用于牙组织再生的组合物和方法
阅读：705发布：2023-03-12
专利汇可以提供用于牙组织再生的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种再生牙组织的方法，包括将含有Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或NGF的 支架 与牙组织 接触 ，由此促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进祖细胞迁移至牙组织中，或者再生牙组织。本发明还提供了用于再生牙组织的组合物，其包含支架及Wnt3a和BMP-7，及任选存在的VEGF、bFGF或NGF。，下面是用于牙组织再生的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种用于再生牙组织的组合物，其包含：
包含水凝胶的基质或支架；及
治疗有效量的Wnt3a多肽；及
治疗有效量的骨形态发生蛋白7(BMP-7)；及
任选地，治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或者神经生长因子(NGF)；
其中
所述组合物不包含活细胞，及
基质或支架包含Wnt3a和BMP-7，及任选存在的VEGF、bFGF或NGF。
2.一种用于再生牙组织的方法，包括：
提供权利要求1的组合物；及
将所述组合物插入哺乳动物牙齿的天然或人工的洞或腔室中；
其中所述组合物促进祖细胞的成牙本质细胞分化，促进祖细胞迁移至牙组织中，促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育，以再生牙组织。
3.权利要求2的方法，其中所述组合物再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质。
4.权利要求2-3任一项的方法，其中所述支架进一步包含选自如下的化合物：血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF1)、除了BMP-7之外的骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-β、生长和分化因子(GDF)、胰岛素样生长因子-1(IGF1)、牙本质基质蛋白、牙本质涎蛋白、骨涎蛋白、牙釉蛋白、整联蛋白、血管生成素、血管形成素-1、del-1、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)、白细胞介素-8(IL-8)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、多营养因子(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMP)、血管形成素1(ang1)、ang2、delta-样配体4(DLL4)、结缔组织生长因子(CTGF)、脑衍生神经因子(BDNF)、NT-4和NT-3。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述支架进一步包含抗生素或镇痛药。
6.权利要求2-5任一项的方法，其中将Wnt3a多肽、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF注射于、混合于、包囊于、束缚于或者吸附于基质或支架中。
7.权利要求2-4任一项的方法，其中所述支架具有人切牙、人尖牙、人双尖牙或人磨牙的形状，或者其中天然或人工的洞或腔室的形状。
8.权利要求2-7任一项的方法，其中所述基质或支架包含：
天然聚合物，选自胶原蛋白、明胶、多糖、壳聚糖、羟磷灰石(HA)及聚羟基脂肪酸酯；
合成的聚合物，选自聚(α-羟基酸)的脂肪族聚酯及聚乙二醇；
羟磷灰石；或者
藻酸盐水凝胶。
9.权利要求2-8任一项的方法，其中所述支架包含直径为(i)50-500μm或者(ii)大约200μm的微通道。
10.权利要求9的方法，其中Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或者NGF被包埋入支架微通道中的凝胶中。
11.权利要求9的方法，其中Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或者NGF包囊于微球中。
12.权利要求2-11任一项的方法，进一步包含使用计算机辅助设计(CAD)制作牙齿或者牙洞的模型，及用生物绘图仪合成支架。
13.权利要求2-12任一项的方法，其中Wnt3a多肽包含：
(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；或者(ii)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少大约95％序列相同性并具有Wnt3a活性的氨基酸序列。
14.权利要求2-13任一项的方法，其中所述基质或支架是生物可降解的。
15.权利要求2-14任一项的方法，其中Wnt3a以大约1ng至大约1,000mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。
16.权利要求2-15任一项的方法，其中BMP-7以大约1ng至大约1,000mg BMP-7/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。
17.权利要求2-16任一项的方法，其中Wnt3a以大约10ng/ml溶液的浓度存在，BMP-7以大约200ng/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。
18.权利要求2-17任一项的方法，其中：
VEGF以大约1ng至大约1,000mg VEGF/ml溶液的浓度存在；
bFGF以大约1ng至大约1,000mg bFGF/ml溶液的浓度存在；或者
NGF以大约1ng至大约1,000mg NGF/ml溶液的浓度存在；
其中所述溶液被导入基质或支架中。
19.权利要求2-18任一项的方法，进一步包括：
暴露牙髓腔或根管中创伤或患病的牙髓组织；及
用所述组合物覆盖或充填至少一部分的牙髓腔或根管；
其中在覆盖或充填后新生的血管化牙髓样组织在牙髓腔或根管中形成。
20.权利要求2-19任一项的方法，进一步包括：
从牙齿中除去创伤或患病的牙髓组织，以产生基本上没有创伤或患病组织的牙髓腔或根管；
从牙齿中除去基本上所有的牙髓组织；或者
用惰性材料充填至少一部分牙髓腔。
用于牙组织再生的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年6月5日申请的美国临时申请系列号61/831,595及2013年3月21日申请的美国临时申请系列号61/804,138的权益，每个申请全文引入本文作参考。
[0004] 本发明是在政府资助下完成的，所述资助为由National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research颁发的基金5RC2DE020767，及由The National Institutes of Health颁发的基金R01DE15391。政府在本发明中具有一定权利。
[0005] 引入作参考的材料
[0007] 发明背景
[0008] 牙齿是生物学可存活的，这主要是由于牙髓。目前，患病的、缺失的或创伤的牙髓是通过用惰性合成材料覆盖或置换。最常用的充填材料是杜仲胶，这是橡胶基质的热塑性聚合物。在除去已经患病、缺失或创伤的天然牙髓后，将杜仲胶熔化并注入以充填根管。尽管牙髓或根管处理已经是当代牙科医学领域的常规技术，但是仍具有对于患者的生活质量有不利影响的一些缺点(Salvi et al.2007)。首先，经根管治疗的牙趋于易碎，且容易断裂。其次，在根管治疗后通常发生牙齿变色。其经过根管治疗而发生牙齿变色的患者通常需要额外的高价牙齿美容程序。第三，脱落的牙齿(乳牙)的患病的、缺失的或感染的牙髓通常缺乏治疗选择，且通常不适于根管治疗。牙髓坏死在85-96％的撕脱牙及70-100％侵入牙(intruded teeth)中发生。未处理的或不良处理的牙感染可以导致全身性感染(Shay2002；Brennan et al.2007)。
[0009] 理想地，一种改良的用于患病、缺失或创伤牙髓的治疗方式使得生物学活组织得以恢复。组织工程技术已经用于开发恢复颅面组织和骨的方法和组合物。见例如Alhadlaq and Mao,2003；Edwards and Mason,2006；Fong et al.,2005；Goldberg and Smith,2004；Hong and Mao,2004；Lovschall et al.,2001；Mao et al.,2006；Mathieu et al.,2006；
Murray et al.,2002；Murray et al.,2007；Nakashima and Alamine,2005；Nakashima and Reddi,2003；Stosich and Mao,2007；Young et al.,2002；美国专利No.5,885,829；及美国专利申请公开20050079470。大多数技术包括使用支架材料，其包含哺乳动物细胞如牙髓干细胞或者间充质干细胞，和/或生物活性成分如骨形态发生蛋白(BMP)。将细胞接种于支架材料上的技术具有难以制备和贮存的缺点，因为活细胞必须在支架上接种、培养和维持。此外，用于组织再生中的细胞的来源和产量不足。
Murray et al.,2002；Murray et al.,2007；Nakashima and Alamine,2005；Nakashima and Reddi,2003；Stosich and Mao,2007；Young et al.,2002；美国专利No.5,885,829；及美国专利申请公开20050079470。大多数技术包括使用支架材料，其包含哺乳动物细胞如牙髓干细胞或者间充质干细胞，和/或生物活性成分如骨形态发生蛋白(BMP)。将细胞接种于支架材料上的技术具有难以制备和贮存的缺点，因为活细胞必须在支架上接种、培养和维持。此外，用于组织再生中的细胞的来源和产量不足。
[0010] 将祖细胞诱导成成牙本质细胞(Od)的关键因素尚未知。
[0011] 发明概述
[0012] 在本发明的各个方面中，提供了用于再生牙组织的组合物和方法。
[0013] 本发明一方面提供了用于再生牙组织的组合物。在一些实施方案中，组合物包含基质或支架(例如包含水凝胶的基质或支架)和治疗有效量的Wnt3a多肽和骨形态发生蛋白7(BMP-7)。在一些实施方案中，组合物包含治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或者神经生长因子(NGF)。在一些实施方案中，组合物不包含活细胞。在一些实施方案中，基质或支架包含Wnt3a和BMP-7，及任选存在的VEGF、bFGF或NGF。所述组合物的其它特征在下文使用方法中论述。本领域技术人员了解这种特征可同样用于组合物自身。
[0014] 本发明另一方面提供了用于再生牙组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供上述组合物，及将组合物插入哺乳动物牙齿的天然或人工的洞或腔室中。在一些实施方案中，所述组合物促进祖细胞的成牙本质细胞分化，促进祖细胞迁移至牙组织中，促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育，以再生牙组织。在一些实施方案中，所述组合物再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质(neodentin)。
[0015] 在一些实施方案中，所述支架进一步包括选自如下的化合物：血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生的因子-1(SDF1)、除了BMP-7之外的骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-β、生长和分化因子(GDF)、胰岛素样生长因子-1(IGF1)、牙本质基质蛋白、牙本质涎蛋白、骨涎蛋白、牙釉蛋白、整联蛋白、血管生成素(angiogenin)、血管形成素-1(angiopoietin-1)、del-1、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)、白细胞介素-8(IL-8)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、多营养因子(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMP)、血管形成素1(ang1)、ang2、delta-样配体4(DLL4)、结缔组织生长因子(CTGF)、脑衍生神经因子(BDNF)、NT-4和NT-3。在一些实施方案中，支架进一步包含抗生素或镇痛药。
[0016] 在一些实施方案中，将Wnt3a多肽、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF注射于、混合于、包囊于、束缚于(tethered to)或者吸附于基质或支架中。
[0017] 在一些实施方案中，支架具有人切牙、人尖牙、人双尖牙(bicuspid)或人磨牙或者其中天然或人工的洞或腔室的形状。
[0018] 在一些实施方案中，基质或支架包括天然聚合物，选自胶原蛋白、明胶、多糖、壳聚糖、羟磷灰石(HA)及聚羟基脂肪酸酯。在一些实施方案中，基质或支架包括合成的聚合物，选自聚(α-羟基酸)的脂肪族聚酯及聚乙二醇。在一些实施方案中，基质或支架包括羟磷灰石。在一些实施方案中，基质或支架包括藻酸盐水凝胶。在一些实施方案中，基质或支架是生物可降解的。
[0019] 在一些实施方案中，支架包括直径为(i)50-500μm；或者(ii)大约200μm的微通道。在一些实施方案中，Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或NGF被包埋入支架微通道中的凝胶中。在一些实施方案中，Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或NGF包囊于微球中。
[0021] 在一些实施方案中，Wnt3a多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。在一些实施方案中，Wnt3a多肽包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少大约95％序列相同性并具有Wnt3a活性的氨基酸序列。
