用于药物递送的组合物和方法
阅读：473发布：2020-05-28
专利汇可以提供用于药物递送的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及表面修饰粒子及其制造和使用方法。表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的 表面活性剂 或其盐，并且表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。，下面是用于药物递送的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种表面修饰粒子，其包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有1nm至2,000nm的平均尺寸：
其中n和m是1；
1 2 3
R、R 和R 是甲基；并且
4 5
R 和R 独立地选自顺-9-十八烯酰基和顺-9-十八烯基，其中小分子为分子量低于
2500克/mol的有机化合物。
4 5
2.权利要求1的粒子，其中R 和R 是顺-9-十八烯酰基。
4 5
3.权利要求1的粒子，其中R 和R 是顺-9-十八烯基。
4.权利要求1的粒子，所述涂层吸附于粒子核心的表面。
5.权利要求1-4任一项的粒子，其中涂层还包含第二种表面活性剂。
6.权利要求5的粒子，其中第二种表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂、表面活性生物改性剂及其组合。
7.权利要求1-4任一项的粒子，其中涂层还包含第二种表面活性剂，第二种表面活性剂包含泊洛沙姆和磷脂中的至少一种。
8.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是治疗药剂。
9.权利要求8的粒子，其中治疗药剂选自镇痛药、麻醉药、兴奋剂、肾上腺素药剂、抗胆碱能药剂、抗胆碱酯酶剂、抗惊厥药、烷基化剂、别构抑制剂、促蛋白合成类固醇、减食欲剂、解酸剂、止泻剂、解毒剂、抗叶酸剂、退热药、抗风湿药剂、精神治疗药剂、神经阻断剂、抗炎剂、抗生素、抗凝剂、抗真菌剂、抗纤维化药剂、抗感染药剂、抗寄生虫药剂、抗组胺剂、抗毒蕈碱药剂、抗分支杆菌药剂、抗肿瘤剂、抗病毒剂、β-肾上腺素能受体阻断剂、镇咳剂、多巴胺能药物、血液药剂、免疫药剂、毒蕈碱药物、拟副交感神经功能药物、前列腺素类、放射药物、刺激剂、拟交感神经药物、维生素、黄嘌呤、生长因子、激素及其组合。
10.权利要求8的粒子，其中治疗药剂选自抗朊病毒药剂、焦虑镇静药、抗蠕虫药、抗原虫剂、止血剂、抗抑郁剂、抗癫痫药、催眠药、肾上腺素能阻断剂、抗肾上腺素药、肾上腺类皮质激素、拟肾上腺素药及其组合。
11.权利要求8的粒子，其中治疗药剂是镇静剂。
12.权利要求8的粒子，其中治疗药剂是皮质类固醇。
13.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是选自生物碱、抗代谢物、酶抑制剂、烷基化剂及其组合的抗肿瘤剂。
14.权利要求13的粒子，其中生物碱包含紫杉醇或紫杉醇衍生化合物。
15.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是紫杉醇。
16.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是蛋白酶抑制剂。
17.权利要求16的粒子，其中蛋白酶抑制剂选自茚地那韦、利托那韦、沙奎那韦、奈非那韦、阿扎那韦及其组合。
18.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是核苷反转录酶抑制剂。
19.权利要求18的粒子，其中核苷反转录酶抑制剂选自齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、拉米夫定及其组合。
20.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是非核苷反转录酶抑制剂。
21.权利要求20的粒子，其中非核苷反转录酶抑制剂选自依法韦仑、奈韦拉平、德拉维拉丁及其组合。
22.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂是抗炎剂。
23.权利要求22的粒子，其中抗炎剂选自非甾类抗炎药、非选择性环加氧酶（COX）抑制剂、COX-1抑制剂、COX-2抑制剂、脂氧合酶抑制剂、皮质类固醇、抗氧化剂、肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂及其组合。
24.权利要求1-4任一项的粒子，其中活性剂选自塞来西布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布及其组合。
25.一种药物组合物，其包含多个如前述权利要求任一项的粒子。
26.一种增加活性剂的细胞摄取的方法，所述方法包含：
将细胞与表面修饰粒子在足以增加所述表面修饰粒子的细胞摄取的条件下离体相接触，所述粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有1nm至
2,000nm的平均尺寸：
其中n和m是1；
R1、R2和R3是甲基；并且
R4和R5独立地选自顺-9-十八烯酰基和顺-9-十八烯基，其中小分子为分子量低于
2500克/mol的有机化合物。
27.权利要求26的方法，其中细胞是吞噬细胞。
28.权利要求26的方法，其中细胞是肿瘤细胞。
29.权利要求26的方法，其中细胞是选自巨噬细胞、粒细胞、无粒细胞及其组合的吞噬细胞。
30.权利要求26的方法，其中细胞是选自单核细胞、中性粒细胞及其组合的吞噬细胞。
31.多个表面修饰粒子在制备增加活性剂的细胞摄取的药物中的应用，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有1nm至
2,000nm的平均尺寸：
其中n和m是1；
1 2 3
R、R 和R 是甲基；并且
4 5
R 和R 独立地选自顺-9-十八烯酰基和顺-9-十八烯基，其中小分子为分子量低于
2500克/mol的有机化合物。
32.权利要求31的应用，其中细胞是吞噬细胞。
33.权利要求31的应用，其中细胞是选自巨噬细胞、粒细胞、无粒细胞及其组合的吞噬细胞。
34.权利要求31的应用，其中细胞是选自单核细胞、中性粒细胞及其组合的吞噬细胞。
35.权利要求31的应用，其中细胞是肿瘤细胞。
36.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物能够通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、真皮内、关节内、鞘内、硬膜外、脑内、局部、口、通过肺途径、腹膜内或通过其组合给药。
37.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物能够通过鼻内、眼内、直肠、透皮、颊或通过其组合给药。
38.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物能够给药于哺乳动物对象。
39.权利要求31-34任一项的应用，其中所述药物被用于治疗选自帕金森病、阿茨海默病、多发性硬化症、脑脊髓炎、脑炎、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症、额颞性痴呆症、朊病毒疾病、克-雅二氏病和肾上腺脑白质营养不良的神经变性疾病或病症。
40.权利要求31-34任一项的应用，其中所述药物被用于治疗选自类风湿关节炎、格雷夫斯病、重症肌无力、甲状腺炎、糖尿病、炎性肠病、自体免疫性卵巢炎、系统性红斑狼疮和舍格伦综合征的炎性疾病或病症。
41.权利要求31-34任一项的应用，其中所述药物被用于治疗选自登革热病毒感染、肠病毒感染、HIV感染、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、真菌感染、非洲锥虫病、疟疾、霍乱、脑膜炎和结核病的感染性疾病或病症。
42.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物被用于治疗选自结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、腹膜腔的癌症、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和成胶质细胞瘤的增殖性疾病或病症。
43.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物被用于治疗选自急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病和慢性髓性白血病的白血病。
44.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物被用于治疗增殖性疾病或病症；并且
4 5
R 和R 是顺-9-十八烯酰基。
45.权利要求31-35任一项的应用，其中所述药物被用于治疗增殖性疾病或病症；并且
4 5
R 和R 是顺-9-十八烯基。
46.多个表面修饰粒子，其用于增加活性剂的细胞摄取，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有1nm至2,000nm的平均尺寸：
其中n和m是1；
R1、R2和R3是甲基；并且
R4和R5独立地选自顺-9-十八烯酰基和顺-9-十八烯基，其中小分子为分子量低于
2500克/mol的有机化合物。
47.权利要求46的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子与吞噬细胞相接触。
48.权利要求46的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子与肿瘤细胞相接触。
49.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子能够通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、真皮内、关节内、鞘内、硬膜外、脑内、局部、口、通过肺途径、腹膜内或通过其组合给药。
50.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子能够通过鼻内、眼内、直肠、透皮、颊或通过其组合给药。
51.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子能够被给药于哺乳动物对象。
52.权利要求46-47任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗选自帕金森病、阿茨海默病、多发性硬化症、脑脊髓炎、脑炎、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症、额颞性痴呆症、朊病毒疾病、克-雅二氏病和肾上腺脑白质营养不良的神经变性疾病或病症。
53.权利要求46-47任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗选自类风湿关节炎、格雷夫斯病、重症肌无力、甲状腺炎、糖尿病、炎性肠病、自体免疫性卵巢炎、系统性红斑狼疮和舍格伦综合征的炎性疾病或病症。
54.权利要求46-47任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗选自登革热病毒感染、肠病毒感染、HIV感染、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、真菌感染、非洲锥虫病、疟疾、霍乱、脑膜炎和结核病的感染性疾病或病症。
55.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗选自结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、腹膜腔的癌症、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和成胶质细胞瘤的增殖性疾病或病症。
56.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗选自急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病和慢性髓性白血病的白血病。
57.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗
4 5
增殖性疾病或病症；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。
58.权利要求46-48任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子被用于治疗
4 5
增殖性疾病或病症；并且R 和R 是顺-9-十八烯基。
59.多个表面修饰粒子在制备用于治疗感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症、或增殖性疾病或病症的药物中的应用，其中所述药物包含有效减轻、治疗和/或防止与所述疾病或病症相关的症状或病理的量的表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有1nm至2,000nm的平均尺寸：
其中n和m是1；
1 2 3
R、R 和R 是甲基；并且
4 5
R 和R 独立地选自顺-9-十八烯酰基和顺-9-十八烯基。
60.权利要求59的应用，其中所述药物能够给药到体腔，其中所述体腔选自腹膜腔、膀胱腔、肺腔、胸膜腔、心腔、胃肠腔、眼的房水和眼的玻璃体液。
61.权利要求59-60任一项的应用，其中所述药物被用于治疗癌症，并且活性剂是抗肿瘤剂。
62.多个表面修饰粒子，其用于治疗患有感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症、或增殖性疾病或病症的对象，其中所述多个表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有1nm至2,000nm的平均尺寸：
其中n和m是1；
1 2 3
R、R 和R 是甲基；并且
4 5
R 和R 独立地选自顺-9-十八烯酰基和顺-9-十八烯基。
63.权利要求62的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子能够给药到体腔，其中所述体腔选自腹膜腔、膀胱腔、肺腔、胸膜腔、心腔、胃肠腔、眼的房水和眼的玻璃体液。
64.权利要求62-63任一项的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子用于治疗癌症，并且活性剂是抗肿瘤剂。
用于药物递送的组合物和方法
技术领域
[0001] 总的来说，本公开涉及包含涂层粒子的组合物，以及制造和使用这种用于靶向药物递送的组合物的方法。
[0002] 相关技术简述
[0003] 纳米粒子(包括纳米球)和微粒(包括微球)在本文中合称为“粒子”，是直径为约1nm至约10,000nm(10微米)、优选约1nm至约2,000nm(2微米)的固体或半固体粒子。这样的粒子可以从包括蛋白质、合成聚合物、多糖、核酸、小分子及其组合的各种材料形成，并且已被用于许多不同应用中，主要是分离、诊断和药物递送。
[0004] 已发现，包含这样的粒子的组合物可用于药物递送。例如，美国专利公布No.2006/0073199公开了包含活性剂的粒子能够被配制成水性悬液，并且通过在粒子上或周围提供表面活性剂涂层能够使粒子对聚集和粒子生长而言稳定。
[0005] 对于开发包含粒子的组合物及其制造和应用、特别是用于目标药物递送的方法，存在着持续不断的需求。
[0006] 发明概述
[0008]
[0009] 其中n和m独立地选自1、2、3、4、5和6；R1、R2和R3独立地选自C1至C8烷基；并且R4和R5独立地选自C6至C40烷基、C6至C40烯基、C6至C40炔基、C(＝O)(C5至C39烷基)、C(＝O)(C5至C39烯基)和C(＝O)(C5至C39炔基)。本发明的表面修饰粒子一般具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0010] 本发明的另一方面涉及增加活性剂的细胞摄取的方法。所述方法包含将细胞与表面修饰粒子在足以增加表面修饰粒子的细胞摄取的条件下相接触。粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。这些方法可以离体或在体内执行。每种增加活性剂的细胞摄取的方法都可以离体执行，即无需通过手术或疗法对人体或动物体进行任何治疗。或者，增加活性剂的细胞摄取的方法也可以在体内执行。细胞可以是吞噬细胞例如巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、无粒细胞、中性粒细胞及其组合。此外，细胞可以是肿瘤细胞。
[0011] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子在制备用于增加活性剂的细胞摄取的药物中的应用，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，粒子核心包含选自小分子、肽和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0012] 本发明的另一方面涉及用于增加活性剂的细胞摄取的多个表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，粒子核心包含选自小分子、肽和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0013] 本发明的另一方面涉及用于治疗患有炎性疾病或病症的对象的方法，所述方法包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗炎剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止与所述炎性疾病或病症相关的症状或病理。
