显示出具有如下独特的性质：
[0188] a)在静脉注射给药后，它能把两性霉素B递送到有效器官-肝、脾和淋巴结。这些是动物和人被利什曼原虫感染的主要器官。
[0189] b)当静脉注射给药时，它能有效地用细胞内递送把两性霉素B递送至利什曼原虫感染的巨噬细胞。
[0190] c)两性霉素B-聚(甲基丙烯酸，钠盐)复合物在细胞内利什曼原虫无鞭毛体存活、繁殖和存留的胞内细胞器中蓄积，可以增强利什曼原虫无鞭毛体的细胞内杀灭。
[0191] d)内脏利什曼原虫动物模型的体内研究表明，临床级两性霉素B、市售的脂质体两性霉素B制剂AmBisome、及两性霉素B-聚(甲基丙烯酸，钠盐)制剂彼此之间的抗利什曼病活性并没有显著的不同。在内脏利什曼病的动物模型中，两性霉素B-聚(甲基丙烯酸，钠盐)和市售的脂质体两性霉素B制剂AmBisome都是同样有效的。
[0192] e)在组织巨噬细胞中，聚(甲基丙烯酸，钠盐)从两性霉素B中释放出来，然后它可以促进P-趋化因子和干扰素γ释放。这会产生局部的Th1辅助性应答。
[0193] f)趋化因子和细胞因子表达的局部诱导作用可以促进遗传免疫系统细胞的复原和激活到其位置。其包含未成熟的树突细胞和CD+4T淋巴细胞。上述淋巴细胞刺激巨噬细胞，产生更多的TNF-α、IL-10和IL-6。
[0194] g)遗传免疫系统的激活可以诱导树突细胞成熟并从组织转移到包含新释放抗原的局部淋巴结中。这会诱导并产生CD+4T细胞应答和效应子CD8+T细胞应答。
[0195] h)因此，在抗原呈递细胞内杀灭利什曼原虫和Th1促进佐剂直接邻近的利什曼原虫抗原的继发有效性，能够将受感染的巨噬细胞转变为细胞疫苗。
[0196] i)由于抗原呈递细胞近似封闭，两性霉素B的杀灭活性会导致利什曼原虫抗原的释放，并同时对适宜的和局部的Th1趋化因子/细胞因子环境有促进作用，因此细胞免疫应答得到显著的增强。
[0197] j)同时治愈疾病和产生治疗性效应子细胞免疫应答，即对于受感染个体中的生物，接种产生了长期保护性免疫。
[0198] k)因此可以同时完成疾病的治愈和治疗性接种，而不需要其他的佐剂或其他来源的利什曼原虫抗原。
[0199] l)单剂量治疗是有效的，而不像两性霉素B，后者一般需要15-20剂量。
[0200] m)与市售的脂质体两性霉素B制剂相比，该制剂更为稳定，特别是在热带环境温度较高的情况下。
[0201] n)当使用该制剂时，人静脉给药常见的游离两性霉素B毒性减少到了最小。
[0202] o)两性霉素B和PMAA-Na形成复合物，可以避免药物的化学衍生作用。因此，两性霉素B对于利什曼原虫sp.的效能并没有改变或减弱。特别是对于两性霉素B糖基部分的氨基，因为该基团在诱导药物的药理活性方面是很重要的。由于具有反应性，其糖基部分的氨基可以作为一个共轭点(Conover C.D.et al.Utility of poly(ethyleneglycol)conjugation to create prodrugs of amphotericin B.Bioconjugate Chem.2003；14：661-666)。
[0203] 如上所述，本发明提供一种药物制剂，包含本发明的复合物，或与药学上适宜的载体混合或结合的包括衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物。
[0204] 本发明的药物制剂的给药形式可以是适于静脉、动脉、进入淋巴循环、进入淋巴结、口服、腹膜、局部、向颊、直肠、皮肤表面、经皮、皮下、肌内、进入关节空腔、鼻内、玻璃体内、或肺、直接到器官、器官周围、注射到器官、或直接注入到器官给药。本发明包括将根据本发明聚合物的复合物以任何的途径给药。本发明的药物制剂可以是贮库型或储库型(depot or reservoir)制剂，或是一种气雾剂的形式。如上述或其他给药途径的适宜制剂是众所周知的，参见例如E.W.Martin著的Remington′s Pharmaceutical Sciences，也可参见Wang，Y.J.and Hanson，M.A.，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，Supp.42：2S，1988。
[0205] 本发明的复合物或包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物可以是“结合微粒”。这些微粒可以用本领域已知的乳化、匀化和喷雾干燥的方法制备出来。对于这些制剂的讨论，可参见例如Hanes J，Cleland JL & Langer R，AdancedDrug Delivery Reviews 28(1997)97-119。包含本发明的结合微粒复合物的药物组合物可以通过鼻或肺途径粘膜给药、吸入给药、非粘膜胃肠外途径给药，特别是皮下或肌内给药。
[0206] 在液体形式的本发明的药物制剂中，聚合物的浓度可以是例如0.1-2,500μg/ml，例如1至500μg/ml。其他制剂可以包含类似量的聚合物，例如以液体制剂为基础来计算。
[0207] 本发明涉及包括衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物，涉及包含上述聚合物和抗原或免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质的复合物。该聚合物可以是包含衍生自丙烯酸或其盐单元的同聚物或共聚物，例如包含衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸的同聚物或共聚物。一些包含衍生自丙烯酸的单元的聚合物是已知的。如上所述，该聚合物一般应具有窄分子量分布。其多分散性为例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地说，多分散性越小越好。因此，通常优选多分散性小于1.2。因此，通常优选多分散性小于1.2。
[0208] 聚合物通常具有一定的分子量，使得其在血液中时，在通过肾期间或之后聚合物基本都保留在循环血液中，没有或只有少量聚合物经过肾小球器官的过滤。肾过滤(也称为肾小球过滤)大分子是其一项功能，尤其是根据分子的大小和形状进行过滤，而部分也根据分子量过滤。一般地，对于任意特定的聚合物，存在阈分子量或窄范围的分子量，低于该分子量则发生肾过滤，高于该分子量则不发生或很少发生肾过滤。任意特定聚合物的阈分子量可以通过标准试验，例如用放射标记聚合物来确定。
[0209] 作为一般性的指导，该聚合物的分子量一般为例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。该聚合物的分子量一般为例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。该聚合物可具有上面给出的较大分子量和较小分子量的组合范围内的分子量。例如，该范围包括但不限于80,000-4,000、75,000-5,000、65,000-10,000、55,000-10,000、及45,000-10,000。
进一步的实例包括50,000-4,000的范围，例如40,000-25,000。一般优选分子量范围为
45,000-10,000。
进一步的实例包括50,000-4,000的范围，例如40,000-25,000。一般优选分子量范围为
45,000-10,000。
[0210] 一般通常需要该聚合物或复合物在循环血中保留比较适当的时间。如本领域技术人员所知道的那样，该适当的时间取决于很多因素，在复合物的情况下，包括结合到聚合物上的物质的性质。例如，聚合物或复合物可以在循环中保留几个小时，例如高达24小时，例如约4-6小时乃至约24小时。
[0211] 包括衍生自丙烯酸或其盐单元的聚合物可以是包含单元(I)的聚合物
[0212]
[0213] 其中R选自氢和C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰基、C2-C18烷氨基羰基、或任一在碳主链上由杂原子取代或连接有杂原子的C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基1
羰基、C2-C18烷氨基羰基；R 选自氢和C1-C6烷基；及其盐，例如其碱金属盐，例如其钠盐，或其铵盐。
羰基、C2-C18烷氨基羰基；R 选自氢和C1-C6烷基；及其盐，例如其碱金属盐，例如其钠盐，或其铵盐。
[0214] 优选R选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6芳烷基、C1-C6烷芳基、C1-C6烷基酰氨1
基和C1-C6烷基亚氨基。优选R是氢或者甲基。优选R 独立于R，是氢或者甲基。特别地，
1
R是氢并且R 是甲基。
基和C1-C6烷基亚氨基。优选R是氢或者甲基。优选R 独立于R，是氢或者甲基。特别地，
1
R是氢并且R 是甲基。
[0215] 包括衍生自丙烯酸或其盐单元的嵌段共聚物可以是包含单元(II)的嵌段共聚物[0216]
[0217] 其中，R、R1和R2如上述定义；R3选自C1-C18亚烷基、C2-C18亚烯基、C7-C18亚芳烷基、C7-C18亚烷芳基、C6-C18亚芳基；L是连接嵌段的二价连接体；m和n分别是1或大于1的整数。
[0218] 优选R选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6芳烷基、C1-C6烷芳基、C2-C8烷氧基羰基和C2-C8烷氨基羰基。最优选R选自氢和甲基。
[0219] 优选R1选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或它们的异构体。最优选R1选自氢和甲基。
[0220] 优选R2选自键或包含至少一个碳原子或至少一个杂原子。
[0221] 当R2不是键时，R2通过二价基团连接到CR1上，优选包含由一个或多个杂原子取代2
的羰基、C1-C18亚烷基和/或C6-C18亚芳基的基团。优选R 包含选自C1-C6亚烷基、C6-C12亚
2
芳基、C1-C12氧化烯基及羰基-C1-C6亚烷基的基团。当R 包含亚烷基时，它可以是支化的、线型的或者环状的，被一个或多个烷基取代或者没有取代，优选其为亚甲基、1，2-亚乙基、
2
1，3-亚丙基、亚己基或亚辛基。当R 包含亚芳基时，优选其为亚苄基、甲代亚苯基或亚二甲苯基。
的羰基、C1-C18亚烷基和/或C6-C18亚芳基的基团。优选R 包含选自C1-C6亚烷基、C6-C12亚
2
芳基、C1-C12氧化烯基及羰基-C1-C6亚烷基的基团。当R 包含亚烷基时，它可以是支化的、线型的或者环状的，被一个或多个烷基取代或者没有取代，优选其为亚甲基、1，2-亚乙基、
2
1，3-亚丙基、亚己基或亚辛基。当R 包含亚芳基时，优选其为亚苄基、甲代亚苯基或亚二甲苯基。
[0222] 优选的是，基团R3可以相同或不同，选自C1-C8亚烷基，优选1，2-亚烷基和C6-C123
亚芳基，最优选是亚甲基、亚乙基、1，2-亚丙基和1，3-亚丙基。优选所有的R 都是相同的，最优选都是1，2-亚乙基、1，2-亚丙基。
亚芳基，最优选是亚甲基、亚乙基、1，2-亚丙基和1，3-亚丙基。优选所有的R 都是相同的，最优选都是1，2-亚乙基、1，2-亚丙基。
[0223] 优选L包含由一个或多个杂原子取代或阻断的C1-C18亚烷基或C6-C18亚芳基。优选L包含的基团选自C1-C6亚烷基、C6-C12亚芳基、C1-C12氧化烯基及C1-C6酰基。当L包含包含亚烷基时，它可以是支化的、线型的或者环状的，或者被一个或多个烷基取代或未被取代，优选其为亚甲基、1，2-亚乙基、1，2-亚丙基、亚叔丁基、亚仲丁基、亚己基或亚辛基。当a aL包含亚芳基时，优选其为亚苄基、甲代亚苯基或亚二甲苯基。最优选L包含-COR，其中R选自C1-C6亚烷基或C6-C12亚芳基，优选为亚甲基、1，2-亚乙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丙基、亚叔丁基及亚仲丁基。
[0224] 该聚合物可以是含有单元(I)的均聚物，或者可以是含有其它多聚体、低聚体或单体单元的共聚物或嵌段共聚物，例如包含如上述单元(II)的嵌段共聚物。例如，在均聚物、共聚物或嵌段共聚物中的其它多聚体单元可以包含丙烯酸聚合物、烯化聚合物、氨基甲酸乙酯聚合物、酰氨聚合物、多肽、多糖和酯聚合物。优选当该聚合物是杂聚物时，其它的多聚体组分包括聚乙二醇、聚乌头酸或聚酯。
[0225] 例如，具有单元(I)或(II)的聚合物还可以包含例如在本发明的聚合物中能够对前体聚合物具有增溶作用和/或能够控制游离丙烯酸数目(并由此形成盐基团)的单元。例如，包含单元(I)的该聚合物可以具有结构(III)或(IV)