[0022] 在一些实施方案中，Wnt3a以大约1ng至大约1,000mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。在一些实施方案中，BMP-7以大约1ng至大约1,000mg BMP-7/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。在一些实施方案中，Wnt3a以大约10ng/ml溶液的浓度存在，BMP-7以大约200ng/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。在一些实施方案中，VEGF以大约1ng至大约1,000mg VEGF/ml溶液的浓度存在。在一些实施方案中，bFGF以大约1ng至大约1,000mg bFGF/ml溶液的浓度存在。在一些实施方案中，NGF以大约1ng至大约1,000mg NGF/ml溶液的浓度存在。在一些实施方案中，上述溶液被导入基质或支架中。
[0023] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括暴露牙髓腔或根管中创伤或患病的牙髓组织；及用所述组合物覆盖或充填至少一部分牙髓腔或根管，其中在覆盖或充填后新生的血管化牙髓样组织在牙髓腔或根管中形成。
[0024] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括从牙齿中除去创伤或患病的牙髓组织，以产生基本上没有创伤或患病组织的牙髓腔或根管。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从牙齿中除去基本上所有的牙髓组织。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用惰性材料充填至少一部分牙髓腔。
[0025] 本发明的其它目的和调整在后文将部分显见和点明。
[0027] 本领域技术人员理解下文所述附图只是举例说明本发明。附图不以任何方式限制本发明教导的范围。
[0028] 图1是经过临床相同根管处理的成人牙齿照片。经牙髓处理的根管和牙髓腔用无生物活性成分(a图)，或者仅具有碱性成纤维细胞生物活性成分(bFGF)(b图)，或者既具有bFGF也具有血管内皮生物活性成分(VEGF)(c图)的胶原蛋白海绵充填。将牙齿在皮下植入免疫缺陷的小鼠维持2周，以评估在牙髓处理的根管和牙髓腔内是否发生血管化。与无生物活性成分处理(仅胶原蛋白海绵)(a)相反，仅bFGF(b)及VEGF和bFGF组合(c)处理均示出在插入根管中的胶原蛋白海绵中的血管化。
[0029] 图2示出如图1所示处理的成人牙齿切片的显微照片。A图示出植入无生物活性成分的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根管。在免疫缺陷的小鼠中体内植入后，不存在任何宿主组织从牙根尖孔的向内生长。B图示出具有VEGF-加载的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根管，示出存在血管化(箭头所指)和宿主组织向内生长。浸润的宿主组织附着于牙本质。C图示出具有bFGF-加载的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根管，示出存在血管化(箭头所指)和宿主组织向内生长。浸润的宿主组织附着于牙本质。D图示出具有VEGF+bFGF-加载的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根管，示出存在血管化(箭头所指)和宿主组织向内生长。浸润的宿主组织附着于牙本质。
[0030] 图3示出在1％BSA溶液中TGFβ3从PLGA微球中的释放动力学图。通过ELISA检测，TGFβ3以缓释方式在直至36和42天分别从以50:50或75:25的共聚合物比率的PLGA微球释放。这两个共聚合物比率均观测到初始的爆发样释放，尽管50:50PLA/PGA比率比75:25PLA/PGA比率产生更快速的释放速率。
[0031] 图4是扫描电子显微图，示出PLGA微球的制造和降解。A图示出由聚-d-l-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)以50:50PLA/PGA比率制造的包囊有TGFβ3的微球的代表性SEM图像。B图示出包囊有TGFβ3的PLGA微球在PBS溶液中的预期降解的代表性SEM图像。
[0032] 图5是示出BMP-7从PLGA微球中的累积平均释放的图表。
[0033] 图6是示出NGF从PLGA微球中的累积平均释放的图表。
[0034] 图7是描述col1a1(2.3kb)-EGFP小鼠中报道基因表达及成牙本质细胞和成骨细胞的微阵列分析的一系列图像、散点图和阵列图。图7A是转基因示意图，其含有驱动EGFP表达的2.3kb col1a1启动子。图7B是分离自转基因小鼠的颌骨的图像，其中GFP信号可以在骨与牙齿中均检测到。图7C示出经解剖的Col1a1小鼠的颅盖骨，以及在缝合处和骨中观测到转基因表达。图7D示出颌骨和磨牙的切片。图7E示出在牙槽骨、牙周膜和成牙本质细胞中观察到GFP信号。图7F和图7G示出GFP阳性小鼠的切牙，GFP阳性细胞沿着牙本质表面排成一行，GFP信号位于成牙本质细胞中。图7H示出GFP阳性成牙本质细胞形成牙本质小管。图7I示出GFP阳性成牙本质细胞从Col1a1-EGFP小鼠牙髓中迁移出。图7J示出来自皮下接种于胶原蛋白凝胶(0.1ml)中的牙髓的10,000个GFP阳性细胞(基于GFP分选)。在图7J左侧角插入的X-线图像示出3周后矿化组织形成。图7K示出矿化组织是GFP阳性的。图7L是示出输送的GFP阳性成牙本质细胞形成与紊乱的牙本质相似的矿化结构的组织切片。图7M是示出DSP阳性的牙本质样组织的图像(绿色，GFP；红色，DSP；紫色，DAPI)。图7N示出来自接种于肾小囊(0.1ml)中的牙髓的10,000个GFP阳性细胞(基于GFP分选)。在图7N的左侧角插入的X-线图像示出3周后矿化组织形成。图
7O示出矿化组织的H&E染色。图7P示出细胞形成DSPP阳性矿化组织。图7Q和图7R示出在Col1a1-EGFP小鼠中颅盖骨的骨细胞和成骨细胞是GFP阳性的。图7S示出分离自颅盖骨并在OIM中培养的细胞，其中GFP细胞在一周内形成结节。图7T和图7U示出分离自牙(成牙本质细胞)和颅盖骨(成骨细胞)的GFP阳性细胞的mRNA的Agilent全基因组微阵列分析。所有点的信号强度的散射图。图7U示出一个阵列试验数据的实例(n＝4)。
每个特征的信号强度以圆点表示。
7O示出矿化组织的H&E染色。图7P示出细胞形成DSPP阳性矿化组织。图7Q和图7R示出在Col1a1-EGFP小鼠中颅盖骨的骨细胞和成骨细胞是GFP阳性的。图7S示出分离自颅盖骨并在OIM中培养的细胞，其中GFP细胞在一周内形成结节。图7T和图7U示出分离自牙(成牙本质细胞)和颅盖骨(成骨细胞)的GFP阳性细胞的mRNA的Agilent全基因组微阵列分析。所有点的信号强度的散射图。图7U示出一个阵列试验数据的实例(n＝4)。
每个特征的信号强度以圆点表示。
[0035] 图8是示出通过免疫组织化学和原位杂交检测的差异表达的基因的一系列图像。进行免疫组织化学以检测选择的基因的蛋白质水平。图2A、图8B、图8C、图8E示出在切牙、磨牙和颅盖骨的成牙本质细胞中高度表达的选择的基因的表达。图8F和图8G示出在成骨细胞中高度表达的选择的基因的表达(比例尺＝20μm)(De:牙本质；P:牙髓)。图8H、图
8I和图8J示出通过原位杂交检测的生长因子的表达，因为Wnts和BMP7是分泌的生长因子，其可以扩散至周围组织(比例尺：A-G，50μm；H、I、J，250μm)。
8I和图8J示出通过原位杂交检测的生长因子的表达，因为Wnts和BMP7是分泌的生长因子，其可以扩散至周围组织(比例尺：A-G，50μm；H、I、J，250μm)。
[0036] 图9是示出通过RT-PCR证实微阵列的一系列条形图。图9A示出在成牙本质细胞中高度表达的选择的基因。图9B示出在成骨细胞中高度表达的选择的基因。选择的基因的表达通过实时PCR证实，使用分离自GFP阳性成牙本质细胞和成骨细胞的RNA进行(n＝3)。选择的基因是生长因子或分泌因子及转录因子。
[0037] 图10是示出Wnt3a选择性诱导成牙本质细胞迁移的一系列条形图和图像。图10A是条形图，示出用于研究响应Wnt3a、BMP-7的细胞迁移的使用PDL细胞进行的Boyden室测定的结果。将100k个PDL细胞接种在孔中，并将迁移诱因加入室中。12小时后，将迁移的细胞经胰蛋白酶消化并计数。然后将细胞铺板及增殖以进一步研究(n＝4*p<0.05)。图10B是在成骨诱导培养基中分化的迁移的细胞的图像，3周后用硝酸银染色(von Kossa)。
图10C和图10D是示出通过PCR检测的标记基因表达的条形图(n＝3*p<0.05)。
图10C和图10D是示出通过PCR检测的标记基因表达的条形图(n＝3*p<0.05)。
[0038] 图11是示出通过标准牙髓切除术除去的迷你猪牙髓的一对图像。在牙髓腔做入口。在根除牙髓组织后，清洁髓腔。根管用手锉成形，直径为0.1-2.5mm，并用盐水洗涤。用无菌纸尖干燥根管。
[0039] 图12是示出Wnt3a或BMP-7再生牙髓和牙本质的一系列图像和条形图。图12A、图12B、图12C和图12D示出与生长因子(对照物、BMP-7或Wnt 3a)组合的可注射的胶原蛋白凝胶注射进根管中。开放寻开髓室入口(access cavity)用基材和复合树脂密封。图12E和图12F是图12D部分的放大图。图12H、图12I、图12J和图12K示出在6-8周后收获及用组织学和微型-CT检验的切牙。图12L和图12M示出新形成的牙本质体积和密度的数量(p<0.05，n＝4)。
[0040] 图13是示出牙髓减压充填膜的一系列图，其中：1是膜；2是复合材料的边缘粘附；3是备填牙洞；4是可吸附生物材料；5是微孔膜和牙洞的连接；及6是牙髓组织。图13A示出充填膜的顶视图，其示出膜的中心部分和复合材料的周围部分。图13B示出充填膜的截面图，其示出复合材料中携带的膜。图13C示出以透视法示出的牙腔密封装置的截面图。牙腔中炎症的渗出物可以由藻酸盐立即吸收，随后从膜中渗出，而口腔中的细菌被该膜阻止。图13D示出密封装置与牙的截面图。
[0041] 图14是藻酸盐水凝胶形成的反应示意图。
[0042] 图15是物理交联的藻酸盐水凝胶的泡胀率(％)条形图。
[0043] 图16是麻醉的迷你猪的口腔照片，其中放置橡皮障以隔离切牙。通过用高速牙钻机械性开口以触及牙髓腔。
[0044] 图17是迷你猪切牙的组织横切面图，示出在将具有BMP-7(200ng/ml)的水凝胶注射进根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓(r.p.)、再生的血管(b.v.)、再生的牙本质(r.d.)和天然的牙本质(n.d.)。
[0045] 图18是迷你猪切牙的组织横切面图，示出在将具有Wnt蛋白质(10ng/ml)的水凝胶注射进根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓(r.p.)、再生的血管(b.v.)、再生的牙本质(r.d.)和天然的牙本质(n.d.)。
[0046] 图19是迷你猪切牙的组织横切面图，示出在将具有BMP-7(200ng/ml)和Wnt蛋白质(10ng/ml)的水凝胶注射进根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓(r.p.)、再生的血管(b.v.)、再生的牙本质(r.d.)和天然的牙本质(n.d.)。
[0047] 发明详述
[0048] 本发明至少部分基于发现患病的、创伤的或缺失的牙髓可以用包含基质或支架及一或多种生物活性成分的组合物置换，所述组合物促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育。这种组合物可以促进髓腔中血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育，保持牙齿活力。
[0049] 本发明提供了组合物，其包含用于一或多种生物活性剂，以再生牙髓或牙本质。各种组合物可包含生物活性剂如Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF、NGF或者其组合。
[0050] 本发明还提供了一些生物相容的材料以在可复性牙髓炎阶段保持牙髓的活力。如本文所示，一些可再吸收或不可再吸收的生物材料，包括多孔膜和水凝胶，不仅允许血液、组织液或水扩散，而且也可以阻止口腔中病原体进入牙髓组织。因此，可复性牙髓炎中的牙髓可以被挽救以维持其活力。
[0051] 本发明至少部分基于通过整体基因表达模式发现了从祖细胞如干细胞进行成牙本质细胞特化的关键因子。这些关键因子用于体内临床前牙髓和牙本质模型中。如本文所示，这些关键因子，包括Wnt蛋白，不仅诱导牙髓而且还诱导牙本质的强力再生。这些关键因子的输送可以代替根管材料、牙腔充填物或牙本质。
[0052] 在一些实施方案中，提供了基质或支架(例如非细胞基质或支架)。支架可以是哺乳动物牙齿形状或者塑形以充填进哺乳动物牙齿的天然或人工的洞或牙腔中。基质可适于插入或者部分或全部充填哺乳动物牙齿的天然或人工的洞或腔室。基质或支架可包含本文所述的生物活性剂(例如趋化性、骨发生性、牙本质发生性、牙釉质发生性或者牙骨质发生性制剂)(例如Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF)或其活性类似物。基质或支架可以与或不与外源性应用的细胞一起植入。例如，包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF或者编码其的核酸的基质或支架可以导入牙齿上或其中(例如牙腔中)，以促进祖细胞的成牙本质分化、促进细胞迁移(例如祖细胞迁移)、再生牙髓组织(例如血管化牙髓组织)，或者再生新牙本质。
[0053] 在一些实施方案中，本文所述组合物用于对有需要的哺乳动物牙齿进行牙齿、牙髓或根管处理程序。所述方法可包括暴露牙髓腔和/或根管中创伤或患病的牙髓组织；用包含生物活性成分的组合物覆盖或充填至少一部分牙髓腔和/或根管。所述生物活性成分可以促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育。在一些实施方案中，所述组合物在覆盖或充填期间不包含活细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从牙齿中除去创伤或患病的牙髓组织，以产生基本上没有创伤或患病组织的牙髓腔和/或根管。在一些实施方案中，所述组合物包含基质或支架。