[0014] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子在用制备于治疗炎性疾病或病症的药物中的应用，其中所述药物包含有效减轻、治疗和/或防止与炎性疾病或病症相关的症状或病理的量的表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，粒子核心包含活性剂(例如抗炎剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0015] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子或其药物组合物，其用于治疗患有炎性疾病或病症的对象，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，粒子核心包含活性剂(例如抗炎剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0016] 本发明的另一方面涉及用于治疗患有增殖性疾病或病症的对象的方法，所述方法包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗增殖剂，如抗肿瘤剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止与所述增殖性疾病或病症相关的症状或病理。
[0017] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子在制备用于治疗增殖性疾病或病症的药物中的应用，其中所述药物包含有效减轻、治疗和/或防止与增殖性疾病或病症相关的症状或病理的量的表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，粒子核心包含活性剂(例如抗增殖剂，如抗肿瘤剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0018] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子或其药物组合物，其用于治疗患有增殖性疾病或病症的对象，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，粒子核心包含活性剂(例如抗增殖剂，如抗肿瘤剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0019] 本发明的另一方面涉及用于治疗患有感染性疾病或病症的对象的方法，所述方法包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗感染药剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止与所述感染性疾病或病症相关的症状或病理。
[0020] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子在制备用于治疗感染性疾病或病症的药物中的应用，其中药物包含有效减轻、治疗和/或防止与感染性疾病或病症相关的症状或病理的量的表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗感染药剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0021] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子或其药物组合物，其用于治疗患有感染性疾病或病症的对象，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗感染药剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0022] 另一方面，本发明涉及用于治疗患有神经变性疾病或病症的对象的方法，所述方法包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗神经变性药剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止与所述神经变性疾病或病症相关的症状或病理。
[0023] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子在制备用于治疗神经变性疾病或病症的药物中的应用，其中所述药物包含有效减轻、治疗和/或防止与神经变性疾病或病症相关的症状或病理的量的表面修饰粒子，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗神经变性药剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0024] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子或其药物组合物，其用于治疗患有神经变性疾病或病症的对象，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗神经变性药剂)，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0025] 本发明的另一方面涉及用于治疗患有感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症或增殖性疾病或病症的对象的方法，所述方法包含将多个表面修饰粒子给药到所述对象的具有疾病或炎症位点的体腔内，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止与所述疾病或病症相关的症状或病理。
[0026] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子在制备用于治疗感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症或增殖性疾病或病症的药物中的应用，其中所述药物包含减轻、治疗和/或防止与所述疾病或病症相关的症状或病理的有效量的表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0027] 本发明的另一方面涉及多个表面修饰粒子或其药物组合物供用于治疗患有感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症或增殖性疾病或病症的对象，其中所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0028] 上面提到的用于治疗的每种方法，都可以通过使用细胞运输以将表面修饰粒子递送到对象的靶组织、或通过将表面修饰粒子局部给药到对象的具有疾病(例如癌症、感染)和/或炎症位点的体腔内，以便表面修饰粒子能够被位于体腔内的患病或炎性细胞摄取而实施。
[0030] 图1提供的图显示了用俄勒冈绿标记的DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188涂层紫杉醇粒子(无DOTAP)和用俄勒冈绿标记的DOTAP涂层紫杉醇粒子(DOTAP)的摄取。
[0031] 图2提供的图显示了DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188涂层紫杉醇粒子(DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)、用俄勒冈绿标记并储存3个月的DOTAP涂层紫杉醇粒子(DOTAP样品1)、新鲜制备的用俄勒冈绿标记的DOTAP涂层紫杉醇粒子(DOTAP样品2)和用俄勒冈绿标记的鱼精蛋白涂层紫杉醇粒子(鱼精蛋白)的摄取。
[0032] 图3提供的图显示了DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188涂层紫杉醇粒子的摄取。俄勒冈绿涂层粒子或含有DOTAP或不含DOTAP(无DOTAP)。在将细胞暴露于紫杉醇粒子之前将细胞培养1、2或6天。
[0033] 图4提供的图显示了用俄勒冈绿标记的DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188涂层紫杉醇粒子(DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)、用俄勒冈绿标记的DOTAP涂层紫杉醇粒子(DOTAP/DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)、用俄勒冈绿标记的乳酸-乙醇酸共聚物涂层紫杉醇粒子(PLGA/泊洛沙姆188)和用俄勒冈绿标记的磷脂酰丝氨酸涂层紫杉醇粒子(PS/DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)的摄取。
[0034] 图5提供的图显示了用俄勒冈绿标记的DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188涂层紫杉醇粒子(DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)、用俄勒冈绿标记的DOTAP涂层紫杉醇粒子(DOTAP/DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)和用俄勒冈绿标记的十六烷基三甲基溴化铵涂层紫杉醇粒子(CTAB/DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188)的摄取。
[0035] 详细描述
[0036] 所要求保护的发明容许有许多不同形式的实施方案。如本文所公开的优选实施方案应该被视为所要求保护的发明的原理的示例，因此不打算将所要求保护的发明的广泛方面限制于举例说明的实施方案。
[0037] 本发明的一个方面提供了包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层的表面修饰粒子。粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐：
[0038]
[0039] 其中n和m独立地选自1、2、3、4、5和6；R1、R2和R3独立地选自C1至C8烷基；并且R4和R5独立地选自C6至C40烷基、C6至C40烯基、C6至C40炔基、C(＝O)(C5至C39烷基)、C(＝O)(C5至C39烯基)和C(＝O)(C5至C39炔基)，并且所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。
[0040] 当在本文中使用时，术语“烷基”是指直链和支链饱和烃基，其非限制性示例包括甲基、乙基以及直链与支链丙基和丁基。烷基任选可以用例如一个或多个羟基(-OH)、氧基(＝O)、卤基(-F、-Cl、-Br或-I)和巯基(-SH)或其组合取代。
[0041] 当在本文中使用时，术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的直链和支链烃基，其非限制性示例包括直链和支链十六烯基和十八烯基。烯基任选可以用例如一个或多个羟基(-OH)、氧基(＝O)、卤基(-F、-Cl、-Br或-I)和巯基(-SH)或其组合取代。
[0042] 当在本文中使用时，术语“炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的直链和支链烃基，其非限制性示例包括直链和支链十六炔基和十八炔基。炔基任选可以用例如一个或多个羟基(-OH)、氧基(＝O)、卤基(-F、-Cl、-Br或-I)和巯基(-SH)或其组合取代。
[0044] 式I的R4和R5烷基可以具有例如6至40个碳原子、10至24个碳原子、14至18个碳原子、5至39个碳原子、9至23个碳原子和/或13至17个碳原子。
[0045] 式I的R4和R5烯基可以具有例如1、2、3、4、5、6个或更多个双键。R4和R5烯基可以具有例如6至40个碳原子、10至24个碳原子、14至18个碳原子、5至39个碳原子、9至23个碳原子和/或13至17个碳原子。
[0046] 式I的R4和R5炔基可以具有例如1、2、3、4、5、6个或更多个三键。R4和R5炔基可以具有例如6至40个碳原子、10至24个碳原子、14至18个碳原子、5至39个碳原子、9至23个碳原子和/或13至17个碳原子。
[0047] 在一些实施方案中，R4和R5独立地选自辛基、2-乙基己基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、顺-9-十六烯基、十八烷基、16-甲基十七烷基、反-9-十八烯基、顺-9-十八烯基、顺，顺-9，12-十八碳二烯基、反，反-9，12-十八碳二烯基、顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯基、反，反，反-9，12，15-十八碳三烯基、12-羟基-9-十八烯基、二十烷基、二十二烷基、顺-13-二十二烯基、二十四烷基、二十六烷基、二十八烷基、三十烷基、三十四烷基、辛酰基、癸酰基、十二酰基、十四酰基、十六酰基、十七酰基、十八酰基、二十酰基、二十二酰基、二十四酰基、顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯酰基、顺，顺，顺，顺-6，9，
12，15-十八碳四烯酰基、顺，顺，顺，顺，顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酰基、顺，顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酰基、顺，顺-9，12-十八碳二烯酰基、顺，顺，顺-6，9，12-十八碳三烯酰基、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酰基、顺，顺，顺，顺-5，8，
11，14-二十碳四烯酰基、顺-9-十八烯酰基、反-9-十八烯酰基、顺-13-二十二烯酰基、和顺-15-二十四烯酰基。
12，15-十八碳四烯酰基、顺，顺，顺，顺，顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酰基、顺，顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酰基、顺，顺-9，12-十八碳二烯酰基、顺，顺，顺-6，9，12-十八碳三烯酰基、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酰基、顺，顺，顺，顺-5，8，
11，14-二十碳四烯酰基、顺-9-十八烯酰基、反-9-十八烯酰基、顺-13-二十二烯酰基、和顺-15-二十四烯酰基。
[0048] 在一些实施方案中，m和n是1；R1、R2和R3是甲基；并且R4和R5是顺-9-十八烯酰基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTAP)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，1 2
3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)。在另一个实施方案中，m和n是1；R、R
3 4 5
和R 是甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯
1 2 3 4 5
化铵)。在一些实施方案中，活性剂是紫杉醇；m和n是1；R、R 和R 是甲基；并且R 和R是顺-9-十八烯酰基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTAP)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)。在其他实施方案中，活性
1 2 3 4 5
剂是紫杉醇；m和n是1；R、R 和R 是甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)。
3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)。在另一个实施方案中，m和n是1；R、R
3 4 5
和R 是甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯
1 2 3 4 5
化铵)。在一些实施方案中，活性剂是紫杉醇；m和n是1；R、R 和R 是甲基；并且R 和R是顺-9-十八烯酰基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTAP)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)。在其他实施方案中，活性
1 2 3 4 5
剂是紫杉醇；m和n是1；R、R 和R 是甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯基，即式I的表面活性剂是N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)或其盐(例如N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)。
[0049] 本发明的另一方面提供了增加活性剂被吞噬或非吞噬细胞摄取的方法，所述方法将细胞暴露于包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层的表面修饰粒子，从而形成荷载表面修饰粒子的细胞。粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含式I的表面活性剂或其盐，并且表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。观察到至少与细胞接触不具有包含式I的表面活性剂或其盐的涂层的粒子相比，活性剂被细胞的摄取增加。这样的方法可以在体内或离体执行，以形成荷载表面修饰粒子的细胞。
[0050] 在另一个实施方案中，本发明提供了多个表面修饰粒子在药物制备中的应用，所述药物用于增加活性剂被吞噬或非吞噬细胞的细胞摄取。
