一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用专利检索-坏死生物学专利检索查询-专利查询网

一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用

阅读：1028发布：2020-08-14

专利汇可以提供一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用，该试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖试纸芯的面板，试纸芯包括样品垫、带有金标抗体的胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫；胶体金结合垫包被有胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白；硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线和对照线上分别包被的是七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白和鼠抗神经坏死病毒MCP重组蛋白单克隆抗体，本发明提供了用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的核苷酸序列。本发明的试纸操作简便、灵敏度高、结果快速、成本低廉，适合养殖场开展七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的快速诊断。，下面是一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。
2.一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述检测试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖于试纸芯上的面板，衬板连接在底座之上，所述试纸芯安装在衬板内，所述面板上设有加样孔和结果显示窗，所述试纸芯包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫，依次粘贴于衬板上；
所述加样孔设于样品垫的上方位置，所述结果显示窗设于硝酸纤维素反应膜上方对应的位置，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被有七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，对照线上包被有鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体，所述的胶体金结合垫为包被有胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白的玻璃纤维纸。
3.根据权利要求2所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的包被量为1.0 ~ 10μg蛋白，所述胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白中胶体金标记量为1~20μg/mL，所述鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体的包被量为0.5 ~5.0μg 蛋白。
4.根据权利要求2 所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述检测线和对照线两者线间距为5-7 mm。
5.根据权利要求2 所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：
(1) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白重组表达质粒的构建
以七带石斑鱼神经坏死病毒RNA 为模板，设计引物克隆得到编码七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，将该序列插入表达载体，获得重组表达载体；
(2) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白在大肠杆菌中的表达
将重组表达载体转化大肠杆菌，挑选含重组表达载体的大肠杆菌接种到培养基中进行扩大培养，然后加入IPTG 诱导表达，收集细菌培养物；
(3) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组包涵体蛋白的变复性
收集包涵体，包涵体用缓冲液稀释后，装入透析袋中进行透析；
(4) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的Ni柱亲和纯化；
将透析后的包涵体溶液上样至亲和层析柱进行蛋白纯化，收集蛋白流出液；将其装入透析袋中进行透析，获得纯化的MCP重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述步骤(1) 中引物序列为：
正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’；
反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’。
7.根据权利要求5所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述步骤(2)中当细菌浓度生长到OD600=0.5~1.0时，按浓度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 诱导3 ~5h，离心，收集细菌培养物。
8.根据权利要求2所述的免疫层析检测试纸，其特征在于：所述胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，取胶体金溶液和七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，搅拌震荡使其结合，加入牛血清白蛋白，离心，弃上清，沉淀加入金标缓冲溶液悬浮后定容制得。
9.权利要求2所述的胶体金免疫层析检测试纸在制备用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的检测用品中的应用。
10.根据权利要求9所述的胶体金免疫层析检测试纸在制备用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的检测用品中应用，其特征在于：在加样孔内加入稀释后的鱼类待检血清样本，静置后如果若检测线和对照线均呈现红色，表明待检血清样本中含有神经坏死病毒抗体；如果只有对照线呈现红色，表明检测样品中不含有神经坏死病毒抗体。

说明书全文

一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层

析检测试纸及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于水产动物免疫学检测技术领域，具体涉及一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用。

背景技术

[0002] 七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我国沿海分布纬度最高的石斑鱼种类，除了具有个体大、生长速度快和经济价值高等特点外，对低温的耐受能力较强，生存水温9~34℃，摄食水温12~32℃，有“冷水石斑”之称，被认为是东北亚温带海域网箱养殖理想海水鱼类品种之一，其苗种繁育技术的突破，可以缓解我国东海北部和黄渤海沿岸网箱适养鱼类品种缺乏的问题，因此备受业界重视。但是尽管国内外研究多年，七带石斑鱼的苗种繁育技术始终不能稳定，在所面临的技术瓶颈中，神病毒性神经坏死病(viral nervousnecrosis，VNN)造成的早期苗种死亡率居高不下是目前最亟待解决的关键问题。