[0054] 生物活性剂
[0055] 本文描述的组合物可包含掺入基质支架中的趋化性、骨发生性、牙本质发生性、牙釉质发生性或者牙骨质发生性化合物。如本文所用，趋化性化合物是引诱细胞的化合物。骨发生性化合物是促进新骨合成的化合物。牙本质发生性化合物是促进新牙本质合成的化合物。牙釉质发生性化合物是促进牙釉质合成的化合物。牙骨质发生性化合物是促进压牙骨质合成的化合物。
[0056] 本文所述的组合物可包含促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育的任何生物活性剂。本文所述组合物可包含多于一种的生物活性成分，例如2、3、4或更多种生物活性成分。
[0057] 生物活性成分可以是如在美国专利公开No.2012/0282573中描述，其并入本文作参考。非限制性的生物活性剂的实例包括血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF1)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、胰岛素样生长因子-1(IGF1)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、牙本质基质蛋白、牙本质涎蛋白、骨涎蛋白、牙釉蛋白、整联蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管生成素、血管形成素(angiopoietin)-1、del-1、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)、白细胞介素-8(IL-8)、瘦素、中期因子(midkine)、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、多营养因子(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMP)、血管形成素1(ang1)、ang2、delta-样配体4(DLL4)、结缔组织生长因子(CTGF)、脑衍生神经因子(BDNF)、NT-4和NT-3。
[0058] 生物活性成分可以来自任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，生物活性成分是人生物活性成分，特别是当治疗的哺乳动物是人时。生物活性成分可以是重组生物活性成分。
[0060] 本文所述的组合物可包含镇痛药。举例的镇痛药是扑热息痛、双氯芬酸、酮洛芬(ketoprofen)、阿司匹林、甲氧萘丙酸、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、布洛芬(ibuprofen)、吡罗昔康(piroxicam)、塞来考昔(celecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、甲芬那酸(mefenemic acid)、罗非考昔(rofecoxib)、尼美舒利(nimesulide)或者前列腺素。
[0061] 本文所述生物活性剂的浓度通常以每单位溶液体积的质量提供，其中溶液可以导入基质或支架中。
[0062] 生物活性剂可以包囊于各种载体输送系统中给予。举例的载体输送系统包括微球、水凝胶、聚合物植入体、智能聚合物载体及脂质体(通常见Uchegbu and Schatzlein,eds.(2006)Polymers in Drug Delivery,CRC,ISBN-10:0849325331所述)。输送分子或生物分子制剂的基于载体的系统可以：提供细胞内输送；调整生物分子/制剂释放速度；增加达到其作用部位的生物分子的比例；改良药物至其作用部位的转运；允许与其他制剂或赋形剂共局部沉积；改良制剂在体内的稳定性；通过降低清除率而延长制剂在其作用部位的停留时间；降低制剂对于非靶组织的非特异性输送；降低由制剂导致的刺激；降低由于高初始剂量的制剂所致毒性；改变制剂的免疫原性；降低给药频率，改良产物味道；或者改良产物的贮存期。
[0063] Wnt3a
[0064] 本文所述再生牙髓或牙本质的组合物可包括Wnt多肽(例如Wnt3a)。这种组合物可包括Wnt多肽组合其它生物活性剂如VEGF、bFGF、BMP-7或NGF。
[0065] Wnt3a在于本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1,000mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约100mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约10mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约1mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约0.1mg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约100μg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约10μg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约
0.1ng至大约1μg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约100ng Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约10ng Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约10ng Wnt3a/ml溶液的浓度存在。
0.1ng至大约1μg Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约100ng Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约0.1ng至大约10ng Wnt3a/ml溶液的浓度存在。再例如，在本文所述组合物中Wnt3a可以以大约10ng Wnt3a/ml溶液的浓度存在。
[0066] 含有上述浓度Wnt3a的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0067] 如本文所示，经典Wnt信号途径对于祖细胞如间充质干细胞的成牙本质细胞特化或者分化是关键，并且可以如同例如微囊化可转移的医学装置来编排牙髓或牙本质再生，其可以无需细胞移植。这种方法可代替例如根管材料、牙腔充填物或者其它牙科充填物(见实施例3)。
[0068] 如本文所述，Wnt3a(无翅型MMTV整合位点家族，成员3A)可促进祖细胞的成牙本质分化、促进细胞迁移、再生血管化牙髓组织，或者再生新牙本质。
[0069] Wnt蛋白质单独诱导牙髓和牙本质再生。Wnt蛋白组合例如BMP-7或PDGF可进一步增强牙髓和牙本质再生。Wnt蛋白质可增强PDGF和BMP-7信号途径，及可因此进一步促进牙髓或牙本质再生。
[0070] 在一些实施方案中，Wnt3a可用于促进祖细胞如来自牙槽骨骨髓或牙周膜的间充质干细胞的成牙本质细胞分化。Wnt3a也可用于促进细胞迁移。Wnt3a的体内输送可以在例如牙髓处理的根管中再生血管化牙髓组织。Wnt3a的体内输送通过招募宿主内源性细胞可以再生在天然管状牙本质表面具有极化的成牙本质细胞的新牙本质。
[0071] 在一些实施方案中，Wnt3a多肽或编码其的核酸可以与牙、骨、牙髓或其它牙组织接触。如本文所述，这种接触可促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进细胞迁移(例如祖细胞迁移)、再生牙髓组织(例如血管化牙髓组织)，或者再生新牙本质。例如，Wnt3a多肽或编码其的核酸可以导入牙齿之上或之中(例如导入牙腔中)，以促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进细胞迁移(例如祖细胞迁移)、再生牙髓组织(例如血管化牙髓组织)或者再生新牙本质。
[0072] 应理解Wnt3a多肽由WNT3A基因编码(通常见Saitoh et al.2001Biochem Biophys Res Commun 284(5),1168–1175)。WNT基因家族由编码分泌的信号蛋白的结构相关的基因组成。这些蛋白质参与肿瘤形成及一些发育过程，包括在胚胎发生期间调节细胞命运和模式。这个基因是WNT基因家族的成员。其编码与小鼠Wnt3A蛋白质具有96％氨基酸相同性及与另一种WNT基因产物-人WNT3蛋白质-具有84％相同性的蛋白质。这个基因与另一家族成员WNT14基因在染色体1q42区域中聚簇。
[0073] Wnt3a多肽可包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列，或者与其具有至少大约80％相同性(例如至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％或者至少大约99％)的序列，其中所述多肽保留Wnt3a活性，或者其功能片段。
[0074] Wnt3a多肽可以是根据SwissProtID P27467相关的氨基酸序列，其并入本文作参考。Wnt3a多肽可以是根据UniParc P56704相关的氨基酸序列，其并入本文作参考。Wnt3a多肽可以是根据UniParc Q3SY79相关的氨基酸序列，其并入本文作参考。Wnt3a多肽可以是根据Uniprot accession Q9GTJ9(水螅)相关的氨基酸序列，其并入本文作参考。Wnt3a多肽可以是根据SwissProtID P27467(小鼠)相关的氨基酸序列，其并入本文作参考。
[0075] Wnta多肽可以是全长Wnta肽的活性片段(例如人Wnt3a的氨基酸残基250-350)。
[0076] Wnt3a多肽与上述任何序列可具有至少大约80％序列相同性并保留Wnt3a活性。例如，Wnta多肽与上述任何序列可具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％或者至少大约99％序列相同性，其中所述多肽保留Wnta活性。
[0077] 本文描述的组合物、支架或装置可包括Wnt3a多肽或者编码Wnt3a多肽的核酸。Wnta核酸可以是编码上述任何Wnta多肽序列的核酸。Wnta核酸与编码上述任何序列的核酸可具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％或者至少大约99％序列相同性，由此编码的多肽保留Wnta活性。在其中核酸编码Wnt3a多肽的实施方案中，这种核酸可以在如本文所述的载体或构建体中提供。
[0078] Wnt3a多肽可商购自各种来源(例如ABCAM，Cambridge，MA)。
[0079] 已知Wnt3a由TIKI1和TIKI2蛋白酶解，其促进较大的二硫键寡聚物氧化和形成，导致WNT3A失活。本文描述的组合物可包括TIKI1和TIKI2的抑制剂。在一些实施方案中，Wnt3a多肽可以是对例如由TIKI1或TIKI2蛋白酶解抗性的其衍生物。
[0080] BMP-7
[0081] 本文所述再生牙髓或牙本质的组合物可包含骨形态发生蛋白7(BMP-7)。这种组合物可包含BMP-7组合其它生物活性剂，如Wnt3a、VEGF、bFGF或NGF。
[0082] BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1,000mg BMP-7/ml溶液的浓度存在。例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100mg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10mg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1mg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约0.1mg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100μg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10μg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约
0.1ng至大约1μg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约500ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约200ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约200ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。
0.1ng至大约1μg BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约500ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约200ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。再例如，BMP-7在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约200ng BMP-7/ml溶液的浓度存在。
[0083] 含有上述浓度BMP-7的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0084] BMP-7可商购。
[0085] VEGF
[0086] 本文所述再生牙髓或牙本质的组合物可包含血管内皮生长因子(VEGF)。这种组合物可包含VEGF组合其它生物活性剂，如Wnt3a、bFGF、BMP-7或NGF。