[0051] 在另一个实施方案中，本发明还提供了使用上面提到的荷载表面修饰粒子的细胞，通过细胞运输将包含多个表面修饰粒子的活性剂或药物组合物递送到哺乳动物对象的靶组织的方法。靶向递送表面修饰粒子的有效方法允许将更高浓度的治疗药剂以较低的全身不良作用和较低的毒性给药到疾病、肿瘤或感染位点。可以设想，各种给药方法例如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、腹膜内、口服等，将促进通行到淋巴系统、肝脏和其他组织靶的细胞对粒子增加的摄取。例如，对于各种疾病、包括沿着淋巴系统局部区域性侵入的头颈癌，设想了皮下给药。
[0052] 当在本文中使用时，“靶组织”或“组织靶”是指对象待治疗的特定组织。这样的靶组织的实例包括但不限于脑和中枢神经系统的其他部分、淋巴系统(例如淋巴结、骨髓、脾脏、胸腺等)、肝脏以及任何感染、炎症或肿瘤位点。
[0053] 除了通过细胞运输进行递送之外，向靶组织的递送还可以通过将表面修饰粒子局部给药到对象具有疾病(例如癌症、感染)和/或炎症位点的体腔中来进行，以便表面修饰粒子可以被位于体腔内的患病或炎性细胞摄取，从而将活性剂递送到非常靠近患病的组织靶。例如，腹膜腔的癌症例如卵巢癌、腹膜间皮细胞瘤、腹膜癌病等，可以通过将粒子或包含粒子的药物组合物腹膜内给药到腹膜腔内来治疗。同样地，膀胱的癌症、感染和/或炎症可以通过将粒子或包含粒子的药物组合物给药到膀胱腔内来治疗；肺的癌症、感染和/或炎症可以通过将粒子给药到肺腔内(例如通过吸入)来治疗；胸膜腔的癌症、感染和/或炎症可以通过将粒子给药到胸膜腔内来治疗；心腔的癌症、感染和/或炎症可以通过将粒子或包含粒子的药物组合物给药到心腔内来治疗；以及眼的癌症、感染和/或炎症可以通过将粒子或包含粒子的药物组合物给药到眼的房水或玻璃体液内来治疗。此外，胃肠的癌症、感染和/或炎症可以通过将粒子或包含粒子的药物组合物给药到胃和/或肠中(例如通过口服给药)来治疗。有利的是，当通过给药到含有疾病或炎症位点的体腔而将表面修饰粒子或包含表面修饰粒子的药物组合物给药到靠近和/或邻近疾病或炎症位点时，所述表面修饰粒子能够被位于疾病或炎症位点处的患病(例如癌性、被感染的)或炎性细胞摄取，从而观察到至少与细胞接触不具有包含式I的表面活性剂或其盐的涂层的粒子相比，本发明的表面修饰粒子被患病或炎性细胞的摄取增加。
[0054] 当在本文中使用时，“体腔”是指被支持性组织包围的相对空的空间或被支持性组织包围的流体填充的空间。当在本文中使用时，体腔涵盖了包围(并限定)腔的组织和腔的整个内部两者。示例性体腔包括腹膜腔、膀胱腔、肺腔、胸膜腔、心腔、胃肠腔、眼的房水和眼的玻璃体液。
[0055] 在一个方面，本发明设想了用于治疗患有炎性疾病或病症的对象的方法、组合物和药物，包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含本文中所限定的式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸大小，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止了与所述炎性疾病或病症相关的1 2 3
症状或病理。一种情况下，对象患有炎性疾病或病症，并且m和n是1；R、R 和R 是甲基；
4 5
并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗炎剂。活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输、或如本文中所述通过局部给药到炎症位点来执行。
症状或病理。一种情况下，对象患有炎性疾病或病症，并且m和n是1；R、R 和R 是甲基；
4 5
并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗炎剂。活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输、或如本文中所述通过局部给药到炎症位点来执行。
[0056] 另一个方面中，本发明设想了用于治疗患有神经变性疾病或病症的对象的方法、组合物和药物，包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含本文中所限定的式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸大小，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止了与所述神经变性疾病或病症相关的症状或病理。一种情况下，对象患有神经变性疾病或病症，并且m和n是1；
1 2 3 4 5
R、R 和R 是甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗神经变性药剂。活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输来执行。
1 2 3 4 5
R、R 和R 是甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗神经变性药剂。活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输来执行。
[0057] 又一个方面中，本发明设想了用于治疗患有增殖性疾病或病症的对象的方法、组合物和药物，包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含本文中所限定的式I的表面活性剂或其盐，所述表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸大小，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止了与所述增殖性疾病或病症相1 2 3
关的症状或病理。一种情况下，对象患有增殖性疾病或病症，并且m和n是1；R、R 和R 是
4 5
甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗增殖药剂例如抗肿瘤剂。
活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输、或如本文中所述通过局部给药到疾病位点来执行。
关的症状或病理。一种情况下，对象患有增殖性疾病或病症，并且m和n是1；R、R 和R 是
4 5
甲基；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗增殖药剂例如抗肿瘤剂。
活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输、或如本文中所述通过局部给药到疾病位点来执行。
[0058] 再一个方面中，本发明设想了用于治疗患有感染性疾病或病症的对象的方法、组合物和药物，包含向所述对象给药多个表面修饰粒子，所述表面修饰粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含本文中所限定的式I的表面活性剂或其盐，表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸大小，并且所述给药有效减轻、治疗和/或防止了与所述感染性疾病或病症相关1 2 3
的症状或病理。一种情况下，对象患有感染性疾病或病症，并且m和n是1；R、R 和R 是甲
4 5
基；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗感染药剂例如抗真菌剂、抗病毒剂、抗细菌剂或抗寄生虫药剂。活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输、或如本文中所述通过局部给药到疾病位点来执行。
的症状或病理。一种情况下，对象患有感染性疾病或病症，并且m和n是1；R、R 和R 是甲
4 5
基；并且R 和R 是顺-9-十八烯酰基。一种情况下，活性剂是抗感染药剂例如抗真菌剂、抗病毒剂、抗细菌剂或抗寄生虫药剂。活性剂的递送可以如本文中所述通过细胞运输、或如本文中所述通过局部给药到疾病位点来执行。
[0059] 因此，本文中公开的给药方法设想了治疗有效量的所述表面修饰粒子的给药。当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指根据本文所公开的治疗方法，足以减轻、缓解、清除、治疗和/或防止与所设想治疗的疾病或病症相关的症状或病理的表面涂层粒子的量。治疗有效量的确定完全在本技术领域的专业人员的能力范围之内，特别是根据本文提供的公开内容。
[0060] 下面对表面修饰粒子的描述适用于本文公开的所有实施方案。表面修饰粒子的活性剂可以是水溶性差的或是水溶性的。活性剂可以是治疗药剂或诊断药剂。活性剂可以是小分子或生物制剂例如蛋白质、肽、糖类、或复合物、接合物或其组合。在一种优选情况下，DNA、RNA、寡核苷酸和多核苷酸不是适合用于本发明的表面修饰粒子的活性剂。在本文公开的组合物和方法中使用的活性剂表现出通常与这样的活性剂相伴的药物活性，尽管活性剂可以被吞噬或非吞噬细胞摄取并随后递送到靶组织。正如上面讨论的，活性剂也可以在哺乳动物对象的疾病(例如癌症、感染)和/或炎症位点处局部给药，并被位于疾病和/或炎症位点处的患病细胞(例如感染细胞或癌细胞)或炎性细胞摄取。
[0061] 活性剂可以选自各种已知药物化合物，例如但不限于：镇痛药、麻醉药、兴奋剂、肾上腺素药剂、肾上腺素能阻断剂、抗肾上腺素药、肾上腺类皮质激素、拟肾上腺素药、抗胆碱能药剂、抗胆碱酯酶剂、抗惊厥药、烷基化剂、生物碱、别构抑制剂、促蛋白合成类固醇、减食欲剂、解酸剂、止泻剂、解毒剂、抗叶酸剂、退热药、抗风湿药剂、精神治疗药剂、神经阻断剂、抗炎剂、抗蠕虫药、抗凝剂、抗抑郁剂、抗癫痫药、抗纤维化药剂、抗感染剂(例如抗真菌剂、抗病毒剂例如抗反转录病毒剂例如核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和抗生素)、抗组胺剂、抗毒蕈碱药剂、抗分支杆菌药剂、抗肿瘤剂、抗原虫剂、抗焦虑镇静药、β-肾上腺素能受体阻断剂、皮质类固醇、镇咳剂、多巴胺能药物、止血剂、血液药剂、催眠药、免疫药剂、毒蕈碱药物、拟副交感神经功能药物、前列腺素类药物、放射药物、镇静剂、刺激剂、拟交感神经药物、维生素、黄嘌呤、生长因子、激素、抗朊病毒药剂、蛋白酶抑制剂及其组合。
[0062] 抗肿瘤剂的实例包括但不限于紫杉醇、紫杉醇衍生化合物、生物碱、抗代谢物、酶抑制剂、烷基化剂及其组合。
[0063] 活性剂还可以是蛋白酶抑制剂，例如HIV蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于茚地那韦、利托那韦、沙奎那韦、奈非那韦、阿扎那韦及其组合。
[0064] 活性剂可以是核苷反转录酶抑制剂。核苷反转录酶抑制剂的实例包括但不限于齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、拉米夫定及其组合。
[0065] 活性剂可以是非核苷反转录酶抑制剂。非核苷反转录酶抑制剂的实例包括但不限于依法韦仑、奈韦拉平、德拉维拉丁及其组合。
[0066] 抗炎剂的实例包括但不限于非甾类抗炎药、非选择性环加氧酶(COX)抑制剂、COX-1抑制剂、COX-2抑制剂、脂氧合酶抑制剂、皮质类固醇、抗氧化剂、肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂及其组合。COX-2抑制剂的实例包括但不限于塞来西布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布及其组合。
[0067] 诊断剂包括x-射线显像剂和造影介质。x-射线显像剂的实例包括WIN-8883(3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸乙酯)，也称为泛影酸乙基酯(EEDA)；WIN 67722，即(6-乙氧基-6-氧己基-3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酸酯；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘-苯甲酰氧基)丁酸乙酯(WIN 16318)；泛影酰氧基乙酸乙酯(WIN
12901)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙酸乙酯(WIN 16923)；N-乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基乙酰胺(WIN 65312)；异丙基-2-(3，
5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)乙酰胺(WIN 12855)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙二酸二乙酯(WIN 67721)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，
6-三碘苯甲酰氧基)苯乙酸乙酯(WIN 67585)；丙二酸，[[3，5-双(乙酰胺基)-2，4，5-三碘苯甲酰基]氧基]双(1-甲基)酯(WIN 68165)；和苯甲酸，3，5-双(乙酰胺基)-2，4，
6-三碘-4-(乙基-3-乙氧基-2-丁烯酸)酯(WIN 68209)。造影剂包括预期在生理条件下相对快速分解，因此使任何与粒子相关的炎性响应降到最低的造影剂。分解可以由酶水解、羧酸在生理pH下的增溶作用或其他机制引起。因此，包括了溶解差的碘代羧酸例如胆影酸、泛影酸和甲泛影酸以及水解不稳定的碘代物质例如WIN 67721、WIN 12901、WIN 68165和WIN 68209。
12901)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙酸乙酯(WIN 16923)；N-乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基乙酰胺(WIN 65312)；异丙基-2-(3，
5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)乙酰胺(WIN 12855)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙二酸二乙酯(WIN 67721)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，
6-三碘苯甲酰氧基)苯乙酸乙酯(WIN 67585)；丙二酸，[[3，5-双(乙酰胺基)-2，4，5-三碘苯甲酰基]氧基]双(1-甲基)酯(WIN 68165)；和苯甲酸，3，5-双(乙酰胺基)-2，4，
6-三碘-4-(乙基-3-乙氧基-2-丁烯酸)酯(WIN 68209)。造影剂包括预期在生理条件下相对快速分解，因此使任何与粒子相关的炎性响应降到最低的造影剂。分解可以由酶水解、羧酸在生理pH下的增溶作用或其他机制引起。因此，包括了溶解差的碘代羧酸例如胆影酸、泛影酸和甲泛影酸以及水解不稳定的碘代物质例如WIN 67721、WIN 12901、WIN 68165和WIN 68209。
[0069] 治疗药剂和诊断药剂的类别和每类中的物质的名单的描述，可见于Martindale，《大药典》(The Extra Pharmacopoeia)，第31版，The Pharmaceutical Press，London，1996，其在此引为参考并作为本文的一部分。所列出的治疗药剂和诊断药剂是可商购的和/或可以通过已知方法制备。
[0070] 在具体实施方案中，活性剂是水溶性差的化合物。“水溶性差”的意义是指化合物在水中的溶解度小于约10mg/mL、优选小于约1mg/mL。这些水溶性差的化合物特别适合用于水性悬液制剂，因为将这些化合物配制在水性介质中的可选方案有限。有利的是，提供了本发明的涂层的式I的表面活性剂或其盐，能够吸附到包含这种水溶性差的活性剂的粒子的表面上，在其上形成基本上均匀的涂层。例如，式I的表面活性剂或其盐的疏水性尾部部分，能够与粒子表面上的疏水区域相结合。此外，式I的表面活性剂或其盐带有正电荷，因此，所述表面活性剂与粒子表面上带负电荷的区域之间的静电相互作用能够使包含式I的表面活性剂或其盐的涂层稳定。在一种优选情况下，水溶性差的活性剂化合物是分子量低于2500克/mol、低于2000克/mol并且最典型低于1000克/mol、例如在200克/mol至900克/mol之间的有机化合物。这样的有机化合物在本文中被称为“小分子”。
[0071] 或者，本发明可以用水溶性化合物来实践。为了形成水溶性化合物的水性悬液，可以将水溶性活性化合物包埋在固体载体基质(例如聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(polylactate-polyglycolate copolymer)、白蛋白、淀粉)中或囊封在基本上不透过活性剂的包围囊泡中。这种囊封性囊泡可以是聚合物包衣例如聚丙烯酸酯。此外，从这些水溶性化合物制备的小粒子可以被改性以提高化学稳定性，并通过控制化合物从粒子的释放来控制化合物的药代动力学性质。水溶性化合物的实例包括但不限于简单的有机化合物、蛋白质、肽类、核苷酸和糖类。
[0072] 下面关于粒子的描述也适用于本文公开的所有实施方案。当通过适合的分析方法例如差示扫描量热术(DSC)或X-射线衍射进行测定时，粒子可以是无定形的、半晶体、晶体或其组合。在给药之前，粒子可以通过均质化方法进行均化。粒子也可以通过微沉淀/均质化方法来均化。
[0073] 当通过动态光散射方法(例如光子相关光谱术、激光衍射、小角激光光散射(LALLS)、中角激光光散射(MALLS))、光遮蔽方法(例如Coulter方法)、流变学、或显微术(光学或电子)测量时，涂层粒子一般具有通常约1nm至约2μm(或2000纳米)的平均有效粒度。优选的平均有效粒度取决于多种因素，例如化合物所打算的给药途径、制剂、溶解度、毒性和生物利用度。其他适合的粒度包括但不限于约10nm至约1μm、约50nm至约500nm和/或约100nm至约250nm。
[0074] 在所有实施方案中，涂层粒子是包含活性剂的固体或半固体粒子。涂层粒子通常由至少5％(w/w)活性剂例如至少10％(w/w)、至少25％(w/w)、至少50％(w/w)和/或至少75％(w/w)或更多的活性剂构成。
[0075] 粒子核心的制备
[0076] 制备在本发明中使用的粒子的方法可以通过许多技术来实现。用于制备粒子的技术的代表性但不是穷举性的讨论如下。