[0003] 病毒性神经坏死病(viral nervousnecrosis，VNN)是目前全球范围内除非洲外海水养殖鱼类危害最严重的病毒性疾病之一，分为SJNNV、TPNNV，BFNNV和RGNVV4种类型，已报道的感染养殖鱼类种类已超过13科近40种。养殖石斑鱼受害尤其严重，受到感染后，早期仔稚鱼死亡率高达100%，中间培育稚鱼死亡率也常常超过50%，即便是体重超过1.5kg的养殖成鱼受到感染后也会死亡。因此，VNN已经成为造成养殖石斑鱼从苗种到养殖大量死亡的主要原因之一。我国是石斑鱼养殖大国，2008年产量达到4.5万t，占世界石斑鱼养殖总产量7.5万t的一半以上，为保障我国石斑鱼养殖这一海水养殖支柱产业的可持续稳定发展，亟需对石斑鱼病毒性神经坏死病的防治技术开展深入研究。

[0004] 病毒性神经坏死病（viral nervousnecrosis，VNN）是由诺达病毒科（Nodaviridae）的一种小RNA病毒引起的，该病毒被称为神经坏死病病毒（nervousnecrosis virus，NNV），NNV的传播主要有两条途径，一是由携带病毒的亲鱼通过配子垂直传播给子代，另外一条途径是同一养殖环境中养殖鱼群体间、不同种类养殖鱼类或者栖息生物间以及从生鲜饵料鱼和生物饵料至养殖群体的水平传播。为了明晰NNV的传播途径和研发出相应的预防技术，目前国内外研究学者已经开发出了多种NNV检测技术，如原位杂交、免疫组织化学方法、荧光抗体技术、细胞培养、ELISA、逆转录转录酶链式聚合反应（RT-PCR）和实时定量PCR等方法。目前在生产实际中较为有效的检测手段均建立在神经坏死病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的PCR扩增基础之上，但仍然存在检测成本高、操作繁琐、周期长、需要专用仪器设备等缺点，无法满足养殖现场大规模快速准确检测的需求。

[0005] 胶体金免疫层析技术则是在胶体金标记技术和免疫层析技术发展的基础上，结合了单克隆抗体技术和新材料技术，它以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在层析反应过程中，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来。该技术操作简便、可靠性好、灵敏度高、反应迅速、结果直观并可大量制备，成本低廉，适合养殖场的大批量快速检测，真正实现了长期以来人们在检测技术领域所追求的“快速、简便、特异、敏感”的目标。胶体金免疫层析技术已在猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等多种动物病毒检测中得到应用，研究技术成熟，但现尚未见有将胶体金免疫层析技术用于石斑鱼神经坏死病毒抗体检测的相关报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对石斑鱼神经坏死病毒检测，提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用。本发明的检测试纸操作简便、灵敏度高、结果快速、成本低廉，适合养殖场开展七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的快速诊断。

[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。

[0008] 本发明还提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸，所述检测试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖于试纸芯上的面板，衬板连接在底座之上，所述试纸芯安装在衬板内，所述面板上设有加样孔和结果显示窗，所述试纸芯包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫，依次粘贴于衬板上；所述加样孔设于样品垫的上方位置，所述结果显示窗设于硝酸纤维素反应膜上方对应的位置，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被有七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，对照线上包被有鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体，所述的胶体金结合垫为包被有胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白的玻璃纤维纸。

[0009] 进一步的：所述七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的包被量为1.0 ~ 10μg蛋白，所述胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白中胶体金标记量为1~20μg/mL，所述鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体的包被量为0.5 ~5.0μg 蛋白。