[0087] VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1,000mg VEGF/ml溶液的浓度存在。例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100mg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10mg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物可以以大约0.1ng至大约1mg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约0.1mg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100μg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10μg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1μg VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约500ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约
0.1ng至大约200ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物可以以大约33ng VEGF/ml溶液的浓度存在。
0.1ng至大约200ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng VEGF/ml溶液的浓度存在。再例如，VEGF在本文所述组合物可以以大约33ng VEGF/ml溶液的浓度存在。
[0088] 含有上述浓度VEGF的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0089] VEGF可商购。
[0090] bFGF
[0091] 本文所述再生牙髓或牙本质的组合物可包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。这种组合物可包含bFGF组合其它生物活性剂，如Wnt3a、VEGF、BMP-7或NGF。
[0092] bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1,000mg bFGF/ml溶液的浓度存在。例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100mg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10mg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物可以以大约0.1ng至大约1mg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约0.1mg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100μg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10μg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1μg bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约500ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约
0.1ng至大约200ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约167ng bFGF/ml溶液的浓度存在。
0.1ng至大约200ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng bFGF/ml溶液的浓度存在。再例如，bFGF在本文所述组合物中可以以大约167ng bFGF/ml溶液的浓度存在。
[0093] 已经发现在根管处理之后VEGF与bFGF加入胶原蛋白海绵并插入髓腔中时，其可以在髓腔和根管中有效修复存活组织(见例如实施例1)。
[0094] 在一些实施方案中，其中组合物包含VEGF和bFGF，所述组合物包含大约0.001ng至大约10,000μg VEGF和大约0.001ng至大约10,000μg bFGF/ml溶液。在其它实施方案中，所述组合物包含大约0.01ng至大约1,000μg VEGF和大约0.02ng至大约2,000μg bFGF/ml溶液。在另外的实施方案中，所述组合物包含大约10ng至大约200ng VEGF和大约50ng至大约500ng bFGF/ml溶液。在进一步的实施方案中，所述组合物包含大约33ng VEGF和大约167ng bFGF/ml溶液。
[0095] 含有上述浓度bFGF的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0096] bFGF可商购。
[0097] NGF
[0098] 本文所述再生牙髓或牙本质的组合物可包含神经生长因子(NGF)。这种组合物可包含NGF组合其它生物活性剂，如Wnt3a、VEGF、bFGF或BMP-7。
[0099] NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1,000mg NGF/ml溶液的浓度存在。例如，NGF在本文所述组合物可以以大约0.1ng至大约100mg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10mg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1mg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约0.1mg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100μg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10μg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约1μg NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约500ng NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约200ng NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约100ng NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.1ng至大约10ng NGF/ml溶液的浓度存在。
[0100] NGF在本文描述的组合物中可以以大约0.2ng至大约500ng NGF/ml溶液的浓度存在。例如，NGF在本文描述的组合物中可以以大约0.5ng至大约100ng NGF/ml溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文描述的组合物中可以以大约1ng至大约10ng NGF/ml溶液的浓度存在。
[0101] 在一些实施方案中，其中组合物包含BMP-7和NGF，所述组合物包含大约0.2ng至10,000ng BMP-7及大约0.2ng至500ng NGF/ml溶液。在其它实施方案中，所述组合物包含大约1ng至1000ng BMP-7及大约0.5ng至100ng NGF/ml溶液。在另外的实施方案中，所述生物活性成分组合物包含大约5ng至50ng BMP-7及大约1ng至10ng NGF/ml溶液。
[0102] 含有上述浓度NGF的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0103] NGF是可商购的。
[0104] 基质或支架
[0105] 本发明一方面提供了适于插入牙髓腔中的基质或支架，其中包含本文所述一或多种生物活性剂的组合物包含在所述基质或支架之中或之上。包含生物活性剂的组合物的基质或支架当插入牙髓腔中时可促进所述基质或支架中血管组织形成或者神经形成。在一些实施方案中，所述基质或支架不包含活细胞。这种材料可用于牙齿、牙髓或根管处理方法中。
[0106] 如本文所用，“基质”是无定形结构，例如凝胶，其中可以悬浮一或多种生物活性成分。“支架”应理解为具有二级或三级结构(例如柱形结构或多孔结构，如在典型的胶原蛋白海绵中，例如具有在大约250-400μM之间的完全一致的孔，其中一或多种生物活性成分可以渗透)。本发明不限于任何特定的基质或支架。优选所述基质或支架是可生物降解的。
[0107] 在一些实施方案中，基质或支架包含水凝胶。水凝胶应理解为具有聚合物链网络，其是亲水性的，有时是胶状凝胶，其中水是分散介质。水凝胶可以是高度可吸收的(例如大约80％、85％、90％、95％、99％或99.9％的以上的水)天然或合成的聚合物。水凝胶由于其显著的水含量而也可以具有与天然组织相似程度的柔性。水凝胶可包括例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸盐聚合物或者具有亲水性基团的共聚物。天然水凝胶可包括琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸或者其它天然衍生的聚合物。
[0108] 包含一或多种生物活性剂的组合物可以通过本领域已知的任何方式与所述基质或支架组合。例如，包含一或多种生物活性剂的组合物可以注射进基质或支架中。再例如，包含一或多种生物活性剂的组合物可与基质或支架混合。再例如，包含一或多种生物活性剂的组合物通过本领域已知的方法可以包囊于基质或支架中，或者化学束缚于或吸附于基质或支架中。
[0109] 基质或支架可以置于手术制备的牙腔上或者置入除去病变组织，包括腐烂的牙釉质和牙本质之后的髓腔中。对于置入制备的牙腔中的基质或支架材料如藻酸盐水凝胶，血液、组织液或水可以被吸收进生物材料中。在基质或支架保留在原位或者在除去材料后，髓腔可以封闭或者患病的牙齿可以恢复。
[0110] 在一些实施方案中，生物材料装置可以在大约24小时后除去。例如，生物材料装置可以在大约24至大约48小时后除去。再例如，生物材料装置可以在大约48小时后除去。
[0111] 基质或支架可以提供细胞生长或组织形成的底物。基质或支架的有益性质是多孔性、生物相容性和可生物降解性、支持细胞生长的能力，或者其用作可控的基因和蛋白质输送载体的能力(Murphy 1999)。由支架提供的三维大分子结构可以指导生物工程化组织的最终形状(Murphy 1999)。
[0112] 本文描述的支架可具有任何哺乳动物牙齿或其中的洞或腔室的形状。例如，支架可具有人切牙、人尖牙、人双尖牙或人磨牙或者其中的洞或腔室的形状。本文所述基质可适合任何哺乳动物的天然或人工的洞或腔室。
[0113] 许多研究已经调查外源性生长因子在载体中以输送生长因子至植入部位的地位和作用。尽管载体也许不提供为组织形成必需的任何另外的因子，但是其仍可以是生长过程的重要成分(Wozney 1990)。载体的功能之一是保持所述因子在植入部位及因此增加其局部浓度。载体也可以作为环境，在其中组织可以形成，并因此有助于限定新组织可以形成的区域(Whang 1998)。胶原性或合成载体已经用作输送运载体，其物理化学性质以及其产生的微环境在归纳结果(inductive outcome)中起作用。载体可以是固体异种的(例如羟磷灰石)(Kuboki 1995，Murata 1998)、固体异质成形的(聚乙烯聚合物)材料(Saito1998,Isobe 1999)或者自生凝胶(Sweeney 1995，Schwartz 1998)，同种异体的(Bax
1999,Viljanen 1997)或者异质成形的来源(Santos 1998)，及上述材料的组合(Alpaslan
1996)。
1999,Viljanen 1997)或者异质成形的来源(Santos 1998)，及上述材料的组合(Alpaslan
1996)。
[0114] 基质或支架可进一步包含任何其它生物活性分子，例如抗生素或趋化性生长因子。在一些实施方案中，基质或支架是加强的，通过加入例如人血清白蛋白(HSA)、羟乙基淀粉、葡聚糖或者其组合。用于本发明组合物中的这些化合物的合适浓度为本领域技术人员已知，或者可以不用过度实验而易于确定。
[0115] 基质或支架中化合物的浓度可以根据化合物的性质、其生理学作用及希望的治疗或诊断效果而变化。治疗有效量通常是治疗剂展示希望的作用而无过度毒性的的足够浓度。
[0116] 化合物可以通过任何已知方法掺入基质或支架中。在一些实施方案中，化合物是包埋在凝胶中，例如胶原蛋白凝胶中，掺入基质或支架的孔中，如实施例中所述。
[0117] 或者，化学修饰方法可用于将化合物共价连接在基质或支架表面上。基质或支架的表面官能团可以与化合物的反应性官能团偶联以形成共价键，使用本领域熟知的偶联剂如乙醛化合物、碳二亚胺等。此外，间隔分子可用于使表面反应基团和生物分子的反应基团形成缺口，以使得基质表面上这种分子更灵活。使生物分子与基质内部或外部附着的其它相似方法为本领域技术人员已知。
[0118] 化合物或者可以通过基于载体(carrier)的系统如包囊载体(vehicle)导入基质中或其上。这种载体可用作缓释组合物。例如，化合物可以是微囊化的以提供增强的稳定性或延长的输送时间。包囊化载体包括但不限于微粒、脂质体、微球等，或者任何上述载体的组合，以提供各种比例的希望的释放模式。控制释放输送制剂的其它方法为本领域技术人员已知。此外，这些及其它系统可以组合或者调整以优化基质内制剂的整合/释放。
[0119] 聚合物微球可以使用天然发生的或者合成的聚合物产生，其是大小在0.1-500μm范围的微粒系统。聚合物微团和聚合物囊泡(polymeromes)是具有与微球相似特性的聚合物输送载体，也可以促进本文所述化合物的包囊化及基质整合。各种有效载荷的微球的制造、包囊和稳定在本领域技术范围内(见例如Varde&Pack(2004)Expert Opin.Biol.4(1)35-51)。微球的释放速度可以通过聚合物的类型、聚合物分子量、共聚物成分、加入微球剂型中的赋形剂以及微球的大小而调整。用于形成微球的聚合物材料包括PLA、PLGA、用DPPC包被的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明胶、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、DL-PLG、SDLMs、PEG(例如ProMaxx)、透明质酸钠、二酮哌嗪衍生物(例如Technosphere)、磷酸钙-PEG微粒和/或寡糖衍生的DPPG(例如Solidose)。包囊化可以例如使用水/油单一乳化方法、水-油-水双重乳化方法或者冻干法实现。一些商业包囊化技术是可获得的(例如Alkerme)。