[0077] I.用于形成小粒子分散体的能量加入技术
[0078] 一般来说，使用能量加入技术制备小粒子分散体的方法，包括将活性剂或药物活性化合物、有时应该被称为药物，以松散形式添加到适合的介质例如通常含有一种或多种下面提出的表面活性剂的水或水性溶液、或药物化合物不能明显溶解在其中的其他液体中以形成第一悬液的步骤，所述悬液应该被称为预悬液。向预悬液添加能量以形成物理上比预悬液更稳定的粒子分散体。能量通过机械研磨(例如珠磨、球磨、锤磨、流体能磨、喷射磨或湿法研磨)来添加。这样的技术公开在美国专利No.5,145,684中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。
[0079] 能量加入技术还包括利用微射流机对预悬液施加高剪切条件包括空化、剪切或冲击力。本发明还设想使用活塞间隙均质机或逆流式均质机向预悬液添加能量，所述均质机例如在美国专利No.5,091,188中所公开的，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部TM分。适合的活塞间隙均质机可以在商品名EMULSIFLEX (Avestin)和FRENCH Pressure Cell(Thermo Spectronic)下商购。适合的微射流机可以从Microfluidics Corp商购。
[0080] 添加能量的步骤还可以使用超声技术来实现。超声步骤可以使用任何适合的超声装置来进行。适合的装置包括Branson S-450A型和Cole-Parmer 500/750瓦型。这样的装置在工业中是公知的。超声装置典型具有插入到预悬液中以将超声能发射到溶液中的超声辐射体或探头。在本发明的优选形式中，超声装置在约1kHz至约90kHz、更优选约20kHz至约40kHz或其中的任何范围或范围组合的频率下操作。探头尺寸可以变化，并优选采取不同尺寸例如1/2英寸或1/4英寸等。
[0081] 小粒子的分散体在给药前可以进行灭菌。灭菌可以通过热灭菌、γ辐射、过滤(作为具有小于200nm的粒度的分散体直接过滤，或者在形成固体分散体之前对沉淀过程中使用的溶液进行除菌过滤)和通过施加非常高的压力(高于2000个大气压)或通过高压和升高温度的组合来实现。
[0082] II.用于制备亚微米尺寸粒子分散体的沉淀方法
[0083] 小粒子分散体也可以通过沉淀技术来制备。下面是沉淀技术的实例的描述。
[0084] 微量沉淀方法.微量沉淀方法的一个实例公开在美国专利No.5,780,062中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。’062号专利公开了有机化合物沉淀方法，其包括：(i)将有机化合物溶解在与水混溶的第一溶剂中；(ii)制备聚合物和两亲分子在水性第二溶剂中的溶液，并且有机化合物基本上不溶于所述第二溶剂中，由此形成聚合物/两亲分子复合物；以及(iii)混合步骤(i)和(ii)的溶液，从而导致有机化合物与聚合物/两亲分子复合物的聚集体的沉淀。
[0085] 其他适合的沉淀方法公开在美国专利No.6,607,784、7,037,528、6,869,617、6,884,436中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。所公开的方法包括下列步骤：(1)将有机化合物溶解在与水混溶的第一有机溶剂中以产生第一溶液；(2)将第一溶液与第二溶剂或水混合来沉淀有机化合物以产生预悬液；以及(3)以高剪切混合或热的形式向预悬液加入能量，以提供小粒子的分散体。任选地，通过任何适合的手段例如离心或过滤方法从混合物移除第一有机溶剂。此外，分散体的连续相可以任选被另一种连续相代替，这可以通过使用诸如离心和过滤的方法移除第一种连续相、并添加第二种连续相然后将固体物质在第二种连续相中重新分散来进行。下面提出的一种或多种任选表面活性剂可以添加至第一有机溶剂、第二水性溶液或第一有机溶剂和第二水性溶液两者。
[0086] 乳液沉淀方法.一种适合的乳液沉淀技术公开在美国专利公布No.2005/0037083中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。以这种方式，方法包括下列步骤：(1)提供具有有机相和水性相的多相系统，有机相在其中具有药物活性化合物；以及(2)对系统进行超声来蒸发一部分有机相，引起化合物在水性相中沉淀以形成小粒子的分散体。提供多相系统的步骤包括下列步骤：(1)将与水不混溶的溶剂与药物活性化合物混合以确定有机溶液，(2)使用一种或多种表面活性化合物制备水基溶液，以及(3)将有机溶液与水性溶液混合以形成多相系统。将有机相与水性相混合的步骤可以包括使用活塞间隙均质机、胶体磨、高速搅拌设备、挤出设备、手动搅拌或振荡设备、微射流机或用于提供高剪切条件的其他设备或技术。粗乳液将在水中具有尺寸为直径约小于1μm的油滴。对粗乳液进行超声以确定微乳液，并最终提供小粒子的分散体。
[0087] 制备小粒子的分散体的另一种方法公开在美国专利No.6,835,396中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。方法包括下列步骤：(1)提供具有有机相和水性相的多相系统的粗分散体，有机相在其中具有药物化合物；(2)向粗分散体提供能量以形成细分散体；(3)将细分散体冷冻；以及(4)将细分散体冷冻干燥以获得药物化合物的小粒子。小粒子可以通过下面提出的技术灭菌，或者小粒子可以在水性介质中重构并灭菌。
[0088] 提供多相系统的步骤包括下列步骤：(1)将与水不混溶的溶剂与药学有效化合物混合以确定有机溶液；(2)使用一种或多种表面活性化合物制备水基溶液；以及(3)将有机溶液与水性溶液混合以形成多相系统。将有机相与水性相混合的步骤包括使用活塞间隙均质机、胶体磨、高速搅拌设备、挤出设备、手动搅拌或振荡设备、微射流机或用于提供高剪切条件的其他设备或技术。
[0089] 溶剂-反溶剂沉淀.小粒子分散体也可以使用由Fessi等在美国专利No.5,118,528中和由Leclef等在美国专利No.5,100,591中公开的溶剂-反溶剂沉淀技术来制备，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部分。两种方法都包括下列步骤：(1)制备生物活性物质在可以向其中添加一种或多种表面活性剂的溶剂或溶剂混合物中的液体相；(2)制备非溶剂或非溶剂混合物的第二种液体相，所述非溶剂与物质的溶剂或溶剂混合物混溶；(3)在搅拌下将(1)和(2)的溶液加到一起；以及(4)除去不想要的溶剂以产生小粒子的分散体。这些方法与上一节“微量沉淀方法”下描述的方法的区别在于，它们不提供以高剪切混合或热量形式向悬液加入能量的最后一步。
[0090] 相转化沉淀.小粒子分散体可以使用如美国专利No.6,235,224、6,143,211和6,616,869中所公开的相转化沉淀来形成，所述每个专利在此引为参考并作为本发明的一部分。相转化是用于描述溶解在连续相溶剂系统中的聚合物转变成聚合物作为连续相的固体大分子网络的物理现象的术语。诱导相转化的一种方法是通过向连续相添加非溶剂。聚合物经历从单一相向不稳定的两相混合物、即富聚合物和贫聚合物部份的转变。非溶剂在富聚合物相中的胶束滴起到成核位点的作用并变得被聚合物包被。’224号专利公开了聚合物溶液在某些条件下的相转化能够导致自发形成离散微粒、包括纳米粒子。’224号专利公开了聚合物在溶剂中的溶解或分散。药剂也被溶解或分散在溶剂中。为了使晶体接种步骤在这种方法中有效，适宜将药剂溶解在溶剂中。聚合物、药剂和溶剂一起形成具有连续相的混合物，其中溶剂是连续相。然后将混合物导入到至少10倍过量的可混溶非溶剂中，以引起自发形成平均粒度在10nm至10μm之间的药剂微囊化微粒。粒度受到溶剂∶非溶剂体积比、聚合物浓度、聚合物-溶剂溶液的黏度、聚合物的分子量和溶剂-非溶剂对的特性的影响。
[0091] pH变换沉淀.小粒子分散体可以通过pH变换沉淀技术来形成。这样的技术典型地包括将药物溶解在具有可以溶解药物的pH的溶液中的步骤，随后进行将pH改变到药物不再可溶的点的步骤。取决于具体的药物化合物，pH可以是酸性或碱性的。然后将溶液中和以形成小粒子的分散体。一种适合的pH变换沉淀方法公开在美国专利No.5,665,331中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。该方法包括将药剂与晶形调变剂(CGM)一起溶解在碱溶液中、然后在适合的表面改性表面活性剂存在下用酸中和溶液以形成药剂的小粒子分散体的步骤。沉淀步骤后可以进行分散体的透滤净化、然后将分散体的浓度调整至所需水平的步骤。
[0092] pH变换沉淀方法的其他实例公开在美国专利No.5,716,642、5,662,883、5,560,932和4,608,278中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。
[0093] 灌注沉淀方法.适合用于形成小粒子分散体的灌注沉淀技术公开在美国专利No.4,997,454和4,826,689中，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部分。首先，将适合的固体化合物溶解在适合的有机溶剂中以形成溶剂混合物。然后，将与有机溶剂混溶的沉淀用非溶剂在约-10℃至约100℃之间的温度下，以每50ml体积每分钟约0.01ml至每分钟约1000ml的灌注速率灌注到溶剂混合物中，以形成化合物的沉淀的非聚集固体粒子的悬液，所述粒子具有小于10μm的基本上均匀的平均直径。优选将被灌注的溶液与沉淀用非溶剂一起搅拌(例如通过搅动)。非溶剂可以含有表面活性剂以使粒子稳定以防聚集。然后将粒子与溶剂分离。根据本发明，取决于固体化合物和所需粒度，可以改变温度、非溶剂与溶液比率、灌注速率、搅拌速率和体积这些参数。粒度与非溶剂；溶剂体积的比率和灌注温度成正比，并与灌注速率和搅拌速率成反比。取决于化合物的相对溶解性和所需的悬浮介质，沉淀用非溶剂可以是水性或非水性的。
[0094] 温度变换沉淀.温度变换沉淀技术可用于形成小粒子分散体。这种技术公开在美国专利No.5,188,837中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。在本发明的实施方案中，脂质球(liposphere)通过下列步骤制备：(1)将待递送物质例如药物熔化或溶解在熔融介质中，以形成待递送物质的液体；(2)在高于所述物质或介质的熔点温度的温度下向熔化的物质或介质加入磷脂以及水性介质；(3)将悬液在高于介质的熔点温度的温度下混合直至获得均匀的细粒制备物；以及然后(4)将制备物快速冷却至室温或更低温度。
[0095] 溶剂蒸发沉淀.溶剂蒸发沉淀技术公开在美国专利No.4,973,465中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。’465号专利公开了制备微晶体的方法，其包括下列步骤：(1)提供溶解在常用有机溶剂或溶剂组合中的药物组合物和磷脂的溶液，(2)蒸发溶剂，以及(3)将通过溶剂蒸发获得的薄膜通过剧烈搅拌悬浮在水性溶液中，以形成小粒子的分散体。可以通过蒸发足够量的溶剂来移除溶剂，以引起化合物沉淀。也可以通过其他公知的技术、例如向溶液施加真空或在溶液上方吹氮气来移除溶剂。
[0096] 反应沉淀.反应沉淀包括将药物化合物和任选的其他赋形剂溶解在适合的溶剂中以形成溶液的步骤。化合物可以添加到所述化合物在溶剂中的饱和点或更低的量。化合物或任何赋形剂通过与化学试剂反应、或通过对施加能量例如热或UV光等做出响应而改性，使改性化合物在溶剂中具有较低溶解度并从溶液沉淀以形成小粒子分散体，从溶液中沉淀出来。赋形剂的沉淀提供了固体基质，药物吸附在其中。
[0097] 压缩流体沉淀.适合用于通过压缩流体进行沉淀的技术公开在Johnston的WO97/14407中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。方法包括将水不溶性药物溶解在溶剂中以形成溶液的步骤。然后将溶液喷洒在压缩流体中，所述流体可以是气体、液体或超临界流体。向溶质在溶剂中的溶液添加压缩流体导致溶质达到或接近过饱和状态，并作为细小粒子沉淀出来。在这种情况下，压缩流体起到降低用于溶解药物的溶剂的内聚能密度的反溶剂的作用。
[0098] 或者，可以将药物溶解在压缩流体中，然后喷洒到水性相中。压缩流体的快速膨胀降低了流体的溶解能力，进而引起溶质作为小粒子在水性相中沉淀出来。在这种情况下，压缩流体起到溶剂的作用。
[0099] 为了使粒子稳定以防聚集，在这种技术中包含了表面改性剂例如表面活性剂。
[0100] 喷洒到低温流体中.适合用于通过压缩流体进行沉淀的技术由Williams等公开在美国专利公布No.2004/0022861中，其在此引为参考并作为本发明的一部分。方法提供了用于生产小粒子的系统和方法，其中将活性成分与水、一种或多种溶剂或其组合进行混合，并将得到的混合物喷洒在低温流体表面处或其下方。由此提供了冷冻粒子。也可以加入用于囊封固体粒子的材料，以便产生囊封剂包围活性剂的冷冻粒子。
[0101] 蛋白质纳米球/微球沉淀.在本发明中使用的粒子也可以从包含将大分子例如蛋白质与水溶性聚合物混合或溶解的方法来生产。这种方法公开在美国专利No.5,981,719、6,090,925、6,268,053、6,458,387和美国专利公布No.2004/0043077中，在此引为参考并作为本发明的一部分。在本发明的实施方案中，通过将溶液中的大分子与溶液中的聚合物或聚合物混合物在接近大分子的等电点的pH下混合来制备粒子。将混合物在能量源例如热、辐射或电离存在下温育预定量的时间。可以通过物理分离方法将如此产生的粒子与溶液中存在的任何未掺入的组分分开。
[0102] 存在众多其他适合用于制备能够在本发明中使用的小粒子分散体的方法。
[0103] III.用于制备药物组合物的粒子分散体的其他方法
[0104] 下列用于制备在本发明中使用的药物组合物(即活性剂或有机化合物)粒子的其他方法，可以分成四大类。每类方法共有下列步骤：(1)将有机化合物溶解在与水混溶的第一溶剂中以产生第一溶液，(2)将第一溶液与水的第二溶剂混合来沉淀有机化合物以产生预悬液，以及(3)以高剪切混合或热或二者的组合的形式向预悬液加入能量，以提供具有如上限定的所需尺寸范围的有机化合物的稳定形式。混合步骤和加入能量步骤可以在连续步骤中或同时执行。
[0105] 方法的类别根据有机化合物的物理性质来区分，所述物理性质通过在能量加入步骤之前和能量加入步骤之后进行x-射线衍射研究、差示扫描量热术(DSC)研究或其他适合的研究来确定。在第一类方法中，在能量加入步骤之前，预悬液中的有机化合物采取无定形形式、半结晶形式或过冷液体形式，并具有平均有效粒度。在能量加入步骤后，有机化合物是结晶形式，其具有与预悬液基本上相同或较小的平均有效尺寸。
[0106] 在第二类方法中，在能量加入步骤之前，有机化合物处于结晶形式并具有平均有效尺寸。在能量加入步骤后，有机化合物处于具有与能量加入步骤前基本上相同的平均有效粒度的结晶形式，但能量加入步骤后晶体不太可能聚集或形成大晶体。
[0107] 通过激光动态光散射和光学显微术观察到了有机化合物聚集或形成大晶体的较低倾向。
[0108] 在第三类方法中，在能量加入步骤之前，有机化合物处于易碎并具有平均有效粒度的结晶形式。术语“易碎”的意义是指粒子是脆的并更容易破碎成更小的粒子。在能量加入步骤后，有机化合物处于平均有效粒度比预悬液的晶体更小尺寸的结晶形式。通过采取将有机化合物置于易碎结晶形式所需的步骤，与处于不太易碎结晶形态的有机化合物相比，随后的能量加入步骤可以更快和有效地执行。
[0109] 在第四类方法中，对第一溶液和第二溶剂同时进行能量加入步骤。因此，没有测量能量加入步骤之前和之后有机化合物的物理性质。
[0110] 能量加入步骤可以用任何方式执行，其中预悬液或第一溶液和第二溶剂暴露于空化、剪切或冲击力。在一种形式中，能量加入步骤是退火步骤。在本发明中退火被定义为通过单次或重复地施加能量(直接加热或机械应力)然后进行热弛豫、将热动力学不稳定的物质转变成更稳定形式的过程。这种能量的降低可以通过固体形式从不太有序向更加有序的晶格结构的转变来实现。或者，这种稳定化作用可以通过表面活性剂分子在固体-液体界面处的重排序而产生。
[0111] 下面分别显示这四类方法。然而，应该理解，可以对方法的条件例如表面活性剂或表面活性剂组合的选择、使用的表面活性剂的量、反应温度、溶液混合速率、沉淀速率等进行选择，以允许加工接下来讨论的任一门类下的药物。
[0112] 第一类方法以及第二、第三和第四类方法，可以进一步分成两个亚类，方法A和B。
[0113] 按照下述方法，第一溶剂是目标有机化合物在其中相对可溶并且能够与第二溶剂混溶的溶剂或溶剂混合物。这样的溶剂包括但不限于与水混溶的质子性化合物，其中分子中的氢原子与电负性原子例如氧、氮或元素周期表中其他的VA、VIA和VII A族原子结合。这样的溶剂的实例包括但不限于醇、胺(伯胺或仲胺)、肟、氧肟酸、羧酸、磺酸、膦酸、磷酸、酰胺和脲。
[0114] 第一溶剂的其他实例还包括非质子有机溶剂。这些非质子溶剂中有些可以与水形成氢键，但是只能作为质子受体，因为它们缺乏有效的供质子基团。一类非质子溶剂是偶极非质子溶剂，其被国际纯粹与应用化学协会(International Union of Pure and Applied Chemistry)(《IUPAC化学术语汇编》(IUPAC Compendium of Chemical Terminology)，第二版，1997)定义为：具有高于约15的比较高的相对电容率(或介电常数)和相当大的永久偶极矩、不能提供适当不稳定的氢原子以形成强氢键的溶剂，例如二甲基亚砜。
[0115] 偶极非质子溶剂可以选自：酰胺(全取代的，具有缺乏相连的氢原子的氮)、脲(全取代的，没有与氮相连的氢原子)、醚、环醚、腈、酮、砜、亚砜、全取代的磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、硝基化合物等。二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、2-吡咯烷酮、1，3-二甲基咪唑烷酮(DMI)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、二噁烷、丙酮、四氢呋喃(THF)、四亚甲基砜(环丁砜)、乙腈和六甲基磷酰胺(HMPA)、硝基甲烷等，是该类的成员。
