产生微粒的方法
阅读：813发布：2023-03-11
专利汇可以提供产生微粒的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 基于条件永生化细胞能够产生微粒这一发现。所述条件永生化细胞可以是干细胞。 实施例 表明从条件永生化的神经干细胞和CD34+细胞中可以成功地收集到微粒。条件永生化提供了一种产生诸如外来体的微粒的无性细胞的稳定来源。条件永生化细胞作为“产生者细胞”用于产生诸如外来体的、典型地收集或分离自条件永生化细胞的微粒。，下面是产生微粒的方法专利的具体信息内容。
1.条件永生化细胞产生微粒的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述条件永生化细胞是：
间充质干细胞，任选自来源于骨髓的干细胞、子宫内膜再生细胞、间充质祖细胞、脂肪衍生干细胞或多能成体祖细胞；
神经干细胞，任选自神经球启始干细胞或少突胶质前体细胞；
造血干细胞，任选地为CD34+细胞和/或分离自脐带血，或任选地为CD34+/CXCR4+细胞；
非造血脐带血干细胞；
极小胚胎样干细胞(VSELSs)；
诱导多能干(iPS)细胞；
成纤维细胞；或
树突状细胞。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述细胞包含c-mycER。
4.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒是一种外来体、微囊泡、膜颗粒、膜囊泡、外来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。
5.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述细胞来自干细胞系，任选地来自神经干细胞系或非神经干细胞系。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述细胞在无血清培养基中生长。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述干细胞系是神经干细胞系，任选地是具有ECACC登记No.04091601的CTX0E03、具有ECACC登记No.04110301的STR0C05和具有ECACC登记No.04092302的HPC0A07。
8.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒具有：
(a)由电子显微镜测量到的30至1000nm、30至200nm、或30至100nm的粒径；
(b)在蔗糖中1.1-1.2g/ml.的密度。
9.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒包含RNA。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述RNA是mRNA和/或miRNA。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述微粒包含hsa-miR-1246,hsa-miR-4492,hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、二种、三种或四种。
12.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒包含下述的一种或多种：
(a)选自神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和/或磷脂酰胆碱中的脂类；
(b)miRNA， 任 选 自 hsa-let-7g、hsa-miR-101、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-126、hsa-miR-128、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-130a、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-155、hsa-miR-15a、hsa-miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-182、hsa-miR-183、hsa-miR-185、hsa-miR-18b、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-195、hsa-miR-20a、hsa-miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-218、hsa-miR-301a、hsa-miR-302a、hsa-miR-302c、hsa-miR-345、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-7、hsa-miR-9、hsa-miR-93、hsa-miR-96和hsa-miR-99a；
(c)四跨膜蛋白，任选自CD63、CD81、CD9、CD53、CD82和/或CD37；
(d)TSG101、Alix、CD109和/或thy-1；和/或
(e)CD133。
13.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒包含存在于表19或表21的蛋白中的至少十种。
14.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒包含干细胞、干细胞条件培养基、神经干细胞或神经干细胞条件培养基的至少一种生物学活性。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述至少一种生物学活性是再生活性。
16.根据前述任一项权利要求所述的用途产生的微粒，其用于治疗。
17.根据权利要求16所述的微粒，其中所述治疗是再生治疗。
18.一种产生微粒的方法，包括自条件永生化细胞培养基中分离微粒，任选地其中所述细胞如权利要求2或3所定义。
19.根据权利要求18所述的产生微粒的方法，其中：
(i)所述细胞条件培养基包含一种或多种组分使干细胞诱导微粒释放到所述培养基中；
(ii)所述细胞在低氧条件下培养；
(iii)所述细胞与一种不同类型的细胞共培养；
(iv)所述细胞在多隔室生物反应器中培养；和/或
(v)所述细胞是部分分化的干细胞。
20.根据权利要求19(i)所述的方法，其中所述一种或多种组分选自：转化生长因子β(TGF-β)、干扰素γ(INF-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
21.根据权利要求19(iii)或当从属于权利要求19(iii)时权利要求20所述的方法，其中所述的不同类型的细胞是内皮细胞。
22.一种根据权利要求19-21中任一项所述的方法可获得的微粒。
23.一种组合物，其包含根据权利要求22所述的微粒和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
24.一用于产生根据权利要求22所述的微粒的方法的试剂盒，其包括：(a)一培养基；
(b)一条件永生化细胞；(c)任选地，一种或多种根据权利要求19或20所述的组分；(d)任选地，适合用作对照的根据权利要求22所述的微粒；(e)任选地，一适合特异性检测所述产生的微粒的检测试剂；及(f)使用所述试剂盒产生根据权利要求22所述的微粒的使用说明。
25.一种筛选一种改变条件永生化细胞的微粒产率的试剂的方法，其包括使条件永生化细胞与候选试剂接触并观察所接触的干细胞的微粒产率与对照相比是增加还是减少。
产生微粒的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及通过细胞产生的微粒、其用途和产生。
背景技术
[0002] 干细胞具有自我更新和分化成功能上不同的细胞类型的能力。其有潜力成为不断发展的再生医学领域、尤其是需要组织替换、再生或修复的再生疗法中的有效工具(Banerjee等人2011)。然而，在疗法中使用干细胞存在缺点：需要具有功能和表型稳定性的干细胞的一致和大量供应以及由细胞产生、贮存、运输和处理所引起的相关高成本和时间延迟；对避免接受者排斥干细胞的免疫学相容性具有一定要求；和存在与肿瘤或异位组织形成的潜在安全风险有关的复杂调节问题。此外，尽管干细胞移植具有治疗功效，但没有令人信服的证据证明所移植干细胞的直接长期作用(例如通过移植和分化成修复和替换细胞)。
[0003] 神经干细胞(NSC)是产生神经元、星形细胞和少突胶质细胞的具有自我更新能力的多能干细胞(Kornblum,2007)。已有大量文件证明神经干细胞的医疗潜力。受损中枢神经系统(CNS)组织具有极有限的再生能力以使得神经功能的损失经常是慢性和进行性的。神经干细胞(NSC)已显示了在神经损伤或疾病的基于干细胞的疗法中有前途的结果(Einstein等人2008)。已显示在将神经干细胞(NSC)植入中风后动物的脑中后在运动和认知测试中有显著恢复(Stroemer等人2009)。还未完全了解NSC如何能够在受损组织中恢复功能，但现在逐渐认识到NSC具有多模式修复性质，包括位点适当性细胞分化、促血管生成和神经营养活性以及免疫调节，从而通过天然免疫系统和其它宿主细胞促进组织修复(Miljan和Sinden,2009,Horie等人,2011)。很可能这些作用中有许多取决于从所植入的神经干细胞到宿主环境的瞬时信号传导，例如当植入缺血性肌肉组织损伤中时NSC瞬时表达指导并扩大天然促血管生成和调节免疫反应以促进治愈和修复的促炎症性标记物(Hicks等人,未公布数据)。在慢性中风脑中，NSC也具有相当大的神经营养性作用。举例来说，其促进具有宿主脑源性双皮质素抗体(doublecortin)阳性神经母细胞的中风损坏的纹状体脑组织的再增殖(Hassani,O'Reilly,Pearse,Stroemer等人,PLoS One.2012；7(11))。
[0004] 此外，根据在慢性中风动物模型中的大量NSC恢复作用，ReNeuronLimited(Surrey,UK)正在进行使用神经干细胞的临床试验，以检验使用其“CTX0E03”条件永生化皮层源性神经干细胞对残疾中风患者的治疗(Clinicaltrials.gov标识符：
NCT01151124)。
NCT01151124)。
[0005] 间质干细胞(MSC)是谱系限制性干细胞，其仅具有分化成间质细胞类型(即脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞谱系)的潜力(Pittenger等人1999；Ding等人2011)。MSC(也被称为间质基质细胞和间质祖细胞)来源于各种来源，包括骨髓、血液、脂肪和其它体细胞组织。然而，MSC的治疗潜力更加指向应用其作为未分化细胞的促血管生成和免疫调节性质。人类MSC的产生因这些细胞无法大量稳定扩增超过约15-20次群体倍增受到限制。
[0006] 间质干细胞条件培养基(MSC-CM)具有类似于MSC自身的治疗功效，表明了基于MSC的疗法的旁分泌机制(Timmers等人2007)。WO-A-2009/105044公开由MSC分泌的称为外来体的粒子包含MSC的至少一种生物学性质并且提出在疗法中使用这些MSC粒子，而Théry等人2011提供了对外来体和其它类似分泌囊泡的综述。尽管通过使用间质干细胞源性外来体克服了直接使用干细胞作为治疗剂的一些缺点(例如贮存、运输和处理)，但提供功能上和表型上稳定的干细胞的一致且大量供应以产生外来体仍是个问题。对于治疗用途，外来体优选地需要大规模地产生。在缺乏干细胞系的情况下，需要通过从干细胞来源重复得到而补充细胞，其带来了用于测试和检验每一个新的批次的续生成本。此外，可以通过MSC治疗的疾病和病症可能是有限的。
[0007] 仍需要改良的基于干细胞的疗法。发明概要
[0008] 本发明是基于微粒能够便利地通过条件永生化细胞所制得的惊人发现。条件永生化细胞可以是干细胞。实施例表明从条件永生化的神经干细胞和CD34+细胞中可以成功地收集到微粒。条件永生化提供了一种产生诸如外来体的微粒的无性细胞的稳定来源。条件永生化细胞作为“产生者细胞”用于产生诸如外来体的、典型地收集或分离自条件永生化细胞的微粒。
[0009] 本发明的第一方面提供了一种条件永生化细胞产生微粒的用途。典型地，所述条件永生化细胞为：
[0010] 间充质干细胞，任选自骨髓衍生干细胞，子宫内膜再生细胞，间充质祖细胞或多能成体祖细胞；
[0011] 神经干细胞，任选自神经球起始干细胞，或少突胶质前体细胞；
[0012] 造血干细胞，任选地为CD34+细胞和/或分离自脐带血，或任选地为CD34+/CXCR4+细胞；非造血脐带血干细胞；
[0013] 极小胚胎样干细胞(VESLs)；
[0014] 诱导多能干(iPS)细胞；
[0016] 树突状细胞。
[0017] 生产出来的微粒可以是外来体、微囊泡、膜颗粒、膜囊泡、外来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。典型地，所述微粒是外来体。在一实施方案中，细胞是间充质干细胞并且微粒是外来体。
[0018] 条件永生化可以通过引入永生化因子来实现。所述永生化因子只有当细胞被提供激活试剂时才会被激活。这样的永生化因子可以是基因，如c-mycER。所述c-mycER基因的产物是一种融合蛋白，其由一c-Myc突变体与一突变雌激素受体的配体结合域融合形成。典型地，该条件永生化细胞在加入激活试剂下培养。针对c-mycER条件永生化细胞，所述激活试剂为4-羟基它莫西芬(4-OHT)。相应地，在分离微粒的时候，微粒典型地从处于永生化状态的条件永生化细胞中被分离。
[0020] 本发明的第二方面提供了一种产生微粒的方法，包括以下步骤：从一种条件永生化细胞的细胞条件培养基中分离微粒，任选地，其中所述细胞为上述定义的细胞。在这一方面的某些实施方案中：
[0021] 所述细胞条件培养基可以包括一种或多种诱导干细胞释放微粒到培养基中的组分；
[0022] 所述细胞可以在低氧条件下培养；
[0023] 所述细胞可以与一种不同类型的细胞共培养；
[0024] 所述细胞可以在多隔室生物反应器中培养；和/或
[0025] 所述细胞可以是部分分化的干细胞。
[0026] 本发明进一方面提供了一种产生干细胞微粒，典型地为神经干细胞微粒或来自(如上所述)另一种干细胞的微粒的方法。该方法可以包括在允许干细胞分化并收集由所述细胞产生的微粒的环境中培养干细胞，典型地为条件永生化干细胞。微粒可以分离自部分分化的神经干细胞。干细胞可以在允许有效去除代谢废物的条件下培养。在一实施方案中，一种允许干细胞分化的环境是在多隔室生物反应器中培养，典型地为时间段延长(例如超过七天)。该方法可以包括从一种干细胞条件培养基中分离微粒。所述干细胞条件培养基可以包括一种或多种刺激所述干细胞释放微粒至所述培养基的添加的成分或试剂。所述一种或多种成分可以选自转化生长因子β(TGF-β)、干扰素γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。所述微粒可以分离自干细胞条件培养基，其中所述干细胞在低氧条件下培养。所述微粒可以分离自干细胞与一类不同细胞，典型地为内皮细胞共培养的干细胞条件培养基，以创建神经干细胞微环境。
[0027] 本发明进一方面提供了一种可通过本发明的方法获得的微粒。
[0028] 本发明另一方面提供了一种筛选一种改变条件永生化细胞微粒产生的试剂的方法，其包括使条件永生化细胞与备选试剂接触并观察接触了的条件永生化细胞产生微粒的速率与对照相比是增加还是减少。
[0029] 本发明进一方面提供了一种使用产生微粒的方法的试剂盒，包括：(a)一培养基；(b)一条件永生化细胞；(c)任选地，一种或多种权利要求19或20中的组分；(d)任选地，权利要求22中适合作为对照的微粒；(e)任选地，适合特异性检测产生的微粒的检测试剂；
及(f)用试剂盒产生权利要求22中任一项的微粒的说明书。
及(f)用试剂盒产生权利要求22中任一项的微粒的说明书。
[0030] 本发明更多方面和实施方案如下文及权利要求所描述。
[0031] 本发明也涉及到发现含有治疗用途的微粒的神经干细胞。此处讨论的关于从神经干细胞中产生微粒的方法可以被应用于从本发明第一方面所描述的其他类型细胞产生微粒的方法。
[0032] 本发明一方面提供了一种神经干细胞微粒。该微粒可以是外来体、微囊泡、膜颗粒、膜囊泡、外来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。典型地，微粒是外来体。所述微粒可以从在允许干细胞分化的环境下培养的一种条件永生化神经干细胞中分离。微粒可以从部分分化的神经干细胞分离。在一实施方案中，允许干细胞分化的环境是多隔室生物反应器，典型地其中细胞被培养超过七天。微粒可以来源于神经干细胞系。在一些实施方案中，神经干细胞系可以是“CTX0E03”细胞系、“STR0C05”细胞系、“HPC0A07”细胞系或Miljan等人Stem Cells Dev.2009中公开的神经干细胞系。在一些实施方案中，微粒来源于在培养时不需要维持血清的干细胞系。微粒可具有如通过电子显微镜术所测定的介于30nm和1000nm之间或介于30nm和200nm之间或介于30nm和100nm之间的尺寸；和/
或1.1-1.2g/ml的蔗糖密度。微粒可包含RNA。RNA可以是mRNA、miRNA和/或任何其它小RNA。微粒可包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、两种、三种或四种。微粒可包含一种或多种脂质，典型地选自神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱。微粒可包含一种或多种四跨膜蛋白，典型地为CD63、CD81、CD9、CD53、CD82和/或CD37。微粒可包含TSG101、Alix、CD109、thy-1和CD133中的一种或多种。微粒可包含表19或表21中所出现的蛋白质中的至少10种。微粒可包含神经干细胞或神经干细胞条件培养基的至少一种生物活性。至少一种生物活性可以是组织再生活性。本发明的微粒典型地经过分离或纯化。