[0120] 脂质体也可以用于整合化合物与基质或支架。脂质体的制剂携带能力和释放速度可依赖于脂质成分、大小、电荷、药物/脂质比率及输送方法。常规的脂质体由中性或阴离子脂质(天然或合成的)组成。常用的脂质是卵磷脂制剂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油及磷脂酰肌醇。脂质体包囊方法为本领域已知(Galovic et al.(2002)Eur.J.Pharm.Sci.15,441-448；Wagner et al.(2002)J.Liposome Res.12,259-270)。靶向脂质体和反应性脂质体也可以用于组合所述制剂和基质。靶向脂质体具有靶向配体如单克隆抗体或凝集素附着于其表面，使得与特异性受体和/或细胞类型相互作用。反应性或多态性脂质体包括各种脂质体，其共有性质是其基于特定的相互作用改变其相和结构的倾向(例如pH-敏感性脂质体)。见例如Lasic(1997)Liposomes in Gene Delivery,CRC Press,FL)。
[0121] 基质或支架可以由本领域技术人员认可的任何材料制造。合适的基质或支架材料在例如Ma and Elisseeff,ed.(2005)Scaffolding in Tissue Engineering,CRC,ISBN1574445219；Saltzman(2004)Tissue Engineering:Engineering Principles for the Design of Replacement Organs and Tissues,Oxford ISBN 019514130X中论述。对于所有或部分基质或支架潜在可用的材料的非限制性实例包括聚乙二醇、聚交酯、聚乙醇酸、聚(交酯-共-乙交酯)、聚(己内酯)、聚酐、polyglactin、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚正酯、聚缩醛、聚腈基丙烯酸酯)、聚磷腈、可降解的聚氨酯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯酯聚合物及其它酰基取代的纤维素醋酸酯及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙烯咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、 、尼龙、琼脂糖、藻酸盐(例如藻酸钙凝胶)、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、胶原蛋白(例如胶原蛋白凝胶)、明胶、透明质酸、壳多糖，及其它合适的聚合物和生物聚合物，或者类似物、混合物、组合，以及上述材料的衍生物。
[0122] 在一些实施方案中，基质或支架包含天然聚合物。举例的天然聚合物是胶原蛋白、壳聚糖和多糖。在其它实施方案中，基质或支架包含合成聚合物。举例的合成聚合物是聚(α-羟基酸)的脂肪族聚酯及聚乙二醇。另外的合成的聚合物是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及PLA和PGA的混合物(PLGA)。在一些实施方案中，合成聚合物是包含大约50％PLA和50％PGA的PLGA。在其它实施方案中，基质或支架包含胶原蛋白海绵或PLGA。
[0123] 在一些实施方案中，基质或支架由包含骨引导材料的组合物制造。骨引导材料的非限制性实例是羟磷灰石(HA)。HA多年来由于其良好的生物相容性和高生物活性而用作骨替代物(Liao 2006,Nebahat 2006,Lijun 2006,Wei 2003)。
[0124] 尽管HA具有良好的生物活性和骨引导性，但是其非常易碎及具有不佳的固有的可拉伸性质。因此，在一些实施方案中，HA与ε-聚已酸内酯(PCL)组合。PCL是良好的骨基质或支架材料，因为其在几年内在体内降解且是生物相容的、相对廉价的及可以大数量获得(Rich 2002,Kim 2004)。PCL与HA组合(PCL-HA)提供了生物活性、可生物降解性及强度的希望的组合(Patcharaporn 2005,Rezwan 2006,Landis 1995,Ziv 1994)。复合的PCL-HA材料被认为具有最佳的基质或支架的生物相容性、细胞粘附、增殖和分化性质(Zhao 2008)。在一些实施方案中，基质或支架包含大约80wt％聚已酸内酯和大约20wt％羟磷灰石的混合物。在其它实施方案中，基质或支架包含大约60wt％聚已酸内酯和大约40wt％羟磷灰石至大约95wt％聚已酸内酯和大约5wt％羟磷灰石。例如，基质或支架可包含大约70wt％聚已酸内酯和大约30wt％羟磷灰石。再例如，基质或支架可包含大约90wt％聚已酸内酯和大约10wt％羟磷灰石。
[0125] 在一些实施方案中，基质或支架具有较高多孔性。这种多孔结构提供了细胞迁移、粘附和新骨组织向内生长的空间(Gazdag 1995,Rezwan 2006,Mano 2004,Shin 2003,Kim2001,Leong 2003)。
[0126] 支架的孔和通道可以工程化为各种直径。例如，支架的孔的直径可以是微米至毫米范围。在一些实施方案中，基质材料的孔包括微通道。微通道的平均直径为大约0.1μm至大约1,000μm，例如大约50μm至大约500μm(例如大约100μm、150μm、大约200μm、大约250μm、大约300μm、大约350μm、大约400μm、大约450μm、大约500μm或者大约550μm)。技术人员了解微通道直径的分布可具有任何分布方式，包括正常分布或非正常分布。在一些实施方案中，微通道是基质材料的天然存在的特征。在其它实施方案中，微通道工程化为在基质材料中存在。
[0127] 本发明还提供了置换哺乳动物口腔中牙齿的方法。在这些实施方案中，牙齿缺失，并且口腔中在缺失的牙齿部位有牙槽。所述方法包括在牙槽中植入具有缺失的牙齿形状的非细胞支架。
[0128] 一些方法用于制造多孔支架，包括粒子沥滤法、气体发泡法、静电纺丝、冷冻干燥、从浆材料中釉质发泡(foaming of ceramic from slurry)，以及有机泡沫形成(Mikos1994,Mooney 1996,Qing 2002,Sylvain 2006)。然而，通过使用这些方法制备的支架具有限制孔的结构和互相连接性的缺点，这样会限制其应用于组织工程中的细胞渗透方面(Yeong 2004,Tan 2003)。
[0129] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过计算机辅助设计(CAD)制作缺失牙的模型及用生物绘图仪合成支架。这种方法可提供具有较高多孔性和良好互相连接性的支架。已经提出了快速原型设计(RP)方法如熔融沉积造型术、选择性激光烧结术、3D打印、多相喷射固化及3D绘图方法(Hutmacher 2001,Moroni 2006)。
[0130] 快速原型设计的关键特征是自由实体成型(SFF)方法：将3D计算机模型切成系列薄层，其用于构建复合层叠物体。薄层通过熔融固化、层光聚合作用或者微粒粘合而产生，使用激光束诱导的烧结(选择性激光烧结)或者特殊的粘合剂进行(Landers 2002)。近年TM来，已经引进特化快速原型系统(Bioplotter ,EnvisionTec,Germany)，使得可以设计和制造具有不同内部结构的解剖学形状的支架，从而使得可以精确控制孔大小、多孔性、渗透性TM
和硬度(Landers 2002；Landers 2005)。使用Bioplotter 以制造组织特异性PCL-HA支架的原型设计方法需要靶组织或组织缺陷的3D形态学信息，这可以通过计算机断层检查(CT)或者磁共振成像(MRI)获得。当缺失的牙齿在口腔另一侧具有对应物时，该对应物可用作模型以设计缺失牙的支架。
和硬度(Landers 2002；Landers 2005)。使用Bioplotter 以制造组织特异性PCL-HA支架的原型设计方法需要靶组织或组织缺陷的3D形态学信息，这可以通过计算机断层检查(CT)或者磁共振成像(MRI)获得。当缺失的牙齿在口腔另一侧具有对应物时，该对应物可用作模型以设计缺失牙的支架。
[0131] 然后将上述获得的信息用于通过CAD设计功能性支架，并移至BioplotterTM系TM统。在该系统中，Bioplotter 机械熔融并以层叠形式在收集板上分配支架材料(例如PCL-HA)。孔，例如微通道，可以作为设计的一部分而产生。通过RP系统制造的3D支架产生明显的细胞渗透，及因此具有理想的支架性质(Heo 2007)。这些3D支架可具有临床应用潜力，通过提供患者用于营养素转运和血管化的组织特异性解剖学形状以及优化的内部微结构。关于这些方法的更详细的论述在PCT公开WO2009/006558中提供，其并入作为参考。
[0132] 本发明另外提供了制作牙齿支架的方法。所述方法包括合成哺乳动物牙齿形状的无细胞支架并加入本文所述的化合物。在这些方法的一些实施方案中，牙齿被制成与哺乳动物中缺失的牙齿一样的形状，所述方法进一步包括通过计算机辅助设计制作缺失的牙齿模型，及用生物绘图仪合成支架。当缺失的牙齿在口腔中有对应牙时，例如磨牙，所述方法进一步包括进行例如在口腔另一侧的相似磨牙的CT扫描，其中CAD利用第二个磨牙的CT扫描数据设计支架。
[0133] 在这些方法的一些实施方案中，本文描述的生物活性剂或者编码其的核酸包含在支架中。
[0134] 在这些方法的一些实施方案中，支架中包含的化合物可以是Wnt3a多肽、血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF1)、骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-β、生长和分化因子(GDF)、胰岛素样生长因子-1(IGF1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、牙本质基质蛋白、牙本质涎蛋白、骨涎蛋白、牙釉蛋白或者整联蛋白。
[0135] 在其它实施方案中，支架由包含骨引导材料的组合物制造。如上文论述，可用的骨引导材料的实例是羟磷灰石。进一步的实例是如上述ε-聚己酸内酯与羟磷灰石的混合物。在这些方法的各种实施方案中，支架包含具有直径为50-500μm的微通道。在另外的实施方案中，支架进一步包含无孔帽。
[0136] 祖细胞
[0137] 如本文所用，祖细胞(例如干细胞)是相对未分化的细胞，能通过细胞有丝分裂自身更新，也能分化为更特化的细胞类型。如本领域已知，干细胞包括胚胎干细胞，其是全能的，即能分化为其从中衍生的生物体的所有细胞类型，以及成体干细胞，其是多能(pluripotent)干细胞(能分化为几乎所有细胞类型，包括所有三个胚层的类型)、多能(multipotent)干细胞(能分化为细胞密切相关家族的一些细胞类型)或者单能干细胞(能分化为仅一种细胞类型，但是与非干细胞区别在于通过有丝分裂自我更新的能力)。
[0138] 如本文所用，牙干细胞(DSC；也称作牙齿衍生的干细胞，TSC)是衍生自脊椎动物牙髓的祖细胞。DSC可以来自具有牙齿的任何脊椎动物的任何牙齿。在一些实施方案中，牙干细胞衍生自乳牙。在其它实施方案中，牙干细胞衍生自前磨牙(premolar)、磨牙、切牙或尖牙。DSC能分化为所有三个胚层的细胞，因此是多能细胞。
[0139] 牙组织
[0140] 如本文所述，牙组织可以在与Wnt3a多肽接触时再生。牙组织可以是牙髓、牙冠髓(例如咬合面、中央、末梢、颊面、舌面或者底部)、牙根髓、牙尖周组织、牙尖周结缔组织、牙周组织、副根管、根尖孔、孔(foramina)、Rinaggio区、Weil区、成牙本质细胞层、骨、牙龈、血管、神经、Raschkow神经丛、牙骨质、牙本质、硬化牙本质、弥补性牙本质、反应性牙本质、修复性牙本质、牙本质小管、新牙本质，或者含有任何成釉细胞、成纤维细胞、成牙本质细胞、组织细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞或浆细胞的组织。
[0141] 配制物
[0142] 本文所述制剂和组合物可以通过任何常规方式配制，使用一或多种药物学可接受的载体或赋形剂，如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro,Ed.),21st edition,ISBN:0781746736(2005)中描述，并入本文作参考。这种配制物含有治疗有效量的本文描述的生物活性剂，其可以是纯化形式，以及适量的载体以提供正确给予对象的形式。这种配制物可以掺入基质或支架之中或之上。
[0143] 各个制剂也可以组合一或多种另外的制剂或者与其它生物活性或生物惰性制剂一起给予。这些生物活性或惰性制剂可以是液体，或者与所述制剂机械性交通，或者通过离子、共价、范德华、疏水性、亲水性或者其它物理力与所述制剂附着。
[0144] 可以配制控制释放的(或者持续释放的)制备物，以扩大制剂的活性及降低给药频率。控制释放的制备物也可用于影响作用发生时间或者其它特性，如制剂的血液水平，并因此影响副作用的发生。控制释放的制备物可以设计为最初释放产生希望的治疗作用的量的制剂，并逐步和持续地释放其它量的制剂以在延长的时间内维持治疗作用水平。为了维持机体内接近恒定水平的制剂，所述制剂可以以代替被代谢或从机体中排泄的制剂的量的速度从剂型中释放。制剂的控制释放可以由各种诱因刺激，例如pH变化、温度变化、酶、水或者其它生理学条件或分子。
[0145] 本文描述的制剂或组合物也可以用于组合其它治疗模式，如下文进一步论述。因此，除了本文描述的治疗方法之外，也可以为对象提供已知对于治疗疾病、失调或病症有益的其它治疗方法。
[0146] 治疗方法
[0147] 本发明还提供了一种在需要给予治疗有效量的包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF或其组合的基质或支架的对象中再生牙组织的方法，以促进祖细胞的成牙本质细胞分化，促进细胞迁移，再生血管化牙髓组织，或者再生新牙本质。
[0148] 本发明还提供了一种在需要给予治疗有效量的Wnt3a多肽的对象中再生牙组织的方法，以促进祖细胞的成牙本质细胞分化，促进细胞迁移，再生血管化牙髓组织，或者再生新牙本质。