[0116] 也可以选择一般与水不混溶、但是在小体积下(低于10％)具有足够水溶性的溶剂，来用作在这些小体积下与水混溶的第一溶剂。实例包括芳香族烃类、烯烃、烷烃和卤代芳香化合物、卤代烯烃和卤代烷烃。芳香化合物包括但不限于苯(取代或未取代的)和单环或多环芳烃。取代的苯的实例包括但不限于二甲苯(邻、间或对位)和甲苯。烷烃的实例包括但不限于己烷、新戊烷、庚烷、异辛烷和环己烷。卤代芳香化合物的实例包括但不限于氯苯、溴苯和氯甲苯。卤代烷烃和烯烃的实例包括但不限于三氯乙烷、二氯甲烷、二氯乙烷(EDC)等。
[0117] 适合用作第一溶剂的溶剂的其他具体实例包括但不限于：N-甲基-2-吡咯烷酮(也称为N-甲基-2-吡咯烷酮)、2-吡咯烷酮(也称为2-吡咯烷酮)、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、乙酸、乳酸、甲醇、乙醇、异丙醇、3-戊醇、正戊醇、苯甲醇、甘油、丁二醇、乙二醇、丙二醇、单酰化和二酰化甘油单酸酯(例如辛酸甘油酯)、异山梨醇二甲醚、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、1，4-二噁烷、四亚甲基砜(环丁砜)、乙腈、硝基甲烷、四甲基脲、六甲基磷酰胺(HMPA)、四氢呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、叔丁基甲基醚(TBME)、芳香族烃类、烯烃、烷烃、卤代芳香化合物、卤代烯烃、卤代烷烃、二甲苯、甲苯、苯、取代的苯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、氯苯、溴苯、氯甲苯、三氯乙烷、二氯甲烷、二氯乙烷(EDC)、己烷、新戊烷、庚烷、异辛烷、环己烷、聚乙二醇(PEG，例如PEG-4、PEG-8、PEG-9、PEG-12、PEG-14、PEG-16、PEG-120、PEG-75、PEG-150)、聚乙二醇酯(实例例如PEG-4二月桂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-6异硬脂酸酯、PEG-8棕榈酰硬脂酸酯、PEG-150棕榈酰硬脂酸酯)、聚乙二醇失水山梨糖醇(例如PEG-20失水山梨糖醇异硬脂酸酯)、聚乙二醇单烷基醚(实例例如PEG-3二甲基醚、PEG-4二甲基醚)、聚丙二醇(PPG)、聚丙烯藻酸酯、PPG-10丁二醇、PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚、PPG-15硬脂基醚、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇月桂酸酯和三缩四乙二醇(四氢呋喃基醇聚乙二醇醚)。优选的第一溶剂是N-甲基-2-吡咯烷酮。另一种优选的第一溶剂是乳酸。
[0118] 第二溶剂是水性溶剂。该水性溶剂可以是水本身。该溶剂也可以包含缓冲剂、盐、表面活性剂、水溶性聚合物以及这些赋形剂的组合。
[0119] 方法A.在方法A中，首先将有机化合物(“活性剂”或“药物”)溶解在第一溶剂中以产生第一溶液。取决于有机化合物在第一溶剂中的溶解度，可以添加约0.1％(w/v)至约50％(w/v)的有机化合物。为了确保化合物在第一溶剂中全部溶解，可能需要将浓缩物在约30℃至约100℃加热。
[0120] 第二水性溶剂提供有一种或多种任选的表面改性剂，例如向其添加阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂或生物表面活性分子。适合的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、藻酸钠、磺基琥珀酸二辛基钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其它胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠等)。
[0121] 两性离子表面活性剂是电中性的，但是在同一分子内具有局部正和负电荷。适合的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。适合的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(例如二肉豆蔻基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。包含阴离子和两性离子磷脂的磷脂混合物也可以用在本发明中。这样的混合物包括但不限于溶血磷脂、卵或大豆磷脂或其任何组合。磷脂、不论是阴离子、两性离子还是磷脂的混合物，都可以成盐或脱盐、加氢或部分加氢，或是天然、半合成或合成的。在本发明中，磷脂也可以与水溶性或亲水性聚合物接合，以特异性靶向递送到巨噬细胞。然而，接合的磷脂在其他应用中可用于靶向其他细胞或组织。优选的聚合物是聚乙二醇(PEG)，其也被称为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。PEG的分子量可以不同，例如从200至50,000。一些常用的可商购PEG包括PEG 350、PEG 550、PEG 750、PEG 1000、PEG 2000、PEG 3000和PEG 5000。磷脂或PEG-磷脂接合物也可以包含能够与配体共价连接的官能团，所述配体包括但不限于蛋白质、肽类、糖类、糖蛋白、抗体或药学活性剂。这些官能团可以通过例如酰胺键形成、二硫化合物或硫醚形成、或生物素/链亲合素结合与配体接合。配体结合性官能团的实例包括但不限于己酰胺、十二烷基胺、1，12-十二烷二羧酸酯、硫代乙醇、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(MPB)、4-(对马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酰胺(MCC)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PDP)、琥珀酸酯、戊二酸酯、十二烷酸酯和生物素。
[0122] 适合的阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苯甲基氯化铵、酰基肉毒碱盐酸盐、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP，也称为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵)、N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨甲酰基胆甾醇(DC-Chol)、1，2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶卤化物或长链烷基胺例如正辛基胺和油烯基胺。本文中所限定的式I的表面活性剂或其盐也是适合的阳离子表面活性剂。
[0123] 适合的非离子表面活性剂包括：甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚(MACROGOLTM和BRIJTM)TM聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酸酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯(MYRJ )、失水山梨糖TM
醇酯(SPAN )、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂基醇、硬脂醇、芳烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖包括淀粉和淀粉衍生物例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在优选形式中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，优选为丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。这样的聚合物在商品名泊洛沙姆(POLOXAMER)、有时也称为PLURONIC 下销售，并由几家供应商包括Spectrum Chemical和Ruger销售。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的聚氧乙烯脂肪酸酯。这样的表面活性剂的一个实例是由BASF Aktiengesellschaft制造的SOLUTOL HS 15、聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
醇酯(SPAN )、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂基醇、硬脂醇、芳烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖包括淀粉和淀粉衍生物例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在优选形式中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，优选为丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。这样的聚合物在商品名泊洛沙姆(POLOXAMER)、有时也称为PLURONIC 下销售，并由几家供应商包括Spectrum Chemical和Ruger销售。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的聚氧乙烯脂肪酸酯。这样的表面活性剂的一个实例是由BASF Aktiengesellschaft制造的SOLUTOL HS 15、聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
[0124] 表面活性生物分子包括分子例如白蛋白、酪蛋白、水蛭素或其他适合的蛋白。例如，具有亲水和疏水结构域的蛋白也可以使用。还包括多糖表面活性生物制品，其包括但不限于淀粉、肝素和壳聚糖。其他适合的表面活性剂包括任何氨基酸例如亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，或这些氨基酸的任何衍生物例如酰胺或酯衍生物以及从这些氨基酸形成的多肽。
[0125] 还可能需要向第二溶剂添加pH调节剂。适合的pH调节剂包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、单羧酸(例如乙酸和乳酸)、二羧酸(例如琥珀酸)、三羧酸(例如柠檬酸)、THAM(三(羟基甲基)氨基甲烷)、甲葡胺(N-甲基葡萄糖胺)、氢氧化钠、和氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸和亮氨酸。第二溶剂应该具有约3至约11范围内的pH。水性介质可以另外包含渗透压调节剂，例如但不限于甘油、单糖例如葡萄糖、二糖例如蔗糖、三糖例如棉子糖、以及糖醇例如甘露糖醇、木糖醇和山梨糖醇。
[0126] 对于口服剂型来说，可以使用一种或多种下列赋形剂：明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、阿拉伯胶、胆固醇、黄蓍胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂基醇、聚西托醇乳化蜡、失水山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚例如聚乙二醇醚例如聚西托醇TM1000、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯例如可商购的TWEENS 、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸酯、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。大多数这些赋形剂详细描述在由美国药学协会(American Pharmaceutical Association)和大不列颠药学会(The Pharmaceutical Society of Great Britain)联合出版的《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，the Pharmaceutical Press，1986中。表面改性剂是可商购的和/或可以通过本技术领域已知的技术制备。两种或多种便面改性剂可以组合使用。
[0127] 在优选形式中，用于制备有机化合物的小粒子的方法包括向第二溶剂添加第一溶液的步骤。添加速率取决于批量大小和有机化合物的沉淀动力学。典型地，对于小规模实验室方法(制备1升)来说，添加速率为每分钟约0.05cc至每分钟约10cc。在添加期间，溶液应该在恒定搅拌下。使用光学显微术观察到，形成了无定形粒子、半结晶固体或过冷液体以产生预悬液。方法还包括对预悬液进行能量加入步骤以将无定形粒子、过冷液体或半结晶固体转变成更稳定的结晶固体状态的步骤。当通过动态光散射方法(例如光子相关光谱术、激光衍射、小角激光光散射(LALLS)、中角激光光散射(MALLS))、光遮蔽方法(例如Coulter方法)、流变学或显微术(光学或电子)测量时，得到的粒子将具有上面提出的范围内的平均有效尺寸。在第四类方法中，在进行能量加入步骤的同时将第一溶液与第二溶剂合并。
[0128] 能量加入步骤包括通过超声、均质化、反向流均质化、微流化或提供冲击、剪切或空化力的其他方法来加入能量。在此阶段期间，可以对样品进行冷却或加热。在一种形式中，能量加入步骤通过活塞间隙均质机、例如由Avestin Inc.在产品名EmulsiFlex-C160下所销售的该均质机来执行。在另一种形式中，能量加入步骤使用超声波处理器例如由Sonics and Materials，Inc.制造的Vibra-Cell超声波处理器(600W)通过超声来实现。在另一种形式中，能量加入步骤使用在美国专利No.5,720,551中描述的乳化装置来实现，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部分。
[0129] 取决于能量加入速率，可能希望将被处理样品的温度调整到约-30℃至30℃的范围内。或者，为了在被处理固体中执行所需相变，也可能需要在能量加入步骤期间将预悬液加热到约30℃至约100℃范围内的温度。
[0130] 方法B.方法B与方法A的差别在于下列方面。第一个差别是表面活性剂或表面活性剂的组合被添加到第一溶液。表面活性剂可以选自上面提出的阴离子、非离子、阳离子表面活性剂和表面活性生物改性剂。
[0131] 方法A和方法B与美国专利No.5,780,062的对比实例.美国专利No.5,780,062公开了通过首先将化合物溶解在适合的与水混溶的第一溶剂中来制备有机化合物的小粒子的方法。第二溶液通过将聚合物和两亲分子溶解在水性溶剂中来制备。然后向第二溶液加入第一溶液，以形成由有机化合物和聚合物-两亲分子复合物构成的沉淀。’062号专利没有公开利用了在方法A和B中该过程的能量加入步骤。缺乏稳定性典型由快速聚集和粒子生长来证明。在某些情况下，无定形粒子重新结晶成大晶体。以上面公开的方式向预悬液加入能量典型地产生显示出粒子聚集和生长的速率降低并且在产品储存后不出现重结晶的粒子。
[0132] 方法A和B与’062号专利的方法的区别还在于在沉淀之前不存在形成聚合物-两亲分子复合物的步骤。在方法A中，由于没有向稀释剂(水性)相加入聚合物，因此不能形成这样的复合物。在方法B中，将也可以起到两亲分子作用的表面活性剂、或聚合物与有机化合物一起溶解在第一溶剂中。这排除了在沉淀之前形成任何两亲分子-聚合物复合物。在’062号专利中，小粒子的成功沉淀依赖于沉淀前形成两亲分子-聚合物复合物。’062号专利公开了两亲分子-聚合物复合物在水性第二溶液中形成聚集体。’062号专利解释称，疏水有机化合物与两亲分子-聚合物复合物相互作用，从而降低了这些聚集体的溶解度并引起沉淀。在本发明的方法中，已经证实在第一溶剂中包含表面活性剂或聚合物(方法B)，在随后添加到第二溶剂中后导致形成比’062号专利概述的方法所能提供的更均匀、更细小的颗粒。
[0133] 粒子的涂层
[0134] 用于对本发明制备的粒子进行涂层的方法，可以通过本技术领域的专业人员已知的各种技术来实现。涂层可以通过各种结合、包括共价和/或非共价结合(例如共价键合、离子相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键键合、范德华力、疏水/疏水结构域相互作用、交联和/或任何其他相互作用)与粒子结合。
[0135] 非共价结合的涂层可以例如通过本文中公开的制备粒子核心的方法来制备，只要使用式I的表面活性剂或其盐来制备粒子即可，或通过将多个预先制造的粒子与包含本文中限定的式I的表面活性剂或其盐的溶液混合以形成本发明的表面修饰粒子来制备。可以使用例如微射流机、活塞间隙均质机、反向流均质机或超声波处理器将溶液在高剪切条件下混合。为了证实涂层成功吸附于粒子，可以通过在涂层过程之前和之后测量ζ电位来确定粒子的表面电位。也可以使用测量涂层吸附的其他已知方法，例如，可以用荧光标记物修饰式I的表面活性剂或其盐，并可以通过荧光显微镜检测荧光标记的式I的表面活性剂或其盐的吸收。有利地，可以将包含式I的表面活性剂或其盐的涂层与粒子核心结合，例如通过吸附于粒子表面，这是用于将包含式I的表面活性剂或其盐的涂层结合于粒子核心、特别是包含如上所解释的水溶性差的活性剂的粒子的有效方法。
[0136] 通过向包含式I的表面活性剂或其盐的溶液加入其他表面活性剂，然后将预先制造的粒子与所述溶液混合，还可以在涂层中包含一种或多种其他表面活性剂，包括式I的其他表面活性剂或其盐。这种其他的表面活性剂可以选自各种已知的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂和表面生物活性改性剂。适合的其他表面活性剂包括本文中前面提出的表面活性剂。示例性的其他表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、磷脂、聚乙二醇接合的磷脂、和聚山梨酸酯。示例性的其他表面活性剂组合包括但不限于泊洛沙姆与磷脂、泊洛沙姆与聚乙二醇接合的磷脂、以及泊洛沙姆与聚山梨酸酯。
[0137] 涂层粒子的细胞摄取