[0226]
[0227] 其中，R、R1、R2和R3、L、m和n如上述定义，R4、R5和R6独立地分别选自与R、R1、R2相同的基团；Q代表一个在制备聚合物的条件下不分裂或基本不分裂的基团；p代表1或大于1的整数。如果需要，Q可以是靶向基团，即将聚合物靶向输送到某一类型的细胞如巨噬细胞，或输送到某一器官例如肝。
[0228] 例如，Q可以选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C7-C12芳烷基、C7-C12烷芳基、C1-C12烷氧基、C1-C12羟烷基、C1-C12烷氨基、C1-C12烷酰基、C1-C12氨烷基或被胺、羟基或硫醇基取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、C7-C12芳烷基、C7-C12烷芳基、C1-C12烷氧基、C1-C12羟烷基、C1-C12烷氨基、C1-C12烷酰基中的任一种。优选Q包含胺基，例如C1-C12羟烷氨基、例如2-羟丙基氨基或羟乙基氨基部分。
[0229] 基团Q可以是聚合物在液体溶液中的增溶基团。例如该聚合物可以是水溶性的聚丙烯酰胺均聚或共聚物，优选是聚甲基丙烯酰胺或聚乙基丙烯酰胺均聚或共聚物。此外，当基团Q在制备上述聚合物的条件下不分裂(或基团Q大部分不分裂)时，基团Q的存在能够控制聚合物中游离丙烯酸数目(并由此形成盐基团)。例如在前体聚合物中含Q单元相对于含离去基团X的单元数目的比例是可以选择的。含Q单元相对于含离去基团X单元的数目的相对比例将会决定聚合物产物中丙烯酸或其盐基团的数目。如下文所示，该聚合物的多阴离子性质会影响它的生物活性。因此，处理聚合物离子性质的能力对于制备具有所需性质的聚合物是非常有用的。
[0230] 根据本发明使用的聚合物，例如本发明所形成的复合物，可以是，例如聚甲基丙烯酸，例如该丙烯酸的多分散性为例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地说，多分散性越小越好。因此，通常优选多分散性小于1.2。聚合物的分子量一般如上文定义部分所述。聚甲基丙烯酸及其盐和它们的产品的例子将会在下文的实施例中给出。这些聚甲基丙烯酸及其盐在本发明的实践中是特别有效的。
[0231] 我们已经发现，β-趋化因子和干扰素-γ从原代组织巨噬细胞即抗原呈递细胞中释放，其中该释放是由如本文所描述制备的聚丙烯酸钠盐(PMAA-Na)复合物诱导的，并未在市售的具有类似窄分子量分布的丙烯酸钠盐均聚物中观察到这种释放。所观察到的趋化因子和细胞因子从组织巨噬细胞中释放的不同，表明如本文所描述制备的PMAA-Na与市售的PMAA-Na的结构不同。由于本文制备的PMAA-Na的Mn与市售的一种样品相同(即Mn～22kg/mol)，因此免疫效果不太可能是取决于分子量的影响。PMAA-Na是一种聚阴离子。有人提出，聚阴离子的生物活性可能取决于其结构特征，例如分子量、电荷密度及立构规整度(Ottenbrite，R.et al.Biologicalactivity of poly(carboxylic acid)polymers.，in Polymeric Drugs，L.Donaruma and O.Vogl，Editors.1978，Academic Press：New York.p.263-304.)。不受上下文中涉及根据本发明使用的聚合物的生物活性的假定所限制，我们认为，生物学数据表明，可能是能够给出结构细节的制备方法导致了PMAA-Na具有所述独特的生物活性。
[0232] 本文实施例中的聚合物是聚甲基丙烯酸，钠盐，其制备方法包括用氢氧化钠水解聚(N-甲丙烯酰基琥珀酰亚胺)(PMOSu)。该方法和类似的方法特别是涉及前体聚合物水解的方法可以用于制备根据本发明的所述聚合物和其它的聚合物。
[0233] 例如，根据本发明的聚合物可以通过用包括利用碱性试剂水解前体聚合物的方法制备，其中碱性试剂例如是碱金属或碱土金属的碱，例如是钠、钾、铯、钙、镁或锂的碱。所述碱可以是例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，如氢氧化钠。所述前体聚合物可以是PMOSu，或者其它适宜的前体聚合物，例如如下所述的前体聚合物。水解在适当的溶剂中进行。由于前体聚合物一般是疏水性分子，因此该反应通常在有机溶剂中进行，例如DMF、DMSO、DMPU或二甲替酰胺化合物(dimethylactamide)。该水解作用可以在温和条件下进行，例如在环境气温与气压和微热条件下，例如40-60℃，例如2-16小时，或者也可以在较强烈的条件下进行。
[0234] 用所述方法制备的聚合物所具有的生物学活性类似于如本文所制备的PMAA-Na所显示出来的部分或全部生物学性质。
[0235] 如在WO01/18080和在本文的实施例A4中所述，利用原子转移自由基聚合法特别是铜介导法均相聚合甲丙烯酰氧基琥珀酰亚胺来生产如本文所描述制备PMAA-Na中作为前体聚合物使用的POMSu，所述的制备方法对于制备根据本发明的前体聚合物和其它前体聚合物是非常有用的，但是在本发明中，不论是用这些方法制备的前体聚合物还是由这些前体聚合物制备的聚合物，都并不仅限于这些方法。
[0236] 根据本发明的包含衍生自丙烯酸或其盐单元的聚合物可以通过水解相应的前体聚合物而制备，该前体聚合物具有在衍生自丙烯酸的单元中替换丙烯酸羧酸的氢原子的基团，该基团通过水解作用可以分裂从而产生酸，例如以温和的水解作用分裂。可以通过水解作用分裂的基团例如是适当的离去基团，例如吸电子基团，如酰化基团，优选是羧酸盐活化的，一般选自N-琥珀酰亚胺基、五氯苯基、五氟苯基、对硝基苯基、二硝基苯基、N-苯二酰亚氨基、N-冰片基、氰甲基、吡啶基、三氯三嗪、5-氯喹啉基及咪唑基，优选N-琥珀酰亚胺基或咪唑基，特别优选N-琥珀酰亚胺基。该水解作用可以用碱性试剂完成，例如如上所述使用氢氧化钠，并且水解可以在温和条件下进行，例如在环境气温与气压和微热条件下，例如40-60℃，例如2-16小时。
[0237] 如上述所述包含单元(I)或(II)的聚合物可以由WO01/18080所述的聚合物(“前体聚合物”)或类似的聚合物来制备，或者由WO03/059973所述的聚合物或类似的聚合物来制备。这些前体聚合物包括含有单元(Ia)的聚合物和含有单元(IIa)的聚合物
[0238]
[0239] 其中R、R1、R2和R3、L、m和n如上述定义，X代表离去基团，例如吸电子基团，如酰化基团，优选是羧酸盐活化的，一般选自N-琥珀酰亚胺基、五氯苯基、五氟苯基、对硝基苯基、二硝基苯基、N-苯二酰亚氨基、N-冰片基、氰甲基、吡啶基、三氯三嗪、5-氯喹啉基及咪唑基，优选X代表N-琥珀酰亚胺基或咪唑基。
[0240] 可以由相应的前体聚合物(IIIa)或(IVa)来制备包含含有基团Q的单元的聚合物，即含有单元(III)的聚合物或含有单元(IV)的聚合物：
[0241]
[0242] 其中R、R1、R2和R3、R4、R5和R6、L、Q、X、m、n和p如上述定义。m，n和p各自代表最高为500的整数，优选m、n和p的总和不大于约500。
[0243] 可以由任意适当的方法制备前体聚合物，尤其是包含离去基团的前体聚合物，其中该离去基团适于在水解中断裂而得到本发明聚合物，，特别是采用能够制备窄分子量分布的聚合物的任何方法，优选所述窄分子量分布的聚合物的多分散性为例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地说，多分散性越小越好。因此，通常优选多分散性小于1.2。该聚合物通常具有如上文定义部分所述的分子量。
[0244] 具有所需多分散性的前体聚合物可以由原子转移自由基聚合法得到，例如铜介导的原子转移自由基聚合法，或使用包括自由基聚合的其他方法。这些方法在WO01/18080和WO03/059973中有描述。实施例在下文给出。本发明也提供一种根据这些方法可得到的包含衍生自丙烯酸及其盐单元的聚合物。但是，本发明并不仅限于这些方法制备的聚合物。任何适于生产包含含有丙烯酸原子单元的聚合物的方法都是可以使用的，特别是生产具有上述多分散性的聚合物的方法。
[0245] 当聚合作用是通过原子转移自由基聚合法完成的，那么需要使用适宜的自由基引发剂。这些引发剂通常包括烷基卤，优选烷基溴。晶体地，该引发剂是2-溴-2-甲基-(2-羟乙基)丙酸酯。该聚合作用也可以在包含Cu(I)复合物的聚合介质存在的条件下实施。所述复合物通常是由螯合配位体复合的Cu(I)Br复合物。典型的介质是Cu(I)Br(Bipy)2、Cu(I)Br(Bipy)、Cu(I)Br(五甲基二亚乙基)、Cu(I)Br[甲基]6三(2-氨乙基)胺]及Cu(I)Br(N，N，N′，N″，N -五甲基二亚乙基三胺)。
[0246] 上述反应应当是在适宜的溶剂中进行的。所述溶剂一般是非质子溶剂，例如四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和环丁砜及它们的混合物。也可以选择使用水。特别优选的溶剂是二甲基亚砜和二甲基甲酰胺及它们的混合物。
[0247] 关于本发明复合物的生物学性质，我们发现，制备本发明的复合物的方法不同会影响复合物的性质。显然，在抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质存在的情况下，特别是在温和条件下，通过水解聚合物前体形成聚合物从而制备本发明的复合物，比用已经制备好的聚合物和抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质形成复合物更有利。
[0248] 在抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质存在的情况下水解聚合物前体一般应当在适宜条件下进行，以使得抗原、免疫原或所述物质基本不受有害影响，例如水解应当在温和条件下进行。例如，该条件能够使抗原、免疫原或所述物质基本不发生分解、降解或以其它方式导致相关活性丧失。
[0249] 例如，在抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质存在的情况下水解聚合物前体可以使用碱性试剂进行，例如碱金属或碱土金属的碱，例如是钠、钾、铯、钙、镁或锂的碱。所述碱可以是例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，如氢氧化钠。水解作用在适当的溶剂中进行，例如有机溶剂，如DMF，、DMSO、DMPU或二甲替酰胺化合物。水解作用可以在温和条件下进行，例如在环境气温与气压和微热条件下，例如40-60℃。该反应可以进行，例如2-16小时。
[0250] 通过制备本发明的聚合物来制得复合物的方法，包括在抗原和免疫原或具有对抗病原生物或癌的药理活性的物质存在的情况下水解聚合物前体；例如，如上所述，作为本发明的一部分，用这种方法获得该复合物。
[0251] 我们认为，在本发明的复合物中，聚合物与具有抗病原生物或抗原或癌的药理活性的物质的结合主要是非共价的(即通过离子或范德华力结合)，但是药理活性物质或抗原的一些分子也可以共价结合到所述聚合物上。共价结合的程度取决于药理活性物质或抗原的性质和该聚合物的性质。
[0252] 如上所述，术语“复合物”表示聚合物和具有抗病原生物或抗原或癌的药理活性的物质之间的结合主要是非共价的，但也可以包含一些共价键。
[0253] 本发明的复合物是具有酸性基团的聚电解质。根据复合物的环境，其去质子化的程度也是不同的。本发明的复合物可以是盐的形式。盐可以有例如一价、二价、三价或四价相反离子。一价相反离子可以是例如碱金属离子，例如钠或钾离子，或铵离子。二价相反离子可以是例如碱土金属离子，例如钙或镁离子。其他相反离子包括过渡金属的离子，例如铁、锡等。可以存在一种以上的相反离子，并与所述聚合物相结合。此外，形成盐的基团数目和性质是可以控制的，例如，通过使用适当的聚合物前体，例如，如上所述。应当认识到，由于聚合物具有酸性基团并因此形成负电荷，那么与聚合物形成复合物的物质或试剂一般应当是可以保持正电荷的，以便可通过包括源于相对电荷的静电力的非共价作用直接形成复合物。例如，用于形成复合物的物质或试剂可以具有碱性、阳离子或两性离子的性质或适合具有上述性质。作为替代方案，可以改变聚合物的组成，特别是适当选择基团Q，使得所需要的物质或试剂可以例如与基团Q结合形成复合物。