[0149] 如本文所用，牙科治疗方法可以是涉及牙齿的任何方法。举例的牙科治疗方法包括牙髓病治疗，其涉及牙髓。根管处理是一种牙科治疗方法，其中全部的牙髓和根管组织均被除去，并用惰性材料或者本文所述组合物代替，其可以恢复髓腔中活组织。
[0150] 本发明一方面提供了在有需要的哺乳动物牙齿上进行牙齿、牙髓或根管治疗的方法。所述方法可以包括暴露牙髓腔或根管中创伤或患病的牙髓组织；用包含生物活性成分的组合物(例如包含生物活性剂的组合物的支架)覆盖或充填至少一部分的牙髓腔或根管。如本文所述，所述组合物可促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育。在一些实施方案中，所述组合物在覆盖或充填期间不包含活细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从牙齿中除去创伤或患病的牙髓组织，产生基本上没有创伤或患病组织的牙髓腔或根管。在一些实施方案中，基质或支架含有生物活性剂的组合物，所述基质或支架插入牙腔或根管中。
[0151] 本发明的一个应用是根管治疗，其中所有牙髓组织均从牙齿中除去。本文描述的基质或支架可部分或完全代替目前的牙髓充填材料如那些方法中的杜仲胶。目前的方法不排除组合使用所述基质或支架及目前的材料如杜仲胶。因此，在一些实施方案中，惰性材料如杜仲胶也插入髓腔中。
[0153] 本文所述方法通常对有需要的对象进行。需要本文所述治疗方法的对象可以是患有、诊断有、疑似患有或者处于发生与牙组织相关的损伤、疾病或病症如牙创伤、牙髓炎或龋齿等风险中的对象。例如，需要本文所述治疗方法的对象可以是患有、诊断有、疑似患有或者处于发生可医治的牙髓炎或常规需要随着患病牙髓一起除去健康牙髓的其它疾病或病症风险中的对象。确定是否需要治疗典型是通过与所述疾病或病症一致的病史和身体检查而评定。各种通过本文所述方法可治疗的病症的诊断在本领域技术人员技术范围内。对象可以是动物，包括哺乳动物如马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、豚鼠和鸡，以及人。例如，对象可以是人。
[0154] 通常地，包含Wnt3a、BMP-7、VEG、bFGF或NGF或其组合的基质或支架的安全有效量是例如在对象中产生希望的治疗作用，同时不希望的副作用最小化的量。在不同实施方案中，有效量的包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF或其组合的基质或支架促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进细胞迁移、再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质。
[0155] 通常地，Wnt3a多肽的安全有效量是例如在对象中产生希望的治疗作用，同时不希望的副作用最小化的量。在不同实施方案中，有效量的Wnt3a多肽促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进细胞迁移、再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质。
[0156] 当在本文所述治疗中使用时，治疗有效量的Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF可以纯化形式应用，其中这种形式以药物学可接受的盐形式存在，有或无药物学可接受的赋形剂。例如，本发明的化合物可以对于任何医学治疗均适用的合理益处/风险比率以足够量给予，以促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进细胞迁移、再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质。
[0157] 可以与药物学可接受的载体组合以产生单一剂量形式的组合物的量根据治疗的宿主和给予的特定模式而不同。本领域技术人员意识到每个剂量形式的单独剂量中包含的制剂的单位含量其自身不需要组成治疗有效量，因为必需的治疗有效量可以通过给予许多单独剂量而达到。
[0158] 本文所述的组合物的毒性和治疗效力可以通过标准药物学方法在细胞培养或实验动物中确定LD50(半数致死量)和ED50(半数治疗有效量)而确定。毒性与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，可以表示为LD50/ED50，其中较大的治疗指数在本领域通常理解为是最佳的。
[0159] 任何特殊对象的特异性治疗有效量水平依赖于各种因素，包括治疗的疾病和疾病的严重性，应用的特定化合物的活性，应用的特定组合物，对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，给予时间，给予途径，应用的组合物的排泄速度，治疗持续时间，与应用的特定化合物组合或同时使用的药物，以及医药领域已知的其它因素等 ( 见 例 如 Koda-Kimble et al.(2004)Applied Therapeutics:The Clinical Use of Drugs,Lippincott Williams&Wilkins,ISBN 0781748453；Winter(2003)Basic thClinical Pharmacokinetics,4 ed.,Lippincott Williams&Wilkins,ISBN 0781741475；
Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/
Appleton&Lange,ISBN 0071375503)。例如，本领域技术人员熟知所述组合物的起始剂量在低于需要达到希望的治疗作用所需的水平，及逐步增加剂量直至达到希望的作用。如果需要，每日有效剂量可以分成多次给予。因此，单一剂量组合物可含有这种量或其约数量(submultiple)以组成每日剂量。然而，应理解本发明的化合物和组合物的总计每天剂量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/
Appleton&Lange,ISBN 0071375503)。例如，本领域技术人员熟知所述组合物的起始剂量在低于需要达到希望的治疗作用所需的水平，及逐步增加剂量直至达到希望的作用。如果需要，每日有效剂量可以分成多次给予。因此，单一剂量组合物可含有这种量或其约数量(submultiple)以组成每日剂量。然而，应理解本发明的化合物和组合物的总计每天剂量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
[0160] 再次，本文所述的每种病理状态、疾病、失调和病症以及其它病症均可得益于本文所述的组合物和方法。通常地，治疗病理状态、疾病、失调或病症包括阻止或延迟哺乳动物中受累于或倾向于所述病理状态、疾病、失调或病症但是仍未经历或显示临床或亚临床症状的临床症状的出现。治疗也可以包括抑制所述病理状态、疾病、失调或病症，例如阻止或降低疾病或者其至少一个临床或亚临床症状的发生。此外，治疗可包括解除疾病，例如导致所述病理状态、疾病、失调或病症或者其至少一个临床或亚临床症状的衰退。对于治疗对象的益处可以是统计学显著的或者至少为对象或医生所感知。
[0161] 本发明所述组合物的给予可以是一次给予或者在治疗时程中给予。例如，组合物可以每天、每周、每两周或者每月给予一次。对于急性病症的治疗，治疗时程通常是至少几天。某些病症可以延长治疗从几天至几周。例如，治疗可以延长超过一周、两周或三周。对于更慢性的病症，治疗可以从几周延续至几个月甚至一年或更长时间。
[0162] 根据本发明方法的治疗可以在与牙组织相关的损伤、疾病或病症的常规治疗模式之前、同时或之后进行。
[0163] 本文所述组合物可以与另一制剂如抗生素、抗炎剂或者另一制剂同时或相继给予。例如，包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF的基质或支架可以与另一制剂如抗生素或抗炎剂或者基质或支架之中或之上可包含的其它制剂同时给予。同时给予可以是通过给予单独的组合物进行，每种组合物含有一或多种的基质或支架、Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF、NGF、抗生素、抗炎剂或者上述另一制剂。包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF的基质或支架可以与抗生素、抗炎剂或另一制剂相继给予。例如，包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF的基质或支架可以在给予抗生素、抗炎剂或另一制剂之前或之后给予。
[0164] 上文列举了Wnt3a多肽。本领域技术人员理解上文论述可相同地用于编码Wnt3a多肽的核酸。
[0165] 分子工程
[0166] 提供如下定义和方法以更好地定义本发明及指导本领域技术人员实施本发明。除非特别指出，文中术语是根据相关领域技术人员的常规用法。
[0167] 如本文所用，术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”或者“异源核酸”均是指源自与特定的宿主细胞不同的来源的序列，或者如果相同来源则从其原始形式加以修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞内源的但是已经通过例如使用DNA改组而修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语是指对于细胞是外源或异源的DNA区段，或者与细胞同源但是在宿主细胞核酸内并非该元件通常发现的位置。外源DNA区段表达产生外源多肽。“同源”DNA序列是与其导入之中的宿主细胞天然相关的DNA序列。
[0168] 表达载体、表达构建体、质粒或者重组DNA构建体通常理解为是指通过人工干预产生的核酸，包括通过重组方式或直接化学合成方式，使用一系列特定的核酸元件允许特定核酸在例如宿主细胞中转录或翻译。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。典型地，表达载体可包括与启动子可操纵地连接的被转录的核酸。
[0169] “启动子”通常理解为核酸控制序列，其指导核酸的转录。可诱导的启动子通常理解为是介导可操纵地连接的基因应答特定刺激的转录的启动子。启动子可包括在转录起始位点附近的必需的核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况中的TATA元件。启动子可任选包括末端增强子或阻抑物元件，其可位于与转录起始位点几千个碱基对的位置。
[0170] 如本文所用，“可转录的核酸分子”是指能转录为RNA分子的任何核酸分子。已知以一定方式将构建体导入细胞中，由此可转录的核酸分子被转录为功能性mRNA分子，其被翻译及因此表达为蛋白质产物。构建体也可以构建为能表达反义RNA分子，以抑制感兴趣的特定RNA分子的翻译。对于实施本发明，常规组合物和制备及使用构建体和宿主细胞的方法为本领域技术人员熟知(见例如Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel et al.(2002)Short Protocols in Molecular Biology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology167,747-754)。
[0171] “转录起始位点”或者“起始位点”是第一个核苷酸周围的位置，其是转录序列的一部分，也被定义为位置+1。关于这个位点，基因及其控制区的所有其它序列均可以编号。下游序列(即3’方向的进一步蛋白质编码序列)可以命名为正，而上游序列(主要是5’方向控制区)命名为负。
[0172] “可操纵地连接”或者“功能性连接”优选是指单一核酸片段上核酸序列的联合，由此其功能互相影响。例如，如果两个序列的位置是调节性DNA序列影响编码DNA序列表达的方式(即编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)，则调节性DNA序列与编码RNA或多肽的DNA序列是“可操纵地连接”或者“联合”。编码序列与调节序列可以有义或反义方向可操纵地连接。两个核酸分子可以是单一连续的核酸分子的一部分，且可以是相邻的。例如，如果启动子调节或介导感兴趣的基因在细胞中转录，则该启动子与感兴趣的基因是可操纵地连接。
[0173] “构建体”通常理解为任何重组核酸分子如质粒、粘粒、病毒、自主复制核酸分子、噬菌体，或者线性或环形单链或双链DNA或RNA核酸分子，衍生自任何来源，能基因组整合或自主复制，包含其中一或多个核酸分子已经可操纵地连接的核酸分子。
[0174] 本发明的构建体可含有与可转录的核酸分子可操纵地连接的启动子，所述可转录的核酸分子与3’转录终止核酸分子可操纵地连接。此外，构建体可包含但不限于例如3’非翻译区(3'UTR)的另外的调节核酸分子。构建体可包含但不限于mRNA核酸分子的5’非翻译区(5'UTR)，其在翻译起始中可起重要作用，并且也可以是表达构建体中的遗传成分。这些另外的上游和下游调节核酸分子可以衍生自与启动子构建体上存在的其它元件天然或异源的来源。
[0175] 术语“转化”是指核酸片段移至宿主细胞基因组中，导致遗传稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主细胞称作“转基因”细胞，包含转基因细胞的有机体称作“转基因有机体”。
[0176] “转化的”、“转基因的”和“重组的”是指其中已经导入异源核酸分子的宿主细胞或有机体，如细菌、蓝细菌、动物或植物。如本领域已知和揭示，核酸分子可以稳定整合进基因组中(Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis&Gelfand 1999)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、成套引物、单一特定引物、降解引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。术语“未转化的”是指未进行转化程序的正常细胞。
[0177] “野生型”是指天然发现的无任何已知突变的病毒或有机体。