或1.1-1.2g/ml的蔗糖密度。微粒可包含RNA。RNA可以是mRNA、miRNA和/或任何其它小RNA。微粒可包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、两种、三种或四种。微粒可包含一种或多种脂质，典型地选自神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱。微粒可包含一种或多种四跨膜蛋白，典型地为CD63、CD81、CD9、CD53、CD82和/或CD37。微粒可包含TSG101、Alix、CD109、thy-1和CD133中的一种或多种。微粒可包含表19或表21中所出现的蛋白质中的至少10种。微粒可包含神经干细胞或神经干细胞条件培养基的至少一种生物活性。至少一种生物活性可以是组织再生活性。本发明的微粒典型地经过分离或纯化。
[0033] 本发明的更进一方面提供了一种用于疗法中的神经干细胞微粒。该疗法可以是需要组织替换、再生或修复的再生疗法，例如其中该疗法需要血管生成、神经发生和/或神经保护。疗法可以用于神经疾病、病症或缺损。疗法可以改善功能和/或认知恢复。疗法可以是对中风、外周动脉疾病、神经病或需要组织再生、血管再生或局部消炎作用的任何其它疾病或病症的疗法，这些疾病或病症包括：
[0034] (i)神经病症、疾病或缺损，例如帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、中风或ALS；
[0035] (ii)溶酶体贮积症；
[0036] (iii)心血管病症，例如心肌梗死、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃疡、伤口愈合；
[0038] (v)代谢或炎症性病症，例如糖尿病(I或II)、类风湿关节炎、骨关节炎、狼疮、克罗恩氏病(Crohn's disease)、炎症性肠病或移植物抗宿主病(Graft versus Host Disease)；
[0040] (vii)视网膜致盲疾病，例如年龄相关黄斑变性、斯塔加特病(Stargardtdisease)、糖尿病性视网膜病、视网膜色素变性；和
[0041] (viii)脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症、大脑性麻痹、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病(Devic's disease)、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脑白质营养不良、格巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、抗MAG周围神经病和恰克-马利-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth disease)。
[0042] 在一实施方案中，微粒是外来体且疗法是对需要组织替换、再生或修复的疾病或病症的疗法。在另一实施方案中，微粒是微囊泡且疗法是对需要血管生成的疾病或神经疾病、病症或缺损的疗法。
[0043] 疗法也可以是在随后、同时或同步接受微粒所来源的干细胞的宿主中诱导耐受性、典型地为免疫耐受性的预防疗法。在施用干细胞疗法之前或同时向患者施用一次或多次剂量的本发明的微粒可用于降低干细胞疗法的不利免疫反应(即“排斥”)的风险。
[0044] 本发明的更进一方面提供了神经干细胞微粒在制造用于治疗疾病的药剂中的用途。
[0046] 图1描绘了产生微粒的CTX0E03条件永生化神经干细胞的电子显微图。图A-E示出了含有直径介于30nm和50nm之间的外来体的细胞内多泡体(multivesicular body；MVB)且图F示出了通过在细胞膜处出芽的方法由神经干细胞释放的直径>100nm的微囊泡。
[0047] 图2是用于鉴别、表征微粒和由干细胞产生微粒的方案概述。
[0048] 图3示出了对CTX0E03条件和非条件培养基进行的人类血管生成ELISA条光学密度读出。
[0049] 图4A示出了与正常培养条件(3天T175)相比从15ml含有由Integra系统纯化的微粒的培养基提取的蛋白质的量(通过BCA分析测量)。图4B示出了(i)Integra培养的CTX0E03外来体(上左图)和微囊泡(上右图)中的CD63和(ii)Integra培养的CTX0E03外来体(下左图)和微囊泡(下右图)中的CD81的FACS检测(以2ug/ml，1:250)。
[0050] 图5示出了与正常培养条件(3天T175)相比从15ml含有通过从Integra系统过滤而纯化的微粒的培养基提取的在260/280nm下测量的分离的总RNA的量。
[0051] 图6A示出了伤口闭合/划痕分析的结果，其表示在CTX0E03条件培养基中培养或在添加经纯化的CTX0E03外来体后的正常人类皮肤纤维母细胞(NHDF)的迁移活性。图6B示出了72小时后的划痕分析的结果，比较10μg CTX0E03外来体与基础条件(无外来体)的作用。图6C示出了基础条件、2μg/ml外来体、6μg/ml外来体、20μg/ml外来体和LSGS(低血清生长补充剂)阳性对照的愈合区域％。图6C的上图示出了从在Integra Celline系统中培养2周的CTX0E03细胞分离的外来体且图6C的下图示出了从在Integra Celline系统中培养6周的CTX0E03细胞分离的外来体。图6D在体内注射伤口愈合分析中将CTX0E03细胞与阴性对照(生理盐水)进行了比较。
[0052] 图7示出了在3周时间点从标准CTX0E03(T175)培养物相对于Integra CELLine系统获得的每个培养基的经纯化外来体的数量。
[0053] 图8A示出了从CTX0E03Integra CELLine培养系统的两个不同烧瓶在1周、2周和3周后所收获的外来体的浓度。
[0054] 图8B示出了在CTX0E03细胞的6周连续培养期间从单个Integra CELLine烧瓶收获的外来体的浓度。
[0055] 图9示出了与标准(“对照”)CTX0E03(T175)培养物相比在Integra CELLine系统中培养3周的CTX0E03细胞中所测量的多种mRNA标记物的表达水平的倍数变化。
[0056] 图10示出了从在Integra生物反应器培养物中培养3周的CTX0E03细胞获得的外来体和从标准CTX0E03(T175)培养物获得的微粒中多种miRNA的倍数上调和下调，其是针对标准(T175)培养物中的CTX0E03细胞中的基线表达水平而进行评估。
[0057] 图11描绘了由来自在标准(T175)条件下培养的CTX0E03细胞(“CTX”)、微囊泡(“MV”)和外来体(“EXO”)的miRNA的深度测序的获得的miRNA谱。图11a和11b示出了两种培养物的结果。
[0058] 图12示出了hNSC微囊泡对HUVEC的血管生成的作用。图12A是照片，示出了与基本HUVEC相比添加微囊泡时(右图)所观察到的管形成的显著增加。图12B和12C示出了在多种浓度(0.05μg、0.1μg、0.3μg-图12B；和0.6μg/ml-图12C)下由hNSC微囊泡提供的总管长的增加。
[0059] 图13示出了hNSC微囊泡对PC-12细胞中的轴突长出的作用。
[0060] 图14是电泳图，示出了如通过Agilent RNA生物分析器所测定的CTX0E03细胞、外来体和微囊泡中的总RNA含量谱。
[0061] 图15是完全覆盖外显子的编码基因和位于内含子或基因间序列中的非编码转录物的百分比的示意图(通过针对GENCODE序列数据集运行NGS BAM文件而产生)。
[0062] 图16描绘了与CTX0E03产生者细胞相比外来体和MV中的热门优先穿梭的新颖miRNA。
[0063] 图17示出了试图测定在Integra CELLine系统中培养1、2、3、4、5和6周的CTX0E03外来体(图17A)和微囊泡(图17B)的粒径和浓度的NanoSight分析结果。
[0064] 图18示出了比较来自CTX0E03外来体和微囊泡的蛋白质组数据(18A和18B)和将神经干细胞外来体与间质干细胞外来体进行比较(18C和18D)的文氏图(Venn diagram)。图18A说明了从第2周Integra培养系统分离的CTX0E03外来体和微囊泡内的独特蛋白质数目。图18B比较了与CTX0E03外来体和微囊泡内所鉴别的蛋白质相关的生物过程。图
18C将CTX0E03神经干细胞外来体蛋白质组与间质干细胞外来体蛋白质组进行了比较，并且图18D比较了与MSC源性外来体与神经干细胞源性外来体中所鉴别的蛋白质相关的生物过程。
18C将CTX0E03神经干细胞外来体蛋白质组与间质干细胞外来体蛋白质组进行了比较，并且图18D比较了与MSC源性外来体与神经干细胞源性外来体中所鉴别的蛋白质相关的生物过程。
[0065] 图19示出了发现与NSC源性外来体和非间质干细胞外来体相关的30种生物过程。
[0066] 图20示出了CD34+细胞成功的条件永生化。(A)是定量RT-PCR循环示意图，显示被慢病毒感染的来源于脐带血的CD34+祖体细胞中存在c-mycERTAM mRNA。(B)是对照样品，显示免疫共沉淀中检测到外来体的标记物Alix。(C)显示Alix在CD34+和
CD34+c-MycERTam细胞免疫共沉淀的外来体中表达。
CD34+c-MycERTam细胞免疫共沉淀的外来体中表达。
[0067] 发明详述
[0068] 本发明是基于微粒能够便利地通过条件永生化细胞所制得这一惊人发现。条件永生化细胞可以是干细胞。实施例表明从条件永生化的神经干细胞和CD34+细胞中可以成功地产生微粒。条件性永生提供了一种产生如外来体这样的微粒的无性细胞的稳定来源。条件永生化细胞作为“产生者细胞”用于产生诸如外来体的、典型地收集或分离自条件永生化细胞的微粒。本发明者还惊人地鉴别出神经干细胞中的微粒。这些微粒保留其所来源的神经干细胞的一些功能并且典型地在治疗上适用于与神经干细胞相同的治疗。微粒优于相应干细胞，因为其较小并且较不复杂，从而更易产生、维持、贮存和运输，并且具有避免与干细胞相关的一些调节问题的潜力。微粒可以通过从条件培养基分离而连续产生，例如在例如多隔室生物反应器的生物反应器中，其允许大规模生产和提供“现成”疗法。该多隔室生物反应器典型地是两隔室生物反应器。
[0069] 另外发现，令人惊讶的是，在允许干细胞开始分化的环境中培养干细胞(任何类型，不限于神经干细胞)显著增加所产生微粒的产量。
[0070] 发明者已意外地观察到，在多隔室生物反应器中培养干细胞(任何类型，不限于神经干细胞)导致干细胞部分分化成更加分化形式的干细胞。培养中的这种分化不需要添加诱导分化的试剂。这种分化典型地需要至少一周、至少两周或至少三周的培养期。通过所培养的干细胞产生的微粒反映在多隔室生物反应器中孵育时所出现的干细胞变化。因此，通过在多隔室生物反应器中培养干细胞，可以诱导细胞分化。因此，来自部分分化的干细胞的微粒可以通过从在多隔室生物反应器中培养典型地至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周或至少六周的干细胞收获微粒而产生。任选地，所述细胞，如NSC，已经培养了至多十周。在一实施方案中，本发明提供了一种通过从部分分化的神经干细胞分离微粒来产生微粒的方法。
[0071] 发明者还发现可以诱导微粒从干细胞分泌。也不限于神经干细胞并且可以用于从任何干细胞产生微粒的这一发现允许从干细胞培养获得改良的微粒产量。已经鉴别出在不同程度上增强微粒分泌的若干种试剂，其具有能够控制分泌的微粒的量的其它优点。在低氧条件下培养干细胞也会改良微粒产生。此外，已经发现将干细胞与不同细胞类型、尤其是内皮细胞类型共培养可以有利地改变由干细胞产生的微粒。
[0072] 在另一实施方案中，本发明提供了由无血清干细胞产生的微粒、典型地为外来体。血清是成功培养许多细胞系所需的，但其含有许多污染物，包括其自身外来体。如下文所述，发明者已经从成功培养不需要血清的干细胞产生微粒。
[0073] 微粒
[0074] 本发明涉及从条件永生化细胞产生微粒。
[0075] 在一个方面，本发明提供了从条件永生化神经干细胞、间充质干细胞或造血干细胞可获得的微粒。神经干细胞微粒是一种由神经干细胞产生的微粒；间充质干细胞微粒是一种由间充质干细胞产生的微粒；造血干细胞微粒是一种由造血干细胞产生的微粒。典型地，微粒由干细胞分泌。更加典型地，微粒是外来体或微囊泡。在本领域已知，微粒来自某些干细胞(非条件永生化的干细胞)，例如间质干细胞。
[0076] “微粒”是由细胞释放的直径为30nm到1000nm的细胞外囊泡。其受到包围生物分子的脂质双分子层限制。术语“微粒”在本领域中是已知的并且涵盖许多不同种类的微粒，包括膜颗粒、膜囊泡、微囊泡、外来体样囊泡、外来体、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。不同类型的微粒是基于直径、亚细胞起源、其蔗糖密度、形状、沉降速率、脂质组合物、蛋白质标记物和分泌方式(即根据信号(诱导性)或自发(组成性))来进行区分。四种常见微粒和其区分特点描述于下表1中。
[0077] 表1：多种微粒
[0078]
[0079] 认为微粒通过利用直接和间接机制充当供体和受体细胞之间的媒剂而在细胞间连通中起作用。直接机制包括通过受体细胞摄取微粒和其供体细胞源性组分(例如蛋白质、脂质或核酸)，这些组分在受体细胞中具有生物活性。间接机制包括微囊泡-受体细胞表面相互作用，并且引起受体细胞的细胞内信号传导的调节。因此，微粒可以介导通过受体细胞获得一种或多种供体细胞源性性质。已经观察到尽管干细胞疗法在动物模型中具有功效，但干细胞似乎并不移植到宿主中。因此，使干细胞疗法有效的机制尚不清楚。在不希望受理论束缚的情况下，发明者相信由神经干细胞分泌的微粒在这些细胞的治疗效用中起作用且因此自身在治疗上是有用的。
[0080] 本发明的微粒和细胞，如干细胞，是分离的。术语“分离”指示其所指的微粒、微粒群体、细胞或细胞群体并不在其自然环境中。微粒、微粒群体、细胞或细胞群体已经基本上与周围组织分离。在一些实施方案中，如果样品含有至少约75％、在一些实施方案中至少约85％、在一些实施方案中至少约90％且在一些实施方案中至少约95％微粒和/或干细胞，那么微粒、微粒群体、细胞或细胞群体基本上与周围组织分离。换句话说，如果样品含有小于约25％、在一些实施方案中小于约15％且在一些实施方案中小于约5％除微粒和/或干细胞以外的物质，那么样品基本上与周围组织分离。所述百分比值是指重量百分比。该术语涵盖已经从其所来源的生物体除去并且存在于培养物中的细胞或微粒。该术语还涵盖已经从其所来源的生物体除去并且随后再插入生物体中的细胞或微粒。含有再插入细胞的生物体可以是除去细胞的相同生物体，或且可以是不同生物体。
[0081] 干细胞通过包括质膜出芽(以形成膜囊泡和微囊泡)的各种机制并且通过细胞内多泡体(其含有微粒)与细胞膜融合和微粒释放到细胞外隔室中(以分泌外来体和外来体样囊泡)来天然产生微粒。
[0082] 在一实施方案中，产生本发明的微粒的神经干细胞可以是胎儿、胚胎或成人神经干细胞，例如已经描述于US5851832、US6777233、US6468794、US5753506和
WO-A-2005121318中。胎儿组织可以是人类胎儿皮质组织。细胞可以通过诱导性多能干(induced pluripotent stem；iPS)细胞(如已经由Yuan等人(2011)描述)或由体细胞产生的直接诱导性神经干细胞(例如纤维母细胞)的分化而选为神经干细胞(例如最近根据Their等人,2012，通过组成性诱导Sox2、Klf4和c-Myc，同时将Oct4活性严格限制于重新编程的初始阶段)。人类胚胎干细胞可以通过保存供体胚胎的存活力的方法获得，如本领域中所已知的(例如Klimanskaya等人,2006，和Chung等人2008)。获得人类胚胎干细胞的所述非破坏性方法可以用于提供可以获得本发明的微粒的胚胎干细胞。可选地，本发明的微粒可以从成人干细胞、iPS细胞或直接诱导性神经干细胞获得。因此，本发明的微粒可以通过不需要破坏人类胚胎或使用人类胚胎作为基础材料的多种方法来产生。典型地，产生微粒的细胞群体基本上是纯的。如本文中所使用，术语“基本上纯的”是指相对于组成总细胞群体的其它细胞至少约75％、在一些实施方案中至少约85％、在一些实施方案中至少约90％并且在一些实施方案中至少约95％纯的细胞群体。举例来说，相对于干细胞，如神经干细胞群体，这一术语的意思是与组成总细胞群体的其它细胞相比存在至少约75％、在一些实施方案中至少约85％、在一些实施方案中至少约90％并且在一些实施方案中至少约95％纯的干细胞群体。换句话说，术语“基本上纯的”是指在后续培养和扩增之前在原始未扩增和分离的群体中含有少于约25％、在一些实施方案中少于约15％并且在一些实施方案中少于约5％的谱系定型细胞群体的本发明的干细胞群体。
WO-A-2005121318中。胎儿组织可以是人类胎儿皮质组织。细胞可以通过诱导性多能干(induced pluripotent stem；iPS)细胞(如已经由Yuan等人(2011)描述)或由体细胞产生的直接诱导性神经干细胞(例如纤维母细胞)的分化而选为神经干细胞(例如最近根据Their等人,2012，通过组成性诱导Sox2、Klf4和c-Myc，同时将Oct4活性严格限制于重新编程的初始阶段)。人类胚胎干细胞可以通过保存供体胚胎的存活力的方法获得，如本领域中所已知的(例如Klimanskaya等人,2006，和Chung等人2008)。获得人类胚胎干细胞的所述非破坏性方法可以用于提供可以获得本发明的微粒的胚胎干细胞。可选地，本发明的微粒可以从成人干细胞、iPS细胞或直接诱导性神经干细胞获得。因此，本发明的微粒可以通过不需要破坏人类胚胎或使用人类胚胎作为基础材料的多种方法来产生。典型地，产生微粒的细胞群体基本上是纯的。如本文中所使用，术语“基本上纯的”是指相对于组成总细胞群体的其它细胞至少约75％、在一些实施方案中至少约85％、在一些实施方案中至少约90％并且在一些实施方案中至少约95％纯的细胞群体。举例来说，相对于干细胞，如神经干细胞群体，这一术语的意思是与组成总细胞群体的其它细胞相比存在至少约75％、在一些实施方案中至少约85％、在一些实施方案中至少约90％并且在一些实施方案中至少约95％纯的干细胞群体。换句话说，术语“基本上纯的”是指在后续培养和扩增之前在原始未扩增和分离的群体中含有少于约25％、在一些实施方案中少于约15％并且在一些实施方案中少于约5％的谱系定型细胞群体的本发明的干细胞群体。
[0083] 干细胞，如神经干细胞微粒包含至少一种脂质双分子层，其典型地包围包含脂质、蛋白质和核酸的环境。核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。RNA可以是信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)或任何miRNA前体，例如初级miRNA、前体miRNA和/或小核RNA(snRNA)。