[0254] 在本发明的一个实施方案中，用于本发明的复合物中的聚合物或与抗原或免疫原或具有抗病原生物或抗原或癌的药理活性的物质结合的聚合物是聚甲基丙烯酸(PMAA)或其盐，例如，钠盐，其多分散性小于1.4，优选小于1.2。该聚合物的分子量一般如上文定义部分所述。如本文实施例所述或基本如本文实施例所述，利用氢氧化钠水解前体聚合物例如含N-琥珀酰亚胺离去基团的前体聚合物来制备该聚合物是比较有利的。在制备聚合物的同时，用抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质在原位制备复合物也是比较有利的。
[0255] 本发明具体涉及一种复合物，该复合物包含具有抗病原生物例如利什曼原虫的物质，例如两性霉素B；涉及一种包含上述复合物的药物制剂，例如如上所述的药物制剂；还涉及所述复合物在治疗由病原体导致的疾病或病症和/或诱导对上述病原体产生免疫应答中的各种用途。该复合物的聚合物组分是窄分子量分布的聚合物，包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，例如如上所述的聚合物，例如上述的聚甲基丙烯酸聚合物或其盐。
[0256] 本发明具体提供一种复合物，包含两性霉素B和上述的聚甲基丙烯酸聚合物或其盐，尤其是如实施例中所描述制备的PMAA聚合物或其盐；还提供一种包含上述复合物的药物制剂，例如上述的药物制剂。本发明还提供该复合物在治疗利什曼病和/或诱导对导致利什曼病的病原体产生免疫应答中的各种用途，包括如上所述完成对抗利什曼病的治疗和/或预防接种。
[0257] 在另一种作为替代方案的治疗利什曼病和/或诱导对导致利什曼病的病原体产生免疫应答的方法中，联合使用独立制剂形式的本发明的聚合物和具有抗诸如利什曼原虫的病原生物的药理活性的物质例如两性霉素B，对利什曼病进行治疗性和/或预防性接种，如上所述。一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但一般优选两种制剂基本上同时施用。
[0258] 下面用非限制性的实施例对本发明进行说明。
[0259] 实施例：
[0260] 实施例A1：化学合成：甲基丙烯酸钠盐均聚物的制备
[0261] 通过用氢氧化钠水解聚(N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺)(PMOSu)1来制备聚(甲基丙烯酸，钠盐)(PMAA-Na)2(方案1)。
[0262] 首 先 用 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 法 (ATRP)(Brocchini S.J.和 Godwin A.，″Uniformmolecular weight precursors″，International Patent Publication Numbers WO01/18080A1 & EP99307152.1(March 15，2001))由甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺3(方案2)的聚合作用制备出PMOSu1。
[0263]
[0264] 方案1：由PMOSu1制备PMAA-Na2
[0265] 实施例2：合成PMOSu1
[0266]
[0267] 方案2.由甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺3制备PMOSu1
[0268] 甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺3的合成。保持温度低于5℃，将甲基丙烯酰氯(6.0g，57mmol)的二氯甲烷(12ml)溶液滴加到二氯甲烷(12ml)溶液中的N-羟基琥珀酰亚胺(6.6g，57mmol)中，同时加入三乙胺(5.8g，57mmol)的二氯甲烷(12ml)溶液。完成滴加后，搅拌反应混合物1小时，然后用碳酸氢钠(0.1M)和水洗涤(3次)。然后分离有机相并用硫酸镁干燥。除去溶剂获得呈白色固体状的产物，用乙酸乙酯：己烷再结晶。产品质量为8g，m.p.＝102℃。
[0269] (1H，500MHz，DMSO-d6)：2.00(3H，s，CH3)，2.84(4H，s，(CH2)2)，6.09(1H，s，＝CH2)，6.34(1H，s，＝CH2)。
[0270] 均相聚合：本反应如方案2所示。在典型的铜介导的聚合反应中，DMSO为溶剂，在单体3中其优选重量百分比为56％，将铜(I)溴(31.3mg，0.2mmol)、2-2’-二吡啶(Bpy)(68.3mg，0.4mmol)和单体3(2.00g，10.9mmol)加入到圆底烧瓶中，然后用隔膜密封。然后向该烧瓶中注入DMSO(1.3g)。微热所得到褐色混合物直到形成溶液，然后用氩气净化大约5分钟。将氩气净化过的DMSO(0.2g)中2-溴-2-甲基-(2-羟乙基)propaneate4(46.1ml，
0.2mmol)溶液注入到上述混合物中，烧瓶在油浴中加热到100℃。在几分钟后反应混合物变成粘稠状，加热10-15分钟后移开反应混合物并迅速冷却。加入7-8ml DMSO溶解粗产物混合物以分离出聚合产物，然后缓慢加入到丙酮(100ml)的搅拌溶液中，沉淀出呈白色固体状的PMOSu1。在聚合物1的沉淀过程中，由于铜类和配体的溶解，丙酮溶液变成了绿色。原子吸收分析表明，在DMF中浓度为28.0mg/ml的聚合物1，其铜的含量为0.153ppm。
氧化铝色谱法常用于铜介导的聚合作用以从聚合物产品中除去铜，聚合物1从DMSO反应溶液中沉淀到丙酮中可以提供对氧化铝色谱法的可行替代方案。聚合物1分离收率是1.78g(89％)。平均分子量为22,700g/mol，多分散性指数为1.20。PMOSu1的表观分子量和分子量分布可以用与Gibson133反射指数检测器配对的Waters Styragel HR4和HR3(7.3×300mm)柱测定，聚(甲基丙烯酸甲酯)PMAA作为校准标准品，含0.1％LiCl的DMF为洗脱液。
0.2mmol)溶液注入到上述混合物中，烧瓶在油浴中加热到100℃。在几分钟后反应混合物变成粘稠状，加热10-15分钟后移开反应混合物并迅速冷却。加入7-8ml DMSO溶解粗产物混合物以分离出聚合产物，然后缓慢加入到丙酮(100ml)的搅拌溶液中，沉淀出呈白色固体状的PMOSu1。在聚合物1的沉淀过程中，由于铜类和配体的溶解，丙酮溶液变成了绿色。原子吸收分析表明，在DMF中浓度为28.0mg/ml的聚合物1，其铜的含量为0.153ppm。
氧化铝色谱法常用于铜介导的聚合作用以从聚合物产品中除去铜，聚合物1从DMSO反应溶液中沉淀到丙酮中可以提供对氧化铝色谱法的可行替代方案。聚合物1分离收率是1.78g(89％)。平均分子量为22,700g/mol，多分散性指数为1.20。PMOSu1的表观分子量和分子量分布可以用与Gibson133反射指数检测器配对的Waters Styragel HR4和HR3(7.3×300mm)柱测定，聚(甲基丙烯酸甲酯)PMAA作为校准标准品，含0.1％LiCl的DMF为洗脱液。
[0271] 聚合作用中使用不同比率的单体3和引发剂4可以获得分子量不同并且窄分子量分布(MWD)的PMOSu1。这些实验列于表1，其反应范围是2-6g的甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺3。在DMSO中的均相聚合条件都是几分钟左右即可得到得到聚合物1(例如表1中的实验6是在2分钟后完成，得到了显著收率的窄MWD的聚合物1)。
[0272] 聚合作用在80-130℃的范围内进行以保持在甲基丙烯酰琥珀酰亚胺与溶剂重量比为33-91％时溶液的均匀性。优选溶剂为DMSO，但用DMF也能获得类似的结果。单体3与极性溶剂(DMSO或DMF)的重量比对于聚合作用的结果是关键性的。在DMSO中，单体3的重量比小于56％(如50和41％)将会导致聚合物的收率较低(分别是52％和40％)。在DMSO中，如果单体3的重量比大于60％，聚合作用的溶液会发生固化。同样在DMF中，单体的重量浓度对于聚合作用的结果也是关键性的。但是，DMF的最大收率要小于DMF。当单体3：DMF的重量比为61％时，分离出的聚合物1的收率为50％。当反应在单体3的重量比为
33％时进行，将分离不出聚合物。在单体重量浓度较高(75％以上)时，反应混合物发生固化。
33％时进行，将分离不出聚合物。在单体重量浓度较高(75％以上)时，反应混合物发生固化。
[0273] 表1
[0274]
[0275] (a)开始时单体和引发剂浓度的比例
[0276] (b)用DMSO稀释使反应在2.5分钟后停止并迅速冷却。
[0277] (B)沉淀聚合：单体3的铜介导的聚合作用在例如THF、乙酸乙酯、甲苯和丙酮中进行也能得到窄MWD的聚合物1。根据聚合物分子量的不同，其收率为10-95％。高达25,000g/mol的较高分子量聚合物1可以在例如THF和碳酸亚乙酯的混和溶剂系统中获得。当分子量大于10,000g/mol时，其收率有时会小于在DMSO或DMF中进行的聚合作用。在THF中在70℃下利用0.5g单体1实施典型的铜介导聚合作用，反应超过16小时，其结果列于表2。
在THF反应中的铜螯合配位体是N，N，N′，N″，N -五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)。其它的沉淀反应列于表3，其用2-溴-2-甲基-丙酸(BMA)作为引发剂。
在THF反应中的铜螯合配位体是N，N，N′，N″，N -五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)。其它的沉淀反应列于表3，其用2-溴-2-甲基-丙酸(BMA)作为引发剂。
[0278] 表2
[0279]
[0280] 表3
[0281][MOSu]o∶[BMA]o. 溶剂 收率 Mn Mw/Mn
[CuBr]o∶[配位体]o (wt％) (％)
50∶1∶1∶2(bipy) EC(45) 39 34,600 1.43
a
100∶1∶1∶1.2(PMDETA)THF/EC 5∶1(74) 67 25,300 1.39
100∶1∶1∶1(bipy) THF/EC 6∶1(78) 75a 19,500 1.29
100∶1∶1∶1(bipy) THF/EC 20∶1(84) 82a 12,200 1.12
50∶1∶0.5∶1(bipy) THF/EC 20∶1(84) 74a 12,000 1.09
100∶1∶1∶1(bpy) THF/EC 27∶1(87.5)b 22 10,000 1.08
b
50∶1∶0.5∶1(bpy) THF/EC 27∶1(87.5) 24 12,500 1.10
a
[CuBr]o∶[配位体]o (wt％) (％)
50∶1∶1∶2(bipy) EC(45) 39 34,600 1.43
a
100∶1∶1∶1.2(PMDETA)THF/EC 5∶1(74) 67 25,300 1.39
100∶1∶1∶1(bipy) THF/EC 6∶1(78) 75a 19,500 1.29
100∶1∶1∶1(bipy) THF/EC 20∶1(84) 82a 12,200 1.12
50∶1∶0.5∶1(bipy) THF/EC 20∶1(84) 74a 12,000 1.09
100∶1∶1∶1(bpy) THF/EC 27∶1(87.5)b 22 10,000 1.08
b
50∶1∶0.5∶1(bpy) THF/EC 27∶1(87.5) 24 12,500 1.10
a
[0282] 直接过滤和洗涤产品b
[0283] 刚蒸馏过的THF
[0284] 实施例A3：水解PMOSu1得到PMAA-Na2(方案1)
[0285] 将PMOSu1(1.00g，Mn＝24,800g/mol，Mw/Mn＝1.20，DMF洗脱液，PMMA标准品)溶解在DMF(5.0ml)中，然后在搅拌下滴加2M氢氧化钠水溶液(6.0ml)使得聚合物部分沉淀。反应器很快变热并随即溶液变成均匀。然后将溶液在70℃加热24小时，之后再加入水(约
50ml)。然后将该稀溶液用再生纤维素膜(MWCO2000，SpectraPor)在水中透析。冷冻干燥该透析溶液，得到白色固体产物PMAA-Na2(0.3g)。GPC(PBS洗脱液，PMAA-Na标准品)Mn＝-1 -1 -1
22,000g/mol，Mw/Mn＝1.28；FT-IR(ATR)1675cm ，1547cm ，1194cm 。
50ml)。然后将该稀溶液用再生纤维素膜(MWCO2000，SpectraPor)在水中透析。冷冻干燥该透析溶液，得到白色固体产物PMAA-Na2(0.3g)。GPC(PBS洗脱液，PMAA-Na标准品)Mn＝-1 -1 -1
22,000g/mol，Mw/Mn＝1.28；FT-IR(ATR)1675cm ，1547cm ，1194cm 。