[0178] 具有上述要求的百分比相同性并保留表达的蛋白质要求的活性的变体核苷酸及其编码的多肽的设计、产生和检测在本领域技术范围内。例如，突变体的定向进化和快速分离可以根据参考文献中所述的方法进行，包括但不限于Link et al.(2007)Nature Reviews 5(9),680-688；Sanger et al.(1991)Gene 97(1),119-123；Ghadessy et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(8)4552-4557。因此，本领域技术人员可以产生众多的核苷酸和/或多肽变体，其与本文所述参考序列相比具有例如至少95-99％相同性，并根据本领域常规方法针对希望的表型进行筛选。
[0179] 核苷酸和/或氨基酸序列相同性百分比(％)应理解为是当对比两个序列时，与参考序列相比候选序列中相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了确定百分比相同性，对序列进行比对，如果需要则导入缺口以实现最大百分比序列相同性。确定百分比相同性的序列对比程序为本领域技术人员熟知。通常可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件用于比对序列。本领域技术人员可确定合适的参数以测量对比，包括实现在对比的序列全长的最大比对所需的算法。当比对序列时，指定序列A与指定序列B的百分比序列相同性(可以另外描述为指定序列A具有或包含指定序列B的一定的百分比序列相同性)可以计算为：百分比序列相同性＝X/Y100，其中X是通过A和B的序列比对程序或算法的比对计数为相同匹配的残基数，Y是B中的残基总数。如果序列A的长度不等于序列B的长度，则A与B的百分比序列相同性不同于B与A的百分比序列相同性。
[0180] 通常地，可以在任何位置进行保守取代，只要保留需要的活性。可以进行所谓的保守置换，其中被置换的氨基酸具有与原始氨基酸相似性质，例如Glu由Asp置换、Gln由Asn置换、Val由Ile置换、Leu由Ile置换，以及Ser由Thr置换。缺失是氨基酸由直接键合置换。缺失的位置包括多肽的末端及单独的蛋白质结构域之间的连接。插入是在多肽链中导入氨基酸，直接键合由一或多个氨基酸代替。氨基酸序列可以借助于本领域已知的计算机模拟程序调整，其可以产生具有例如改良的活性或改变的调节作用的多肽。基于这种人工产生的多肽序列，使用希望的宿主细胞的特定密码子使用可以在体外合成编码这种经调整的多肽的相应核酸分子。
[0181] “高度严格杂交条件”定义为于65℃在6×SSC缓冲液(即0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)中杂交。鉴于这些条件，通过计算两个序列之间DNA双链体的解链温度(Tm)可以确定指定系列的序列是否杂交。如果一特定双链体的解链温度在6×SSC盐条件下低于65℃，则两个序列将不杂交。另一方面，如果解链温度在相同盐条件下高于65℃，则两个序列将杂交。通常地，任何杂交的DNA:DNA序列的解链温度可以使用如下公式确定：Tm+＝81.5℃+16.6(log10[Na])+0.41(级分G/C含量)–0.63(％甲酰胺)–(600/l)。此外，核苷酸相同性每降低1％，则DNA:DNA杂交体的Tm降低1-1.5℃(见例如Sambrook and Russel,2006)。
[0182] 宿主细胞可以使用本领域已知的各种标准技术转化(见例如Sambrookand Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel et al.(2002)Short Protocols in Molecular Biology,5th ed.,Current
Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology
167,747-754)。这种技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的输送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔等。可以选择并增殖转染的细胞以提供重组宿主细胞，其包含稳定整合进宿主细胞基因组中的表达载体。
Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology
167,747-754)。这种技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的输送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔等。可以选择并增殖转染的细胞以提供重组宿主细胞，其包含稳定整合进宿主细胞基因组中的表达载体。
[0183] 可以导入宿主细胞中的核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或者甚至源于或存在于相同物种中但是通过遗传工程方法掺入接受体细胞中的基因或序列。术语“外源的”是指基因非正常存在于转化的细胞中，或者也许仅仅不是以在转化的DNA区段或基因中发现的形式、结构等存在，或者正常存在并需要以不同于天然表达模式的方式如过表达方式表达的基因。因此，术语“外源的”基因或DNA是指被导入受体细胞中的任何基因或DNA区段，无论这种细胞中是否已经存在相似的基因。外源DNA包含的DNA类型可包括已经存在于细胞中的DNA，来自相同类型有机体的另一个体的DNA，来自不同有机体的DNA，或者外部产生的DNA，如含有反义基因信息的DNA序列，或者编码合成或修饰的基因形式的DNA序列。
[0184] 根据本文所述方法产生的宿主株系可以通过许多已知方式评估(见例如Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen,ed.(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
[0185] 下调或沉默基因的方法为本领域已知。例如，表达的蛋白质活性可以使用反义寡核苷酸、蛋白质适配体、核苷酸适配体及RNA干扰(RNAi)(例如小干扰RNAs(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微RNAs(miRNA)等下调或消除(见例如Fanning and Symonds(2006)Handb Exp Pharmacol.173,289-303G，描述了锤头核酶和小发夹RNA；Helene,C.,et al.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36；Maher(1992)Bioassays 14(12):807-15，描述了靶向脱氧核糖核苷酸序列；Lee et al.(2006)Curr Opin Chem Biol.10,1-8，描述了适配体；Reynolds et al.(2004)Nature Biotechnology 22(3),326-330，描述了RNAi；Pushparaj and Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology
33(5-6),504-510，描述了RNAi；Dillon et al.(2005)Annual Review of Physiology
67,147-173，描述了RNAi；Dykxhoorn and Lieberman(2005)Annual Review of Medicine
56,401-423，描述了RNAi)。RNAi分子可商购自多个来源(例如Ambion,TX；Sigma Aldrich,MO；Invitrogen)。本领域已知使用各种算法的一些siRNA分子设计程序(见例TM
如Cenix algorithm,Ambion；BLOCK-iT RNAi Designer,Invitrogen；siRNA Whitehead Institute Design Tools,Bioinofrmatics&Research Computing)。影响最佳siRNA序列定义的性状包括在siRNA末端的G/C含量，siRNA的特定内部结构域的Tm，siRNA长度，CDS(编码区)中靶序列的位置，以及3’突出端的核苷酸含量。
33(5-6),504-510，描述了RNAi；Dillon et al.(2005)Annual Review of Physiology
67,147-173，描述了RNAi；Dykxhoorn and Lieberman(2005)Annual Review of Medicine
56,401-423，描述了RNAi)。RNAi分子可商购自多个来源(例如Ambion,TX；Sigma Aldrich,MO；Invitrogen)。本领域已知使用各种算法的一些siRNA分子设计程序(见例TM
如Cenix algorithm,Ambion；BLOCK-iT RNAi Designer,Invitrogen；siRNA Whitehead Institute Design Tools,Bioinofrmatics&Research Computing)。影响最佳siRNA序列定义的性状包括在siRNA末端的G/C含量，siRNA的特定内部结构域的Tm，siRNA长度，CDS(编码区)中靶序列的位置，以及3’突出端的核苷酸含量。
[0187] 本发明还提供了试剂盒。这种试剂盒可包含本文描述的制剂或组合物，及在一些实施方案中还包含施用说明书。这种试剂盒可便于实施本文所述方法。当以试剂盒提供时，组合物的不同成分可以包装在单独的容器中，在使用之前即刻混合。组合物成分包括但不限于基质或支架以及Wnt3a多肽或多核苷酸、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF、抗生素、抗炎剂，或者如上述另一制剂。如果需要，这种单独包装的成分可以存在于一个包装或分配装置中，其可以含有具有所述组合物的一或多个单位剂量形式。包装可例如包括金属或塑料薄片包装如泡罩包装。这种单独包装的成分在一些情况中也可以允许长期贮存而不丧失所述成分的活性。
[0188] 试剂盒也可以包含在单独容器中的试剂，例如无菌水或盐水有待加入单独包装的冻干的活性成分中。例如密封的玻璃安瓿可含有冻干成分，及在单独的安瓿中具有在中性非反应性气体如氮气下包装的无菌水、无菌盐水或无菌物。安瓿可以由任何合适材料组成，如玻璃、有机聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或者典型用于容纳试剂的任何其它材料。合适的容器的其它实例包括瓶，其可以由与安瓿相似物质制成，以及包袋，其可以由箔片内壁如铝或合金箔片组成。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等。容器可具有无菌入口，如具有可以由皮下注射用注射针头刺穿的塞子的瓶。其它容器可具有由易于抽取的膜隔开的两个隔间，在将膜除去时成分混合在一起。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
[0189] 在一些实施方案中，试剂盒可以提供说明书。说明书可以印刷在纸上或者其它基质上，和/或可以以电子可读介质，例如软盘、mini-CD-ROM、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、录音带等提供。详细的说明书也许未与试剂盒在一起；代之以用户可以被指向生产者或试剂盒的经销商指定的互联网站。
[0190] 如下专利公开以其全部内容并入作参考：美国专利公开No.2011/0171607,BIOPULP；美 国 专 利 公 开 No.2013/0022989,DENTAL STEM CELL PROGRAMMING；美国专利公开No.2011/0236977,DENTAL STEM CELL DIFFERENTIATION；美国专利公开No.2012/0282573,TOOTH SCAFFOLDS；美国专利公开No.20110171607,BIOPULP；
WO 2012/045097,PRODUCTION OF DENTIN,CEMENTUM AND ENAMEL BY CELLS。
WO 2012/045097,PRODUCTION OF DENTIN,CEMENTUM AND ENAMEL BY CELLS。
[0191] 本文所述的组合物和方法利用的分子生物学方法可基于本领域已知的各 种 标 准 技 术 (见 例 如 Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel et al.(2002)Short Protocols in Molecular Biology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology
167,747-754；Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen,ed.(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel et al.(2002)Short Protocols in Molecular Biology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology
167,747-754；Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen,ed.(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
[0192] 提供本文所述的定义和方法是为了更好地定义本发明及指导本领域技术人员实施本发明。除非特别指出，术语是根据相关领域技术人员惯例使用。
[0193] 在一些实施方案中，用于描述和要求本发明的实施方案的表示成分的数量、性质如分子量、反应条件等的数字应理解为在一些情况中由术语“大约”修正。在一些实施方案中，术语“大约”用于表示数值包括用于确定数值的装置或方法的平均值的标准偏差。在一些实施方案中，在说明书和所附权利要求中描述的数值参数是近似值，可以根据由特定实施方案获得的期望的性质而变化。在一些实施方案中，所述数值参数应根据报道的限制性数字及应用通常近似技术而解释。尽管描述本发明一些实施方案的宽范围的数值范围和参数是近似值，具体实施例中的数值如实精确报道。在本发明一些实施方案中存在的数值可以包括由在其各自测试测量中发现的标准差所必然产生的一些误差。本文对数值的引用仅仅是作为逐个指代落入该范围内的每个单独数值的简化方法。除非在本文中特别指出，每个数值均并入本说明书中，就像其在本文中逐个引用一样。