[0084] 干细胞，如神经干细胞微粒保留其所来源的干细胞的至少一种生物功能。可以保留的生物功能包括促进血管生成和/或神经发生的能力、实现已患中风的患者脑中的认知改善的能力或加速外周动脉疾病的血流恢复的能力。举例来说，已知CTX0E03细胞在PBMC分析中抑制T细胞活化，并且在一实施方案中本发明的微粒保留在PBMC分析中抑制T细胞活化的这种能力。PBMC分析是本领域技术人员所熟知的并且用于进行该分析的试剂盒是可购得的。
[0085] 实施例8、表2和图6说明CTX0E03干细胞外来体在伤口愈合的“划痕”模型中保留闭合伤口的能力。图6A中的结果示出了在CTX0E03条件培养基中培养的正常人类皮肤纤维母细胞(NHDF)的迁移活性与添加经纯化外来体所观察到的迁移活性几乎相同。因此，本发明的微粒可以保留的一种生物功能是刺激正常人类皮肤纤维母细胞(NHDF)的迁移活性的能力。
[0086] 实施例8还显示本发明的微囊泡能够刺激初级HUVEC的血管生成并且刺激PC-12细胞的轴突长出。因此，本发明的微粒可以保留的生物功能是刺激初级HUVEC的血管生成和/或刺激PC-12细胞的轴突长出的能力。
[0087] 实施例13中的蛋白质组分析指示神经干细胞外来体包含与遗传物质的产生、包装、功能和降解相关的生物功能。因此，在一实施方案中，本发明的外来体保留这些功能，典型地为RNA聚合酶功能、RNA降解功能、核糖体功能和剪接体功能中的一种或多种。
[0088] 微粒具有1000nm或更小的直径。典型地，本发明的微粒将具有200nm或更小、例如100nm或更小的直径。如表1中所示，微囊泡具有100nm到1000nm的直径。外来体典型地被定义为具有30-100nm的直径，但更多最新研究证实外来体也可以具有介于100nm和200nm之间的直径(例如Katsuda等人,Proteomics 2013和Katsuda等人,Scientific Reports
2013)。因此，外来体具有介于30nm和150nm之间的直径。膜颗粒具有50nm到80nm的直径且外来体样粒子具有20nm-50nm的直径。直径可以通过任何合适的技术来测定，例如电子显微镜术或动态光散射。术语“微粒”包括(但不限于)：膜颗粒、膜囊泡、微囊泡、外来体样囊泡、外来体、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。
2013)。因此，外来体具有介于30nm和150nm之间的直径。膜颗粒具有50nm到80nm的直径且外来体样粒子具有20nm-50nm的直径。直径可以通过任何合适的技术来测定，例如电子显微镜术或动态光散射。术语“微粒”包括(但不限于)：膜颗粒、膜囊泡、微囊泡、外来体样囊泡、外来体、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。
[0089] 图1图A-E示出了神经干细胞中存在含有直径介于30-50nm之间的外来体的MVB，而图F示出了直径>100nm的微囊泡。表20和图17(下文)示出了量测到典型神经干细胞外来体具有约70nm到约150nm的直径范围，其与本领域中所述的外来体(来自间质干细胞)的尺寸一致。因此，本发明的外来体典型地具有介于30nm和200nm之间、更典型地介于50nm和150nm之间的直径。如上文所述，外来体对于Alix标记物(UNIPROT登记No.Q8WUM4)典型地呈阳性。
[0090] 图1F和表20示出了所观察到的典型神经干细胞微囊泡的尺寸，其中众数直径为约150nm-200nm，或中值直径为约180nm-350nm。因此，本发明的微囊泡典型地具有介于100和1000nm之间、更典型地介于150nm和350nm之间的直径。
[0091] 本发明的一些微粒表达CD133表面标记物。本发明的其它微粒并不表达CD133表面标记物。
[0093] 外来体是直径典型地为30-100nm且直径有时介于100nm和200nm之间的内体源性脂质微粒，其通过胞吐作用由细胞释放。组成性或在诱导时以经过调控和功能上相关的方式进行外来体释放。在其生物发生期间，外来体合并各种胞质蛋白质(包括伴侣蛋白、整合素、细胞骨架蛋白质和四跨膜蛋白)和遗传物质。因此，认为外来体是在母细胞微环境中和在相当大的距离内用于细胞之间蛋白质、脂质和遗传物质的传递的细胞间连通装置。尽管本发明不受这一理论束缚，但外来体可以负责神经干细胞的功效。因此，预期来自神经干细胞的外来体自身在治疗上是有效的。
[0094] 设计成具有所需功能的微粒
[0095] 微粒保留产生其的干细胞的至少一些功能。因此，可以通过操作干细胞(其可以是任何干细胞类型并且不限于神经干细胞，但作为实施方案特意包括本发明的神经干细胞微粒)而将微粒设计成具有一种或多种所需功能，典型地为蛋白质或miRNA。该操作将典型地为遗传工程改造，以将一种或多种外源性编码、非编码或调控核酸序列引入干细胞中。举例来说，如果需要含有VEGF和/或bFGF的外来体，那么产生外来体的干细胞可以经过转化或转染以表达(高水平的)VEGF和/或bFGF，其随后将并入那个干细胞所产生的微粒中。类似地，iPS细胞可用于产生微粒，且这些细胞可以被设计成产生由iPS细胞所产生的微粒中需要的蛋白质和核酸(例如miRNA)。因此，本发明提供了来自任何干细胞类型的特别微粒，其含有并不天然存在于产生其的干细胞中的功能，即这些微粒(例如外来体)含有一种或多种外源性蛋白质或核酸序列，不是天然存在而是经过工程改造的。条件永生化细胞的使用便利地提供了这些所设计的微粒的持续产生。
[0096] 在一实施方案中，分离或纯化的微粒载有一种或多种打算在靶细胞中执行所需功能的外源性核酸、脂质、蛋白质、药物或前药。这并不需要操作干细胞且外源性物质可以任选地直接添加到微粒中。举例来说，可以通过电穿孔将外源性核酸引入微粒中。然后可以使用微粒作为用于外源性物质的媒剂或载体。在一实施方案中，已经从产生其的细胞分离的微粒载有外源性siRNA，典型地通过电穿孔，以产生可以用于使一种或多种病理学基因沉默的微粒。以这种方式，微粒可以用作媒剂将一种或多种试剂(典型地为治疗或诊断试剂)传递到靶细胞。这种微粒的一个实例是包含能够使一种或多种病理学基因沉默的外源性siRNA的神经干细胞外来体。
[0097] 微粒标记物
[0098] 本发明提供一种分离的神经干细胞微粒群体，其中该群体基本上仅包含本发明的微粒，即微粒群体是纯的。在许多方面，微粒群体包含至少约80％(在其它方面至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)的本发明的微粒。
[0099] 本发明的分离的神经干细胞微粒的特征在于其对于某些标记物具有独特表达谱并且不同于来自其它细胞类型的微粒。当本文中描述标记物时，可以使用其存在或不存在来区分微粒。举例来说，术语“可能包含”或“可能表达”也公开不存在那种标记物的相反实施方案，例如短语“微粒可能包含一种或多种四跨膜蛋白，典型地为CD63、CD81、CD9、CD53、CD82和/或CD37”也描述微粒可能不包含一种或多种四跨膜蛋白，典型地为CD63、CD81、CD9、CD53、CD82和/或CD37的相反实施方案。
[0100] 如果群体微粒的至少约70％、例如膜颗粒、膜囊泡、微囊泡、外来体样囊泡、外来体、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡的70％显示可检测的标记物水平，那么典型地认为本发明的干细胞，如神经干细胞微粒带有标记物。在其它方面，群体的至少约80％、至少约90％或至少约95％或至少约97％或至少约98％或更多显示可检测的标记物水平。在某些方面，群体的至少约99％或100％显示可检测的标记物水平。标记物的量化可以通过使用定量RT-PCR(qRT-PCR)或通过荧光活化细胞分选(FACS)来检测。应了解仅举例提供这一列表，且不打算有所限制。典型地，如果群体微粒的至少约90％显示如通过FACS所检测的可检测的标记物水平，那么认为本发明的神经干细胞微粒带有标记物。如果本文中所述的标记物通过qRT-PCR所测量的表达水平具有低于或等于35(qRT-PCR阵列上的标准截断)的交叉点(Cp)值，那么认为其是通过本发明的细胞群体来表达的。Cp表示扩增曲线与检测阈值交叉的点，并且也可以报导为交叉阈值(ct)。
[0101] 在一实施方案中，本发明涉及由神经干细胞群体产生的微粒，其特征在于群体细胞表达标记物Nestin、Sox2、GFAP、βIII微管蛋白、DCX、GALC、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种。在另一实施方案中，微粒是外来体且外来体群体表达DCX(双皮质素抗体，一种早期神经元标记物)、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白，一种星形细胞标记物)、GALC、TUBB3、GDNF和IDO。
[0102] 本发明的神经干细胞微粒可以低于或高于相同物种的间质干细胞微粒中的那种标记物的表达水平的水平表达一种或多种蛋白质标记物。本文和下文鉴别由CTX0E03细胞微粒表达的蛋白质标记物。在一些实施方案中，微粒可以相对于α微管蛋白或其它所述对照蛋白质的水平表达蛋白质标记物。在一些实施方案中，本发明的微粒可以相对于对照蛋白质至少+/-1.2倍数变化、典型地相对于对照蛋白质至少+/-1.5倍数变化、相对于对照蛋白质至少+/-2倍数变化或相对于对照蛋白质至少+/-3倍数变化的水平表达那种蛋白质。-2
在一些实施方案中，微粒可以相对于α微管蛋白或其它对照蛋白质介于每个细胞10 和-6
10 个拷贝之间的水平表达蛋白质标记物。在一些实施方案中，本发明的微粒可以相对于-2 -3
α微管蛋白或其它对照蛋白质介于每个细胞10 和10 个拷贝之间的水平表达那种蛋白质。
在一些实施方案中，微粒可以相对于α微管蛋白或其它对照蛋白质介于每个细胞10 和-6
10 个拷贝之间的水平表达蛋白质标记物。在一些实施方案中，本发明的微粒可以相对于-2 -3
α微管蛋白或其它对照蛋白质介于每个细胞10 和10 个拷贝之间的水平表达那种蛋白质。
[0103] 本发明的神经干细胞微粒可以低于或高于相同物种的间质干细胞微粒中的那种miRNA(包括miRNA前体)的表达水平的水平表达一种或多种miRNA(包括miRNA前体)。本文和下文鉴别由CTX0E03细胞微粒表达的miRNA标记物。在一些实施方案中，本发明的微粒可以相对于U6B或15a或任何其它miRNA参考基因(也被称为内部对照基因)最小+/-1.5倍数变化、典型地至少+/-2倍数变化或至少+/-3倍数变化(根据ΔΔct方法计算，该方法众所周知)的水平表达标记物miRNA。
[0104] 本发明的神经干细胞微粒可以低于或高于相同物种的间质干细胞微粒中的那种mRNA的表达水平的水平表达一种或多种mRNA。在一些实施方案中，本发明的微粒可以相对于ATP5B或YWHAZ或任何其它mRNA参考基因(也被称为内部对照基因)最小+/-1.5倍数变化、典型地至少+/-2倍数变化或至少+/-3倍数变化(根据ΔΔct方法计算)的水平表达标记物mRNA。
[0105] 本发明的外来体典型地表达其表面上的特定整合素、四跨膜蛋白、I型和/或II型MHC抗原、CD抗原和细胞粘着分子，这可有助于其被特定细胞类型摄取。外来体含有各种细胞骨架蛋白质、GTP酶、网格蛋白、伴侣蛋白和代谢酶(但不包括线粒体、溶酶体和ER蛋白质，所以总概况并不类似于细胞质)。其还含有mRNA剪接和翻译因子。最后，外来体一般含有已知起信号传导作为而并不是通过典型(ER-高尔基体(Golgi))机制分泌的若干种蛋白质，例如HSP70、HSP90和膜联蛋白。
[0106] 外来体的脂质双层典型地富含胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺。外来体也表达一种或多种四跨膜蛋白标记物蛋白质。四跨膜蛋白包括CD81、CD63、CD9、CD53、CD82和CD37。外来体也可以包括生长因子、细胞因子和RNA，尤其是miRNA。外来体典型地表达标记物TSG101、Alix、CD109、thy-1和CD133中的一种或多种。Alix(Uniprot登记No.Q8WUM4)、TSG101(Uniprot登记No.Q99816)和四跨膜蛋白CD81(Uniprot登 记No.P60033)和
CD9(Uniprot登记No.P21926)是特征性外来体标记物。
CD9(Uniprot登记No.P21926)是特征性外来体标记物。
[0107] Alix是内体通道标记物。外来体来源于内体且因此对于这种标记物呈阳性的微粒被表征为外来体。本发明的外来体典型地对于Alix呈阳性。本发明的微囊泡典型地对于Alix呈阴性。
[0108] 微粒蛋白质组
[0109] 表18和20列出分别从在Integra Cellline多隔室生物反应器中培养两周的CTX0E03细胞分离的外来体和微囊泡中通过质谱分析法所检测的所有蛋白质。在一实施方案中，本发明的外来体包含至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或至少
99.5％表18中所列的蛋白质。类似地，本发明的微囊泡典型地包含至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％表20中所列的蛋白质。在另一实施方案中，本发明的微囊泡或外来体的蛋白质组与提供于表18(外来体)或表20(微囊泡)中所提供的蛋白质组最少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％一致。当测定微粒或外来体的蛋白质含量时，使用质谱分析法，例如实施例13中所述的LC/MS/MS方法。
99.5％表18中所列的蛋白质。类似地，本发明的微囊泡典型地包含至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％表20中所列的蛋白质。在另一实施方案中，本发明的微囊泡或外来体的蛋白质组与提供于表18(外来体)或表20(微囊泡)中所提供的蛋白质组最少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％一致。当测定微粒或外来体的蛋白质含量时，使用质谱分析法，例如实施例13中所述的LC/MS/MS方法。
[0110] 表19和21示出了分别从在Integra Celline多隔室生物反应器中培养两周的CTX0E03细胞分离的外来体和微囊泡中通过质谱分析法所检测的100种最丰富蛋白质。典型地，本发明的外来体包含表19中所列的前十种蛋白质，更典型地为表19中所列的前20种、前30种、前40种或前50种蛋白质。类似地，本发明的微粒典型地包含表21中所列的前十种蛋白质，更典型地为表21中所列的前20种、前30种、前40种或前50种蛋白质。在一实施方案中，本发明的外来体包含表19中所列的所有100种蛋白质。在一实施方案中，本发明的微囊泡包含表21中所列的所有100种蛋白质。典型地，本发明的外来体或微囊泡中的100种最丰富蛋白质含有表19(外来体)或表21(微粒)中所鉴别的蛋白质中的至少70种。更典型地，本发明的外来体或微囊泡中的100种最丰富蛋白质含有表19(外来体)或表21(微粒)中所鉴别的蛋白质中的至少80、至少90、至少95、96、97、98或99种或全部
100种。
100种。
[0111] 微粒miRNA含量
[0112] 实施例12(和相关图11)显示CTX0E03细胞、由这些细胞产生的微囊泡和外来体中存在的miRNA的深度测序结果。这一实施例显示，令人惊讶地，微粒中存在的不同miRNA种类数目与细胞中存在的不同miRNA种类数目相比大大减少；微粒含有少于120种不同miRNA，而细胞含有介于450和700个之间的miRNA种类。微粒含有大多数hsa-miR-1246。
[0113] 实施例12中的数据还显示微粒的特征为四个主要miRNA种类，即hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532。这四种miRNA是微粒中仅以大于1000的读取计数存在的miRNA；这四种miRNA与微粒中的其它miRNA相比以巨大过量存在。这和含有较大量以高(读取计数大于1000)或极高(读取计数大于10,000)水平存在的miRNA的细胞中的概况相反。尽管不受理论束缚，但发明者建议将hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532选择性地运输(或另外合并)到微粒中且认为其在微粒的功能中起作用。
[0114] 典型地，在一实施方案中，本发明的微粒(例如外来体)含有hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、两种、三种或全部四种。这些miRNA标记物中的每一种典型地以每个微粒至少1000的读取计数(任选地使用实施例12中所述的深度序列技术测定)存在。hsa-miR-1246可以任选地具有每个微粒至少2000、5000、10,000、20,000或25,000的读取计数。Hsa-miR-4492可以任选地具有每个微粒至少
2000、3000、4000或5000的读取计数。Hsa-miR-4532可以任选地具有每个微粒至少2000或3000的读取计数。
2000、3000、4000或5000的读取计数。Hsa-miR-4532可以任选地具有每个微粒至少2000或3000的读取计数。
[0115] 在 一 实 施 方 案 中，hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 / 或hsa-miR-4532中的每一种以高于产生微粒的细胞中存在的读取计数存在于微粒(例如外来体)中。具体来说，miR-1246在微粒中的读取计数是在细胞中的读取计数的至少两倍，更典型地是在细胞中的读取计数的至少4、5、6、7或8倍，并且任选地是在细胞中的读取计数的10、15或20倍。
[0116] 在一实施方案中，本发明的微粒含有读取计数低于产生微粒的细胞中存在的hsa-let-7a-5p、has-miR-92b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-100-5p和/或hsa-99b-5p。典型地，这些miRNA中的每一种在本发明的微粒中具有小于1000的读取计数，更典型地小于100，例如小于50。任选地，本发明的微粒含有读取计数小于50或小于25的hsa-let-7a-5p。