[0286] PMAA-Na2的分子量值可用于确定聚合度(DP)，以知道在衍生自1的任意聚合物中重复单元的数目。在本实施例中，PMAA-Na2的重复单元的分子量是108，样品的DP是约203(即，22,000g/mol除于108g/mol)。这就是说，PMOSu1的DP是203，而且由于PMOSu1重复单元的分子量是183g/mol，该样品中PMOSu1的绝对数均分子量就是37,149g/mol(即，
183g/mol乘于203)。窄MWD的PMOSu1的DP为203，可以用类似的方式将其用于确定衍生自1的聚合物的绝对分子量。
183g/mol乘于203)。窄MWD的PMOSu1的DP为203，可以用类似的方式将其用于确定衍生自1的聚合物的绝对分子量。
[0287] 实施例A4：水解PMOSu1
[0288] 将PMOSu1(200mg，Mn＝32,200g/mol，Mw/Mn＝1.24，DMF洗脱液，PMMA标准品)溶解于DMSO(2ml)并搅拌。再向其中滴加1M氢氧化钠水溶液(2.2ml)。通常发生部分沉淀。在加入氢氧化钠后，立即加入水(23ml)，并将该混合物在室温下搅拌1小时。然后将得到的反应溶液稀释到44ml并用Visking透析膜(MWCO 7000，MedicellInternational)在1L水中透析24小时。透析过程中，需要换6次水。用0.2μm的过滤器过滤该透析溶液，然后冷冻干燥，获得0.2g PMAA-Na产物2.GPC(三级检波，NaNO30.2M/10％CH3CN)Mn＝35,700g/mol和Mw/Mn＝1.18)。
1
1
[0290] 实施例A5：用AIBN进行自由基聚合作用合成PMOSu1，然后水解得到PMAA-Na2[0291] 将经氩气净化的甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(3g)和AIBN(0.135g)的丙酮溶液(30.0ml)在封闭容器中50℃下加热24小时。过滤分离所形成的白色沉淀，溶解于DMSO(6.0ml)并在快速搅拌的丙酮中再沉淀。过滤分离并真空干燥后，DMSO(4.8ml)中的一些干燥PMOSu1(0.48g)与1N氢氧化钠(5.2ml)和水(56ml)混合。然后将得到的溶液在室温下搅拌1小时，然后加入105ml新鲜水稀释，再用Visking透析膜(MWCO 7000，Medicell International)在5L水中透析24小时。5L水需要换6次。用0.2μm的过滤器过滤该透析溶液，然后冷冻干燥，获得呈固体产物状的PMAA-Na2(0.56g)；Mw26,100Da，Mn15,200g/mol，Mw/Mn1.7(SEC 0.2M NaNO3水溶液/10％CH3CN，PMAA-Na标准品)
[0292] 实施例A6：用4，4′-偶二(氰基戊酸)进行自由基聚合作用合成PMOSu1，然后水解得到PMAA-Na2
[0293] 在压力管中加入甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(0.5-1.0g)、4，4′-偶二(氰基戊酸)(15-30wt％)和溶剂(例如丙酮、新蒸馏过的THF、或者包括甲苯和碳酸亚乙酯在内的上述溶剂的混和物)，然后密封所得到的溶液，然后用氩气净化15分钟。然后将密封的烧瓶加热到70-120℃ 0.25-2.5小时。实施例反应的情况见表4。过滤并真空干燥，分离呈白色沉淀状的PMOSu1，再用PMMA标准品在DMF中进行GPC。
[0294] 表4
[0295]引发剂 溶剂 时间 T/℃ Mn Mw/Mn 收率
-1
wt％ (wt％单体3) (h) (g·mol ) (％)
15 丙酮(85) 3.5 70 14,100 1.65 80
15 THF(86) 0.5 70 15,700 1.54 48
30 THF(81.6) 2.5 70 14,500 1.51 74
30 THF(81.6) 2 100 9,200 1.40 46.5
30 甲苯(81.2) 1 100 11,500 1.70 75
-1
wt％ (wt％单体3) (h) (g·mol ) (％)
15 丙酮(85) 3.5 70 14,100 1.65 80
15 THF(86) 0.5 70 15,700 1.54 48
30 THF(81.6) 2.5 70 14,500 1.51 74
30 THF(81.6) 2 100 9,200 1.40 46.5
30 甲苯(81.2) 1 100 11,500 1.70 75
[0296] 实施例B：合成嵌段共聚物PEG-PMOSu6和它的水解作用，获得嵌段共聚物PEG-PMAA-Na7
[0297] 方案3的聚合作用和水解作用及其实例在现有技术中已有记载(Brocchini S.J和Godwin A，″Block Copolymers.″WO 03/059973和Pedone et al.An information richbiomedical polymer library，J.Mat.Chem.，2003，13，2825-2837)。
[0298]
[0299] 方案3：合成嵌段共聚物PEG-PMOSu6和嵌段共聚物PEG-PMAA-Na7
[0300] (A)制备大分子引发剂5
[0301] 用Jankova等人的方法(Macromolecules(1998)，31，538-541)制备PEG大分子引-3发剂5。将含三乙胺(12.5×10 mol，1.265g，1.75ml)的15ml干燥CH2Cl2加入到装有冷凝管、滴液漏斗、进气口和磁力搅拌器的250ml三颈圆底烧瓶中。在冷却到0℃后，加入含2，-3
2-溴代异丁酰溴化物(12.5×10 mol，2,874g，1.55ml)的10ml CH2Cl2，再用氩气净化混合-3
物。然后将含一甲氧基化封端的PEG(Mn＝2,000g/mol)(5×10 mol，10g)的50ml CH2Cl2在氩气存在条件下在1小时内滴加入上述混合物。PEG事先已经在甲苯中共沸蒸馏干燥化，真空除去残留的甲苯。将反应混合物的温度升高到室温，反应持续18小时。过滤该溶液，将一半的溶剂真空蒸发掉，产品在冷醚中沉淀出来。沉淀物在无水乙醇中再结晶(在冰箱中贮存过夜)。过滤大分子引发剂5，用冷醚洗涤并真空干燥。在80ml水中溶解4g粗产物进行纯化。将溶液的pH升高到8以水解掉多余的i-BuBr。然后用CH2Cl2(70ml)萃取该溶液。得到稳定的乳剂，而实现完全的相分离需要几个小时。真空除去溶剂。将产物溶解于热EtOH中并置于冰箱中结晶。然后过滤，用醚洗涤并真空干燥。纯净的产品5是白色的。
用H MNR光谱计算置换的程度。该方法也可以用于制备衍生自PEG 5000和PEG 10000的PEG大分子引发剂5。
2-溴代异丁酰溴化物(12.5×10 mol，2,874g，1.55ml)的10ml CH2Cl2，再用氩气净化混合-3
物。然后将含一甲氧基化封端的PEG(Mn＝2,000g/mol)(5×10 mol，10g)的50ml CH2Cl2在氩气存在条件下在1小时内滴加入上述混合物。PEG事先已经在甲苯中共沸蒸馏干燥化，真空除去残留的甲苯。将反应混合物的温度升高到室温，反应持续18小时。过滤该溶液，将一半的溶剂真空蒸发掉，产品在冷醚中沉淀出来。沉淀物在无水乙醇中再结晶(在冰箱中贮存过夜)。过滤大分子引发剂5，用冷醚洗涤并真空干燥。在80ml水中溶解4g粗产物进行纯化。将溶液的pH升高到8以水解掉多余的i-BuBr。然后用CH2Cl2(70ml)萃取该溶液。得到稳定的乳剂，而实现完全的相分离需要几个小时。真空除去溶剂。将产物溶解于热EtOH中并置于冰箱中结晶。然后过滤，用醚洗涤并真空干燥。纯净的产品5是白色的。
用H MNR光谱计算置换的程度。该方法也可以用于制备衍生自PEG 5000和PEG 10000的PEG大分子引发剂5。
[0302] (B)嵌段PEG-PMOSu6的典型制备方法
[0303] 将单体3(其合成见WO 01/18080)、碳酸亚乙酯和二吡啶的混合物置于用隔膜密封的管中，通入氩气净化5分钟，并加入CuBr。缓慢加热该混合物至形成溶液(深棕色)，再通入氩气净化30分钟。然后PEG大分子引发剂5的碳酸亚乙酯溶液(缓慢加热到碳酸亚乙酯和5都具有流动性)用氩气净化10分钟，其中该大分子引发剂5的量为表5所示的相对于单体的量，用经氩气净化的注射器加入到该单体溶液中。将混合物置于油浴中，搅拌。将混合物暴露于空气中、冷却和用DMF稀释使反应停止。然后将溶液通过填充了氧化铝的柱，聚合物在甲醇中沉淀出来。过滤PEG-PMOSu6沉淀物，用醚洗涤并真空干燥。得到的PEG-PMOSu6呈白色粉末状。表5显示了衍生自分子量为2000g/mol的PEG的大分子引发剂5发生聚合作用时聚合作用的条件、收率和分子量。
[0304] 表5
[0305]3 5 CuBr Bpy 3∶5∶CuBr： EC T 时间 收率 Mn2 PD
(mmol) (mmol) (mmol) bpy (g) (℃) (h) (％) (Mw/Mn)mmol (g) (g) (g)
(g)
1 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.3 80 1.5 56 17,000 1.39
0.917 0.215 0.0157 0.0342
2 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.0 80 1.0 40 17,600 1.30
0.917 0.215 0.0157 0.0342
3 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.3 80 5.0 87 20,100 1.53
0.917 0.215 0.0157 0.0342
4 5 0.05 0.05 0.1 0.65 80 5.0 100 31,300 1.32
0.917 0.1075 0.0078 0.0171 100∶1∶1∶2
5 2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 60 5.0 20 13,230 1.35
0.458 0.1075 0.008 0.0171
6 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.3 80 5.5 32 19,700 1.29
0.917 0.215 0.0157 0.0342
7 2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 100 5.0 64 28,000 1.38
0.458 0.1075 0.005 0.0171
8 2.5 0.5 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 80 5.0 56 25,700 1.29
0.458 0.1075 0.008 0.0171
9 2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 80 5.0 47 22,800 1.27
0.458 0.1075 0.008 0.0171
2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.5 80 5.0 743 30,200 1.28
10 0.458 0.1075 0.008 0.017
2.5 0.05 0.025 0.15 0.5 80 3.0 42.43 18,100 1.25
11 0.458 0.1075 0.004 0.017 50∶1∶0.5∶3
5 0.05 0.05 0.1 0.5 110 100 18,600 1.33
12 0.917 0.1075 0.008 0.0171 100∶1∶1∶2 4∶35
1
(mmol) (mmol) (mmol) bpy (g) (℃) (h) (％) (Mw/Mn)mmol (g) (g) (g)
(g)
1 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.3 80 1.5 56 17,000 1.39
0.917 0.215 0.0157 0.0342
2 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.0 80 1.0 40 17,600 1.30
0.917 0.215 0.0157 0.0342
3 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.3 80 5.0 87 20,100 1.53