[0138] 本发明的一个实施方案涉及增强活性剂的细胞摄取的方法，所述方法包含将细胞与多个表面修饰粒子相接触，所述粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层。细胞可以是吞噬细胞、弱吞噬细胞或非吞噬细胞。粒子核心包含典型选自小分子、肽类和蛋白质的活性剂，涂层包含本文中限定的式I的表面活性剂或其盐，并且表面修饰粒子具有约1nm至约2,000nm的平均尺寸。由此，至少与使用不包含上面提到的涂层的粒子时活性剂的摄取相比，活性剂被细胞的摄取增加了。
[0139] 细胞摄取允许活性剂被递送至需要治疗的靶组织，因为能够增强本公开的涂层粒子摄取的各种细胞类型也运行到患病(例如癌症、感染)或发炎组织。例如，在感染或炎症早期中性粒细胞占优势，随后是单核细胞衍生的吞噬细胞离开血管系统并进入被感染组织，并且已证实，至少与不具有包含式I的表面活性剂或其盐的涂层的粒子相比，这样的细胞对本发明的表面修饰粒子的摄取增加。固定的巨噬细胞(组织细胞)在肝脏、神经系统、肺、淋巴结、骨髓和几种其他组织中大量存在，并且也已证实，至少与不具有包含式I的表面活性剂或其盐的涂层的粒子相比，这样的细胞对本发明的表面修饰粒子的摄取增加。受细菌、病毒或真菌病原体感染最多并且发炎的组织，可以通过递送具有通过趋化性被导向这些炎性位点的倾向性的载药细胞(例如粒细胞)来靶定。从而，通过促进被上面提到的细胞摄取，将药剂从这些细胞释放到最需要治疗的区域中。因此，荷载本发明的涂层粒子的细胞，促进了向靶组织递送药剂以治疗疾病或病症。这些疾病和病症包括但不限于感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症和增殖性疾病或病症。
[0140] 能够增强涂层粒子摄取的吞噬细胞类型有许多。这些细胞包括但不限于巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、无粒细胞和中性粒细胞。本发明还涵盖弱吞噬细胞和非吞噬细胞。因此，其他适合的细胞类型包括但不限于T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、裸细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、红血细胞、肌细胞、骨髓细胞、干细胞、骨细胞、血管细胞、器官组织细胞、神经元细胞、嗜碱性粒细胞、嗜曙红细胞、树突状细胞和内皮细胞。还有其他细胞能用于将药物活性化合物递送到对象。在本发明中可以使用任何细胞类型，只要它能够摄取粒子即可。
粒子被细胞的摄取可以包括吞噬作用或其他内吞手段，或者粒子附着/吸附在细胞表面上。与细胞表面结合的粒子也可以通过胞饮作用被摄入细胞，所述胞饮作用是细胞膜的内陷以形成包围粒子的细胞内囊。在胞饮作用(“细胞吞饮”)中，被吞入的粒子相对小(例如20nm)(Watts等，胞吞作用：什么进入以及如何进入？(Endocytosis：what goes in and how？)，Journal of Cell Science，1992，103(1)卷，1-8页)。胞饮作用在几乎所有真核细胞中持续发生。
粒子被细胞的摄取可以包括吞噬作用或其他内吞手段，或者粒子附着/吸附在细胞表面上。与细胞表面结合的粒子也可以通过胞饮作用被摄入细胞，所述胞饮作用是细胞膜的内陷以形成包围粒子的细胞内囊。在胞饮作用(“细胞吞饮”)中，被吞入的粒子相对小(例如20nm)(Watts等，胞吞作用：什么进入以及如何进入？(Endocytosis：what goes in and how？)，Journal of Cell Science，1992，103(1)卷，1-8页)。胞饮作用在几乎所有真核细胞中持续发生。
[0141] 至少与细胞同不具有包含式I的表面活性剂或其盐的涂层的粒子相接触相比，患病细胞例如癌细胞也能表现出对本发明的表面修饰粒子的摄取增加。肿瘤细胞按惯例不被当作是吞噬性的。然而，正如在实施例7中所述，表面修饰粒子被小鼠腹膜腔中的卵巢肿瘤细胞摄取。摄取增强的准确机制是未知的，但可能涉及吞噬作用、内吞作用、胞饮作用或其他细胞摄取机制。
[0142] 正如本文中解释的，粒子包括促进细胞摄取的涂层是有利的。具体来说，涂层可以促进被细胞例如单核细胞、巨噬细胞和T-淋巴细胞摄取，所述细胞能够通过已知机制例如趋化性运行到炎症、感染和/或肿瘤位点，并由此将粒子递送到特定靶组织。
[0143] 在本发明的一个方面，细胞与表面修饰粒子的接触(以形成荷载活性剂的细胞)离体进行(即在哺乳动物对象外部)。替代或附加地，细胞与表面修饰粒子的接触可以在体内(即在哺乳动物对象内部)进行。在接触步骤期间使用有效治疗疾病或病症的量的表面修饰粒子。普通专业人员将会理解，一定量的粒子可能被不运行到目标靶组织的细胞类型摄取，或不被细胞释放到目标靶组织处。因此，普通专业人员将会理解，可以通过常规方案对给药的粒子量进行优化，只要这样的量在已确立的给药方案的范围之内即可。
[0144] 对于离体给药来说，可以使用细胞分离器或单采血液成分(apheresis)装置从哺TM乳动物对象分离细胞。例如，可以使用CS-3000 细胞分离器(Fenwal Inc.，Lake Zurich，TM
Ill.)或ISOLEX 细胞分离器(Baxter Healthcare Corp.，Deerfield，Ill.)来分离各种细胞。可以使用本技术领域的专业人员已知的其他离体细胞分离方法来获得可用于本发明的细胞。这样的方法包括但不限于外周血的单采血液成分、骨髓细胞通过例如G-CSF、M-CSF或GM-CSF的动员、或通过脊椎、胸、腰或髂嵴穿刺直接取出骨髓细胞。可以将离体细胞维持在本技术领域的专业人员已知的细胞培养基或其他分离系统中。这样的培养基的实例是Alserver溶液、Ames培养基、Eagle基础培养基、CHO(中华仓鼠卵巢)细胞培养基、Click培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲葡萄糖或蔗糖、Earle平衡盐溶液、基因疗法培养基-3、Gey平衡盐溶液、Glasgow最小必需培养基、Hanks平衡盐溶液、杂交瘤培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基、Krebs-Henseleit含糖缓冲液、Leibovitz培养基(L-15)、M16培养基、McCoy培养基、MCDB、MDBK(Madin-Darby牛肾)、MDCK(Madin-Darby狗肾)、培养基199、NCTC、Ham培养基(例如营养混合物F-10)、Coon改良的Ham培养基、RPMI，以及其他培养基例如在《用于生命科学研究的生物化学品和试剂》(Biochemicals & Reagents for Life Science Research)，Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，Mo.，USA)中列出的培养基。所述培养的目的可以是仅仅为了不损失细胞地储存的目的，或者通过适当添加生长因子、细胞因子和营养物以鼓励细胞扩增，用于细胞增殖或扩增。这样的扩增将使患者必须准备取出细胞样品的次数降到最低。
Ill.)或ISOLEX 细胞分离器(Baxter Healthcare Corp.，Deerfield，Ill.)来分离各种细胞。可以使用本技术领域的专业人员已知的其他离体细胞分离方法来获得可用于本发明的细胞。这样的方法包括但不限于外周血的单采血液成分、骨髓细胞通过例如G-CSF、M-CSF或GM-CSF的动员、或通过脊椎、胸、腰或髂嵴穿刺直接取出骨髓细胞。可以将离体细胞维持在本技术领域的专业人员已知的细胞培养基或其他分离系统中。这样的培养基的实例是Alserver溶液、Ames培养基、Eagle基础培养基、CHO(中华仓鼠卵巢)细胞培养基、Click培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲葡萄糖或蔗糖、Earle平衡盐溶液、基因疗法培养基-3、Gey平衡盐溶液、Glasgow最小必需培养基、Hanks平衡盐溶液、杂交瘤培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基、Krebs-Henseleit含糖缓冲液、Leibovitz培养基(L-15)、M16培养基、McCoy培养基、MCDB、MDBK(Madin-Darby牛肾)、MDCK(Madin-Darby狗肾)、培养基199、NCTC、Ham培养基(例如营养混合物F-10)、Coon改良的Ham培养基、RPMI，以及其他培养基例如在《用于生命科学研究的生物化学品和试剂》(Biochemicals & Reagents for Life Science Research)，Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，Mo.，USA)中列出的培养基。所述培养的目的可以是仅仅为了不损失细胞地储存的目的，或者通过适当添加生长因子、细胞因子和营养物以鼓励细胞扩增，用于细胞增殖或扩增。这样的扩增将使患者必须准备取出细胞样品的次数降到最低。
[0145] 一旦分离后，就可以将细胞与涂层粒子相接触并进行短时期温育，以允许细胞摄取粒子。在离体程序中使用的粒子浓度将因几种因素而变，包括但不限于使用的细胞类型、细胞浓度、所使用的活性剂、小粒子分散体的尺寸、待治疗的疾病等。然而，一般来说，细胞分离物与约1至约300mg/ml本发明的粒子相接触。在粒子与细胞接触期间，粒子的浓度高于热力学饱和溶解度，从而允许粒子在摄取和递送到哺乳动物对象期间保持在颗粒形式。可以将细胞与粒子温育长达24小时或更长时间，以允许细胞充分摄取药物粒子。
[0146] 可以使用任何方法来执行活性剂粒子被离体细胞的摄取，其必要条件是该方法不会破坏细胞或以其它方式使细胞不可用于向对象给药。例如，可以使用粒子通过生物识别分子进行位点特异性递送。参见例如在本文中引为参考的美国专利公布No.2003/0092069，其公开了通过中空纳米粒子将基因转移到特定细胞或组织中。荷载离体细胞的其他方法包括电穿孔、声穿孔(sonoporation)以及破坏细胞膜(例如超声)和能将固体颗粒插入到细胞中的其他机械手段。Zarnitsyn等(Zarnitsyn等，影响最佳超声波介导的DNA转染的物理参数(Physical parameters influencing optimization of ultrasound-mediated DNA transfection)，Ultrasound Med.Biol.，2004，30(4)卷，527-538页成功地使用超声波瞬时破坏细胞膜，由此促进DNA荷载到活细胞中。其他机械程序对于本技术领域的有经验人员来说是公知的，并包含进来作为本公开的一部分。用于使细胞膜瞬时去稳定的化学方法也TM TM是公知的。转染试剂含有表面活性剂，并包括293FECTIN 转染试剂和LIPOFECTAMINE ，二者都是Invitrogen Corporation(Carlsbad，Calif.)的产品。用于将DNA转移到细胞中的表面活性剂的另一个实例是来自Synvolux Therapeutics B.V.L.J.(Groningen，荷兰)的TM
SAINT 试剂，其基于吡啶鎓表面活性剂。
SAINT 试剂，其基于吡啶鎓表面活性剂。
[0147] 下面对粒子进行的描述也适用于本文公开的所有实施方案。对于少量可溶的药物来说，可以使用细胞荷载程序，只要细胞能够以比竞争性溶解过程更快的速率摄取涂层活性剂粒子即可。粒子应该具有适合的尺寸，以允许细胞在粒子完全溶解之前摄取涂层粒子并将它们递送至靶组织。因为已知运行至目标靶组织的细胞能够摄取粒子，因此活性剂最终从细胞释放或以其它方式递送在靶组织附近。此外，活性剂组合物的浓度应该保持高于组合物的饱和溶解度，以便粒子在摄取期间能够保持在结晶状态。
[0148] 下面对粒子进行的描述也适用于本文公开的所有实施方案。表面修饰粒子的给药可以通过本技术领域已知的用于粒子给药的各种技术来进行。给药包括向哺乳动物对象给药表面修饰粒子。用于给药表面修饰粒子或其药物组合物的适合方法包括但不限于静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、真皮内、关节内、鞘内、硬膜外、脑内、颊、直肠、局部、透皮、口、鼻内、通过肺途径、腹膜内、和/或眼内给药粒子。给药的步骤可以通过推注、通过间歇输注或通过连续输注。表面修饰粒子的量和递送方法可以由专业临床医师确定。各种因素将影响递送的量和方法，其包括但不限于使用的细胞类型(对于离体给药方法来说)、待治疗对象的性别、体重和年龄、待治疗疾病或病症的类型和成熟度、待给药的活性剂等。一般来说，活性剂可以提供成1pg化合物/kg体重至1000mg/kg、0.1mg/kg至100mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg和1至20mg/kg范围内的剂量，以日剂量提供或将等效剂量以或长或短的间隔例如每隔一日、每周两次、每周一次、或每天两次或三次提供。
[0149] 通过本发明可以治疗各种疾病或病症，其包括但不限于感染性疾病或病症、炎性疾病或病症、神经变性疾病或病症和增殖性疾病或病症。就此而言，通过本发明的方法可以减轻这些疾病或病症的症状。
[0150] 当在本文中使用时，“感染性疾病或病症”是指由病原微生物例如细菌、病毒、寄生虫或真菌引起的病症。可以从本公开的方法获益的感染性疾病或病症包括但不限于病毒感染(包括反转录病毒感染)例如登革热、肠病毒感染、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎和流感；真菌感染；寄生虫感染例如非洲锥虫病和疟疾；以及细菌感染例如霍乱、脑膜炎和结核病。
[0151] 当在本文中使用时，“炎性疾病或病症”是指以发红、发热、肿胀和疼痛(即炎症)为特征的典型地涉及组织损伤或破坏的病症。炎性疾病或病症尤其与白细胞内流和/或白细胞趋化性相关。炎性病症可以由病原生物体或病毒感染或由非感染性事件引起，所述非感染性事件包括但不限于外伤或心肌梗塞或中风后再灌注、对外来抗原的免疫应答、和自体免疫应答。因此，可以使用本发明的方法和化合物治疗的炎性病症涵盖了与特异性防御系统的反应相关的病症、与非特异性防御系统的反应相关的病症以及与炎性细胞活化相关的病症。
[0152] 当在本文中使用时，术语“特异性防御系统”是指对特定抗原的存在起反应的免疫系统组分。由特异性防御系统的应答引起的炎性病症的实例包括但不限于对外来抗原的经典应答、自体免疫疾病、和由B细胞和/或T细胞(即B-淋巴细胞和/或T-淋巴细胞)介导的迟发型超敏反应。慢性炎性疾病、对实体移植组织和器官包括但不限于肾脏和骨髓移植物的排斥以及移植物抗宿主疾病(GVHD)，是由特异性防御系统的应答引起的炎性病症的其他实例。
[0153] 当在本文中使用时，术语“非特异性防御系统”是指由不能进行免疫记忆的白细胞(例如粒细胞包括但不限于中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞)介导的炎性病症。至少部分由非特异性防御系统的反应引起的炎性病症的实例包括但不限于成年人(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官损伤综合征、再灌注损伤、急性肾小球肾炎、反应性关节炎、具有急性炎性组分的皮炎、急性化脓性脑膜炎、其他中枢神经系统炎性病症包括但不限于中风、热损伤、炎性肠病、粒细胞输血相关综合征和细胞因子诱导的毒性。
[0154] 本发明的治疗方法包括用于减轻与炎性细胞活化相关的病症的方法。“炎性细胞活化”是指由刺激物(包括但不限于细胞因子、抗原和自身抗体)诱导增殖性细胞应答、可溶性介导物(包括但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素类和血管活性胺类)的生产、或炎性细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞(多形核白细胞包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜曙红细胞)、肥大细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞和内皮细胞)中新的或数量增加的介导物(包括但不限于主要组织相容性抗原和细胞黏附分子)的细胞表面表达。本技术领域的专业人员将会认识到，在这些细胞中这些表型的一种或组合的活化能够造成炎性病症的开始、持续或加重。
[0155] 可以被成功治疗的其他疾病或病症包括以炎症或感染为特征的疾病或病症，包括但不限于类风湿关节炎、格雷夫斯病、重症肌无力、甲状腺炎、糖尿病、炎性肠病、自体免疫性卵巢炎、系统性红斑狼疮和舍格伦综合征。
[0156] 可以被成功治疗的神经变性疾病或病症的实例包括但不限于帕金森氏(Parkinson’s)病、阿茨海默氏(Alzheimer’s)病、多发性硬化症、脑脊髓炎、脑炎(包括HIV脑炎)、亨廷顿氏(Huntington′s)病、肌萎缩性侧索硬化症(也称为Lou Gehrig病)、额颞性痴呆症、朊病毒疾病、克-雅二氏(Creutzfeldt-Jakob)病和肾上腺脑白质营养不良。其他可以被成功治疗的神经变性疾病或病症包括匹克氏(Pick′s)病、额颞叶变性、进行性失语和词义性痴呆。朊病毒疾病，也称为传染性海绵状脑病(TSE)，包括克-雅二氏病、克-雅二氏病新变体、Gerstmann- -Scheinker综合征、致死性
家族性失眠症和库鲁病。神经变性疾病或病症还可以是亚历山大(Alexander)病、Alper病、共济失调性毛细血管扩张症、Batten病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、海绵状脑白质营养不良症、Cockayne综合征、皮层基底节变性、HIV相关性痴呆、Kennedy病、克拉伯(Krabbe)病、路易体痴呆症、Machado-Joseph病(3型脊髓小脑性共济失调)、多系统萎缩、神经疏螺旋体病、Pelizaeus-Merzbacher病、原发性侧索硬化、Refsum病、Sandhoff病、Schilder病、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、Steele-Richardson-Olszewski病和脊髓痨。