[0117] 在一实施方案中，当通过深度测序分析时，本发明的微粒含有少于150种类型的miRNA(即不同miRNA种类)，典型地少于120种类型的miRNA。
[0118] 在一实施方案中，hsa-miR-1246是本发明的微粒中最丰富的miRNA(任选地使用实施例12中所述的深度序列技术测定)。典型地，本发明的微粒中(例如微囊泡和外来体)miRNA的总计数的至少40％是hsa-miR-1246。典型地，本发明的外来体中miRNA的总计数的至少50％是hsa-miR-1246。
[0119] hsa-miR-4492典型地是本发明的微粒中第二最丰富的miRNA。典型地，本发明的微粒中(例如微囊泡和外来体)miRNA的总计数的至少3％是hsa-miR-4492。更典型地，本发明的微粒中(例如微囊泡和外来体)miRNA的总计数的至少4％是hsa-miR-4492。
[0120] 典型地，本发明的微粒中(例如微囊泡和外来体)miRNA的总计数的至少2％是hsa-miR-4532。
[0121] 典型地，本发明的微粒中(例如微囊泡和外来体)miRNA的总计数的至少1％是hsa-miR-4488。
[0122] 在一实施方案中，本发明的微粒含有粒子的总miRNA含量的至少0.1％的水平的hsa-miR-4508、hsa-miR-4516中的一种或两种。
[0123] hsa-miR-3676-5p、hsa-miR-4485、hsa-miR-4497、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-3195、hsa-miR-3648、hsa-miR-663b、hsa-miR-3656、hsa-miR-3687、hsa-miR-4466、hsa-miR-4792、hsa-miR-99b-5p和hsa-miR-1973中的一种或多种可以存在于本发明的微粒中。
[0124] 典型地，hsa-let-7a-5p和hsa-100-5p中的每一种是以小于本发明的微粒中的总miRNA的1％、更典型地小于1％或小于0.05％存在。
[0125] 在本发明的典型外来体中，miRNA的总计数的至少50％是hsa-miR-1246，且小于总miRNA计数的0.1％是hsa-let-7a-5p。
[0126] 在一实施方案中，本发明的微粒中miRNA的总计数的至少90％包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532。典型地，本发明的微粒中miRNA的总计数的至少95％或96％包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532。小于这些微粒中的总miRNA含量的10％是不为hsa-miR-1246、
hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532的miRNA。
hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532的miRNA。
[0127] 提供上文所论述的miRNA实施方案的组合。举例来说，本发明的微粒典型地含有读取计数为至少1000的hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488and hsa-miR-4532中的每一种并且含有读取计数小于100的hsa-let-7a-5p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-100-5p和hsa-99b-5p中的每一种。典型地，本发明的微粒中总miRNA的至少90％或至少95％是hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532。
[0128] 本发明的微粒(例如微囊泡或外来体)典型地具有作为最丰富的miRNA的hsa-miR-1246和作为第二最丰富的miRNA的hsa-miR-4492。在这一实施方案中，本发明的微粒(例如微囊泡和外来体)中miRNA的总计数的至少40％是hsa-miR-1246且微粒
中miRNA的总计数的至少3％是hsa-miR-4492。这些微粒中miRNA的总计数的至少2％是hsa-miR-4532且这些微粒中miRNA的总计数的至少1％是hsa-miR-4488。hsa-let-7a-5p和hsa-100-5p中的每一种以小于这些微粒中的总miRNA计数的0.1％存在。
中miRNA的总计数的至少3％是hsa-miR-4492。这些微粒中miRNA的总计数的至少2％是hsa-miR-4532且这些微粒中miRNA的总计数的至少1％是hsa-miR-4488。hsa-let-7a-5p和hsa-100-5p中的每一种以小于这些微粒中的总miRNA计数的0.1％存在。
[0129] 将深度测序结果和与细胞相比的相对倍数变化进行绘图证实了hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532在外来体和微囊泡中与细胞相比显著上调。这一比较也显示miRNA hsa-miR-3195是外来体和微囊泡中皆得到最大程度上调的miRNA。
尽管对于外来体和微囊泡来说hsa-miR-3195的绝对读数在约40范围内，但细胞中检测不到hsa-miR-3195。因此，hsa-miR-3195是唯一存在于本发明的外来体和微囊泡中，且在一实施方案中，本发明的外来体或微囊泡包含hsa-miR-3195。
尽管对于外来体和微囊泡来说hsa-miR-3195的绝对读数在约40范围内，但细胞中检测不到hsa-miR-3195。因此，hsa-miR-3195是唯一存在于本发明的外来体和微囊泡中，且在一实施方案中，本发明的外来体或微囊泡包含hsa-miR-3195。
[0130] 在一实施方案中，本发明的微粒包含以下miRNA前体中的一种或多种：
[0131] AC079949.1(SEQ ID NO：738)
[0132] GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG；
[0133] AP000318.1(SEQ ID NO：739)
[0134] CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG；
[0135] AL161626.1(SEQ ID NO：740)
[0136] CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC；
[0137] AC004943.1(SEQ ID NO：741)
[0138] GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCG
[0139] GCTC；和
[0140] AL121897.1(SEQ ID NO：742)
[0141] GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGC CGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAG
[0142] GGGCCGGGCGCC
[0143] 在一实施方案中，本发明的微粒包含以下来源于上文所列的前体的成熟miRNA(如实施例12的D部分中所述)中的一种、两种或三种：
[0144] ggcggagugcccuucuuccugg(来源于AL161626.1-201)(SEQ ID NO：743)
[0145] ggagggcccaaguccuucugau(来源于AP000318.1-201)(SEQ ID NO：744)
[0146] gaccaggguccggugcggagug(来源于AC079949.1-201)(SEQ ID NO：745)
[0147] 这5种miRNA前体和3种成熟miRNA先前尚未分离且因此还提供每一序列作为自身新序列。因此，在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含miRNA前体AC079949.1、AP000318.1、AL161626.1、AC004943.1和AL121897.1中的一种或多种。在另一实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含成熟miRNA ggcggagugcccuucuuccugg(来源 于 AL 161626.1-201)、ggagggcccaaguccuucugau( 来 源 于 AP000318.1-201) 和gaccaggguccggugcggagug(来源于AC079949.1-201)中的一种或多种。任选地，该组合物是包含一种或多种miRNA前体和/或一种或多种成熟miRNA和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物。如实施例12中所示，这些miRNA和前体似乎选择性地穿梭到外来体和微囊泡中，且因此可以至少部分负责微粒的功能。
[0148] 实施例12还显示神经干细胞微粒包含多种非编码RNA种类。在一实施方案中，本发明的微粒包含核糖体RNA、小核仁RNA、小核RNA、微小RNA、大的基因间非编码RNA和其它RNA(例如RMRP、穹窿体RNA、后生动物SRP和/或RNY)。
[0149] 实施例4显示由CTX0E03细胞产生的微粒中存在并且具有如通过qRT-PCR阵列所测定低于35的Cp的miRNA。典型地，在一实施方案中，本发明的微粒含有以下miRNA中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60种或更多或全部(根据Ambros等人通过名称鉴别并且可在www.mirbase.org上得到)：
[0150]hsa-let-7a
hsa-let-7b
hsa-let-7c
hsa-let-7d
hsa-let-7e
hsa-let-7f
hsa-let-7g
hsa-let-7i
hsa-miR-100
hsa-miR-101
hsa-miR-103a
hsa-miR-106b
hsa-miR-10a
hsa-miR-10b
hsa-miR-124
hsa-miR-125a-5p
hsa-miR-125b
hsa-let-7b
hsa-let-7c
hsa-let-7d
hsa-let-7e
hsa-let-7f
hsa-let-7g
hsa-let-7i
hsa-miR-100
hsa-miR-101
hsa-miR-103a
hsa-miR-106b
hsa-miR-10a
hsa-miR-10b
hsa-miR-124
hsa-miR-125a-5p
hsa-miR-125b
[0151]hsa-miR-126
hsa-miR-127-5p
hsa-miR-128
hsa-miR-129-5p
hsa-miR-130a
hsa-miR-132
hsa-miR-134
hsa-miR-137
hsa-miR-141
hsa-miR-146b-5p
hsa-miR-150
hsa-miR-155
hsa-miR-15a
hsa-miR-15b
hsa-miR-16
hsa-miR-17
hsa-miR-181a
hsa-miR-182
hsa-miR-183
hsa-miR-185
hsa-miR-18a
hsa-miR-18b
hsa-miR-192
hsa-miR-194
hsa-miR-195
hsa-miR-196a
hsa-miR-205
hsa-miR-20a
hsa-miR-20b
hsa-miR-21
hsa-miR-210
hsa-miR-214
hsa-miR-218
hsa-miR-219-5p
hsa-miR-22
hsa-miR-222
hsa-miR-23b
hsa-miR-24
hsa-miR-26a
hsa-miR-301a
hsa-miR-302a
hsa-miR-127-5p
hsa-miR-128
hsa-miR-129-5p
hsa-miR-130a
hsa-miR-132
hsa-miR-134
hsa-miR-137
hsa-miR-141
hsa-miR-146b-5p
hsa-miR-150
hsa-miR-155
hsa-miR-15a
hsa-miR-15b
hsa-miR-16
hsa-miR-17
hsa-miR-181a
hsa-miR-182
hsa-miR-183
hsa-miR-185
hsa-miR-18a
hsa-miR-18b
hsa-miR-192
hsa-miR-194
hsa-miR-195
hsa-miR-196a
hsa-miR-205
hsa-miR-20a
hsa-miR-20b
hsa-miR-21
hsa-miR-210
hsa-miR-214
hsa-miR-218
hsa-miR-219-5p
hsa-miR-22
hsa-miR-222
hsa-miR-23b
hsa-miR-24
hsa-miR-26a
hsa-miR-301a
hsa-miR-302a
[0152]hsa-miR-302c
hsa-miR-33a
hsa-miR-345
hsa-miR-375
hsa-miR-378
hsa-miR-424
hsa-miR-7
hsa-miR-9
hsa-miR-92a
hsa-miR-93
hsa-miR-96
hsa-miR-99a
hsa-miR-33a
hsa-miR-345
hsa-miR-375
hsa-miR-378
hsa-miR-424
hsa-miR-7
hsa-miR-9
hsa-miR-92a
hsa-miR-93
hsa-miR-96
hsa-miR-99a
[0153] 在一实施方案中，CTX0E03微粒含有以下miRNA(其选自以上列表)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30种或更多：
[0154]hsa-let-7g
hsa-miR-101
hsa-miR-10a
hsa-miR-10b
hsa-miR-126
hsa-miR-128
hsa-miR-129-5p
hsa-miR-130a
hsa-miR-134
hsa-miR-137
hsa-miR-155
hsa-miR-15a
hsa-miR-15b
hsa-miR-16
hsa-miR-17
hsa-miR-182
hsa-miR-183
hsa-miR-185
hsa-miR-18b
hsa-miR-192
hsa-miR-194
hsa-miR-195
hsa-miR-20a
hsa-miR-20b
hsa-miR-210
hsa-miR-218
hsa-miR-301a
hsa-miR-302a
hsa-miR-302c
hsa-miR-345
hsa-miR-375
hsa-miR-378
hsa-miR-7
hsa-miR-9
hsa-miR-93
hsa-miR-96
hsa-miR-99a
hsa-miR-101
hsa-miR-10a
hsa-miR-10b
hsa-miR-126
hsa-miR-128
hsa-miR-129-5p
hsa-miR-130a
hsa-miR-134
hsa-miR-137
hsa-miR-155
hsa-miR-15a
hsa-miR-15b
hsa-miR-16
hsa-miR-17
hsa-miR-182
hsa-miR-183
hsa-miR-185
hsa-miR-18b
hsa-miR-192
hsa-miR-194
hsa-miR-195
hsa-miR-20a
hsa-miR-20b
hsa-miR-210
hsa-miR-218
hsa-miR-301a
hsa-miR-302a
hsa-miR-302c
hsa-miR-345
hsa-miR-375
hsa-miR-378
hsa-miR-7
hsa-miR-9
hsa-miR-93
hsa-miR-96
hsa-miR-99a
[0155] 通过斑点印迹(dot-blot)检测的蛋白质
[0156] 实施例5显示如通过斑点印迹所检测的由CTX0E03细胞产生的微粒中存在的蛋白质。典型地，本发明的微粒含有以下蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或全部：
[0157]EDA-A2
半乳糖凝集素-3
IGFBP-2
IGFBP-rp1/IGFBP-7
IL-1a
LECT2
MCP-1
SPARC
TIMP-1
凝血栓蛋白-1
VEGF
半乳糖凝集素-3
IGFBP-2
IGFBP-rp1/IGFBP-7
IL-1a
LECT2
MCP-1
SPARC
TIMP-1
凝血栓蛋白-1
VEGF
[0158] 在实施例13中半乳糖凝集素-3和凝血栓蛋白-1也被鉴别为存在于外来体和微囊泡中。在实施例13中TIMP-1被鉴别为存在于外来体中。
[0159] 实施例5还显示由CTX0E03细胞产生的微粒也可以表达以下蛋白质中的1、2、3、4或5种：
[0160]EGF-R/ErbB1
MDC
内皮抑素
卵泡抑素
Csk
MDC
内皮抑素
卵泡抑素
Csk
[0161] 在实施例13中EGF-R和Csk也被鉴别为存在于外来体和微囊泡中。
[0162] 已知半乳糖凝集素-3、SPARC、TIMP-1、凝血栓蛋白-1、VEGF、MDC和内皮抑素到调节血管生成。因此，含有这些蛋白质中的一种或多种的微粒适用于需要调节血管生成的治疗疾病或病症。
[0163] 已知IL-1a、LECT2、MCP-1和Csk调节炎症。因此，含有这些蛋白质中的一种或多种的微粒适用于治疗需要调节炎症的疾病或病症。
[0164] 含有(i)半乳糖凝集素-3、SPARC、TIMP-1、凝血栓蛋白-1、VEGF、MDC和内皮抑素中的一种或多种和(ii)IL-1a、LECT2、MCP-1和Csk中的一种或多种的微粒可以适用于治疗需要调节血管生成和炎症的疾病或病症。
[0165] 多隔室生物反应器培养中的神经干细胞
[0166] 如以下实施例10和图9中所示，在多隔室生物反应器中培养三周后，神经干细胞以比根据标准程序在标准单隔室T175烧瓶中培养的神经干细胞显著高的水平表达许多标记物。在一实施方案中，从已经典型地在多隔室生物反应器中培养至少两周、典型地至少三周、至少四周、至少五周或至少六周的NSC分离本发明的微粒。任选地，NSC已经培养不超过十周，例如介于2周和10周之间、介于3周和10周之间、介于4周和10周之间、介于5周和10周或介于6周和10周之间。微粒也可以分离自本发明所述的其他类型的细胞，包括在生物反应器内培养上述时间段的间充质干细胞和造血干细胞。