0.917 0.215 0.0157 0.0342
4 5 0.05 0.05 0.1 0.65 80 5.0 100 31,300 1.32
0.917 0.1075 0.0078 0.0171 100∶1∶1∶2
5 2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 60 5.0 20 13,230 1.35
0.458 0.1075 0.008 0.0171
6 5 0.1 0.1 0.2 50∶1∶1∶2 1.3 80 5.5 32 19,700 1.29
0.917 0.215 0.0157 0.0342
7 2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 100 5.0 64 28,000 1.38
0.458 0.1075 0.005 0.0171
8 2.5 0.5 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 80 5.0 56 25,700 1.29
0.458 0.1075 0.008 0.0171
9 2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.65 80 5.0 47 22,800 1.27
0.458 0.1075 0.008 0.0171
2.5 0.05 0.05 0.1 50∶1∶1∶2 0.5 80 5.0 743 30,200 1.28
10 0.458 0.1075 0.008 0.017
2.5 0.05 0.025 0.15 0.5 80 3.0 42.43 18,100 1.25
11 0.458 0.1075 0.004 0.017 50∶1∶0.5∶3
5 0.05 0.05 0.1 0.5 110 100 18,600 1.33
12 0.917 0.1075 0.008 0.0171 100∶1∶1∶2 4∶35
1
[0306] EC＝碳酸亚乙酯2
[0307] 凝胶渗透色谱法，以DMF为洗脱液，PMMA为标准品3
[0308] 反应混合物用氩气净化1小时
[0309] (C)合成衍生自分子量为2000g/mol的聚(乙二醇)的PEG-PMMA-Na7的详细实施例
[0310] 将溴化铜(I)(31.2mg，0.2mmol)、bpy(68.4mg，0.4mmol)、N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(3.67g，20mmol)和碳酸亚乙酯(2g)加入到圆底烧瓶中，然后用隔膜密封。缓慢加热所得到的棕色混合物直至形成溶液，然后用氩气净化约15分钟。然后向该混合物中注入经氩气净化过的含PEG2000-大分子引发剂5(430mg，0.2mmol)的碳酸亚乙酯(0.6g)溶液，然后在油浴中把圆底烧瓶加热到80℃1小时。然后从热源中移开粘稠的反应混合物并快速冷却。把所得到的粗聚合物产物溶解于DMF(8ml)中，再将所得溶液缓慢加入到搅拌中的甲醇-1(500ml)中，即可沉淀出白色固体状的PEG-PMOSu6(3.8g，92％)；Mn＝37，160g.mol Mw/Mn
1
＝1.32 SEC(DMF 0.1％LiCl)。HNMR(DMSO-d6)δ1.38(br，3H，CH3)，2.42(br m，2H，CH2C)，
2.78(br，4H，CH2CH2)，3.50(s，4H，OCH2CH2O)。
1
＝1.32 SEC(DMF 0.1％LiCl)。HNMR(DMSO-d6)δ1.38(br，3H，CH3)，2.42(br m，2H，CH2C)，
2.78(br，4H，CH2CH2)，3.50(s，4H，OCH2CH2O)。
[0311] 然后水解PEG-PMOSu6。通过向10ml圆底烧瓶内的嵌段聚合物前体(0.1g，0.54mmol)的DMF(0.5ml)搅拌溶液中缓慢滴加2M NaOH(0.6ml)来实施PEG-PMAA-Na盐的水解。将反应混合物在60℃加热16个小时，再加入水(5.0ml)。然后用Visking管(MWCO
12,000-14,000)透析该稀释溶液，冷冻干燥透析液得到白色固体产物PEG2000-PMAA-Na-1
盐(收率为95％)；Mn＝34,110g.mol Mw/Mn＝1.34(三级探波-SEC；NaNO3 0.2M/10％
1
CH3CN)。H-NMR(D2O)δ0.85-0.96(br s，3H，CH3)1.60，1.88(br，m，2H，CH2)和3.58(s，4H，OCH2CH2O)，该鉴别结果证明，连接PEG2000-嵌段的受阻酯键并未被水解。
12,000-14,000)透析该稀释溶液，冷冻干燥透析液得到白色固体产物PEG2000-PMAA-Na-1
盐(收率为95％)；Mn＝34,110g.mol Mw/Mn＝1.34(三级探波-SEC；NaNO3 0.2M/10％
1
CH3CN)。H-NMR(D2O)δ0.85-0.96(br s，3H，CH3)1.60，1.88(br，m，2H，CH2)和3.58(s，4H，OCH2CH2O)，该鉴别结果证明，连接PEG2000-嵌段的受阻酯键并未被水解。
[0312] (D)合成衍生自分子量为5000g/mol的聚(乙二醇)的PEG-PMMA-Na7的详细实施例将溴化铜(I)(10.4mg，0.072mmol)、2，2′-二吡啶(bpy，22.6mg，0.145mmol)、N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(2.0g，10.8mmol)、PEG5000-大分子引发剂5(362mg，0.072mmol)和碳酸亚乙酯(2.362g)加入到Schlenk烧瓶中，然后用隔膜密封。用冷冻溶解法给所得到的棕色混合物除气，然后将混合物在油浴中加热到110℃2小时。然后从热源中移开粘稠的反应混合物并快速冷却。把所得到的粗聚合物产物溶解于DMF(8ml)中。所得溶液缓慢加入到搅拌中的甲醇/二乙醚(2∶1v/v，300ml)中，即可沉淀出白色固体状的PEG-PMOSu6(1.8g，-1 176％)；Mn＝32,860g.mol Mw/Mn＝1.36(SEC(DMF0.1％LiCl)。H NMR(DMSO-d6)δ1.38(br，
3H，CH3)，2.42(br m，2H，CH2C)，2.78(br，4H，CH2CH2)，3.50(s，4H，OCH2CH2O)。
3H，CH3)，2.42(br m，2H，CH2C)，2.78(br，4H，CH2CH2)，3.50(s，4H，OCH2CH2O)。
[0313] 通过向10ml圆底烧瓶内的嵌段聚合物前体(0.1g，0.54mmol)的DMF(0.5ml)搅拌溶液中缓慢滴加2M NaOH(0.6ml)来实施PEG-PMOSu6的水解。将反应混合物在60℃加热16个小时，再加入水(5.0ml)。然后用Visking管(MWCO 12,000-14,000)透析该稀释溶液，冷冻干燥透析液得到白色固体产物PEG 5000-PMAA-Na盐(收率为75％)；Mn-1 1＝29,360g.mol Mw/Mn＝1.28(三级探波-SEC；NaNO3 0.2M/10％CH3CN)。H-NMR(D2O)δ0.87-0.97(br s，3H，CH3)1.63，1.89(br，m，2H，CH2)和3.58(s，4H，OCH2CH2O)，该鉴别结果证明，连接PEG2000-嵌段的受阻酯键并未被水解。
[0314] 实施例C)制备两性霉素B-PMAA-Na制剂
[0315] 实施例C1：
[0316] 将聚合物PMOSu(40mg)溶解于DMSO(0.4ml)中，再把该溶液加入到包含两性霉素B(“药物”)(50mg)的玻璃瓶中。搅拌下向所得到的药物混合物中滴加1M氢氧化钠水溶液(0.44ml)。典型地，这时可以观察到一些沉淀。在加入氢氧化钠后立即加入水(4.7ml)，将得到的混合物在室温下搅拌1小时。然后把反应溶液稀释到8.8ml，再用Visking透析膜(MWCO 7000，Medicell lnternational)在水(1L)中透析24小时。在透析期间，需要换6次水。用0.2μm的过滤器过滤该透析溶液，然后冷冻干燥，获得0.9g黄色固体产物。-1 -1 -1 -1 -1
FT-IR(ATR)1676cm ，1568cm ，1404cm ，1070cm ，1012cm 。
FT-IR(ATR)1676cm ，1568cm ，1404cm ，1070cm ，1012cm 。
[0317] 该制剂中含有的药物和聚合物可以用1H NMR和FT-IR光谱法来证实。该制剂中两性霉素B的重量比(wt％)可以用UV光谱法在419.5nm处测定，其中用来自Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Ltd的两性霉素B作校准曲线。经测定，实施例C1的wt％为44-48％。
[0318] 在生物学评价之前，用活性碳或多粘菌素B柱处理甲基丙烯酸钠盐均聚物和共聚物的水溶液以除去内毒素。用鲎变形细胞溶解产物(LAL)测定法测定内毒素水平，在本发明的实验中使用的化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。
[0319] D)甲基丙烯酸钠盐同聚物和共聚物在原代细胞中的细胞毒性
[0320] 所有的实验都是在人的原代细胞中完成的。
[0321] 实施例D1：人红细胞：
[0322] 在RPMI 1640中制备人红细胞的2％v/v溶液。在RPMI 1640中制备PMAA-Na(“药物”)的母液。用TritonX-100的1％溶液作为细胞100％溶解的阳性参照物。葡聚糖和聚-L-赖氨酸分别作为阴性和阳性对照物。抽取相同体积的样品和红细胞到96孔微量反应板中并在37℃下培养。在1小时和24小时之后，离心每一个样品(2,000g，10分钟)并将上层清液加入96孔微量反应板中。用分光光度计在490nm处测定其吸光度。溶解的程度用相对于TritonX-100导致的100％溶解的百分比表示。如附图1所示，在加入浓度高达2,000μg/ml的PMAA-Na 1小时或24小时后，没有观察到其对于来自3个供体(A、B和C)的人红细胞具有显著的毒性。
[0323] 实施例D2：人全血
[0324] 在RPMI 1640中制备来自供体D的人全血的2％v/v溶液。在RPMI 1640中制备PMAA-Na(“药物”)的母液。用TritonX-100的1％溶液作为细胞100％溶解的阳性标准物。葡聚糖和聚-L-赖氨酸分别作为阴性和阳性对照物。抽取相同体积的样品和红细胞到96孔微量反应板中并在37℃培养。在1小时、6小时和24小时后，每个样品都进行离心(500g，
10分钟)，然后将上清液加入到96孔微量反应板中。用分光光度计在490nm处测定其吸光度。溶解的程度用其相对于TritonX-100导致的100％溶解的百分比表示。如附图2所示，在加入浓度高达500μg/ml的PMAA-Na 1小时或6小时或24小时后，没有观察到其对于人全血具有显著的毒性。
10分钟)，然后将上清液加入到96孔微量反应板中。用分光光度计在490nm处测定其吸光度。溶解的程度用其相对于TritonX-100导致的100％溶解的百分比表示。如附图2所示，在加入浓度高达500μg/ml的PMAA-Na 1小时或6小时或24小时后，没有观察到其对于人全血具有显著的毒性。
[0325] 实施例D3
[0326] a)来源于单核细胞的巨噬细胞
[0327] 从单个供体的新鲜血液中分离单核细胞，并将其在RPMI 1640、20mML-谷氨酰胺、青霉素(200IU/ml)、链霉素(200μg/ml)和10％人血清中培养，并按照1×106个细胞/ml的密度铺到培养板上。在3天的粘连反应后，单核细胞发生分化并形成来源于单核细胞的巨噬细胞(MDMs)。然后向该细胞中加入包含PMAA-Na的介质，其中PMAA-Na的浓度范围为0-2,000μg/ml。细胞培养71小时后，加入噻唑蓝(MTT，Sigma5mg/ml)。细胞培养的存活率用相对于细胞在不含任何化合物的环境中存活率的百分比表示。葡聚糖和聚(L-赖氨酸)分别作为阴性和阳性对照物。如附图3a所示，在MTT测定和锥虫蓝测定中当PMAA-Na的最高浓度为2,000μg/ml时，其对MDMs仍然是没有毒性的。
[0328] b)腹膜组织巨噬细胞