[0010] 进一步的：所述检测线和对照线两者线间距为5-7 mm。

[0011] 进一步的：所述的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：(1) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白重组表达质粒的构建
以七带石斑鱼神经坏死病毒RNA 为模板，设计引物克隆得到编码七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，将该序列插入表达载体，获得重组表达载体；
(2) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白在大肠杆菌中的表达
将重组表达载体转化大肠杆菌，挑选含重组表达载体的大肠杆菌接种到培养基中进行扩大培养，然后加入IPTG 诱导表达，收集细菌培养物；
(3) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组包涵体蛋白的变复性
收集包涵体，包涵体用缓冲液稀释后，装入透析袋中进行透析；
(4) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的Ni柱亲和纯化；
将透析后的包涵体溶液上样至亲和层析柱进行蛋白纯化，收集蛋白流出液；将其装入透析袋中进行透析，获得纯化的MCP重组蛋白。

[0012] 进一步的：所述步骤(1) 中引物序列为：正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’；
反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’。

[0013] 进一步的：所述步骤(2)中当细菌浓度生长到OD600=0.5~1.0时，按浓度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 诱导3 ~5h，离心，收集细菌培养物。

[0014] 进一步的：所述胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，取胶体金溶液和七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，搅拌震荡使其结合，加入牛血清白蛋白，离心，弃上清，沉淀加入金标缓冲溶液悬浮后定容制得。

[0015] 本发明还提供了胶体金免疫层析检测试纸在制备用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的检测用品中的应用。

[0016] 进一步的：在加样孔内加入稀释后的鱼类待检血清样本，静置后如果若检测线和对照线均呈现红色，表明待检血清样本中含有神经坏死病毒抗体；如果只有对照线呈现红色，表明检测样品中不含有神经坏死病毒抗体。

[0017] 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供的检测试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖于试纸芯上的面板，试纸芯包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫，所述胶体金结合垫包被有胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线和对照线上分别包被的是七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白和鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体。

[0018] 本发明提供的检测试纸操作简便、灵敏度高、结果快速直观、成本低廉，无需特殊的设备和仪器，十分适合养殖场开展七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的快速诊断。附图说明

[0019] 图1 为本发明所述胶体金免疫层析检测试纸的表面结构示意图；图2 为本发明所述胶体金免疫层析检测试纸的内部结构示意图。

[0020] 其中1、衬板；2、样品垫；3、胶体金结合垫；4、硝酸纤维素反应膜；5、检测线；6、对照线；7、吸水垫；8、底座；9、加样孔；10、结果显示窗；11、面板。

[0021] 图3为本发明所述七带石斑鱼神经坏死病毒外壳MCP重组蛋白的电泳图谱。其中，M：蛋白分子量标准；泳道1：未纯化的包涵体蛋白；泳道2：变复性后的包涵体蛋白；泳道3：纯化后的蛋白。

具体实施方式

[0022] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

[0023] 实施例1一、用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸的结构
如图1和图2所示，本发明提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸，所述的检测试纸包括有底座8、衬板1、试纸芯和覆盖在试纸芯上的面板
11，其中试纸芯安装在所述衬板上，衬板可以通过嵌入方式来安装在底座上，所述面板11上设有加样孔9 和结果显示窗10，所述试纸芯包括样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维素反应膜4和吸水垫7，并按照如图1所示的方式依次排列粘贴在所述衬板1上。

[0024] 所述样品垫2的上方位置对应着面板上设有的加样孔9，便于待检测样品通过加样孔进入样品垫2；所述硝酸纤维素反应膜4上方位置对应着面板上设有的结果显示窗10，硝酸纤维素膜上设有检测线5和对照线6，所述检测线5上包被的是七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，所述对照线6上包被的是鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体，所述胶体金结合垫3为包被有胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的玻璃纤维纸。

[0025] 所述七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的合适包被量为1.0 ~ 10μg蛋白，所述胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白中胶体金标记量为1~20μg/mL，所述鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体合适包被量为0.5 ~5.0μg 蛋白。