[0167] 在多隔室生物反应器中培养三周的CTX0E03神经干细胞以高于在标准单隔室T175细胞培养中培养的神经干细胞的水平表达DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF和IDO。因此，已经在多隔室生物反应器中培养典型地一周或一周以上、十天或十天以上、两周或两周以上或至少三周、四周、五周或五周以上的神经干细胞可以表达DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种。与在标准条件下培养的干细胞相比，在双隔室生物反应器中培养的细胞显示增加的DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种的表达。这些标记物在多隔室生物反应器培养细胞中的表达水平典型地显著高于在标准单隔室T175培养烧瓶中培养的细胞中的表达水平。典型地，在多隔室生物反应器中培养的干细胞以最少是在T-175烧瓶中根据标准培养程序培养的CTX0E03细胞中的2倍的水平表达DCX1、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF或IDO中的一种或多种。在一实施方案中，与在标准条件下培养的干细胞相比，微粒(典型地为外来体)是从显示增加的DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种的表达的神经干细胞获得。举例来说，微粒可以从由Integra CeLLine生物反应器培养的神经干细胞收集的新鲜过滤的条件培养基获得。
[0168] 经上调的标记物包括DCX(双皮质素抗体，一种早期神经元标记物)、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白，一种星形细胞标记物)、GALC、TUBB3、GDNF和IDO。CTX0E03细胞能够分化成3种不同细胞类型：神经元、星形细胞和少突胶质细胞。在多隔室生物反应器中三周后DCX和GFAP的高水平表明所培养的干细胞已经部分分化并且已经进入神经元(DCX+细胞)和/或星形细胞(GFAP+细胞)谱系。因此，在一实施方案中，本发明提供了一种由神经干细胞群体产生的微粒，该神经干细胞群体表达(i)一种或多种与神经元谱系相关的标记物(典型地为DCX)和/或(ii)一种或多种与星形细胞谱系相关的标记物(典型地为GFAP)。在另一实施方案中，本发明提供了神经干细胞微粒，典型地为外来体，其表达(i)一种或多种与神经元谱系相关的标记物(典型地为DCX)和/或(ii)一种或多种与星形细胞谱系相关的标记物(典型地为GFAP)。这些细胞或来源于这些细胞的微粒(典型地为外来体)以高于标准(T-175)培养的相应干细胞的水平表达DCX和/或GFAP。典型地，这些细胞或微粒以是干细胞的至少2倍、更典型地是标准培养中的相应干细胞的至少2.5倍、是标准培养中的相应干细胞的至少5倍、是标准培养中的相应干细胞的至少7.5倍或是标准培养中的相应干细胞的至少10倍的水平表达DCX和/或GFAP。对于DCX的表达，与标准(T-175)培养中的相应干细胞相比细胞或微粒中的倍数变化可以任选地是标准干细胞的至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。
[0169] 术语“生物反应器”将被赋予其本领域中常见的含义，即用于进行生物过程的仪器。本文中所述的生物反应器适合用于细胞，如干细胞培养。用于细胞培养的简单生物反应TM 2器是单隔室烧瓶，例如常用的T-175烧瓶(例如BD Falcon 175cm细胞培养烧瓶，750ml，组织培养处理的聚苯乙烯，直颈，蓝色塞子密封螺帽，BD产品码353028)。如本领域中所已知的，生物反应器可以具有多个隔室。这些多隔室生物反应器典型地含有被一个或多个膜或隔层分隔的至少两个隔室，这些膜或隔层将含有细胞的隔室与一个或多个含有气体和/或培养基的隔室分隔开。多隔室生物反应器在本领域中是众所周知的。多隔室生物反应器的一个实例是Integra CeLLine生物反应器，其含有借助于10kDa半透膜分隔的培养基隔室和细胞隔室；这种膜允许营养物连续扩散到细胞隔室中并同时除去任何抑制性废产物。隔室的个别可接近性允许供应细胞新鲜培养基而不会机械地干扰培养。硅酮膜形成细胞隔室底座并且通过向细胞隔室提供短的扩散通道来提供最佳氧气供应和二氧化碳水平控制。根据本发明可以使用任何多隔室生物反应器。
[0170] 实施例11、表3和图10示出了由已经在多隔室生物反应器中培养三周的神经干细胞产生的外来体的miRNA含量不同于在标准T-175烧瓶中培养的干细胞的miRNA含量和由在单隔室T175培养烧瓶中培养三周的神经干细胞产生的微粒。在一实施方案中，如通过倍数调节所计算，本发明提供了一种微粒、典型地为外来体，其中至少两、三、四、五、六或七种miRNA与在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞相比被上调或下调(参见实施例11)。每一种miRNA的倍数调节任选地是向上或向下至少两倍。
[0171] 从图6C和实施例8可见，当NSC已经培养几周时，从NSC分离的外来体显示尤其惊讶的功效。因此，在一实施方案中，从已经典型地在多隔室生物反应器中培养至少两周、典型地至少三周、至少四周、至少五周或至少六周的NSC分离本发明的外来体。任选地，NSC已经培养至多十周，例如介于2周和10周之间、介于3周和10周之间、介于4周和10周之间、介于5周和10周或介于6周和10周之间。
[0172] 在一实施方案中，如通过倍数调节所计算，本发明的神经干细胞外来体以高于在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中所表达的水平表达以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种(其中星号指示优选至少两倍调节增加的miRNA)：
[0173]hsa-miR-146b-5p＊
hsa-let-7c＊
hsa-miR-99a＊
hsa-miR-132＊
hsa-miR-378＊
hsa-miR-181a＊
hsa-let-7b＊
hsa-let-7c＊
hsa-miR-99a＊
hsa-miR-132＊
hsa-miR-378＊
hsa-miR-181a＊
hsa-let-7b＊
[0174] 在一实施方案中，如通过倍数调节所计算，本发明的神经干细胞外来体以高于在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中所表达的水平表达以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种(其中星号指示优选至少两倍调节减少的miRNA)：
[0175]hsa-miR-7＊
hsa-miR-106b＊
hsa-miR-101＊
hsa-miR-302a＊
hsa-miR-301a＊
＊
hsa-miR-183
hsa-miR-219-5p＊
hsa-miR-18a＊
hsa-miR-15a＊
hsa-miR-182＊
hsa-miR-33a＊
hsa-miR-96＊
hsa-miR-18b＊
hsa-miR-106b＊
hsa-miR-101＊
hsa-miR-302a＊
hsa-miR-301a＊
＊
hsa-miR-183
hsa-miR-219-5p＊
hsa-miR-18a＊
hsa-miR-15a＊
hsa-miR-182＊
hsa-miR-33a＊
hsa-miR-96＊
hsa-miR-18b＊
[0176] 在另一实施方案中，本发明的NSC外来体包含(i)增加水平的miRNA中的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种，上文指示其在外来体中与标准培养中的相应细胞相比得到增加和(ii)减少水平的miRNA中的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种，上文指示其在外来体中与标准培养中的相应细胞相比得到减少。举例来说，神经干细胞外来体可以含有三种或更多种miRNA的倍数调节增加，上文指示其在外来体中与标准培养中的相应细胞相比得到增加和三种或更多种miRNA的倍数调节减少，上文指示其在外来体中与标准培养中的相应细胞相比得到减少。在另一个示例性实施方案中，神经干细胞外来体可以含有五种或更多种miRNA的倍数调节增加，上文指示其在外来体中与标准培养中的相应细胞相比得到增加和五种或更多种miRNA的倍数调节减少，上文指示其在外来体中与标准培养中的相应细胞相比得到减少。
[0177] 术语“表达(expressed)”是用于描述细胞或微粒内的标记物的存在。为了视为表达，标记物必须以可检测水平存在。“可检测水平”意指可以使用一种标准实验室方法(例如qRT-PCR或qPCR、印迹法、质谱分析法或FACS分析)来检测的标记物。如果可以在低于或等于35的交叉点(cp)值处适当地检测到表达，那么认为基因由本发明的群体的细胞或微粒表达。术语“表达(express/expression)”具有相应含义。在低于这一cp值的表达水平下，认为标记物不表达。本发明的干细胞或微粒中标记物的表达水平和另一细胞或微粒(例如间质干细胞)中相同标记物的表达水平之间的比较可以优选地通过比较已经从相同物种分离的两种细胞/微粒类型来进行。这一物种优选地是哺乳动物，且这一物种更优选地是人类。所述比较可以使用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)实验来方便地进行。
[0178] 如本文中所使用，术语“显著表达”或其等效术语“阳性”和“+”当关于标记物使用时应意指，在细胞或微粒群体中，细胞/微粒中超过20％、优选地超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％95％、98％、99％或全部表达所述标记物。
[0179] 如本文中所使用，“阴性”或“-”当关于标记物使用时应意指，在细胞或微粒群体中，细胞/微粒中小于20％、10％、优选地小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或无细胞/微粒表达所述标记物。
[0180] 微粒表面标记物的表达可以例如借助于针对特异性细胞表面标记物的流式细胞术和/或FACS使用传统方法和仪器(例如与本领域中已知的市售抗体和标准方案一起使用的Beckman Coulter Epics XL FACS系统)以确定特异性微粒表面标记物的信号是否大于背景信号来确定。该背景信号被定义为由具有与用于检测每一种表面标记物的特异性抗体相同的同种型的非特异性抗体所产生的信号强度。对于视为阳性的标记物，所观察到的特异性信号典型地超过20％、优选地强于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、500％、1000％、5000％、10000％或更多，相对于背景信号强度更大。用于分析所关注微粒表面标记物的表达的替代方法包括目视分析通过电子显微镜术使用针对所关注细胞-表面标记物的抗体进行视觉分析。
[0181] “荧光活化细胞分选(FACS)”是一种基于使用荧光标记抗体的细胞纯化方法。这些抗体是针对细胞表面上的标记物，且因此结合于所关注细胞。然后基于细胞的荧光发射峰分离细胞。
[0182] 微粒标记物(包括表面和细胞内蛋白质)也可以通过本领域技术人员已知的多种分析蛋白质表达方法来分析，包括(但不限于)凝胶电泳随后使用合适的抗体的蛋白质印迹、免疫沉淀随后电泳分析和/或如上文所述的使用针对粒子内标记物的微粒通透的电子显微镜术。举例来说，一种或多种四跨膜蛋白的表达可以使用本领域技术人员已知的一种或多种上述方法或任何其它方法来分析。也可以分析RNA水平以评估标记物表达，例如qRT-PCR。
[0183] 微粒功能
[0184] 如上文所述，干细胞微粒保留其所来源的干细胞的至少一种生物功能。可以保留的生物功能包括促进血管生成、组织再生、组织修复和/或神经发生的能力、实现已患中风的患者脑中的认知改善的能力或加速外周动脉疾病的血流恢复的能力。
[0185] 举例来说，已知CTX0E03细胞在PBMC分析中抑制T细胞活化，并且在一实施方案中本发明的微粒保留在PBMC分析中抑制T细胞活化的这种能力。PBMC分析是本领域技术人员所熟知的并且用于进行该分析的试剂盒是可购得的。
[0186] 实施例8、表2和图6说明CTX0E03干细胞外来体在伤口愈合的“划痕”模型中保留闭合伤口的能力。结果显示在CTX0E03条件培养基中培养的正常人类皮肤纤维母细胞(NHDF)的迁移活性与添加经纯化外来体所观察到的迁移活性几乎相同。因此，本发明的微粒可以保留的一种生物功能是刺激正常人类皮肤纤维母细胞(NHDF)的迁移活性的能力。NHDF迁移分析在本领域中是已知的。NHDF迁移的刺激可以使用体外划痕(伤口闭合)分析(例如实施例8(A)的分析)来测定。将伤口闭合计算为相对于如在0小时所测定的初始伤口面积被NHDF细胞覆盖的面积。在这一分析中NHDF迁移的刺激典型地被定义为伤口闭合的增加，典型地在24小时后伤口闭合是基础条件(无微粒)下的伤口闭合的至少1.2×、至少1.5×。48小时后，伤口闭合是基础条件(无微粒)下的伤口闭合的至少1.2×或1.5×、更典型地为至少2×。NHDF迁移的刺激也可以定义为引起如通过划痕分析所测定的100％伤口闭合，在基础条件下观察到在100％伤口闭合之前有至少24小时。
[0187] 实施例8还显示本发明的微囊泡能够刺激初级HUVEC的血管生成并且刺激PC-12细胞的轴突长出。因此，本发明的微粒可以保留的生物功能是刺激初级HUVEC的血管生成和/或刺激PC-12细胞的轴突长出的能力。血管生成和轴突长出分析在本领域中是已知的。初级HUVEC的血管生成的刺激可以使用24小时血管生成分析利用ibidiμ载玻片和管长和分叉点的Wimtube检测和分析(例如实施例8(B)的分析)来测定。在这一分析中血管生成的刺激典型地被定义为相较于基础血管生成的增加，例如>100％基础血管生成、典型地为至少110％、至少120％或至少140％基础血管生成(即为基础血管生成水平的至少1.1×、至少1.2×或至少1.4×)。轴突长出的刺激可以通过利用1μm插入物检测PC-12
细胞的长出(例如实施例8(C)的分析)来测定。在这一分析中轴突长出的刺激被定义为相较于基础条件(无微粒)的轴突长出增加，或与NGF组合时相较于单独添加NGF微粒的轴突长出增加，如通过分光光度计所定量。
细胞的长出(例如实施例8(C)的分析)来测定。在这一分析中轴突长出的刺激被定义为相较于基础条件(无微粒)的轴突长出增加，或与NGF组合时相较于单独添加NGF微粒的轴突长出增加，如通过分光光度计所定量。
[0188] 实施例13中的蛋白质组分析指示神经干细胞外来体包含与遗传物质的产生、包装、功能和降解相关的生物功能。因此，在一实施方案中，本发明的外来体保留这些功能，典型地为RNA聚合酶功能、RNA降解功能、核糖体功能和剪接体功能中的一种或多种。
[0189] 免疫原性
[0190] 本发明的(同种异体)神经干细胞微粒典型地不会触发体外或体内免疫反应或者触发基本上弱于预期将在给患者注射同种异体干细胞群体时所触发的免疫反应的免疫反应。在本发明的某些方面，如果至少约70％的微粒不会触发免疫反应，那么认为神经干细胞微粒不会触发免疫反应。在一些实施方案中，至少约80％、至少约90％或至少约95％、99％或或更多的微粒不会触发免疫反应。优选地，本发明的微粒不会触发抗体介导免疫反应或不会触发体液免疫反应。更优选地，本发明的微粒不会触发抗体介导免疫反应或体外体液免疫反应。更优选地，本发明的微粒不会触发混合淋巴细胞免疫反应。本领域技术人员应理解可以通过各种方式测试本发明的细胞触发免疫反应的能力。
[0191] 先前已经说明在肢体局部缺血啮齿动物模型中移植的CTX0E03细胞与媒剂处理的对照相比血管生成所涉及的宿主基因(例如CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL5、IGF1、IL1β、IL6、HGF、HIF1α、bFGF、VEGFA和VEGFC)的上调更快且短暂。hNSC处理短暂地升高宿主先天免疫和血管生成反应并且加速组织再生。
[0192] 先前已经使用人类PBMC分析说明CTX0E03细胞系不具有免疫原性。因此，也预期由CTX0E03细胞产生的微粒是非免疫原性的。免疫原性的缺乏允许微粒避免被宿主/患者免疫系统清除且从而发挥其治疗作用而无有害免疫和炎症性反应。
[0193] 干细胞
[0194] 产生微粒的干细胞可以是干细胞系，即稳定分裂的干细胞的培养物。干细胞系可以使用单一确定的来源大量生长。永生化可以由自发事件引起或可以通过将外源性遗传信息引入编码永生化因子的干细胞中、导致在合适的培养条件下干细胞的无限细胞生长来实现。所述外源性遗传因素可以包括基因“myc”，其编码转录因子Myc。可以通过各种合适的方法(例如转染或转导)将外源性遗传信息引入干细胞中。对于转导，可以使用遗传工程改造的病毒性媒剂，例如来源于反转录病毒(例如慢病毒)的媒剂。
[0195] 其它优点可以通过使用条件永生化干细胞系来提供，其中永生化因子的表达可以得到调控而不会不利地影响治疗有效微粒的产生。这可以通过引入无活性(除非向细胞供应活化剂)的永生化因子来实现。所述永生化因子可以是基因，例如c-mycER。c-MycER基因产物是一种融合蛋白，其包含与突变型雌激素受体的配体结合域融合的c-Myc变异体。C-MycER仅在合成类固醇4-羟基它莫西芬(4-OHT)(Littlewood等人1995)的存在下驱动细胞增殖。这种方法允许控制体外例如神经干细胞的扩增，同时由于来源于神经干细胞系的微粒中存在c-Myc或其编码基因而避免了对宿主细胞增殖(例如肿瘤形成)的非所需体内作用。合适的c-mycER条件永生化神经干细胞描述于美国专利7416888中。因此使用条件永生化神经干细胞系可提供优于现有干细胞微粒分离和产生的改良。其他条件永生化的方法是本领域所已知的。
[0196] 优选的条件永生化细胞系包括CTX0E03、STR0C05和HPC0A07神经干细胞系，其已经以登记No.04091601(CTX0E03)、登记No.04110301(STR0C05)和 登记
No.04092302(HPC0A07)保藏于欧洲动物培养物保藏中心(European Collection of