[0329] 将人腹膜组织细胞在RPMI 1640、20mML-谷氨酰胺、10％混合供体人血清、200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素中培养，并将它们的密度调整到1×106个细胞/ml。然后向该细胞中加入包含PMAA-Na的介质，其中PMAA-Na的浓度范围为0-2,000μg/ml。细胞培养71小时后，加入MTT。细胞的存活率用相对于细胞在不含任何化合物的环境中存活率的百分比表示。葡聚糖和聚(L-赖氨酸)分别作为阴性和阳性对照物。PMAA-Na在浓度高达500μg/ml时对腹膜巨噬细胞仍然是没有毒性的。如附图3b所示，在浓度为500μg/ml到
2,000μg/ml之间时在MTT测定和锥虫蓝测定中观察到较小的毒性。
2,000μg/ml之间时在MTT测定和锥虫蓝测定中观察到较小的毒性。
[0330] E)抗凝血剂活性
[0331] 实施例E1：抗凝血剂活性可以通过测定凝血酶时间(PT)、高领土部分凝血激酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原和抗-Xa活性来获得。将该化合物溶解于磷酸盐缓冲生理盐水中并与血浆/巴比妥缓冲液(1∶1)按照50∶50的比例混合并进行实验。抗-Xa活性可以用肝素/ml(HEP(Xa)(V/ml))的单位来表示。PMAA-Na延长了APTT和TT，但对于PT却没有作用。抗-Xa测定是阴性的。因此这些分子的抗凝血剂活性不取决于“类肝素”活性，见表6。
[0332] 表6
[0333]Conc PT APTT TT 纤维蛋白原 抗-Xa
溶解于
(μg/ml) (秒) (秒) (秒) (g/L) (V/ml)
对照组 血浆/巴比妥缓冲液 16.7 40 14 1.31 0
PMAA-Na 血浆/巴比妥缓冲液 500 14.9 144 67 0.47 0
溶解于
(μg/ml) (秒) (秒) (秒) (g/L) (V/ml)
对照组 血浆/巴比妥缓冲液 16.7 40 14 1.31 0
PMAA-Na 血浆/巴比妥缓冲液 500 14.9 144 67 0.47 0
[0334] 将患者的腹膜细胞与每种化合物在连续的流动性腹膜透析(CAPD)中培养，36小时后收集培养的上清液。用EIA(R&D系统)测定其中的促炎趋化因子和促炎细胞因子。
[0335] 实施例F1：
[0336] 将来自3个供体(A、B和C)的腹膜细胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，并分析其中的MIP-1β。当利用鲎变形细胞溶解物测定法(Pyrotell，Associates of Cape Cod，US)测定时，所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml(EU/ml)。这是对于注射用水的欧共体标准值。如附图4所示，在PMAA-Na存在的条件下，MIP-1β具有显著的释放。
[0337] 实施例F2：
[0338] 将来自2个供体(A和B)的腹膜细胞在PMAA-Na(500μg/ml和2,000μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，并分析其中的TNF-α。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml(EU/ml)。如附图5所示，在两种浓度的PMAA-Na存在的条件下，TNF-α具有显著的释放。
[0339] 实施例F3：
[0340] 人腹膜巨噬细胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的促炎趋化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。附图6所示的是取自3个不同的人类供体(A、B和C)的细胞的结果。所述趋化因子和细胞因子从组织抗原呈递细胞中的释放处于可以促进人体的药理学Th1应答的水平，而不会高到导致人体有显著的有害不良作用。
[0341] 实施例F4：
[0342] 来源于血液的单核细胞的巨噬细胞在浓度高达2,000μg/ml的PMAA-Na中培养。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。并未观察到MIP-1β的释放。
附图7所示的是取自3个不同的人类供体(A、B和C)的细胞的结果。因此与来自组织体区室中的巨噬细胞源和其他抗原呈递细胞(如，树突细胞)的细胞相比，PMAA-Na对于来源于血单核细胞的细胞具有不同的免疫调节效果。
附图7所示的是取自3个不同的人类供体(A、B和C)的细胞的结果。因此与来自组织体区室中的巨噬细胞源和其他抗原呈递细胞(如，树突细胞)的细胞相比，PMAA-Na对于来源于血单核细胞的细胞具有不同的免疫调节效果。
[0343] G)市售的PMAA-Na缺乏Th1佐剂活性
[0344] 实施例G1：
[0345] 人腹膜巨噬细胞在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)中培养。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。市售的PMAA-Na中的一个具有与我们制备的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)相同的MWt。36小时后收集培养的上清液。结果显示没有MIP-1β的释放。附图8显示了来自2个人类供体(A和B)各自的结果。
[0346] 实施例G2：
[0347] 人腹膜巨噬细胞在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)中培养。市售的PMAA-Na中的一个与我们制备的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)具有相同的MWt。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。36小时后收集培养的上清液。结果显示没有TNF-α的释放。附图9显示了来自2个人类供体(A和B)各自的结果。
[0348] H)两性霉素B-PMAA-Na制剂对人原代细胞的细胞毒性
[0349] 实施例H1：红细胞：
[0350] 方法如实施例D1所述。该对比是在临床级两性霉素B和两性霉素B-PMAA-Na复合物(在附图中都称作“药物”)之间做出的。供试化合物的母液在MGM中制备。在培养1小时(附图10)、6小时(附图11)和24小时(附图12)后测定3个不同供体(A、B和C)的人红细胞溶解。在培养1小时后，没有观察到两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性。在培养6小时后，两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性远远小于临床级两性霉素B的毒性。当培养时间增加到24小时后，临床级两性霉素B的毒性增加到100％但两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性没有进一步的增加。
[0351] 实施例H2：红细胞：
[0352] 方法如实施例H1所述。在两性霉素B-PMAA-Na复合物(“药物”)浓度为0至1,000μg/ml下培养1小时和24小时后测定红细胞溶解的程度。结果如附图13所示。
[0353] 实施例H3：外周血单核细胞
[0354] 将外周血单核细胞(PBMCs)按1x105个细胞的密度悬浮于RPMI介质、10％混合供体人血清、200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素中并在37℃、5％CO2条件下在96孔组织培养板上培养。然后按最终体积为100μl/孔的剂量向该细胞中加入包含浓度为0-70μg/ml两性霉素B-PMAA-Na制剂(“药物”)的介质。该细胞培养1天或2天或6天，之后加入MTT(5mg/ml)。一小时后除去MTT溶液并加入DMSO(100μl)以溶解MTT结晶物。用平板阅读器(Molecular Devices，Wokingham，UK)在550nm处测定光密度。细胞培养的存活率，用相对于细胞在不含任何化合物的环境中生长的存活率百分比表示。葡聚糖和聚(L-赖氨酸)分别作为阴性和阳性对照物。在培养1天、2天或6天后，当化合物浓度高达70μg/ml时，其在MTT测定和锥虫蓝测定中对外周血单核细胞仍然没有毒性。附图14显示的分别是3个代表性人类供体的结果。在附图14中每个供体的结果都用线图来表示。
[0355] 实施例H4：来源于单核细胞的巨噬细胞
[0356] 将来源于单核细胞的巨噬细胞(MDM)通过密度梯度离心从单个供体的新鲜血液中分离出来并在巨噬细胞生长培养基(MGM)中培养，其中该培养基包含RPMI介质、20mM L-谷氨酰胺、青霉素(250IU/ml)、链霉素(250μg/ml)和10％人血清。它们在培养板上的密6
度是1×10 个细胞/孔并在3天中分化成MDMs。向上述细胞中加入包含浓度为0-125μg/ml的化合物(“药物”)的介质。在加入MTT前，将细胞培养2天或3天。细胞的存活率用相对于细胞在不含任何化合物的环境中生长的存活率百分比表示。葡聚糖和聚(L-赖氨酸)分别作为阴性和阳性对照物。如附图15所示，在培养2天或3天后，当浓度都高达125μg/ml时，两性霉素B-PMAA-Na制剂在MTT测定和锥虫蓝测定中其毒性都小于临床级两性霉素B。
度是1×10 个细胞/孔并在3天中分化成MDMs。向上述细胞中加入包含浓度为0-125μg/ml的化合物(“药物”)的介质。在加入MTT前，将细胞培养2天或3天。细胞的存活率用相对于细胞在不含任何化合物的环境中生长的存活率百分比表示。葡聚糖和聚(L-赖氨酸)分别作为阴性和阳性对照物。如附图15所示，在培养2天或3天后，当浓度都高达125μg/ml时，两性霉素B-PMAA-Na制剂在MTT测定和锥虫蓝测定中其毒性都小于临床级两性霉素B。
[0357] J)测定两性霉素B-PMAA-Na制剂抗利什曼原虫前鞭毛体的抗利什曼病活性实施例J1：
[0358] 用 于 本 实 验 的 是 墨 西 哥 利 什 曼 原 虫 前 鞭 毛 体。 将 其 保 存 在Schneider′sDrosophila生长介质(Invitrogen)中，该介质中加入15％胎牛血清(在6
56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。将寄生物浓度调节到2×10 个寄生物/ml。将两倍于生长介质所需的最终浓度的供试化合物二倍稀释。然后将等体积的药物和寄生物悬浮液在96孔培养板上混合，在26℃培养24小时。这时，加入MTT(5mg/ml)，该培养板在26℃下再培养24小时。然后离心分离(2000g，5分钟)该培养板，弃去上清液，将沉淀物再悬浮于100μl DMSO中。用分光光度计在570nm处测定吸光度。结果用相对于对照孔中未处理、复制的前鞭毛体OD的100％存活率的百分比表示。
56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。将寄生物浓度调节到2×10 个寄生物/ml。将两倍于生长介质所需的最终浓度的供试化合物二倍稀释。然后将等体积的药物和寄生物悬浮液在96孔培养板上混合，在26℃培养24小时。这时，加入MTT(5mg/ml)，该培养板在26℃下再培养24小时。然后离心分离(2000g，5分钟)该培养板，弃去上清液，将沉淀物再悬浮于100μl DMSO中。用分光光度计在570nm处测定吸光度。结果用相对于对照孔中未处理、复制的前鞭毛体OD的100％存活率的百分比表示。
[0359] 临床级两性霉素B对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的50％致死剂量(LD50)是0.14μg/ml(附图16插图)。临床级两性霉素B对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的90％致死剂量(LD90)是1.49μg/ml(附图16插图)。两性霉素B-PMAA-Na制剂的三个实验的结果如附图16所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的50％致死剂量(LD50)是0.10-0.19μg/ml(附图16)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的90％致死剂量(LD90)是1.02-1.49μg/ml(附图16)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
[0360] 实施例J2：