[0026] 二、本发明所述胶体金免疫层析检测试纸的制备方法1、制备七带石斑鱼神经坏死病毒外壳MCP重组蛋白
(1) 构建七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白重组表达质粒
以七带石斑鱼神经坏死病毒RNA 为模板，经过反转录后设计带有酶切位点和保护碱基的引物：
正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’（SEQ ID NO.2）。

[0027] （斜体CCG为保护碱基；粗体GAATTC为Xhol位点；粗体CTCGAG为EcoR1位点）克隆得到编码七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白的cDNA 序列（SEQ ID NO.3）并且两端分别带有XhoI和EcoRI酶切位点，将该序列经过限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表达载体XhoI和EcoRI酶切位点之间，获得重组质粒pET-MCP。

[0028] 编码七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

[0029] (2) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白在大肠杆菌中的表达将重组质粒pET-MCP转化大肠杆菌BG21，挑选阳性克隆，测序正确后，将含pET-MCP质粒的BL21菌株50µL接种于含有2µL Km的2ml LB液体培养瓶中，37℃180rpm振荡培养过夜，次日按1:100 ~ 1:500(V/V) 转接到含有10L LB 培养基的15L 的发酵罐中，以250rpm 转速
37℃培养4~ 10h，当细菌浓度生长到OD600=0.5~1.0时，按浓度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 诱导3 ~5h，6000rpm 离心10min，收集细菌培养物放到置于-20℃保存。

[0030] (3) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组包涵体蛋白的变复性将诱导表达后的菌体沉淀重悬于裂解液Lysis buffer (20 mM Tris-HCl containing
1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0)中，超声破碎(功率
400 W，工作4 sec，间歇8 sec，共20 min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000g离心20 min，收集沉淀即为包涵体。

[0031] 使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3-5次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4度放置过夜；室温，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20 mM Tris-HCL 5mM EDTA Buffer PH7.8缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，剪取处理好适量长度的透析袋，在纯水中冲洗，将蛋白溶液装入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）缓冲液中，4℃透析过夜。

[0032] (4) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的Ni柱亲和纯化利用低压层析系统，将透析后的包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA
Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以
1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集蛋白流出液；剪取处理好适量长度的透析袋，在纯水中冲洗，将上述收集的蛋白溶液装入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）缓冲液中，4℃透析过夜；分步收集洗脱液，检测纯度和含量。

[0033] 分别取3μL未纯化包涵体蛋白、3μL变复性的蛋白和1μL洗脱的纯化产物与蛋白质分子量标准进行12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯蓝染色后，于凝胶成像系统观察重组蛋白纯化效果，结果见图3所示。经亲和层析法纯化后获得纯化的重组蛋白，收集后作为样品备用。

[0034] 2、制备鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒单克隆抗体(1) 动物免疫
选取5 只6-8 周龄雌性BALB/c 小鼠，将七带石斑鱼神经坏死病毒MCP 蛋白与弗氏完全佐剂混合首次免疫，皮下注射100ug，2-3 周加强免疫一次，采用免疫佐剂与抗原混合，皮下注射100ug。四免后采血检测，通过间接ELISA 方法确定抗血清针对七带石斑鱼神经坏死病毒MCP 蛋白的效价，待效价大于1:10000，选择1-2 只小鼠安排进行细胞融合。

[0035] (2)细胞融合融合前一周，用含10%FBS DMEM 培养基扩大培养SP2/0 细胞。到融合时，细胞长满大约
6 瓶T25 细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0 细胞到50ml 离心管中，1000rpm,5min 离心。
弃上清，然后再加入20ml DMEM 基础培养基，吹散细胞然后计数。

[0036] 四次免疫后血清ELISA 效价在1：10000 以上的小鼠，在融合前3 天终免，腹腔注射抗原100ug，融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠，用75%酒精浸泡5min，无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mlDMEM 基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM 到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml 离心管中，用不含血清的DMEM 洗脾细胞两次，1000 rpm离心5min，收集脾细胞计数。