Animal Cultures；ECACC)、疫苗研究和生产实验室(Vaccine Research and Production laboratories)、公共卫生实验院(Public Health Laboratory Services)(Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP40JG)。这些细胞的衍生和起源描述于EP1645626B1中。这些细胞的优点通过由这些细胞产生的微粒来保留。
No.04092302(HPC0A07)保藏于欧洲动物培养物保藏中心(European Collection of
Animal Cultures；ECACC)、疫苗研究和生产实验室(Vaccine Research and Production laboratories)、公共卫生实验院(Public Health Laboratory Services)(Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP40JG)。这些细胞的衍生和起源描述于EP1645626B1中。这些细胞的优点通过由这些细胞产生的微粒来保留。
[0197] CTX0E03细胞系的细胞可以在以下培养条件下培养：
[0198] ·人类血清白蛋白0.03％
[0200] ·腐胺二盐酸盐16.2μg/ml
[0201] ·人类重组胰岛素5μ/ml
[0202] ·孕酮60ng/ml
[0203] ·L-谷氨酰胺2mM
[0204] ·亚硒酸钠(硒)40ng/ml
[0205] 加上碱性纤维母细胞生长因子(10ng/ml)、表皮生长因子(20ng/ml)和用于细胞扩增的4-羟基它莫西芬100nM。可以通过除去4-羟基它莫西芬而使细胞分化。典型地，可以在5％CO2/37℃下或在5％、4％、3％、2％或1％O2的低氧条件下培养细胞。成功地培养这些细胞系不需要血清。血清是成功培养许多细胞系所需的，但其含有许多污染物，包括其自身外来体。CTX0E03、STR0C05或HPC0A07神经干细胞系或不需要血清的任何其它细胞系的另一优点是避免了血清污染。
[0206] CTX0E03细胞系的细胞(和来源于这些细胞的微粒)是最初来源于12周人类胎儿皮质的多能细胞。用于CTX0E03细胞系的分离、制造和方案由Sinden等人(美国专利7,416,888和EP1645626B1)详细描述。CTX0E03细胞不是“胚胎干细胞”，即其不是来源于胚泡内细胞群的多能细胞；原始细胞的分离不会导致胚胎受破坏。
[0207] CTX0E03细胞(和来源于这些细胞的微粒)具有血管生成性，且因此适用于治疗需要血管生成的疾病，例如外周动脉疾病。细胞(和来源于这些细胞的微粒)也具有神经原性且因此适用于治疗需要神经发生的疾病，例如缺血(中风)受损脑。CTX0E03是一种无性细胞系，其含有通过反转录病毒感染传递并且由4-OHT(4-羟基它莫西芬)条件性调控的c-mycER转基因的单一拷贝。C-mycER转基因表达融合蛋白，在4-OHT存在下刺激细胞增殖且因此允许在4-OHT存在下培养时控制扩增。这种细胞系是无性的，在培养时快速扩增(倍增时间50-60小时)并且具有正常人类核型(46XY)。其是遗传稳定的并且可以大量生长。细胞是安全且非致瘤的。在生长因子和4-OHT不存在的情况下，细胞经历生长停滞并且分化成神经元和星形细胞。一旦植入缺血受损脑中，这些细胞仅迁移到组织损伤区域。
[0208] CTX0E03细胞系的研发已经允许扩大一致产品用于临床使用。由库存材料产生细胞允许大量产生细胞用于商业应用(Hodges等人,2007)。
[0209] Pollock等人2006描述了在中风大鼠模型(MCAo)中移植CTX0E03在移植后6-12周时引起感觉运动功能和粗大运动不对称的统计显著改善。这些数据表明CTX0E03具有发展为治疗细胞系所必需的适当生物和制造特征。
[0210] Stevanato等人2009证实了CTX0E03细胞在EGF、bFGF和4-OHT撤出后体外和在植入MCAo大鼠脑中后体内都会下调c-mycERTAM转基因表达。体内c-mycERTAM转基因的沉默提供CTX0E03细胞的另一安全性特点用于潜在临床应用。
[0211] Smith等人2012描述了在中风大鼠模型(短暂性大脑中动脉阻塞)中CTX0E03的临床前功效测试。结果表明在3个月时间范围内CTX0E03植入物有力地恢复行为功能异常并且这一作用对于其移植位点具有特异性。病灶拓扑学可能是恢复的重要因素，其中限于纹状体的中风显示与较大面积的损伤相比更好的结果。
[0212] 根据本发明也可以使用神经视网膜干细胞系(例如如US 7514259中所述)。
[0213] 术语“培养基(culture medium/medium)”在本领域中是被认可，并且一般是指用于活细胞培养的任何物质或制剂。如提及细胞培养使用时，术语“培养基”包括包围细胞的环境的组分。培养基可以是固体、液体、气态或各种相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不会维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括使在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支撑物上生长的细胞暴露的气相。术语“培养基”也是指打算用于细胞培养的材料，即使其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富含营养物的液体是培养基。类似地，当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可以称为“粉末培养基”。“成分明确培养基”是指由化学上定义(通常经纯化)的组分组成的培养基。“成分确定培养基”不含有表征不良的生物提取物，例如酵母提取物和牛肉汁。“丰富培养基”包括设计成支持特定物种的大多数或所有能活的形式生长的培养基。丰富培养基经常包括复杂生物提取物。“适于高密度培养物生长的培养基”是当其它条件(例如温度和输氧率)允许所述生长时允许细胞培养物到达3或更大的OD600的任何培养基。术语“基础培养基”是指促进不需要任何特殊营养补充剂的许多类型的微生物的生长的培养基。大多数基础培养基一般包括四种基础化学基团：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素。基础培养基一般用作更复杂培养基的基剂，向其中添加例如血清、缓冲液、生长因子、脂质及其类似物的补充剂。在一个方面，生长培养基可以是具有必要生长因子以支持本发明的细胞的生长和扩增同时维持其自我更新能力的复杂培养基。基础培养基的实例包括(但不限于)伊格尔基础培养基(Eagles Basal Medium)、最小必需培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、培养基199、营养物混合物汉氏(Ham's)F-10和汉氏F-12、麦科伊氏5A(McCoy's5A)、杜尔贝科MEM/F-I 2、RPMI 1640和伊斯考夫改良杜尔贝科培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium；IMDM)。
[0214] 药物组合物
[0215] 本发明的干细胞微粒适用于疗法中且因此可以配制为药物组合物。除本发明的微粒外，药学上可接受的组合物典型地包括至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、媒剂和/或赋形剂。合适的载剂的一个实例为林格式乳酸盐溶液(Ringer's Lactate solution)。对所述组分的详尽讨论提供于Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy.第20版,ISBN:0683306472中。
[0216] 短语“药学上可接受的”在本文中用于指那些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理判断医生范围内，适合用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0217] 需要时，组合物也可以含有少量pH值缓冲剂。载剂可以包含贮存介质，例如购自BioLife Solutions Inc.,USA的 。合适的药物载剂的实例描述于E WMartin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。所述组合物将含有预防或治疗有效量的预防性或治疗性微粒(优选地呈纯化形式)以及适合量的载剂，以便提供用于适当施用于受试者的形式。制剂将配合投药方式。在优选实施方案中，药物组合物是无菌的且呈适合施用于受试者、优选为动物受试者、更优选为哺乳动物受试者且最优选为人类的形式。
[0218] 本发明的药物组合物可以呈各种形式。这些形式包括例如半固体和液体剂型，例如冻干制剂、液体溶液或悬浮液、可注射和难溶性溶液。药物组合物优选地是可注射的。本发明的微粒的一个特定优点是与获得其的干细胞相比其改良的稳固性；因此微粒可以经受不会适合于干细胞的配制，例如冻干。
[0219] 优选的是本发明的方法、试剂和组合物用于治疗或修复受损组织，和/或用于治疗、调节、预防和/或改善一种或多种与组织病症相关的症状。尤其优选的是将本发明的方法、试剂、组合物和微粒用于再生疗法、典型地治疗中风、外周动脉疾病或视网膜致盲疾病中。
[0221] 为了控制张度，药物组合物可以包含生理盐，例如钠盐。氯化钠(NaCl)是优选的，其可以介于1和20mg/ml之间存在。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠脱水物、氯化镁和氯化钙。
[0222] 组合物可以包括一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；丁二酸缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸盐缓冲液。缓冲液典型地将以5-20mM范围的浓度包括。组合物的pH值一般将介于5和8之间，且更典型地介于6和8之间，例如介于6.5和7.5之间或介于7.0和7.8之间。
[0223] 组合物优选地是无菌的。组合物优选地不含麸质。组合物优选地是无热原的。
[0224] 在一个典型实施方案中，微粒悬浮于包含6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲+ + 2+ 2+ - -酸 Na、K、Ca 、Mg 、Cl、H2PO4、HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露糖醇、葡萄糖、
dextron-40、腺苷和谷胱甘肽的组合物中。典型地，组合物不会包括两极性非质子溶剂，例如DMSO。合适的组合物可商购，例如 所述组合物是有利的，因为
其允许微粒长期(数小时到数天)贮存在4℃到25℃下或保存在冷冻温度下，即低于-20℃的温度。微粒可以在解冻后以这些组合物形式施用。
dextron-40、腺苷和谷胱甘肽的组合物中。典型地，组合物不会包括两极性非质子溶剂，例如DMSO。合适的组合物可商购，例如 所述组合物是有利的，因为
其允许微粒长期(数小时到数天)贮存在4℃到25℃下或保存在冷冻温度下，即低于-20℃的温度。微粒可以在解冻后以这些组合物形式施用。
[0225] 药物组合物可以通过适当途径来施用，该途径对于本领域技术人员将显而易见的，取决于待治疗的疾病或病状。典型的施用途径包括静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、颅内、鼻内或腹膜内。为了治疗脑病，一个选择将脑内施用微粒，典型地施用于损伤或疾病部位。
[0226] 微粒将以治疗或预防有效剂量施用，该剂量对于本领域技术人员将显而易见。由于微粒的低免疫原性或不存在的免疫原性，故可以施用重复剂量而不会诱发有害免疫反应。
[0227] 治疗性用途
[0228] 本发明的微粒适用于治疗或预防疾病。因此，本发明包括一种使用本发明的微粒治疗或防治患者的疾病或病症的方法。术语“患者”包括接受预防或治疗性治疗的人类和其它哺乳动物受试者。
[0229] 如上文所述，组合物包含也适用于这些疗法的本发明的miRNA，且因此本文中对微粒的治疗性用途的提及同样适用于包含miRNA的组合物。
[0230] 本发明的治疗上有用的微粒具有再生活性。具有再生活性的微粒是能够活化或增强再生过程或抑制或减少衰退过程的微粒。再生过程导致细胞和组织的更新、恢复、修复和/或生长。衰退过程导致细胞或组织完整性和/或功能的损失。这可能尤其适用于治疗受损或受干扰细胞或组织，例如由中风、精神病症、心肌梗死、肌萎缩性侧索硬化和外周动脉疾病引起的那些细胞或组织。
[0231] 本发明的微粒适用于组织再生。“组织再生”是增加外伤后组织中的细胞数目的过程。外伤可以是引起细胞数目减少的任何情况。举例来说，事故、自体免疫病症或疾病状态可以构成外伤。组织再生增加组织内的细胞数目并且能够实现待重建组织的细胞与待恢复组织的功能性之间的关系。
[0232] 疗法可以是需要组织替换、再生或修复的再生疗法。疗法可以用于神经疾病、病症或缺损。疗法可以改善功能和/或认知恢复。疗法可以是对中风、外周动脉疾病、神经病或需要组织再生、血管再生或局部消炎作用的任何其它疾病或病症的疗法，包括：
[0233] (i)神经病症、疾病或缺损，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风或ALS；
[0234] (ii)溶酶体贮积症；
[0235] (iii)心血管病症，例如心肌梗死、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃疡、伤口愈合；
[0236] (iv)肺部疾病，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、特发性肺动脉高血压、囊性纤维化和哮喘；
[0237] (v)代谢或炎症性病症，例如糖尿病(I或II)、类风湿关节炎、骨关节炎、狼疮、克罗恩氏病、炎症性肠病或移植物抗宿主病；
[0238] (vi)精神病症，例如抑郁症、躁郁症、精神分裂症或自闭症候群病症(例如自闭症、亚斯伯格综合征或瑞特综合征)；
[0239] (vii)视网膜致盲疾病，例如年龄相关黄斑变性、斯塔加特病、糖尿病性视网膜病、视网膜色素变性；和
[0240] (viii)脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症、大脑性麻痹、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脑白质营养不良、格巴二氏综合征、抗MAG周围神经病和恰克-马利-杜斯氏症。
[0241] 在一实施方案中，微粒和含有其的组合物并不用于免疫调节。在一实施方案中，疗法与免疫调节无关。
[0242] 本发明还提供了一种用于治疗或防治疾病或病状的方法，其包括施用有效量的本发明的微粒，从而治疗或预防该疾病。典型地，疾病或病状如上文所鉴别。
[0243] 本发明的微粒可用于治疗与获得其的干细胞相同的疾病。已知神经干细胞适用于治疗疾病，包括：中风、脑损伤(例如运动、感觉和/或认知缺损)、精神病症、心肌梗死、肌萎缩性侧索硬化、肢体局部缺血、外周动脉疾病。因此，本发明的微粒也适用于治疗中风、脑损伤(例如运动、感觉和/或认知缺损)、精神病症、心肌梗死、肌萎缩性侧索硬化、肢体局部缺血、外周动脉疾病。
[0244] 图6和实施例8说明从神经干细胞获得的外来体刺激伤口愈合。因此，在一实施方案中，使用本发明的外来体治疗需要组织替换、再生或修复的疾病或病状。所述病状包括糖尿病性溃疡和伤口愈合。图6C示出了从培养6周的NSC分离的外来体比从培养2周的NSC分离的外来体更有效。因此，在一实施方案中，使用从已经培养(典型地在多隔室生物反应器中)至少2周、更典型地至少4周或至少6周的NSC(典型地为CTX0E03细胞)分离的外来体治疗需要组织替换、再生或修复的疾病或病状。任选地，NSC已经培养不超过十周，例如介于2周和10周之间、介于3周和10周之间、介于4周和10周之间、介于5周和10
周或介于6周和10周之间。
周或介于6周和10周之间。
[0245] 所观察到的增加的从NSC(CTX0E03细胞)已经培养(在多隔室生物反应器中)6周的NSC分离的外来体的功效与所观察到的外来体的尺寸减小到约70nm直径(这在培养细胞6周后也会发生)有关。因此，在一实施方案中，使用从已经培养(典型地在多隔室生物反应器中)至少6周的NSC(典型地为CTX0E03细胞)分离的外来体治疗需要组织替换、再生或修复的疾病或病状。如上文所述，任选地，NSC已经培养不超过十周，例如介于6周和10周之间。在另一实施方案中，使用从具有小于100nm、典型地小于80nm的直径、例如约70nm直径的NSC(典型地为CTX0E03细胞)分离的外来体治疗需要组织替换、再生或修复的疾病或病状。
[0246] 如图12中所示和实施例8中所论述，从神经干细胞获得的微囊泡刺激血管生成。因此，在一实施方案中，使用本发明的微囊泡治疗需要血管生成的疾病或病状，典型地为通过组织再生和/或血管再生来治疗的疾病或病症。本发明的微囊泡可用于治疗心血管病症，例如心肌梗死、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃疡和伤口愈合。刺激血管生成在治疗上也适用于治疗局部缺血、尤其是心脏缺血和肢体局部缺血。图12示出了从培养至少3周的NSC收获的微囊泡比从培养1或2周的NSC分离的微囊泡更有效。因此，在一实施方案中，使用从已经培养(典型地在多隔室生物反应器中)至少3周、更典型地至少4周或至少6周的NSC(典型地为CTX0E03细胞)分离的微囊泡治疗需要血管生成的疾病或病状。任选地，NSC已经培养不超过十周，例如介于3周和10周之间、介于4周和10周之间、介于5周和10周之间或介于6周和10周之间。
[0247] 如图13中所示和实施例8中所论述，从神经干细胞获得的微囊泡刺激轴突长出。因此，在一实施方案中，使用本发明的微囊泡治疗神经疾病、病症或缺损，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、神经病或ALS。