[0361] 用于实验的是杜氏利什曼原虫。将其保存在Schneider′s生长介质199中，该介质中加入15％胎牛血清(在56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。将寄生6
物浓度调节到2×10 个寄生物/ml。将两倍于生长介质所需最终浓度的供试化合物二倍稀释。然后将等体积的药物和寄生物悬浮液在96孔培养板上混合，在26℃培养24小时。这时，加入MTT(5mg/ml)，该培养板在26℃下再培养24小时。然后离心分离(2000g，5分钟)该培养板，弃去上清液，将沉淀物再悬浮于100μl DMSO中。用分光光度计在570nm处测定吸光度。结果用相对于对照孔中未处理、复制的前鞭毛体OD100％存活率的百分比表示。
物浓度调节到2×10 个寄生物/ml。将两倍于生长介质所需最终浓度的供试化合物二倍稀释。然后将等体积的药物和寄生物悬浮液在96孔培养板上混合，在26℃培养24小时。这时，加入MTT(5mg/ml)，该培养板在26℃下再培养24小时。然后离心分离(2000g，5分钟)该培养板，弃去上清液，将沉淀物再悬浮于100μl DMSO中。用分光光度计在570nm处测定吸光度。结果用相对于对照孔中未处理、复制的前鞭毛体OD100％存活率的百分比表示。
[0362] 临床级两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的50％致死剂量(LD50)是0.08μg/ml(附图17插图)。临床级两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的90％致死剂量(LD90)是1.91μg/ml(附图17插图)。两性霉素B-PMAA-Na制剂的三个实验的结果如附图17所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的50％致死剂量(LD50)是0.10-0.17μg/ml(附图17)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的
90％致死剂量(LD90)是0.98-1.28μg/ml(附图17)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
90％致死剂量(LD90)是0.98-1.28μg/ml(附图17)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
[0363] K)测定两性霉素B-PMAA-Na制剂对抗利什曼原虫无鞭毛体的抗利什曼病活性实施例K1：
[0364] 用墨西哥利什曼原虫无鞭毛体感染来源于人单核细胞的巨噬细胞，该巨噬细胞保存在RPMI 1640(Invitrogen)中，该介质中加入10％人血清(在56℃下加热灭活1小时)6
和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。将该细胞按10 个细胞/ml转移到Lab-Tek腔式载波片(Nunc)上，37℃/5％CO2中培养3天。然后从该腔式载波片中吸出介质，并加入等量的新鲜介质，以调节无鞭毛体浓度使得寄生物：受感染细胞的比例为5∶1。然后将细胞在32℃培养20小时，使巨噬细胞确实受到感染。然后从该腔式载波片中吸出介质并用供试化合物的二倍稀释液代替。然后将细胞在32℃培养72小时。用PBS洗涤后，移开该腔，干燥载波片并在甲醇中固定。然后用吉姆萨染料给每个载波片着色并在显微镜下检查。
共计数出250个细胞用于确定感染和未感染细胞的数目。
和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。将该细胞按10 个细胞/ml转移到Lab-Tek腔式载波片(Nunc)上，37℃/5％CO2中培养3天。然后从该腔式载波片中吸出介质，并加入等量的新鲜介质，以调节无鞭毛体浓度使得寄生物：受感染细胞的比例为5∶1。然后将细胞在32℃培养20小时，使巨噬细胞确实受到感染。然后从该腔式载波片中吸出介质并用供试化合物的二倍稀释液代替。然后将细胞在32℃培养72小时。用PBS洗涤后，移开该腔，干燥载波片并在甲醇中固定。然后用吉姆萨染料给每个载波片着色并在显微镜下检查。
共计数出250个细胞用于确定感染和未感染细胞的数目。
[0365] 寄生物数/细胞的平均数乘以受感染细胞的百分比作为感染指数。对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长具有50％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为0.18-0.32μg/ml(附图18)，而临床级两性霉素B为0.14μg/ml(附图19a)或Ambisome为0.45μg/ml(附图19b)。对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长具有90％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为1.18-1.55μg/ml，而临床级两性霉素B为0.95μg/ml或Ambisome为3.89μg/ml。
[0366] 附图19和20中的曲线坡度可以比较出临床级两性霉素B、(脂质体两性霉素B，Gilead Sciences，Great Abingdon，Cambridge，UK)和两性霉素B-PMAA-Na制剂对于细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体的相对活性。它们表明，两性霉素B-PMAA-Na制剂的杀菌曲线比AmBisome的杀菌曲线更陡。
[0367] 实施例K2：
[0368] 用杜氏利什曼原虫无鞭毛体感染来源于人单核细胞的巨噬细胞，该巨噬细胞保存在RPMI 1640(Invitrogen)中，该介质中加入10％人血清(在56℃下加热灭活1小时)和6
200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。将该细胞按10 个细胞/ml转移到Lab-Tek腔式载波片(Nunc)上，37℃/5％CO2中培养3天。然后从该载波片中吸出介质，并加入等量的新鲜介质，以调节无鞭毛体浓度使得寄生物：受感染细胞的比例为5∶1。然后将细胞在
32℃培养20小时，使巨噬细胞确实受到感染。然后从该腔式载波片中吸出介质并用供试化合物的二倍稀释液代替。然后将细胞在32℃培养72小时。在用PBS洗涤后，移开该腔，干燥载波片并在甲醇中固定。然后用吉姆萨染料给每个载波片着色并在显微镜下检查。总共计数出250个细胞用于确定感染和未感染细胞的数目。
200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。将该细胞按10 个细胞/ml转移到Lab-Tek腔式载波片(Nunc)上，37℃/5％CO2中培养3天。然后从该载波片中吸出介质，并加入等量的新鲜介质，以调节无鞭毛体浓度使得寄生物：受感染细胞的比例为5∶1。然后将细胞在
32℃培养20小时，使巨噬细胞确实受到感染。然后从该腔式载波片中吸出介质并用供试化合物的二倍稀释液代替。然后将细胞在32℃培养72小时。在用PBS洗涤后，移开该腔，干燥载波片并在甲醇中固定。然后用吉姆萨染料给每个载波片着色并在显微镜下检查。总共计数出250个细胞用于确定感染和未感染细胞的数目。
[0369] 用寄生物数/细胞的平均数乘以受感染细胞的百分比作为感染指数。对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长具有50％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为0.30-0.71μg/ml(附图21)，而临床级两性霉素B为0.54μg/ml(附图22a)或Ambisome为1.96μg/ml(附图22b)。对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长具有90％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为2.18-3.18μg/ml，而临床级两性霉素B为2.31μg/ml或Ambisome为＞8μg/ml。
[0370] L)干扰素-γ的释放，两性霉素B-PMAA-Na制剂的Th1佐剂活性
[0371] 实施例L1：
[0372] 将包含巨噬细胞和树突细胞的人腹膜细胞在巨噬细胞生长培养基中培养，其中该培养基包含各个化合物。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。24小时后收集上清液。用EIA测定干扰素-γ。如附图23所示，在两性霉素B-PMAA-Na制剂(100μg/ml)存在下Th1促进的细胞因子、干扰素-γ从腹膜巨噬细胞中释放显著地高于对照组、临床级两性霉素B、市售的PMAA-Na或PMAA-Na。不含内毒素的两性霉素B-PMAA-Na制剂的干扰素-γ释放水平能够足于促进人体的药理学Th1应答，但并没有达到可以导致显著有害副反应的水平。
[0373] 实施例L2：
[0374] 在本部分所述的实验的目的是确定抗原和PMAA-Na的制剂能否也能引发Th1辅助应答。
[0375] 用如下方法制备结核菌素-PMAA-Na制剂。将如实施例A1-A4制备的均聚物PMAA-Na(30mg)加入到结核菌素纯蛋白衍生物BP(10ml，100,000单位/ml，Evans疫苗)中，将得到的溶液在室温下搅拌1.5小时。然后将溶液用Visking透析膜(MWCO7000，Medicell International)在1L水中透析24小时，在此期间要更换6次水。用0.2μm的过滤器过-1 -1滤该透析溶液并冷冻干燥，获得灰白色固体产物(20mg)。FT-IR(ATR)1648cm ，1545cm ，-1 -1 -1
1450cm ，1398cm ，1259cm 。
1450cm ，1398cm ，1259cm 。
[0376] 然后用菲可帕克(Ficoll-Paque)将PBMCs从全血中分离出来并再悬浮于加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的链霉素的RPMI 1640中。在鲎变形细胞溶解物测定法(Pyrotell，Associates of Cape Cod，US)测定中，所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。将细胞(105个细胞/孔)和各个化合物按一式两份混
3
合并在37℃/5％CO2中培养4天。按照1μ Ci/孔加入[H]-胸苷(特定活性20-30Ci/
mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培养18小时。然后收集细胞并用液体闪烁计数器测定其增殖。结果用平均数/分(cpm)±sem表示。附图24a显示，当用1μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖显著提高。当用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖会进一步提高(P＝0.001)。
3
合并在37℃/5％CO2中培养4天。按照1μ Ci/孔加入[H]-胸苷(特定活性20-30Ci/
mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培养18小时。然后收集细胞并用液体闪烁计数器测定其增殖。结果用平均数/分(cpm)±sem表示。附图24a显示，当用1μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖显著提高。当用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖会进一步提高(P＝0.001)。
[0377] 附图24b显示的是供体B的结果。与用10μg/ml的结核菌素抗原相比，使用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂后，T淋巴细胞增殖显著提高(P＝0.002)。这表明与结核菌素抗原对其本身的作用相比，结核菌素-PMAA-Na更能显著提高T淋巴细胞的增殖。
[0378] 实施例L3：用ELISpot测定法测定干扰素-γ分泌细胞
[0379] 分离人PBMCs并在加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的链霉5