家族性失眠症和库鲁病。神经变性疾病或病症还可以是亚历山大(Alexander)病、Alper病、共济失调性毛细血管扩张症、Batten病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、海绵状脑白质营养不良症、Cockayne综合征、皮层基底节变性、HIV相关性痴呆、Kennedy病、克拉伯(Krabbe)病、路易体痴呆症、Machado-Joseph病(3型脊髓小脑性共济失调)、多系统萎缩、神经疏螺旋体病、Pelizaeus-Merzbacher病、原发性侧索硬化、Refsum病、Sandhoff病、Schilder病、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、Steele-Richardson-Olszewski病和脊髓痨。
[0157] 可以从本公开的方法获益的增殖性疾病或病症包括但不限于结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、头颈癌、腹膜腔的癌症(例如卵巢癌、肠胃癌症、腹部癌症和间皮瘤)、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌(例如神经胶质瘤、脑脊膜瘤、星形细胞瘤)、胃癌、肠癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和成胶质细胞瘤。甲状腺炎包括桥本氏(Hashimoto’s)甲状腺炎、亚急性甲状腺炎(也称为de Quervain甲状腺炎)、无症状性甲状腺炎(也称为无痛甲状腺炎)、产后甲状腺炎、药物诱发的甲状腺炎、辐射诱发的甲状腺炎和急性化脓性甲状腺炎。
[0158] 参考下面的实施例可以更好地理解本公开，这些实施例不打算是限制性的，而仅仅是提出本公开的示例性实施方案。实施例
[0159] 实施例1
[0160] 具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子的制备
[0161] 紫杉醇粒子使用微量沉淀/均质化程序制备。具体来说，将紫杉醇(0.5g)溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)(3g)中，然后在转子-定子混合下添加到水性表面活性剂溶液A(25mL)中。溶液A(pH～7.8至8.0)在100mL水中含有无水磷酸氢二钠(0.13g)、一水磷酸二氢钠(0.01g)、甘油(2.2g)、DSPE-mPEG 2000(0.2g)和泊洛沙姆188(0.5g)(表1)。
[0162] 表1
[0163]组分 用于溶液A的％(w/v) 用于溶液B的％(w/v)
无水磷酸氢二钠 0.127 0.127
一水磷酸二氢钠 0.0144 0.0144
甘油 2.2 2.2
DSPE-mPEG 2000 0.2 0.2
泊洛沙姆188 0.5 0.5
DOTAP 0.0 0.1
水 补量至100mL 补量至100mL
无水磷酸氢二钠 0.127 0.127
一水磷酸二氢钠 0.0144 0.0144
甘油 2.2 2.2
DSPE-mPEG 2000 0.2 0.2
泊洛沙姆188 0.5 0.5
DOTAP 0.0 0.1
水 补量至100mL 补量至100mL
[0164] 将得到的悬液转移到均质机(Avestin C5)中并在静态压力下循环，直到悬液温度达到至少50℃。然后将悬液在20,000±2,000psi的目标压力和60℃的目标温度下均质化60分钟。收集悬液并以10,000rpm离心30分钟。在离心循环完成后，倾倒出上清液并用等体积水性表面活性剂溶液B替换。溶液B(pH～7.8至8.0)含有与溶液A相同的组分并另外包含N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP，0.1g)(表1)。
将沉淀重悬浮，并将离心再重复两次，每次使用溶液B作为替换表面活性剂。在第三次重悬浮后，将纳米悬液在20,000±2,000psi的目标压力和60℃的目标温度下均质化30分钟。
最终的悬液含有大小为～160-170nm的粒子。
将沉淀重悬浮，并将离心再重复两次，每次使用溶液B作为替换表面活性剂。在第三次重悬浮后，将纳米悬液在20,000±2,000psi的目标压力和60℃的目标温度下均质化30分钟。
最终的悬液含有大小为～160-170nm的粒子。
[0165] 按照上述程序通过向药物浓缩物加入荧光标记的紫杉醇来制备荧光标记的紫杉醇粒子。具体来说，向上述药物浓缩物添加400μg俄勒冈绿标记的紫杉醇(可以从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)，以产生荧光标记的紫杉醇粒子，其具有足够在流式细胞术和荧光显微术中检测到的荧光强度。
[0166] 实施例2
[0167] 人类单核细胞对具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取
[0168] 将人类单核细胞对DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取，与对鱼精蛋白涂层的紫杉醇粒子和DSPE-mPEG 2000/泊洛沙姆188涂层的紫杉醇粒子的摄取进行比较。鱼精蛋白涂层的紫杉醇粒子通过向0.01mL 10mg/mL的俄勒冈绿标记的紫杉醇悬液加入0.08mL 25mg/mL的鱼精蛋白溶液来制备。
[0169] 在用于摄取实验的条件下，DOTAP涂层的粒子和鱼精蛋白涂层的粒子都略微带有正电荷。因此，设计了使用鱼精蛋白涂层的紫杉醇粒子的对比实验来评估紫杉醇粒子的摄取增强是否能仅仅归因于涂层粒子的正电荷。
[0170] 在图2(以及表2)中所示的通过向pH 7.38的10mL 10mM HEPES缓冲液添加30μL悬液的细胞摄取实验中使用的紫杉醇制剂上，进行了ζ电位测量。DOTAP和鱼精蛋白涂层的紫杉醇纳米粒子具有略微正的ζ电位，而DSPE-mPEG 2000/泊洛沙姆188涂层的紫杉醇纳米粒子(其不含DOTAP或鱼精蛋白)在测试条件下具有负的ζ电位(数据未显示)。
[0171] 在摄取实验中使用的人类单核细胞从人类供体的全血中纯化。将这些细胞在组织培养处理过的6孔板(BD Biosciences)中在培养基A中培养5-7天，每2-3天更换培养基。培养基A含有DMEM(Gibco BRL目录号119625-351)并增补下列组分以制成1L：1000U/ml重组人类巨噬细胞集落刺激因子-1(rhM-CSF-1)(Chemicon)，100mL热失活的人类血清，10mL 200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL目录号250325-381)，2mL 50mg/ml庆大霉素(Sigma目录号G1397)和400μL 25mg/mL环丙沙星(Bayer编号89-001-1)。也将细胞培养在玻璃盖玻片上用于显微镜应用。
[0172] 然后将黏附性单核细胞衍生的巨噬细胞用紫杉醇制剂(具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子、具有鱼精蛋白涂层的紫杉醇粒子、或具有DSPE-mPEG 2000/泊洛沙姆188涂层的紫杉醇粒子)在37℃处理不同时间段。制剂悬液含有终浓度为～10μM的紫杉醇(掺有俄勒冈绿标记的紫杉醇)。在温育后，将细胞用2mL/孔的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗至少三次。然后将细胞刮到PBS中并转移到微量离心管(或者如果细胞黏附于盖玻片的话进行固定)。
[0173] 为了评估紫杉醇粒子的摄取，将细胞对CD14的表达进行染色并通过流式细胞术进行分析。基于同种型对照(以建立CD14+选择门控)和未处理的细胞(以建立俄勒冈绿选择门控)来建立门控(gates)。紫杉醇摄取通过对俄勒冈绿荧光阳性的CD14+细胞(单核细胞衍生的巨噬细胞)的比率(紫杉醇+/CD14+的％)、即内化或吸收紫杉醇粒子的细胞的百分率、和平均荧光强度(MFI)两者来评估。MFI值与细胞群体中包含的紫杉醇的浓度直接相关。
[0174] 紫杉醇悬液的摄取动力学显示在图1和2中(结果显示为纳米悬液摄取后紫杉醇阳性细胞的百分率和细胞结合/内化的粒子的MFI两者)。在图1中，将细胞暴露于紫杉醇粒子0、3、5小时，而在图2中，将细胞暴露于紫杉醇粒子0、0.25、0.5和1小时。与DSPE-mPEG2000/泊洛沙姆188涂层的粒子(图1和2)和鱼精蛋白涂层的粒子(图2)相比，DOTAP涂层显著改进了紫杉醇粒子的摄取。这些结果表明，紫杉醇粒子摄取增加不能仅仅归因于涂层粒子的正电荷。
[0175] 此外，图2证实了紫杉醇制剂在储存后的稳定性。DOTAP样品1在摄取实验之前储存了约3个月。DOTAP样品2在制备后很快用于摄取实验中。这些结果表明，DOTAP涂层的紫杉醇粒子储存几个月不显著影响粒子的摄取动力学。
[0176] 通过反相HPLC对紫杉醇粒子的摄取进行定量。在将细胞与紫杉醇悬液温育15、30和60分钟后测量紫杉醇摄取。通过向每种细胞悬液的500μL等份试样加入乙腈(500μL)并涡旋振荡混合来制备样品。然后将样品在25℃下以10,000rpm离心30分钟，并将上清液通过反相HPLC进行分析，以确定样品中紫杉醇的量(表2)。
[0177] 表2-细胞提取物中的紫杉醇水平(mg/mL)
[0178]
[0179] 图3显示了培养1、2或6天后单核细胞衍生的巨噬细胞对DOTAP涂层的紫杉醇纳米悬液的摄取。将细胞暴露于紫杉醇粒子从0至3.5小时的不同时间段。结果表明，细胞培养时间越长，它们对DOTAP涂层的粒子的响应性越低。理论上，随着细胞从单核细胞向巨噬细胞的成熟，预期所有的吞噬作用增加，因此在与年轻细胞(在体外培养相对短时期的细胞)相比时，DOTAP涂层可能在更成熟的细胞中不提供同样大的增强细胞摄取的优势。另一方面，相对更年轻的单核细胞对DOTAP涂层的粒子的增强/加速摄取可能导致治疗药剂的更有效的定向递送，因为这样的单核细胞倾向于作为循环单核细胞，而较老的细胞倾向于分化成固定的巨噬细胞(例如在脾脏和肝脏中)。
[0180] 实施例3
[0181] 人类单核细胞对具有PLGA或磷脂酰丝氨酸涂层的紫杉醇粒子的摄取
[0182] 将DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取与乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)涂层的紫杉醇粒子的摄取和磷脂酰丝氨酸(PS)涂层的紫杉醇粒子的摄取进行比较。PLGA涂层的紫杉醇粒子和PS涂层的紫杉醇粒子按照实施例1中描述的程序制备，区别在于将PLGA粒子超声处理而不是均质化，并使用含有磷酸缓冲液、甘油、PLGA和泊洛沙姆188的溶液进行配制，而PS粒子使用含有磷酸缓冲液、甘油、DSPE-mPEG 2000、泊洛沙姆188和磷脂酰丝氨酸的溶液配制。
[0183] 紫杉醇悬液的摄取动力学显示在图4中(结果显示为纳米悬液摄取后紫杉醇阳性细胞的百分率和细胞结合/内化的粒子的MFI两者)。与PLGA涂层的或磷脂酰丝氨酸涂层的粒子相比，DOTAP涂层显著提高了粒子的摄取。这些结果表明，紫杉醇粒子的摄取增强不能仅仅归因于聚合物或表面活性剂涂层的存在。
[0184] 实施例4
[0185] 人类单核细胞对具有CTAB涂层的紫杉醇粒子的摄取
[0186] 将DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)涂层的紫杉醇粒子的摄取进行比较。CTAB涂层的紫杉醇粒子按照实施例1中描述的程序制备，区别在于CTAB粒子使用含有磷酸缓冲液、甘油、DSPE-mPEG 2000、泊洛沙姆188和CTAB的溶液来制备。
[0187] 紫杉醇悬液的摄取动力学显示在图5中(结果显示为纳米悬液摄取后紫杉醇阳性细胞的百分率和细胞结合/内化的粒子的MFI两者)。与CTAB涂层的粒子相比，DOTAP涂层显著提高了粒子的摄取。这些结果表明，紫杉醇粒子的摄取增强不能仅仅归因于具有正电荷基团和疏水基团两者的涂层的存在。
[0188] 实施例5
[0189] 具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子在全血中的摄取
[0190] 将全血从健康人类献血者抽取到EDTA真空采血管(BD Biosciences)中。将掺有俄勒冈绿标记的紫杉醇的紫杉醇纳米悬液与全血(终浓度～10μM)在1.7mL微量离心管中、在试管混匀仪上室温温育1小时。将一部分全血暴露于低渗裂解溶液(BD Biosciences)以裂解红细胞。然后将裂解的样品针对CD14表达进行染色。全血和染色细胞两者都通过流式细胞术进行分析。
[0191] 在红血细胞(RBC)和血小板群体中没有观察到俄勒冈绿荧光的明显增加。在使用DOTAP配制的紫杉醇悬液时，在裂解样品中的CD14+单核细胞群体中观察到荧光的显著增加。具有DSPE-mPEG 2000/泊洛沙姆188涂层的紫杉醇制剂在CD14+单核细胞群体中也显示出一定的摄取。当通过俄勒冈绿荧光进行评估时，在其他主要细胞群体中没有明显的摄取(数据未显示)。这些结果表明，DOTAP涂层的紫杉醇粒子被单核细胞选择性摄取，其超过红细胞、血小板和血液中存在的其他细胞类型。单核细胞对DOTAP涂层的粒子的选择性摄取表明将治疗药剂更有效地定向递送到疾病、肿瘤或感染位点。
[0192] 实施例6
[0193] 小鼠腹膜巨噬细胞对具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取
[0194] 从小鼠分离腹膜巨噬细胞，并将其暴露于具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子和不具有这种涂层的紫杉醇粒子。荧光图像显示，暴露于DOTAP涂层的粒子的腹膜巨噬细胞与暴露于DSPE-mPEG 2000/泊洛沙姆188涂层的粒子的腹膜巨噬细胞相比，摄取更大量的紫杉醇(数据未显示)。本实施例支持DOTAP增强腹膜巨噬细胞对粒子的摄取。
[0195] 实施例7
[0196] 人类OVCAR-3细胞对具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取
[0197] 将人类OVCAR-3细胞用红色荧光蛋白(RFP)转染以使它们产生红色荧光。然后将这些细胞暴露于使用俄勒冈绿-紫杉醇制备的具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子和不具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子。荧光图像显示，只有当粒子被DOTAP涂层时RFP-OVCAR-3细胞才摄取粒子(数据未显示)。用DSPE-mPEG 2000/泊洛沙姆188涂层的粒子没有可见的摄取。本实施例支持DOTAP增强人类卵巢癌细胞对粒子的摄取。OVCAR-3细胞对DOTAP涂层的紫杉醇粒子的摄取速率表明肿瘤细胞直接摄取粒子，但是准确的机制未知。
[0198] 实施例8
[0199] 具有DOTAP涂层的紫杉醇粒子在小鼠中的停留时间
[0200] 将具有DOTAP涂层的俄勒冈绿标记紫杉醇粒子皮下注射到小鼠中。随时间捕集荧光图像以演示粒子停留时间。在30天时绿色荧光的继续存在表明当皮下注射时，紫杉醇粒子保留至少30天(数据未显示)。
[0201] 在另一个实验中，将具有含DOTAP和罗丹明标记的表面活性剂(丽丝胺罗丹明B1，2-双十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐(rDHPE)；Invitrogen，Carlsbad，CA)的涂层的俄勒冈绿标记紫杉醇粒子，腹膜内(IP)注射到健康小鼠中。随时间捕集荧光图像以证实粒子停留时间。数据表明，在健康小鼠中，紫杉醇纳米粒子被快速(在约24小时内)清除出腹膜空间(数据未显示)。
[0202] 建立了小鼠模型，其中实验小鼠被移植有RFP-OVCAR-3细胞并允许肿瘤生长。肿瘤表达RFP并具有红色荧光。将具有DOTAP涂层的俄勒冈绿标记紫杉醇粒子通过腹膜内注射给药于具有表达RFP的肿瘤的小鼠。DOTAP涂层的紫杉醇粒子相对于肿瘤的存在和位置使用荧光来检测。
[0203] 肿瘤和紫杉醇粒子两者都通过荧光显微术观察(肿瘤为红色荧光，粒子为绿色荧光)。与其中粒子被快速清除出腹膜腔的健康小鼠不同，在带有肿瘤的小鼠中，DOTAP涂层的紫杉醇粒子存在到注射后长达30天，表明小鼠腹膜腔中存在的肿瘤部分造成了停留时间增加。此外，DOTAP涂层的紫杉醇粒子常常与肿瘤共定位。因此，本实施例支持DOTAP涂层的紫杉醇粒子靶向肿瘤位点而不是健康组织，并且能够在所靶向的肿瘤位点中保持相当长的时间段，使得它们能够有效递送持续释放的治疗性药物。
[0204] 此外，当DOTAP涂层的紫杉醇粒子存在时，红色荧光强度随时间减小，与肿瘤细胞死亡相一致。相反，在不存在紫杉醇粒子的情况下，红色荧光随时间增强。因此，本实施例进一步证实DOTAP涂层的紫杉醇粒子的给药在体内有效治疗癌症。
[0205] 还执行了使用不同剂量的DOTAP涂层的紫杉醇粒子(15mg/kg和25mg/kg)的剂量范围研究，以鉴定用于在小鼠模型中引起卵巢肿瘤细胞死亡的有效剂量。测量肿瘤尺寸对不同剂量的DOTAP涂层的紫杉醇粒子给药的响应，以确定给定剂量的效能。在第1天给药25mg/kg的剂量，在给药后25天减小了肿瘤尺寸。15mg/kg的剂量给药两次(在第1天和第14天)，到第25天根除了肿瘤，留下残余的绿色荧光药物。本研究进一步支持DOTAP涂层的紫杉醇粒子给药在体内有效治疗癌症。
[0206] 实施例9
[0207] 具有DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子的制备
[0208] 使用微量沉淀/均质化程序(前文中所述)制备了蛋白酶抑制剂茚地那韦(IDV)和利托那韦(RTV)的粒子。然后将粒子用各种表面活性剂包括DOTAP进行涂层。对不同蛋白酶抑制剂粒子制剂的摄取和有效性进行比较。在本研究中使用的蛋白酶抑制剂制剂显示在表3中。
[0209] 表3
[0210]
[0211] 将粒子悬浮在包含Lipoid E80(1.4％)、P-188(0.5％)、DSPE-mPEG2000(0.2％)和/或DOTAP(0.1％)的溶液中，以便将粒子涂层。向溶液加入重量-体积比约为2％的粒子。通过向涂层溶液加入粒子并使用Ultra-Turrax T-18(KA Works Inc.，Wilmington，NC，USA)转子-定子混合器混合4-7分钟以降低初始粒度，来制备表面修饰粒子的悬液。然后将悬液在每平方英寸20,000磅下均质化约30回或直至达到所需粒度。对于含有DOTAP的悬液来说，将均质化悬液离心(5℃下12,100x g 30分钟)以沉淀药物粒子。通过用Ultra-Turrax T-18混合，将药物重悬浮在含DOTAP的表面活性剂中。使用10mM磷酸钠或10mM HEPES作为缓冲液，将纳米悬液配制成略微碱性pH 7.8。使用甘油(2.25％)或蔗糖(9.25％)调整渗涨度。使用红色荧光标记物——丽丝胺罗丹明B 1，2-双十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐(rDHPE；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)来标记粒子。