[0194] 在一些实施方案中，在描述特定实施方案的上下文(特别是在下述一些权利要求上下文)中的术语“一个”和“所述”可以被理解为包括单数和复数，除非另有说明。在一些实施方案中，包括权利要求，如本文所用，术语“或者”是指“和/或”，除非明确表明仅是指选择项，或者选择项是互相排斥。
[0195] 术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词的任何形式或时态也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一或多个步骤的任何方法不限于仅仅具有那些一或多个步骤，也可以覆盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一或多个特征的任何组合为不限于仅仅具有那些一或多个特征，也可以覆盖其他未列出的特征。
[0196] 本文所述方法可以以任何合适顺序进行，除非本文另有说明或者上下文明显矛盾。本文针对一些实施方案使用任何及全部实施例或者举例语言(例如“例如”)仅仅是更好描述本发明，不是对本发明范围的限制。说明书中的语言不应被认为是实施本发明的任何未要求保护的元素。
[0197] 本文描述的本发明的可选元素或实施方案的集合不应被解释为限制。每个集合成员可以逐个指代或要求保护，或者与该集合的其他成员或者本文发现的其他元素任意组合。一个集合的一或多个成员可以为方便或可专利性而包括于或从一个集合中删除。当任何这种包括或删除发生时，本发明的说明书被视为包含经调整的集合，由此满足后续权利要求书中所用的所有马库什集合的书面描述。
[0198] 本文对参考文献的引用不应认为是承认其是本发明的现有技术。
[0200] 提供如下非限制性实施例以进一步例证本发明。本领域技术人员应意识在后续实施例中揭示的技术代表发明人已证实在本发明的实施中具有良好功能的方法，并因此可认为是组成实施本发明的实例模式。然而，本领域技术人员根据本发明应意识到在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对举例的实施方案进行一些改动，仍可获得相同或相似的结果。
[0201] 实施例1
[0202] 将拔取的人切牙进行根管处理。然后将有或无bFGF和/或VEGF的胶原蛋白海绵植入根管中。然后将该切牙皮下植入免疫缺陷的小鼠中。在2周后除去牙齿，评定髓腔和根管中的血管化。
[0203] 通过肉眼观察，用没有任何生物活性成分的胶原蛋白海绵处理的牙齿无明显的血管发生(图1a)。然而，用具有bFGF或bFGF与VEGF组合的胶原蛋白海绵处理的牙齿在插入根管中的胶原蛋白海绵中显示血管化(图1b和1c)。
[0204] 上述处理的牙齿的根管通过显微镜进一步评估。用没有任何生物活性成分的胶原蛋白海绵处理的牙齿示根管中显示无组织生长(图2A)，而用具有bFGF或VEGF或者bFGF+VEGF组合的胶原蛋白海绵处理的牙齿示出血管化及宿主组织向内生长(图2B-D)。这些处理中浸润的宿主组织附着于牙本质。
[0205] 实施例2
[0206] 如下实施例证实了牙本质发生性生物活性成分，骨形态发生蛋白-7(BMP-7)，及神经发生性生物活性成分，神经生物活性成分(NGF)在生物相容的聚-d-l-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)微球中的包囊化及控制释放。PLGA由50:50(PLA:PGA)制成，缓慢降解。在PLGA微球随着时间降解时，BMP-7和NGF逐渐释放。在4-6周后，BMP-7和NGF的释放模式通过ELISA确定，并证实累积的释放浓度曲线。这些发现提供了在生物相容的微球中应用BMP-7和NGF以在体内再生牙髓的观点的证据。
[0207] 由于在累积释放模式上的公开发现而选择50:50PLA/PGA比率的聚-d-l-乳酸-共-乙醇酸(PLGA,Sigma,St.Louis,MO)微球(Moioli et al.,2006；2007a,b；Clark et al.,2007)(图3)。
[0208] 首先制备100mL的0.1％PVA，并在导入任何其它成分之前，在450rpm持续搅动30分钟。使用双重乳化技术(水包油包水)(Moioli et al.,2006；2007a,b；Clark et al.,2007)制备50:50比率。将总共0.25g的PLGA完全溶解于1mL二氯甲烷中并与在50μL溶液中稀释的2.5μg重组人BMP-7或NGF乳化(最大旋动速度)1分钟(油包水)。然后将初级乳状液与2mL的1％聚乙烯醇(PVA,30,000–70,000MW)旋动1分钟(水包油包水)。
然后将该混合物加入搅动中的0.1％PVA中并搅动1分钟。在最终的乳状液中加入共100mL的2％异丙醇，在化学通风橱中持续搅动2小时以除去溶剂。含有细胞因子的PLGA微球经过滤分离(2μm滤膜)，用蒸馏水洗涤并在液氮中冷冻30分钟及冻干48小时。在使用之前将冻干的PLGA微球在-20℃贮存。
然后将该混合物加入搅动中的0.1％PVA中并搅动1分钟。在最终的乳状液中加入共100mL的2％异丙醇，在化学通风橱中持续搅动2小时以除去溶剂。含有细胞因子的PLGA微球经过滤分离(2μm滤膜)，用蒸馏水洗涤并在液氮中冷冻30分钟及冻干48小时。在使用之前将冻干的PLGA微球在-20℃贮存。
[0209] 牙本质发生性和神经发生性细胞因子包囊的PLGA微球两组均分配4个样品(n＝4)。每组具有在1mL的1％BSA溶液中的10mg包囊的细胞因子，在摇床上于37℃持续搅动。
通过在4-6周每周收集一次全部量的上清而获取数据点。在每次收集后更换1mL的1％BSA溶液。BMP-7和NGF的量通过使用BMP-7ELISA试剂盒和NGF ELISA试剂盒针对每个样品进行量化测量。
通过在4-6周每周收集一次全部量的上清而获取数据点。在每次收集后更换1mL的1％BSA溶液。BMP-7和NGF的量通过使用BMP-7ELISA试剂盒和NGF ELISA试剂盒针对每个样品进行量化测量。
[0210] 结果示出使用50:50比率的PLA/PGA，BMP-7和NGF微球在体外释放直至30-44天。在第一周期间发现爆发样释放，与先前公开的TGFβ3控制释放结果相比示出相似的释放模式(图3)。这两种释放模式均示出50:50PLGA可以包囊BMP-7和NGF，并与其它先前包囊的生物活性成分具有相似的降解速率。
[0211] 表1：BMP-7随着时间的释放-ELISA数据
[0212]
[0213] 表2：NGF ELISA数据，示出从PLGA微球中每周及累积释放
[0214]
[0215] 实施例3
[0216] 原代成牙本质细胞(Od)分离自出生后14天的Col1a1(2.3kb)-GFP小鼠切牙的牙髓，并通过GFP分选与非成牙本质细胞分离。原代成骨细胞(Ob)分离自相同小鼠的颅盖骨。整体的基因表达模式通过Alilgent-mouse-genome-oligo微阵列分析。使用>5倍及p<0.01(调节的)选择在成牙本质细胞(Od)与成骨细胞(Ob)之间不同的靶基因，并通过qRT-PCR、免疫组织化学和原位杂交证实。由来自微阵列数据的相应基因编码的Wnt3a和BMP7包囊在胶原蛋白凝胶中，并输送至迷你猪下切牙在体内经牙髓处理的根管中(N＝8)。3个月后评估牙髓再生情况。
[0217] 表3：差异表达的选择基因。粗体：在成牙本质细胞中高度表达的基因。非粗体：在成骨细胞中高度表达的基因。
[0218]基因 获取号 倍数 描述和推定的功能
Wnt 10a NM_009518 126 激活经典Wnt/β-catenin信号，位于DSP上游
Alx3 NM_007441 51 在发育期间形成中胚层
Pax9 NM_011041 40 在一些人群中不存在智齿时起作用
Dlx1 NM_010053 33 腹侧前脑的发育。在颅面形成和形态发生中可起作用。
BMP7 NM_007557 30 促进骨/牙生成
Foxq1 NM_008239 28 胚胎发育，细胞周期调节，组织特异性基因表达
Tinagl1 NM_023476 28 涉及肾上腺皮质分带发育
Lhx8 NM_010713 25 某些神经元和间充质细胞的分化
Sox11 NM_009234 17 在神经系统发育中可能是重要的
GDF10 NM_145741 200 成骨细胞分化的正调节物
Wnt 16 NM_053116 97 与骨矿物质密度相关
RANKL NM_011613 25 骨重塑
Sox 6 NM_011445 18 促进成骨细胞分化
Wnt 10a NM_009518 126 激活经典Wnt/β-catenin信号，位于DSP上游
Alx3 NM_007441 51 在发育期间形成中胚层
Pax9 NM_011041 40 在一些人群中不存在智齿时起作用
Dlx1 NM_010053 33 腹侧前脑的发育。在颅面形成和形态发生中可起作用。
BMP7 NM_007557 30 促进骨/牙生成
Foxq1 NM_008239 28 胚胎发育，细胞周期调节，组织特异性基因表达
Tinagl1 NM_023476 28 涉及肾上腺皮质分带发育
Lhx8 NM_010713 25 某些神经元和间充质细胞的分化
Sox11 NM_009234 17 在神经系统发育中可能是重要的
GDF10 NM_145741 200 成骨细胞分化的正调节物
Wnt 16 NM_053116 97 与骨矿物质密度相关
RANKL NM_011613 25 骨重塑
Sox 6 NM_011445 18 促进成骨细胞分化
[0219] 结果示出Col1a1(2.3kb)启动子特异性驱动Od和Ob中GFP的表达。Od占总牙髓细胞的大约2％。微阵列分析示出在Od中341个基因的强力表达，包括wnt家族基因、bmp7、dsp、dlx和pax9，在Ob中196个基因表达。Wnt3a示出是促进来自牙槽骨骨髓和牙周膜的间充质干细胞/祖细胞的成牙本质细胞分化所必需且足够的。Wnt3a还示出促进细胞迁移。Wnt3a的体内输送通过招募宿主内源性细胞，不仅再生迷你猪下颌切牙的牙髓处理的根管中血管化的牙髓组织，而且再生在天然管状牙本质表面上具有极化成牙本质细胞的新牙本质。
[0220] 因此证实经典Wnt信号途径对于祖细胞如间充质细胞的成牙本质细胞特化或分化是关键的，并且作为无需细胞移植的微囊化的可转移的医疗装置来编排牙髓或牙本质再生。
[0221] 实施例4:生物材料牙髓保护
[0222] 将生物材料(例如藻酸盐水凝胶)置于在除去病变组织包括腐烂的牙釉质和牙本质后的外科手术制备的牙洞中或者置入牙髓腔(见例如图13A-D)。对于置入制备的牙洞中的生物材料如藻酸盐水凝胶，血液、组织液和水将吸收进入该生物材料中。生物材料装置可以在24-48小时后除去，随后封闭髓腔并复原患病的牙齿。
[0223] 在交联期间，钙与藻酸盐形成稳定复合物以形成网络(见例如图14)。藻酸盐水凝胶可保留其原始重量的60～75倍的水(见例如图15)。
[0224] 实施例5:牙齿成熟的迷你猪中的牙髓处理
[0225] 如下实施例示出在牙齿成熟的迷你猪中的牙髓处理。特别示出BMP7或Wnt3a作为补充物的在水凝胶介导的牙髓和牙本质再生。
[0226] 在麻醉下，放置橡皮障以隔离迷你猪的切牙，这是牙髓病患者的护理标准(见例如图16)。通过用高速牙钻机械性开口以触及牙髓腔。根除牙冠和根尖牙髓，随后使用仪器处理根管牙本质，如在牙髓病患者中一样处理。在消毒及用纸尖干燥后，将有或无BMP7(200ng/ml)或Wnt3a(10ng/ml)的水凝胶注射进根管和髓腔中。使用Cavit和复合树脂恢复牙冠开口，如在牙髓病患者中一样。
[0227] 在4周后含有BMP7(200ng/ml)的水凝胶的结果示出牙髓和牙本质再生(见例如图17)。在4周后含有Wnt3a蛋白质(10ng/ml)的水凝胶的结果示出牙髓和牙本质再生(见例如图18)。在4周后含有BMP7(200ng/ml)和Wnt3a蛋白质(10ng/ml)的水凝胶的结果示出牙髓和牙本质再生(见例如图19)。
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[0254] 序列
[0255] SEQ ID NO:1
[0256] Wnt3a多肽(人)
[0257] UniParc P56704
[0258]
[0259] SEQ ID NO:2
[0260] Wnt3a多肽(人)
[0261] UniParc Q3SY79
[0262]
[0263]
[0264] SEQ ID NO:3
[0265] Wnt3a多肽(小鼠)
[0266] 来自细胞培养的重组全长小鼠Wnt3a蛋白。SwissProtID＝P27467
[0267] SLAVGPQYSS LSTQPILCAS IPGLVPKQLR FCRNYVEIMP SVAEGVKAGI QECQHQFRGR RWNCTTVSNS LAIFGPVLDK ATRESAFVHA IASAGVAFAV TRSCAEGSAA ICGCSSRLQG SPGEGWKWGG CSEDIEFGGM VSREFADARE NRPDARSAMN RHNNEAGRQA IASHMHLKCK CHGLSGSCEV KTCWWSQPDF RTIGDFLKDK YDSASEMVVE KHRESRGWVE TLRPRYTYFK VPTERDLVYY EASPNFCEPN PETGSFGTRD RTCNVSSHGI DGCDLLCCGR GHNARTERRR EKCHCVFHWC CYVSCQECTR VYDVHTCK
[0268] SEQ ID NO:4
[0269] Wnt3a多肽(水螅)
[0270] 在大肠杆菌中表达的来自水螅的重组全长Wnt3a蛋白(UniProt Accession Q9GTJ9)
[0271] MQYKLALNGK TLKGETTTEA VDAATAEKVF KQYANDNGVD GEWTYDDATK TFTVTELVPR GSQLWMALGT QTSAIESRPR SSINKNLCRA LYLHHYQRTV CLNYTDLMLS VAEGIRLGID ECQVQFKHRK WNCTINEHGT SVFGPIITTA SRESAFISGI ISAGVAFSVT ESCAEGKSVH CRCDNSVRGQ TDEGWRWGGC NRPITYGIWF SQLFIDQVEK IVKKRKDPRK IMNLHNNKAG REVIKNLLQT ECKCHGTSGN CNLKTCWRSQ PHFSEIGKIL KEKYDSAHEM EFLYKVKANG ERKIKDLIPK YKEYLPPSSL DFIYYEESPN YCVKNETLGI AGTKGRSCNI TSSGVDGCEL MCCQRGYNVN IVQKTHSCEC KFVWCCKVSC NSCIKMTPEY TCKLVPRGSL EHHHHHH
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