素的RPMI中调节为2x10 个细胞/孔。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。PBMCs和所述化合物在由人干扰素-γ单克隆抗体(R & D系统，UK)包被的ELISpot PVDF-backed培养板的孔中混合。用未受激的细胞作为阴性对照组，用人重组干扰素-γ作为阳性对照组。该培养板在37℃/5％CO2下培养24小时。然后根据厂商的说明书使培养板显像并得到阳性斑的数目以计算干扰素-γ的量。每个斑代表一个干扰素-γ分泌细胞。附图25表明：与单独使用结核菌素抗原相比，结核菌素PPD-PMAA-Na制剂刺激人原代T淋巴细胞释放干扰素的效果更加显著。当使用50μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂和
100μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂时，都可以观察到干扰素-γ分泌物从T淋巴细胞中释放增加。
素的RPMI中调节为2x10 个细胞/孔。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。PBMCs和所述化合物在由人干扰素-γ单克隆抗体(R & D系统，UK)包被的ELISpot PVDF-backed培养板的孔中混合。用未受激的细胞作为阴性对照组，用人重组干扰素-γ作为阳性对照组。该培养板在37℃/5％CO2下培养24小时。然后根据厂商的说明书使培养板显像并得到阳性斑的数目以计算干扰素-γ的量。每个斑代表一个干扰素-γ分泌细胞。附图25表明：与单独使用结核菌素抗原相比，结核菌素PPD-PMAA-Na制剂刺激人原代T淋巴细胞释放干扰素的效果更加显著。当使用50μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂和
100μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂时，都可以观察到干扰素-γ分泌物从T淋巴细胞中释放增加。
[0380] M)在内脏利什曼病的小鼠模型中，测定两性霉素B-PMAA-Na制剂对于杜氏利什曼原虫的抗利什曼病活性
[0381] 实施例M1：
[0382] 从重度感染的供体金黄地鼠-Mesocrifetus auratus的脾中收集杜氏利什曼菌株7
(MHOM/ET/67/L82)无鞭毛体。制备包含7.5-10x10 个无鞭毛体/mL的接种物。在第0天
7
通过静脉注射200μL(相当于1.5-2×10 无鞭毛体)感染不含特殊病原体的雌性BALB/c小鼠(20g)。第14天在显微镜下观察来评价感染的结束点，以确定小鼠的感染水平。在第
21天用后感染的吉姆萨染料给肝印模着色来确定所负荷的总寄生物数目。
(MHOM/ET/67/L82)无鞭毛体。制备包含7.5-10x10 个无鞭毛体/mL的接种物。在第0天
7
通过静脉注射200μL(相当于1.5-2×10 无鞭毛体)感染不含特殊病原体的雌性BALB/c小鼠(20g)。第14天在显微镜下观察来评价感染的结束点，以确定小鼠的感染水平。在第
21天用后感染的吉姆萨染料给肝印模着色来确定所负荷的总寄生物数目。
[0383] 根据如下的方法将下列化合物静脉给药：
[0384] a)感染后未治疗的对照物。
[0385] b)在感染后第14，16和18天的0.5mg/kg空白脂质体。
[0386] c)在感染后第14，16和18天的8mg/kg的PMAA-Na。
[0387] d)在感染后第14，16和18天的1mg/kg临床级两性霉素B。
[0388] e)在感染后第14，16和18天的0.5mg/kg AmBisome。
[0389] f)在感染后第14，16和18天的0.5mg/kg两性霉素B-PMAA-Na制剂。
[0390] g)在感染后第14，16和18天的1mg/kg两性霉素B-PMAA-Na制剂。
[0391] h)在感染后第14，16和18天的2mg/kg两性霉素B-PMAA-Na制剂。
[0392] 每组有5只动物。用于PMAA-Na和两性霉素B-PMAA-Na制剂静脉注射的载体溶液是5％葡萄糖。用0.2μL注射器式滤器过滤所有的药物制剂。静脉注射的量是每次注射200μL。
[0393] 在治疗前后分别将各组的小鼠称重以测定毒性并记录重量变化的比例。在感染21天(在治疗完成后三天)后，用显微镜观察固定于甲醇中并用10％吉姆萨染料着色的肝印模载玻片，以测定所负荷的寄生物。用显微镜数出无鞭毛体/500肝细胞，结果用未治疗对照物的百分比表示。
[0394] 附图26显示的是空白脂质体和PMAA-Na不具有抗利什曼病活性。相对于对照组，临床级两性霉素B、Ambisome、1mg/kg两性霉素B-PMAA-Na和2mg/kg两性霉素B-PMAA-Na对杜氏利什曼原虫无鞭毛体具有显著的杀灭活性(P＜0.0001)。临床级两性霉素B、Ambisome和两性霉素B-PMAA-Na(2mg/kg)对杜氏利什曼原虫无鞭毛体的杀灭活性彼此之间不具有显著差异(P＜0.05)。该结果表明，两性霉素B-PMAA-Na制剂和Ambisome一样，在内脏利什曼原虫病的动物模型中是有效的。
[0395] 实施例N：PMAA-Na的合成
[0396] 制备不同分子量的PMAA-Na构造物
[0397] 在合成PMAA-Na前体期间，如实施例A所述改变聚合反应的条件，可以得到分子量范围在19kD-37kD的几种聚合物。用凝胶渗透色谱法(GPC)确定分子量和多分散性指数。
[0398] 不同分子量的PMAA-Na构造物对于人原代细胞(红细胞溶解和外周血单核细胞(PBMCs))的毒性可以用MTT测定法来测定。如附图27所示，在培养2小时、5小时和24小时后，浓度为2mg/ml的PMAA-Na构造物不会导致红细胞溶解。另外，如附图28所示。在培养1天和2天后，浓度为2mg/ml的该物质对于外周血单核细胞没有毒性。上述结果不会受PMAA-Na构造物分子量的影响而改变。
[0399] 实施例O：两性霉素B-PMAA-Na复合物在贮存期间的稳定性
[0400] 冷冻干燥的两性霉素B-PMAA-Na贮存于4℃氩气中4个月。该物质溶于浓度为1mg/ml的5％葡萄糖中并贮存于4℃氩气中7个月。在此段时间结束后，两性霉素B-PMAA-Na复合物的稳定性可以通过将其与人红血细胞培养来测定。先前的实验已经证明，两性霉素B-PMAA-Na复合物的毒性远小于两性霉素B。因此复合物在贮存几个月后再次进行上述测定。
[0401] 如前所述进行该实验。用新制备的临床级两性霉素B为参照物作对比。培养1小时和6小时。附图29表明，两性霉素B-PMAA-Na复合物在贮存后对红细胞没有毒性。因此作为冷冻粉末贮存4个月后和贮存于4℃5％葡萄糖中7个月后，该复合物仍然是稳定的。
[0402] 该复合物贮存后的抗利什曼病活性可以用如实施例J1和K1的方法来测定。附图30显示的是两性霉素B-PMAA-Na对于游离利什曼前鞭毛体和细胞内无鞭毛体的抗利什曼病活性。两性霉素B-PMAA-Na的活性在以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后没有受到影响。两性霉素B-PMAA-Na的活性在4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后也没有受到影响。
[0403] 实施例P：新型隐球菌
[0404] 实验中所使用的是来自National Collection of Pathogenic Fungi的新型隐球菌类黏蛋白菌株(mucoidal strains)新型变种3003和gattii变种3216。也可以使用新型变种的非类黏蛋白临床分离物和gattii变种的非类黏蛋白临床分离物。将上述生物保存在32℃含有氯霉素(Oxoid，UK)的Sabouraud葡萄糖琼脂培养板中，该培养板置于含5％CO2的潮湿室中。
[0405] 将菌株在Sabouraud葡萄糖琼脂中再培养48小时，然后悬浮于无菌水中，其浓度4
调节为每ml含4x10 菌落形成单位(CFU)。将两倍于x2酵母氮基质(YNB，Anachem)所需最终浓度的样品进行二倍稀释。然后把等体积的样品和酵母混悬液加到96孔平底培养板中，在32℃下培养。培养3天后，充分摇动该培养板以使酵母均匀地分散通过孔并用分光光度计(490nm)测定浊度。100％的存活率定义为：对照组细胞中未治疗酵母的光密度。
调节为每ml含4x10 菌落形成单位(CFU)。将两倍于x2酵母氮基质(YNB，Anachem)所需最终浓度的样品进行二倍稀释。然后把等体积的样品和酵母混悬液加到96孔平底培养板中，在32℃下培养。培养3天后，充分摇动该培养板以使酵母均匀地分散通过孔并用分光光度计(490nm)测定浊度。100％的存活率定义为：对照组细胞中未治疗酵母的光密度。
[0406] 为了达到感染人原代巨噬细胞的目的，将隐球菌菌株在加入了10％人血清的YNB中在5％CO2存在下次培养48小时，以使它们形成荚膜。将人腹膜巨噬细胞或来源于单核细胞的巨噬细胞(～750,000)置于腔式载玻片(Lab-Tek，USA)并粘连24小时。旋压酵母细胞，洗涤并再悬浮于加入了10％人血清和2％葡萄糖的RPMI中，后者(2％葡萄糖)可以促进酵母的生长。加入悬浮液，其浓度为巨噬细胞浓度的15倍，感染在含5％的CO2的潮湿室中和37℃下进行。然后吸出介质并用PBS洗涤该巨噬细胞。然后把二倍稀释的供试样品加入到含10％人血清的RPMI中，在含5％的CO2的潮湿室中和37℃下培养3天。吸出介质并用PBS广泛洗涤该巨噬细胞，以除去所有细胞外的隐球菌。移开该腔，并干燥该载玻片，然后在甲醇中固定并加热，然后用革兰氏液染色。计算受感染和未感染巨噬细胞的数目，和革兰氏阳性酵母CFU的数目。结果用感染指数表示，该指数由CFU的平均数/受感染细胞的比例来确定。
[0407] 附图31(i)和(ii)显示了新型隐球菌新型变种的结果，附图31(iii)和(iv)显示了新型隐球菌gatti变种的结果。两性霉素B的LD50(0.9-1.4μg/ml)和两性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.7μg/ml)相似。当上述生物感染了人来源于单核细胞的巨噬细胞时，附图32(i)和(ii)显示了新型隐球菌新型变种的结果，附图32(iii)和(iv)显示了新型隐球菌gatti变种的结果。两性霉素B和两性霉素B-PMAA-Na的LD50在所有68个实验中都是类似的。对于新型隐球菌新型变种，两性霉素B的LD50是0.9-1.4μg/ml，而两性霉素B-PMAA-Na的LD50与其类似，为1.6-2.7μg/ml。对于新型隐球菌gatti变种，两性霉素B的LD50是0.06-1.0μg/ml，而两性霉素B-PMAA-Na的LD50与其类似，为0.1-0.5μg/ml。因此，该复合物与单独使用两性霉素一样，都可以有效对抗隐球菌。
[0408] 实施例Q：念珠菌属
[0409] 本实验使用的是白色念珠菌(ATCC 90028)和光滑念珠菌(ATCC 90030)。在每种情况下，把所述菌株保存在32℃的加入了氯霉素(Oxoid，UK)的Sabouraud葡萄糖琼脂培养板中，该培养板置于含5％CO2的潮湿室中。将菌株在Sabouraud葡萄糖琼脂中再培养48小5
时，然后将其浓度调节为每ml含2×10CFU。将两倍于酵母氮基质(YNB，Anachem)所需最终浓度的样品进行二倍稀释。然后把等体积的样品和酵母混悬液加到96孔平底培养板中，在32℃下培养。培养1天后，充分摇动该培养板以使酵母均匀地分散通过孔。用分光光度计(490nm)测定浊度。100％的存活率定义为：对照组细胞中未治疗酵母的光密度。
时，然后将其浓度调节为每ml含2×10CFU。将两倍于酵母氮基质(YNB，Anachem)所需最终浓度的样品进行二倍稀释。然后把等体积的样品和酵母混悬液加到96孔平底培养板中，在32℃下培养。培养1天后，充分摇动该培养板以使酵母均匀地分散通过孔。用分光光度计(490nm)测定浊度。100％的存活率定义为：对照组细胞中未治疗酵母的光密度。
[0410] 附图33(i)显示了白色念珠菌的结果，附图33(ii)显示了光滑念珠菌的结果。两性霉素B的LD50(0.9-1.8μg/ml)和两性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.3μg/ml)相似。因此，该复合物与单独使用两性霉素一样，都可以有效对抗念珠菌属。
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