[0037] 混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20 为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM 基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50%PEG，反应90 秒，然后加入20-30ml DMEM 培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10 分钟。1000rpm 5min，弃上清然后加入HAT DMEM培养基. 把融合的细胞铺到96 孔板中，每孔100µL。然后将细胞培养板放到CO2 培养箱中培养。融合后4 天查看，杂交瘤细胞克隆率在50%以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10 天后进行筛选检测，确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

[0038] (3) 融合筛选及亚克隆在检测的前一天，用PBS 包被5ug/ml 抗原于ELISA 板，过夜。次日吸取细胞上清
100ul/孔进行ELISA 检测根据ELISA 结果，判断阳性孔（样品孔OD 值/阴性孔OD 值≥2.1 则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

[0039] 吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4 ml DMEM 培养基，取100ul 细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM 到4ml，吹匀，留100ul（约2 滴）在管底。在离心管中加DMEM 至5ml，混匀后滴加至96 孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml 左右，补加DMEM 至5ml，吹匀后滴加至96 孔板的D、E、F 三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM 至2.8-3ml 左右，吹匀后滴加至96 孔板的G、H 行，每孔一滴，7-10 天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

[0040] (4) 腹水制备（单抗大量生产）在接种杂交瘤细胞前1 周，用0.5 mL液体石蜡腹腔注射正常BALB/C小鼠。将培养的杂交瘤细胞离心，弃去上清，杂交瘤细胞用无血清培养液悬浮，并将细胞数调至106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL。接种杂交瘤细胞后约7~12 天，小鼠腹部可见明显膨大。用75 %酒精棉球消毒腹部皮肤后，用注射器抽取腹水。每只小鼠抽取腹水2 mL，间隔5天后，待腹水再生积聚后，同法抽取。收集的腹水3 000 r/min 离心20 min，收集上清，经硫酸铵沉淀纯化即得纯化的鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒单克隆抗体，-20 ℃保存备用。

[0041] 3、胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的制备胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为30 nm 的胶体金溶液。取胶体金溶液10mL和七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白150μg，在PH7.5 的条件下搅拌30 min震荡使其结合，加入10％(w/w) 的牛血清白蛋白，使其终浓度为1％ (w/v)，10000 rpm /min 离心30 min，弃上清，沉淀加入金标缓冲溶液悬浮后定容至1mL，4 ℃保存备用。

[0042] 4、胶体金免疫层析检测试纸的制备所述检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，按照如下步骤进行：将胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白以2-5µL/cm 的速度喷涂到玻璃纤维纸上得到胶体金结合垫，将浓度为1mg/ml 的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白以1µL /cm 的速度喷涂到硝酸纤维膜上得到检测线5，将浓度为0.5mg/ml的鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体以1.0µL /cm 的速度喷涂到硝酸纤维膜上得到对照线6，检测线和对照线两者线间距为5-7 mm，干燥后切割成4 mm 宽的硝酸纤维素膜条，进行组装得到一种检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸。

[0043] 实施例2、所述胶体金免疫层析检测试纸的应用在应用所述免疫层析检测试纸在检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体时，在本发明胶体金免疫层析检测试纸的加样孔9内加入少量用1mL 0.01M pH值为7.4 的 PBS 稀释后的七带石斑鱼待检血清样本，等待约10min后，若对照线呈现红色表明所述的免疫层析检测试纸有效，若检测线和对照线均呈现红色，表明如果待检血清样本中含有神经坏死病毒抗体，若只有对照线呈现红色，表明检测样品中不含有神经坏死病毒抗体。

[0044] 上述实施例可以看出，本发明可对七带石斑鱼神经坏死病毒抗体进行快速诊断，且操作简便、灵敏度高、结果快速直观、成本低廉，无需特殊的设备和仪器，十分适合养殖场开展七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的快速诊断。

[0045] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

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