[0248] 在预防应用中，向易患特定疾病或另外处于特定疾病风险中的患者施用足以消除或降低该风险或延迟疾病发作的量的药物组合物或药剂。在治疗应用中，向怀疑或已经罹患所述疾病的患者施用足以治愈疾病和其并发症或至少部分使疾病和其并发症的症状停滞的组合物或药剂。足以完成这一情况的量被定义为治疗或药学有效剂量。在预防和治疗方案中，试剂典型地以若干次剂量施用直到已经实现足够反应。典型地，监测反应且如果反应开始减弱，那么就给予重复剂量。
[0249] 本发明的微粒可以任选地与干细胞组合以提供组合疗法。干细胞任选地是微粒所来源的干细胞，例如如果微粒是来自CTX0E03细胞的外来体，那么用于组合疗法的干细胞可以是CTX0E03细胞。干细胞和微粒可以任选地(i)以单一药物组合物形式共同施用、(ii)同时或同步但分开施用或(iii)分开且依序施用，例如干细胞随后是微粒或微粒随后是干细胞。当分开且依序施用干细胞和微粒时，施用细胞和微粒之间的持续时间可以是一个小时、一天、一周、两周或两周以上。
[0250] 在一实施方案中，预防疗法诱导将接受微粒所来源的干细胞的宿主的耐受性、典型地为免疫耐受性。在一实施方案中，在施用干细胞疗法之前或同时向患者施用一次或多次剂量的本发明的微粒可用于降低干细胞疗法的不利免疫反应(即“排斥”)的风险。在另一实施方案中，如上文所论述，对干细胞的耐受性可以通过施用干细胞以及本发明的微粒来增加。
[0251] 用于治疗上述病状的本发明的组合物的有效剂量视许多不同因素而变化，包括施用方法、靶部位、患者的生理状况、患者是人类还是动物、其它所施用的药物和治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类。
[0252] 已经显示CTX0E03细胞系可有效治疗中风、外周动脉疾病、脑损伤(例如运动、感觉和/或认知缺损)和精神病症。细胞目前正在用于治疗残疾中风患者的临床试验中进行测试(Clinicaltrials.gov标识符：NCT01151124)。WO-A-2012/004611描述了CTX0E03细胞在治疗精神病症中的用途，这些精神病症包括单相和双相抑郁症、精神分裂症、强迫症、自闭症和自闭综合征病症。因此，由CTX0E03细胞产生的微粒将能够治疗中风、外周动脉疾病、视网膜致盲疾病(例如视网膜色素变性)、脑损伤(例如运动、感觉和/或认知缺损)和精神病症。
[0253] 如本文中所使用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”和“疗法”当直接用于患者或受试者时应意指该改善一种或多种与病症相关的症状，或防治或预防病症或一种或多种与病症相关的症状。待治疗的病症包括(但不限于)退行性病症、涉及组织破坏的病症、赘生性病症、炎症性病症、自体免疫疾病或免疫介导疾病(包括移植器官和组织的排斥)。由向需要所述治疗的受试者施用本发明的微粒或包含这些微粒的药物组合物引起症状的改善或防治。
[0254] 体内追踪所施用的细胞和微粒
[0255] 本发明提供了一种用于由神经干细胞产生的微粒的独特标记物谱。因此，可以通过测试从患者获得的样品并确定样品中标记物谱是否匹配微粒的标记物谱来体内检测这些微粒的存在。如果样品谱匹配本文中所述的微粒的谱，那么这证实了微粒的存在。这不仅可用于检测微粒自身的存在和/或生物分布，而且还可以检测产生微粒的干细胞的存在。当检测体内施用的干细胞是否已经移植到宿主组织中和/或已经迁移时，例如在ADME(T)研究中，这尤其有用的。
[0256] 体内检测微粒可用于监测向患者施用微粒或干细胞的治疗过程。测定患者中本发明的微粒或产生微粒的细胞的存在、不存在或量允许相应地改变剂量方案，例如根据需要增加或减少剂量以体内提供有效量的微粒或干细胞。
[0257] 产生微粒的方法
[0258] 从细胞条件培养基，典型地从干细胞条件培养基分离微粒。“条件培养基”(CM)可以是用于干细胞的生长培养基，其已经用于培养干细胞的大量培养物至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时或最少约72小时、典型地至多168小时(7天)，移出并需要时在使用之前通过任何合适的方法、优选地通过过滤来灭菌。
[0259] 可选地，可以从双隔室生物反应器收获微粒，该双隔室生物反应器允许细胞培养和因此条件培养基维持较长时段，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或更长时间。该系统将细胞和所分泌的微粒维持在小细胞隔室(约15ml)中，该隔室通过10kDa半透膜与较大培养基储集层分隔。这允许有效除去代谢废物，同时有效维持极高的细胞密度以最大化微粒产生。实施例9和图7和8说明使用双隔室生物反应器导致微粒的产量比当使用标准细胞培养烧瓶(T175烧瓶)时所获得的高得多。
[0260] 微粒可以基于分子量、尺寸、形状、流体动力学半径、组成、电荷、底物-配体相互作用、电磁波的吸收或散射、或生物活性而与其它培养基组分分离。在一实施方案中，使用适当尺寸的过滤器(例如100K MWCO过滤器)来过滤条件培养基以分离所需微粒。任选地，在通过使浓缩的NSC-条件培养基经受尺寸排阻色谱来分离微粒之前浓缩干细胞条件培养基。然后可以选择UV吸收剂部分来分离所关注的微粒。
[0261] 可以通过使用不同的分离技术和参数而从培养基分离不同的微粒。举例来说，外来体具有1.13-1.19g/mL的囊泡密度并且可以通过在100,000-200,000g下差速离心和蔗糖梯度超速离心来分离。可以通过过滤(100K MWCO)和在18,000-20,000g下差速离心来分离微囊泡。膜颗粒具有1.04-01.07g/ml的密度且外来体样囊泡具有1.1g/ml的密度。
[0262] 一种典型的产生方法包括：培养干细胞以产生条件培养基；通过在1500rpm下离心除去细胞碎片；通过利用100K MWCO过滤器超滤来分离微囊泡(<1000kDa)或通过在120,000g下超速离心来分离外来体(30-100nm)；随后使用BCA蛋白质分析来量化。
[0263] 作为微粒产生者细胞的条件永生化干细胞
[0264] 在本发明的一个方面，使用条件永生化干细胞产生微粒，例如微囊泡和/或外来体。条件永生化提供了产生微粒，如外来体的无性细胞的稳定来源。这些条件永生化干细胞典型地是神经干细胞，但可以是任何类型的干细胞，例如造血干细胞或间质干细胞。所述条件永生化细胞可以是CD34+细胞。因此，提供了一种产生干细胞微粒的方法，其包括培养条件永生化干细胞和收获由这些细胞产生的微粒的步骤。如上文所述，干细胞的条件永生化在本领域中是已知的。在一实施方案中，条件永生化通过引入c-mycER来实现，只有当合成类固醇4-羟基它莫西芬(4-OHT)存在时才能驱动细胞分化。为免存疑，这种方法不限于使用神经干细胞。
[0265] 实施例展示了从条件永生化的神经干细胞和CD34+脐带血细胞中产生外来体。该范例可以便利地被应用于其他类型细胞，包括间充质干细胞。
[0266] 当用于产生微粒的干细胞是神经干细胞时，其可以是本文中所述的任何神经干细胞，例如CTX0E03条件永生化细胞系，其是无性系的，标准化的，显示明确的体外和体内安全性并且可以按比例制造，从而提供用于稳定外来体产生的独特资源。可选地，神经干细胞可以是神经视网膜干细胞系，任选地如US 7514259中所述。
[0267] 微粒还可以产生自条件永生化的CD45-、CD34-神经球启始干细胞(NS-IC)。这些细胞能够启始神经球培养。神经球是一团或一簇细胞，包括神经干细胞和原始前体细胞。NS-IC为本领域所已知，例如，在EP11900811B1(StemCells Inc.)中有记载。典型地NS-IC+
为AC133。
为AC133。
[0268] 在另一实施方案中，条件永生化干细胞是少突胶质前体细胞(OPCs)。少突胶质前体细胞是少图胶质细胞的前体，并且典型地还能够分化成为星形胶质细胞以及，任选地，成为神经元。少突胶质前体细胞典型地表达蛋白聚糖PDGFRα。少突胶质前体细胞被记+载于，例如WO-A-2010/075500(StemCells Inc.)中；这些少突胶质前体细胞是PDGFRα/- +
CD105并且任选地是CD133 。
CD105并且任选地是CD133 。
[0269] 当用于产生微粒的干细胞是间质干细胞时，其可以任选地是WO-A-2009/105044中所述的条件永生化脂肪源性干细胞(“ADSC”)或条件永生化型式的间质干细胞；这些细胞是CD29+、CD44+、CD49a+/e+、CD105+、CD166+、CD34-、CD45-。
[0270] 在另一实施方案中，微粒产生自表达CD73,CD90及CD105且不表达CD14,CD19,CD34,CD45及HLA-DR的条件永生化的来源于人骨髓的干细胞，其中细胞
群至少50％的细胞中表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)并分泌BDNF。这些细胞在
EP-A-2620493(Brainstorm Cell Therapeutics)中被记载。
群至少50％的细胞中表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)并分泌BDNF。这些细胞在
EP-A-2620493(Brainstorm Cell Therapeutics)中被记载。
[0271] 在一实施方案中，条件永生化间充质干细胞是子宫内膜再生细胞(ERCs)。ERC是本领域所已知的，并且典型地分离自月经血。ERC典型地表达CD9、CD29、CD41a、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105。从非条件永生化的ERC中产生外来体在例如美国专利公开号US2013/0195899(Medistem Inc.)中被记载。
[0272] 另一实施方案提供了来自条件永生化多能成体祖细胞(MAPCs)的微粒，典型地该细胞来源于骨髓。MAPCs是本领域所已知的并且典型地表达Oct3和端粒酶。MAPCs正在被Athersys Inc.开发，其产品名称为Multistem。在一实施方案中，MAPCs是人多能非胚胎、非生殖细胞，能够分化成为内胚层、外胚层和中胚层细胞谱系中至少2种谱系中每种谱系的至少1种类型的细胞，表达端粒酶，并且任选地表达Oct-3。这些MAPCS典型地在培养时已经经历过10-40次倍增(例如见美国专利8,147,824；Athersys,Inc.)。在另一实施方案中MAPCs是一个人细胞群，表达CD90和CD49c，以及sox-9、sox-11,hox-A5和MSX-1中的一个或多个，并且，任选地，表达端粒酶。这些细胞典型地表现出细胞在培养中经历过22次倍增后的标记物谱。
[0273] 另一种根据本发明能够条件永生化的间充质干细胞的实施方案是间充质祖细胞(MPCs)。MPC表达SDF-1(基质衍生因子1-一种有效的来源于基质的CXCα趋化因子)。MPCs能够典型地分化成骨骼、脂肪和软骨。MPCs可以典型地通过针对SDF-1表达，例如使用SDF-1抗体进行筛选被分离。MPC典型地分离自骨髓。典型地，MPC的标记物中选自bright bright bright bright bright
STRO-l VCAM-l ,THY-l ,CD146 和STRO-2 中的至少一种为阳性。任选地，
bri
MPC带有选自MPC特异性表面标记物STRO-l 、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-选择素、L-选择素,CD49a/CD49b/CD29,CD49c/CD29,CD49d/CD29、CD29、CDl8、CD61、β-1整合素、6-19、血栓调节蛋白、CDlO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGFl-R、NGF-R、FGF-R、Leptin-R、RANKL和CD 146中或以上标记物的任意组合中至少2种标记物。MPCs的存活与增殖，或其子代可以通过暴露于SDF-1或其类似物(例如见WO2006032075,Angioblast Inc.[现为Mesoblast,Inc.]).被增强。MPCs现在正被Mesoblast以Revascor的名称进行商业化开发。
STRO-l VCAM-l ,THY-l ,CD146 和STRO-2 中的至少一种为阳性。任选地，
bri
MPC带有选自MPC特异性表面标记物STRO-l 、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-选择素、L-选择素,CD49a/CD49b/CD29,CD49c/CD29,CD49d/CD29、CD29、CDl8、CD61、β-1整合素、6-19、血栓调节蛋白、CDlO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGFl-R、NGF-R、FGF-R、Leptin-R、RANKL和CD 146中或以上标记物的任意组合中至少2种标记物。MPCs的存活与增殖，或其子代可以通过暴露于SDF-1或其类似物(例如见WO2006032075,Angioblast Inc.[现为Mesoblast,Inc.]).被增强。MPCs现在正被Mesoblast以Revascor的名称进行商业化开发。
[0274] 其他能够分离微粒，如外来体的条件永生化干细胞包括造血干细胞，典型地是CD34+造血干细胞，任选地分离自脐带血(通常被称为“脐带血细胞”)。实施例15和图20A-C显示来源于脐带血的人CD34+祖细胞成功地通过c-mycERTAM慢病毒实现条件永生化，并产生了表达特性标记物Alix的外来体。
[0275] 脐带血还包括非造血干细胞，其也能够被条件永生化并用于产生微粒。
[0276] 造血干细胞还被记载于US 7,794,705(Amorcyte Inc.)。这些细胞是CD34+/CXC-4+细胞，具有CXCR4介导的趋化活性并能在体外形成造血集落。
[0277] 微粒也可以由条件永生化的来源于人的极小胚胎样干细胞(VSELs)，典型地是+ + + - -CD133CXCR4CD34LinCD45(例如在WO2010039241所记载，NeoStem Inc.)。VSELs干细胞+ + +
任选地是Oct-4，SSEA，Nanog，或在细胞核表达Oct-4蛋白并且在表面表达SSEA抗原。
任选地是Oct-4，SSEA，Nanog，或在细胞核表达Oct-4蛋白并且在表面表达SSEA抗原。
[0278] 条件永生化细胞可以是多能成体祖细胞(MAPCSs)。MAPCS是本领域所已知的(例如见Reading et al.J Immunol.2013May 1；190(9):4542-52)。
[0279] 诱导多能干(iPS)细胞也可以条件永生化并用于产生外来体。iPS细胞是本领域所已知的，如综述Malik and Rao Methods Mol Biol,2013；997-23-33所提到。
[0280] 条件永生化的分化的细胞(非干细胞)作为微粒的产生者细胞。
[0281] 条件永生化并非只限于干细胞。相应地，在本发明的更进一方面，条件永生化的分化的细胞(即非干细胞)用于产生微粒，如微囊泡和/或外来体。
[0282] 成纤维细胞可以条件永生化并用于产生微粒如外来体。典型地，成纤维细胞是人皮肤成纤维细胞。
[0283] 树突状细胞也可以条件永生化并用于产生微粒，如外来体。
[0284] 诱导微粒分泌的方法
[0285] 发明者已发现可以增加细胞，典型地如干细胞的微粒产生。该发现不限于神经干细胞并且可以用于从任何细胞(典型地是干细胞)产生微粒的这一发现允许从干细胞培养获得提高的微粒产量。当结合条件永生化细胞持续提供的微粒时该提高产量将变得尤为便利。
[0286] 第一种增加干细胞的微粒产生的技术是用典型地介于1和25ng/ml之间(例如10ng/ml)的TGF-β、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种处理干细胞12到96小时，随后移出条件培养基。
[0287] 如以下实施例2中所解释，观察到多泡体(MVB)的出现率因存在TGF-β、IFN-γ或TNF-α(10ng/ml)而改变。出现率在存在TGF-β时最高，随后是IFN-γ，随后是TNF-α。因此，将TGF-β、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种添加到干细胞培养基中将刺激细胞产生微粒。然后可以通过将微粒与如上文所述的其它组分分离来收获微粒。
[0288] 第二种增加干细胞的微粒产生的技术是在低氧条件下培养细胞。在低氧条件下培养细胞是本领域技术人员所熟知的，并且涉及在具有小于大气水平的O2、即小于21％的O2的气氛下培养细胞。这典型地通过将细胞放在允许改变氧水平的孵育箱中来实现。低氧培养典型地涉及在含有小于10％O2、更典型地5％或更小O2、例如4％或更小、3％或更小、2％或更小、或1％或更小O2的气氛下培养。
[0289] 发明者还明白了将干细胞与不同细胞类型共培养可以改变干细胞的微粒产生。不同细胞类型可以是非干细胞，即最终分化的细胞类型。典型地，不同细胞类型是将与干细胞体内相互作用的细胞类型。在一实施方案中，将神经干细胞与上皮细胞共培养，例如内皮细胞、典型地为人类脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell；HUVEC)。已经观察到NSC和血管系统体内相互作用，其中增殖中的NSC位于极接近或邻近于血管的位置。也观察到当NSC与内皮细胞共培养时，受体酪氨酸激酶活化和信号蛋白质分泌得到上调，再次表明血管系统调节NSC的增殖能力。在不希望受理论束缚的情况下，发明者相信体内，在组织再生过程中，通过扩大细胞因子表达，在NSC和微血管(即内皮细胞)之间存在关键相互作用。因此，与内皮细胞(例如HUVEC)共培养的来源于NSC(例如CTX0E03细胞)的微粒(例如外来体)准备用于治疗用途，因为其在模拟干细胞和微粒具有活性的体内环境的环境中产生。
[0290] 因此，将干细胞与不同细胞类型一起培养可以改良所产生的微粒的量和/或可以提高微粒的含量，典型地使得由干细胞产生的微粒偏向活化状态的组织修复。因此，由已经与其它细胞共培养的干细胞(例如与内皮细胞共培养的NSC)产生的微粒是有利的。如本文中所述，这些微粒可以通过从共培养的干细胞条件培养基分离而获得。