[0212] 对于所有制剂来说，使用HORIBA LA 920光散射仪(HORIBA Instruments Inc.，Irvine，CA，USA；对于IDV来说RRI＝1.08，对于RTV来说为1.20)测量粒度。通过在Malvern Zsizer Nano系列仪器(Malvern Instruments Inc.，Westborough，MA，USA)上将0.1ml悬液在9.9ml pH7.4的10mM HEPES中稀释，来测量ζ-电位。制剂的最终药物含量通过RP-HPLC测定。
[0213] 实施例10
[0214] 人类单核细胞衍生的巨噬细胞对具有DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子的摄取[0215] 人类单核细胞通过白细胞单采术从HIV-1和肝炎血清阴性献血者获得，并按照Dou等((Blood，108(8)：2827-2835，2006)中的描述通过反向流离心淘洗进行纯化。制备Wright染色的细胞离心涂片并通过用抗CD68抗体(克隆KP-1)进行免疫标记来测定细胞6
纯度。将单核细胞以1x10 个细胞/ml的浓度在37℃和加湿气氛(5％CO2)下、在增补有10％热失活的合并人类血清、1％谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、10μg/ml环丙沙星和1000U/ml重组人类巨噬细胞集落刺激因子的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。为了诱导向巨噬细胞的分化，如Gendelman等(J.Exp.Med.167：1428-1441，1988)中所述，将单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子存在下培养7天。
纯度。将单核细胞以1x10 个细胞/ml的浓度在37℃和加湿气氛(5％CO2)下、在增补有10％热失活的合并人类血清、1％谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、10μg/ml环丙沙星和1000U/ml重组人类巨噬细胞集落刺激因子的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。为了诱导向巨噬细胞的分化，如Gendelman等(J.Exp.Med.167：1428-1441，1988)中所述，将单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子存在下培养7天。
[0216] 将MDM(每孔2x106个)与浓度为1、10和100μM的表面修饰的蛋白酶抑制剂粒子一起培养。不改变培养基，对粒子的摄取进行24小时评估，其中每小时进行细胞收集。通过用1ml磷酸盐缓冲盐水清洗三次，收集黏附性MDM，然后将细胞刮入1ml磷酸盐缓冲盐水中。将样品在4℃下以950x g离心10分钟，并除去上清液。将细胞沉淀在200μl甲醇中超声，并在4℃下以10,000x g离心10分钟。将甲醇提取物储存在-80℃下，直到进行RP-HPLC分析。
[0217] 产生了两种不同的RTV制剂(参见表3)。具有最慢摄取速率和最低绝对摄取量的RTV制剂是RTV-1，其用DSPE-mPEG2000单独涂层，具有200nm的尺寸，并且ζ-电位为-25.6mV(表3)。具有最快吸收速率和最大RTV积累的RTV制剂是RTV-4，其用P-188、DSPE、mPEG2000和DOTAP的组合涂层，具有620nm的尺寸，ζ-电位为+15.5mV。最大摄取对6
于RTV-4来说发生在8小时，对于RTV-1来说发生在12小时。对于RTV-4(40.98μg/1x10
6
个细胞)来说，绝对摄取量比RTV-1(24.68μg/1x10 个细胞)高约1.5倍。RTV-4的物理性质与也含有DOTAP的IDV-4类似。这表明优化IDV粒子摄取的物理性质也优化RTV粒子的摄取。
于RTV-4来说发生在8小时，对于RTV-1来说发生在12小时。对于RTV-4(40.98μg/1x10
6
个细胞)来说，绝对摄取量比RTV-1(24.68μg/1x10 个细胞)高约1.5倍。RTV-4的物理性质与也含有DOTAP的IDV-4类似。这表明优化IDV粒子摄取的物理性质也优化RTV粒子的摄取。
[0218] 在最初暴露于表面涂层粒子12小时后，在两周的时间期间评估了从MDM的药物释放，其中每隔一天更换一半培养基。保存培养基样品以及细胞复制品，并储存在-80℃下直至可以使用在Dou等(Virology 358：148-158，2007)中描述的方法的改良版本进行RP-HPLC分析。将甲醇提取的细胞悬液在4℃以21,800x g离心10分钟。将培养基样品融化，并通过加入甲醇除去蛋白。将样品在4℃以21,800x g离心10分钟；将上清液在真空下蒸发至干，并重悬浮于70μl 100％甲醇中。将处理过的培养基或细胞的三份20μl平行样品通过RP-HPLC进行评估，使用了带有C8保护柱的YMC Pack Octyl C8柱(Waters Inc.，Milford，MA，USA)。以0.4ml/min泵送由47％乙腈/53％pH 4.15(用1N HCl调整)的25mM KH2PO4构成的流动相，使用UV/Vis在212nm处检测。对于所有蛋白酶抑制剂制备物来说，通过与在甲醇中制备的游离药物(0.025-100μg/ml)的标准曲线进行比较来定量评估。
[0219] 对于每种药物和制剂观察到了多样化的释放情况。评估了仍包含在细胞内和释放到培养基中的药物的量。当对用IDV-1或IDV-4处理的MDM进行比较时，细胞药物含量在所有时间点都有明显差异(p＜0.05)。在IDV-1处理的细胞中，到第11天时不能检测到药6
物，而对于IDV-4来说，在第15天药物仍明显存在(1.61μg/1x10 个细胞)。从第3至15天，培养基中的药物浓度也有明显差异(p＜0.05)。在IDV-1处理的细胞中，到第13天时不能检测到药物，而在IDV-4处理的MDM中药物仍明显存在(16.37μg/ml)。
物，而对于IDV-4来说，在第15天药物仍明显存在(1.61μg/1x10 个细胞)。从第3至15天，培养基中的药物浓度也有明显差异(p＜0.05)。在IDV-1处理的细胞中，到第13天时不能检测到药物，而在IDV-4处理的MDM中药物仍明显存在(16.37μg/ml)。
[0220] 当对用RTV-1或RTV-4处理的MDM进行比较时，在所有时间点处细胞和培6
养基两者的药物含量都不同(p＜0.05)。对于RTV-1(0.19μg/1x10 个细胞)和
6
RTV-4(8.69μg/1x10 个细胞)两者来说，在第15天时细胞内都存在药物。对于
RTV-1(0.28μg/ml)和RTV-4(11.62μg/ml)两者来说，在第15天时培养基内也都存在药物。与没有用DOTAP涂层的粒子(IDV-1和RTV-1)相比，MDM明显更长时间地保留DOTAP涂层的粒子(IDV-1和RTV-1)。
养基两者的药物含量都不同(p＜0.05)。对于RTV-1(0.19μg/1x10 个细胞)和
6
RTV-4(8.69μg/1x10 个细胞)两者来说，在第15天时细胞内都存在药物。对于
RTV-1(0.28μg/ml)和RTV-4(11.62μg/ml)两者来说，在第15天时培养基内也都存在药物。与没有用DOTAP涂层的粒子(IDV-1和RTV-1)相比，MDM明显更长时间地保留DOTAP涂层的粒子(IDV-1和RTV-1)。
[0221] 这些实验证实，DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子更有效地被MDM摄取，并且这些DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子在与非DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子相比时，在MDM中保留更长时间。因此，载有DOTAP涂层蛋白酶抑制剂粒子的MDM是被感染组织的有效药物载体。
[0222] 实施例11
[0223] 载有含DOTAP粒子的细胞的功能性质评估
[0224] 进行了研究以评估在载有表面修饰粒子的单核细胞和MDM细胞中细胞功能是否TM受到影响。将单核细胞和MDM用100μM粒子处理12小时，并使用ALAMARBLUE 测定法(AbD Serotec，Raleigh，NC，USA)按照制造商的说明书在24小时内评估细胞毒性。ALAMARBLUE试剂掺有氧化还原指示剂，其对由细胞生长引起的生长培养基的化学还原做出响应，既产生荧光又改变颜色。因此，氧化还原指示剂的强度与细胞生长和细胞存活性成正比。
[0225] 结果显示，每种IDV粒子制剂在所使用的最高浓度(100μM)下不显著改变单核细胞或MDM的存活性。此外，所有也在100μM下测试的RTV粒子制备物也不改变巨噬细胞的存活性，但是将单核细胞的存活性降低了15％。
[0226] 按 照 Gendelman 等 (J.Exp.Med.167(4)：1428-1441，1988) 和 Chaudhuri 等(J.Cereb.Blood Flow Metab.28(4)：697-711)中的描述执行单核细胞跨过血脑屏障的4
迁移。对于这种测定法来说，将2x10 个人脑微血管内皮细胞(HBMEC)接种在来自BD Tm
Biosciences(Franklin Lakes.NJ，USA)的胶原蛋白包被的FLUOROBLOK 着色组织培养插片(3μm孔径)上。因为在这些插片上不能看见HBMEC单层，因此使用EVOM电压计(World Precision Instruments，Sarasota，FL，USA)评估跨上皮电阻的手动读数以证实单层的形
6
成和合生。将单核细胞以5μM/1x10 个细胞用钙黄绿素-AM(Invitrogen)标记45分钟，并
5
用磷酸盐缓冲盐水清洗。对于迁移来说，将2.5x10 个标记的单核细胞置于HBMEC单层上(FLUOROBLOK插片的上室)，并允许其跨过单层迁移2小时(37℃，5％CO2)。使用荧光读板器(吸收：494nm；发射：517nm)对迁移到下室中的单核细胞进行定量，并与从已知数量的钙黄绿素标记的细胞的连续稀释液产生的标准曲线进行比较。对于IDV-4和RTV-4来说，尽管相对于未荷载的单核细胞和MDM，粒子的荷载增加了跨过人造血脑屏障模型的单核细胞迁移，但这种增加不是统计学显著的。
迁移。对于这种测定法来说，将2x10 个人脑微血管内皮细胞(HBMEC)接种在来自BD Tm
Biosciences(Franklin Lakes.NJ，USA)的胶原蛋白包被的FLUOROBLOK 着色组织培养插片(3μm孔径)上。因为在这些插片上不能看见HBMEC单层，因此使用EVOM电压计(World Precision Instruments，Sarasota，FL，USA)评估跨上皮电阻的手动读数以证实单层的形
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成和合生。将单核细胞以5μM/1x10 个细胞用钙黄绿素-AM(Invitrogen)标记45分钟，并
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用磷酸盐缓冲盐水清洗。对于迁移来说，将2.5x10 个标记的单核细胞置于HBMEC单层上(FLUOROBLOK插片的上室)，并允许其跨过单层迁移2小时(37℃，5％CO2)。使用荧光读板器(吸收：494nm；发射：517nm)对迁移到下室中的单核细胞进行定量，并与从已知数量的钙黄绿素标记的细胞的连续稀释液产生的标准曲线进行比较。对于IDV-4和RTV-4来说，尽管相对于未荷载的单核细胞和MDM，粒子的荷载增加了跨过人造血脑屏障模型的单核细胞迁移，但这种增加不是统计学显著的。
[0227] 这些研究证实，用DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子荷载MDM对细胞没有毒性，并且MDM保留了细胞功能。因此，载有DOTAP涂层蛋白酶抑制剂粒子的MDM可有效用于将药物递送到被感染组织。
[0228] 实施例12
[0229] 含有DOTAP的粒子制备物的抗反转录病毒效能
[0230] 为了确定被MDM摄取的蛋白酶抑制剂表面修饰粒子的体外抗反转录病毒效果，将细胞用浓度为1、10和100μM的各表面修饰粒子制剂处理12小时，并在药物处理后第1、5、10和15天用HIV-1(分离株ADA)以感染性病毒粒子/细胞的感染复数为0.01进行激惹。
在病毒感染后，将细胞培养10天，每隔一日更换一半培养基。在第5、7和10天从细胞培养物收集培养基样品，用于通过RT活性测定来测量子代病毒粒子的生产。在感染后第10天，通过免疫染色进行被感染细胞的HIV-1 p24抗原表达的平行分析。
在病毒感染后，将细胞培养10天，每隔一日更换一半培养基。在第5、7和10天从细胞培养物收集培养基样品，用于通过RT活性测定来测量子代病毒粒子的生产。在感染后第10天，通过免疫染色进行被感染细胞的HIV-1 p24抗原表达的平行分析。
[0231] 为了测量RT活性，将培养基样品(10μl)与10μl溶液混合，所述溶液含有100mM Tris-HCl(pH 7.9)、300mM KCl、10mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1％壬基苯氧基聚乙氧基乙醇-40和水。将反应混合物在37℃温育15分钟，并向每个孔加入25μl溶液，所述溶液含有50mM Tris-HCl(pH 7.9)、150mM KCl、5mM DTT、15mM MgCl2、0.05％壬基苯氧基聚乙氧
3
基乙醇-40、10μg/ml poly(A)、0.250U/ml寡聚d(T)12-18和10μCi/ml H-胸苷5’-三磷酸(TTP)；将板在37℃温育18小时。在温育后，向每个孔加入50μl冷的10％TCA，将孔在玻璃纤维滤器上进行收获，并通过3-闪烁光谱术使用TopCount NXT计数器(PerkinElmer
3
Inc.，Waltham，MA，USA)评估滤器的 H-TTP掺入。
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基乙醇-40、10μg/ml poly(A)、0.250U/ml寡聚d(T)12-18和10μCi/ml H-胸苷5’-三磷酸(TTP)；将板在37℃温育18小时。在温育后，向每个孔加入50μl冷的10％TCA，将孔在玻璃纤维滤器上进行收获，并通过3-闪烁光谱术使用TopCount NXT计数器(PerkinElmer
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Inc.，Waltham，MA，USA)评估滤器的 H-TTP掺入。
[0232] 对于相同制剂，在与用于实施例10中所描述的摄取和释放研究相同的浓度下进行抗反转录病毒活性测试，以确保数据集可以进行比较。对于IDV-4来说，在检所有的检查时间点都观察到RT活性的剂量依赖性效应，而IDV-1仅在第1和第5天显示出可能的剂量依赖性响应。当药剂在第1天以100μM给药时，从第5天开始观察到两种制剂之间的显著差异(p＜0.05)。到第15天，IDV-1处理组与被感染的对照没有差别，而IDV-4处理组维持显著的(p＜0.05)病毒抑制，从而证实了包含DOTAP的制剂的增加的效能。
[0233] 对于RTV-1和RTV-4来说，RT活性抑制的比较揭示出两种药物在所有时间点的可能的剂量响应趋势。RTV-4处理的细胞随时间保持RT活性的降低，但是RTV-1处理的细胞不是如此。到第15天，RTV-1与对照相比显示出RT活性降低34.84％，而RTV-4将RT活性抑制98.42％，再一次证实了包含DOTAP的制剂的增加的效能。
[0234] HIV-1 p24抗原的表达也被用于证明用表面修饰粒子处理并随后用HIV-1感染的MDM中的抗反转录病毒活性。在HIV-1感染后，将细胞用4％磷酸盐缓冲的聚甲醛固定10天。使用针对HIV-1 p24的小鼠单克隆抗体(1∶10，Dako，Carpinteria，CA，USA)测定HIV-I-感染的细胞的密度。免疫染色的定量使用Image-Pro Plus 4.0版(Media Cybernetics Inc.，Bethesda，MD，USA)通过密度测量法来进行。p24的表达通过测定每个显微镜视野中阳性面积(指数)作为总图像面积的百分数来定量。
[0235] 用IDV-1和IDV-4处理的感染MDM的p24表达的评估，对于用IDV-4处理的细胞来说在所有时间点显示出p24表达的剂量依赖性效应，但是对于用IDV-1处理的细胞来说仅在第一天显示出这种效应。从第1天开始，在所有浓度下观察到两种制剂之间的显著差异(p＜0.05)。在第15天，用100μM IDV-1处理的细胞与被感染对照没有差异，而用100μM IDV-4处理的细胞显示出显著差异(p＝0.0003)。在用RTV-1或RTV-4处理的组中对HIV-1 p24抗原密度的比较，对于所有浓度下的两种制剂来说，在所有时间点都显示出可能的剂量响应效应。对于用100μM RTV粒子处理的细胞来说，从第1天开始观察到HIV-1 p24密度的显著差异(p＝0.0156)。到第15天，在RTV制剂之间所有处理浓度具有显著差异(p＜0.021)。
[0236] 总的来说，IDV-4和RTV-4在被感染细胞中抑制HIV-1子代病毒粒子的生产达15天，而IDV-1和RTV-1不能。这由p24抑制的逐渐丧失以及由p24标记密度的增加所表现的病毒传播随时间过去的爆发所证实。该数据集反映了RT分析的结果，并通过显示RT活性和HIV-1p24两者随时间的降低，证实了对于IDV-4和RTV-4来说病毒复制速率的降低。因此，DOTAP涂层的蛋白酶抑制剂粒子保留了反转录病毒活性，并且载有DOTAP涂层蛋白酶抑制剂粒子的MDM能够有效治疗HIV感染。
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