[0291] 令人惊讶的是，本发明者已经明白了，由干细胞产生的微粒的量可以简单地通过在多隔室生物反应器中培养干细胞而大大增加。这一发现不限于神经干细胞并且一般适用于所有干细胞培养。因此，本发明的一个方面提供了一种由已经在多隔室生物反应器中培养的干细胞产生微粒的方法。收获微粒的细胞典型地已经培养至少一周，典型地至少8、9、10、11、12、13或14天，例如15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或更长时间，例如至少三周、四周、五周、六周或更长时间。从图8可见，微粒产生一周一周地增加不仅是相加的，而且还是指数的。典型地在Integra Celline系统双隔室生物反应器(商购自Integra Biosciences AG,Zizers,Switzerland)中观察长时间培养，但发现不限于这种特定多隔室生物反应器；使用可以任何多隔室生物反应器。这种培养方法可用于由任何干细胞类型产生微粒，包括(但不限于)神经干细胞和间质干细胞。
[0292] 筛选改变微粒生产的试剂的方法
[0293] 本发明提供了一种筛选改变条件永生化细胞，典型地是条件永生化干细胞的微粒产生的试剂的方法。这种方法包括在适于微粒产生的条件下使条件永生化细胞(如干细胞)与候选试剂接触，并且观察与不与试剂接触的对照干细胞相比，(i)所接触的条件永生化细胞的微粒产率增加还是减少，或(ii)微粒变化的特征(例如尺寸、蛋白质、mRNA或miRNA含量)。
[0294] 用于筛选条件培养基的总RNA组合物的方法
[0295] 在离心后(在1500rpm下5分钟)，通过过滤(0.02-0.2μm，或100K MWCO)从条件培养基收集微粒。使用基于trizol的提取，随后使用Qiagen RNaesy迷你试剂盒纯化来获得总RNA。水中的提取物具有260:280nm吸光度，表明其可能是RNA。适于mRNA(Superscript II RT，Invitrogen)或miRNA(mScript RT试剂盒，Qiagen)的方案反转录总RNA。mRNA和miRNA存在的验证是通过qRT-PCR分别使用(对于mRNA)用于ATP5B和YWHAZ的引物和(对于miRNA看家基因)用于U6B和15a的引物来证明。可以通过例如阵列(微阵列或基
于PCR的阵列)的通用基因表达分析法并且测序来评估RNA。
于PCR的阵列)的通用基因表达分析法并且测序来评估RNA。
[0296] 试剂盒
[0297] 本发明提供了一种用于产生本发明的微粒的方法中的试剂盒。该试剂盒包含一细胞培养基、一条件永生化细胞和关于使用试剂盒产生如权利要求22所述的微粒的说明书。任选地，试剂盒包含一种或多种如权利要求19或20所述的组分。试剂盒也可以包含用作对照的根据本发明的微粒。任选地将对照微粒冻干。试剂盒也可以任选地含有适于检测所产生的微粒的检测剂，例如特异性结合于可用于鉴别微粒的标记物蛋白质的抗体。
[0298] 参考以下非限制性实例来进一步描述本发明。实施例
[0299] 实施例1：制备神经干细胞和神经干细胞微粒以用于通过电子显微镜术进行观测。
[0300] 方法
[0301] 包埋CTX0E03细胞以用于电子显微镜术
[0302] ·5×70％CTX0E03培养物
[0303] ·用+/-4OHT、IFNγ、TNFα和TGFβ处理(全部都是10ng，持续24小时)
[0304] ·分离细胞并且在含2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸(Cacodylate)(pH7.4)中过夜[0305] ·300g离心细胞
[0306] ·缓冲锇2％，1.5小时
[0307] ·离心，水洗，过夜
[0308] ·乙酸铀2％，2小时
[0309] ·离心，水洗，30分钟
[0310] ·乙醇梯度20、35、50、70、80、90、100％，过周末。
[0311] ·100％环氧丙烷(PO)，1小时
[0312] ·离心，50％琼脂LV树脂的PO溶液，1小时
[0313] ·75％LV树脂/PO，5小时
[0314] ·在60℃下100％树脂过夜
[0315] ·冷却到室温，随后切割(60-80nm)，在200Kv下TEM成像。
[0316] 结果
[0317] 图1A-E示出了含有直径为约30nm-50nm的外来体的多泡体(MVB)的电子显微图。图1F示出了直径>100nm的微囊泡。
[0318] 实施例2：由神经干细胞系产生神经干细胞微粒。
[0319] 方法
[0320] 个别地用10ng/ml TGF-β、10ng/ml IFNγ或10ng/ml TNFα处理5个含有相同CTX0E03细胞培养物的亚汇合烧瓶，与添加或未添加4OHT的完全生长培养基对照比较。处理后72小时，使用trypzean/EDTA收集细胞，在含2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐(pH7.4)中洗涤并固定过夜，准备电子显微镜术评估。
[0321] 结果
[0322] 观察到多泡体(MVB)的出现率因存在TGF-β、IFN-γ或TNF-α而改变。出现率在存在TGF-β时最高，随后是IFN-γ，随后是TNF-α。
[0323] 结论
[0324] 由神经干细胞产生微粒可以通过添加因子TGF-β、IFN-γ或TNF-α来刺激。这有潜力更有效地产生微粒。
[0325] 实施例3：神经干细胞微粒的纯化、量化和表征。
[0326] 方法
[0327] 图2中提供用于产生大量微粒的方案概述。主要步骤是纯化、量化、表征、功效测试和制造。
[0328] (1)纯化
[0329] 可以通过在100000×g下超速离心1-2小时来从干细胞条件培养基纯化微粒。可以使用用于纯化的替代性或其它方法，例如基于抗体的方法(例如免疫沉淀)、磁性珠粒纯化、基于树脂的纯化、使用特异性抗体。
[0330] (2)量化
[0331] 经纯化的微粒可以通过量化总核酸或蛋白质含量(例如多种PCR)或比色蛋白质量化方法(例如BCA分析)来定量。可以替代地使用其它量化技术，包括电子显微镜术网格或使用特异性结合于微粒特异性标记物的抗体或抗体片段的免疫分析(例如ELISA、免疫印迹)。
[0332] (3)表征
[0333] 可以在功能上或在结构上对微粒进行表征。可以使用本领域中熟知的方法(SDS-PAGE、质谱分析法、PCR)来使用RNA/mRNA/miRNA和蛋白质谱。测试组成性分泌微粒可以且与已经通过添加例如转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(INF-γ)和/或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的诱导剂诱导的微粒进行比较。
[0334] (4)治疗功效
[0335] 微粒的功效可以通过体外和体内分析来测试。对于体外评估，可以将神经干细胞微粒添加到单核细胞、PBMC、内皮细胞和/或纤维母细胞的培养物中且评估微粒对细胞的作用。向合适的动物模型施用神经干细胞微粒可用于评估体内功效。可以进行临床试验以评估神经干细胞微粒在人类受试者中的安全性和结果。
[0336] (5)制造/扩大
[0337] 生物反应器(例如Integra一次性T1000)可以用于大规模生产神经干细胞微粒。然后将经纯化的微粒配制为治疗产品。
[0338] 实施例4：CTX0E03微粒中的miRNA表征
[0339] 方法
[0340] ·3个条件：标准培养的CTX0E03细胞；从标准培养的CTX0E03细胞获得的微粒；和来源于Integra CELLine系统中的CTX0E03细胞的经纯化外来体(参见以下实施例7到
11)
11)
[0341] ·根据制造商的说明书使用qRT-PCR图(Qiagen)研究miRNA阵列。这种分析提供高精确度和高灵敏度，其中数据校正对方法/参考基因的选择敏感。其并不提供全基因组测序。
[0342] 结果：A)存在于(i)标准CTX0E03细胞、(ii)经过滤的条件培养基(0.02-0.2μm过滤器)(即微粒)和(iii)来源于Integra CELLine系统的外来体中的cp≤35的miRNA列表(初级miRNA qRT-PCR miscript阵列(Qiagen)结果)。
[0343] B)参考(看家)基因的算术和几何平均值
[0344] A
[0345]
[0346]
[0347] B
[0348]
[0349] 实施例5：使用蛋白质斑点印迹的CTX0E03条件培养基分析
[0350] 方法
[0351] ·调节24小时和72小时条件培养基(RMM和ITS培养基)
[0352] ·所收集的培养基已经通过透析‘浓缩’并且使蛋白质生物素化(典型的总蛋白质浓度似乎为0.5mg/ml)。然后将培养基与Raybiotech L507人类蛋白质阵列(总蛋白质浓度0.1mg/ml)一起孵育。在洗涤并将阵列与HRP缀合抗生蛋白链菌素一起培育后，通过化学发光检测蛋白质的存在。阵列提供定性数据(即蛋白质存在，但并不指示其与其它蛋白质相比的表达水平)。
[0353] 结果
[0354]
[0355]
[0356]
[0357] *＝血管生成
[0358] ＝炎症
[0359] 实施例6：使用人类血管生成ELISA条(Signosis)的条件培养基分析方法
[0360] 根据制造商的说明书利用人类血管生成ELISA条(Signosis)。针对8种血管生成细胞因子分析新鲜RMM培养基和24小时条件CTX0E03RMM培养基；肿瘤坏死因子
α(TNFα)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、VEGFA、白细胞介素-6(IL-6)、bFGF、转化生长因子β1(TGFβ1)、EGF和瘦素。将该条上涂有针对特异性血管生成细胞因子的每一种初级抗体的个别孔加载测试样品。通过分光光度计在450nM下测量吸光度。血管生成细胞因子的浓度与测试样品的颜色强度成正比。
α(TNFα)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、VEGFA、白细胞介素-6(IL-6)、bFGF、转化生长因子β1(TGFβ1)、EGF和瘦素。将该条上涂有针对特异性血管生成细胞因子的每一种初级抗体的个别孔加载测试样品。通过分光光度计在450nM下测量吸光度。血管生成细胞因子的浓度与测试样品的颜色强度成正比。
[0361] 结果示出于图3中。
[0362] 实施例7：Integra CELLINE-用于由CTX0E03细胞产生微粒的一次性生物反应器。
[0363] 来自细胞系的有效微粒产生和收获依赖于维持用于最大细胞密度的最佳培养条件。供应给细胞的氧或营养物的任何限制或废物代谢产物的积累将限制培养物的寿命，且因此限制微粒产生。
[0364] 双隔室CELLine AD 1000是设计成容纳附着于小细胞隔室内的基质镶嵌物的粘附细胞，借助于10kDa半透膜与大培养基储集层分隔。这种膜允许连续扩散营养物和除去废物，同时集中较小细胞隔室内的由细胞产生的任何微粒。由于培养基隔室的大体积容量(1升)，系统具有较长时间维持高密度培养而无需改变培养基的潜力。由间皮瘤肿瘤细胞培养物产生外来体描述于Mitchell等人,2008中。
[0365] 方法
[0366] 为了获得CELLine AD1000的最佳性能，将25ml完全生长培养基(具有生长因子和4OHT的RMM)放到烧瓶的培养基隔室中以预润湿半透膜。允许烧瓶在室温下静置5分钟，随后通过在37℃下将15ml层粘连蛋白溶液(20μg/ml于DMEM/F12中)添加到细胞隔室中持续至少1小时而用小鼠层粘连蛋白涂布基质镶嵌物。除去层粘连蛋白溶液且将15ml温热的DMEM/F12添加到细胞隔室中以除去任何过量层粘连蛋白。避免基质镶嵌物变干，将约6
15×10个CTX0E03细胞慢慢地引入总共15ml完全生长培养基中。务必从细胞隔室中除去任何气泡。将另外460ml完全生长培养基小心地添加到细胞隔室中，随后在5％CO2、37℃下孵育烧瓶过夜。第二天，从细胞隔室中除去培养基且替换为15ml预加温的生长培养基。
15×10个CTX0E03细胞慢慢地引入总共15ml完全生长培养基中。务必从细胞隔室中除去任何气泡。将另外460ml完全生长培养基小心地添加到细胞隔室中，随后在5％CO2、37℃下孵育烧瓶过夜。第二天，从细胞隔室中除去培养基且替换为15ml预加温的生长培养基。
[0367] 每7天从细胞隔室收获微粒/培养基。在1500rpm下离心培养基5分钟以除去任何细胞碎片且贮存在-80℃下。将另一15ml预加温的完全生长培养基小心地添加到细胞隔室中且将485ml完全生长培养基添加到培养基隔室中并再孵育7天。通过100K MWCO过滤来分离微粒。视需要重复。
[0368] 图4A示出了与正常培养条件(3天T175)相比从15ml含有使用Integra系统纯化的微粒的培养基提取的蛋白质的量。通过BCA分析测量的蛋白质的毫克数。图5示出了在260/280nm下测量的分离的总RNA的相应数量。
[0369] 标记物表征指示两种经纯化的群体(微囊泡和外来体)都表达CD63和CD81(通过FACS测定-图4B)。仅外来体表达内体标记物Alix(通过蛋白质印迹测定，数据未示出)。
[0370] 实施例8：功效分析
[0371] (A)在伤口愈合分析中将CTX0E03条件培养基的功能与来自CTX0E03细胞的经纯化外来体的功能进行比较。
[0372] 方法-伤口闭合/划痕分析
[0373] ·接种12孔板每孔0.25×106个NHDF(正常人类皮肤纤维母细胞)且允许变得汇合(24小时)
[0374] ·除去生长因子24小时
[0375] ·除去细胞(划痕)且与外来体/条件培养基一起孵育
[0376] ·在48小时内使受影响区域成像
[0377] ·使用Image J估计面积
[0378] 结果
[0379]
[0380] 表2-表示在CTX0E03条件培养基中或在添加经纯化的外来体后培养的正常人类皮肤纤维母细胞(NHDF)的迁移活性的伤口闭合/划痕分析。
[0381] 将伤口闭合计算为相对于如在0小时所测定的初始伤口面积被细胞覆盖的面积。将伤口闭合表示为在0小时时初始伤口面积的百分比。图6A中也用照片示出了这些数据。
[0382] 图6B示出了与基础条件(无外来体)相比，10μg CTX0E03外来体在72小时后显著增加伤口闭合(如在HDNF划痕/迁移分析中所测定)。
[0383] 其它实验证实来自连续培养(在生长因子和4OHT存在下使用Integra CELLine生物反应器)期间的所有时间点(第2-6周)的经纯化外来体(通过超速离心；通过BCA蛋白质分析定量；对于CD63和CD81表征为>99％阳性且与相应微粒部分相比具有较大Alix表达水平)显著增强纤维母细胞迁移和伤口愈合，其中与基础条件相比峰值响应介于
5-10μg/ml之间。图6C示出了基础条件、2μg/ml外来体、6μg/ml外来体、20μg/ml外来体和LSGS(低血清生长补充剂)阳性对照的愈合区域％。图6C的上图示出了从在Integra Celline系统中培养2周的CTX0E03细胞分离的外来体且图6C的下图示出了从在Integra Celline系统中培养6周的CTX0E03细胞分离的外来体。这些数据显示与基础条件相比所有测试NSC外来体的所有剂量使得愈合增加，其中在72小时后愈合％接近阳性对照(LSGS)。
5-10μg/ml之间。图6C示出了基础条件、2μg/ml外来体、6μg/ml外来体、20μg/ml外来体和LSGS(低血清生长补充剂)阳性对照的愈合区域％。图6C的上图示出了从在Integra Celline系统中培养2周的CTX0E03细胞分离的外来体且图6C的下图示出了从在Integra Celline系统中培养6周的CTX0E03细胞分离的外来体。这些数据显示与基础条件相比所有测试NSC外来体的所有剂量使得愈合增加，其中在72小时后愈合％接近阳性对照(LSGS)。
[0384] 图6C中的数据也显示从培养6周的NSC分离的外来体使得愈合更快(相较于2周外来体)，其中在仅48小时后对于所有剂量来说愈合％接近100％。
[0385] 图6D示出了在小鼠中的体内注射伤口分析的结果，从而证实CTX0E03细胞在统计显著程度上体内刺激伤口愈合。这是一种简单的体内生物分析，其可用于体内证实微粒的功效。
[0386] 结论：在伤口愈合体外模型中从人类神经干细胞系CTX0E03释放的外来体增强纤维母细胞迁移，从而表明外来体可以有助于hNSC促进修复的机制。与从培养2周的细胞分离的外来体相比，从培养6周的细胞分离的外来体显示体外改善的伤口愈合功效。
[0387] (B)血管生成的刺激
[0388] 使用Ibidiμ载玻片和自动Wimtube检测和分析(管长和分叉点)对初级HUVEC进行检测血管生成的24小时分析。将在1、2、3、4和6周时从Integra烧瓶收获的微囊泡添加到HUVEC中且将血管生成与基础HUVEC(未添加)进行比较。使用LSGS(低血清生长补充剂)作为阳性对照。图12中所描绘的结果显示神经干细胞微囊泡增加血管生成。此外，这些数据显示相较于由培养1或2周的微囊泡所提供的情况，由在培养至少3周后(即在Integra celline生物反应器中培养3周、4周和6周后)收获的微囊泡提供血管生成的较大增加。培养至少3周的微囊泡在统计显著水平和接近阳性对照的水平上刺激血管生成。显示血管生成的最大增加由在4周后收获的微囊泡提供；这些微囊泡以与阳性对照相同的量刺激血管生成。
[0389] 这些数据指示hNSC微囊泡刺激血管生成。
[0390] (C)轴突长出的刺激
[0391] 使用PC-12细胞通过1μm插入物来测定轴突长出。72小时后，除去PC-12细胞主体且在插入物的下侧对轴突染色。然后萃取染色物且在分光光度计上定量。将在2周时从Integra烧瓶收获的微囊泡以0.03μg、0.3μg和3μg添加到细胞中，其中每一种都与100ng/ml NGF(神经生长因子)一起添加。将轴突长出与基底细胞(无添加)进行比较。
使用100ng/ml神经生长因子作为对照。如图13中所示，与单独添加神经生长因子相比，添加3μg hNSC微囊泡使得轴突长出显著增加。
使用100ng/ml神经生长因子作为对照。如图13中所示，与单独添加神经生长因子相比，添加3μg hNSC微囊泡使得轴突长出显著增加。
[0392] 这些数据指示hNSC微囊泡刺激轴突长出。
[0393] 实施例9：使用Integra CELLine系统产生外来体。
[0394] 使用Integra CELLine系统培养CTX0E03细胞且如实施例7中所述纯化外来体。将在3周时间点使用CELLine系统从培养基纯化的外来体的浓度和如本领域中常用的作为对照的标准T175系统定量(使用BCA分析以估计蛋白质含量)。图7示出了与使用传统培养(T175烧瓶)相比使用Integra CELLine系统的外来体产生增加若干倍。
[0395] 如实施例7中所述，使用Integra CELLine系统，在3周时期内培养CTX0E03细胞且在第1、2和3周收获培养基用于纯化和量化外来体。图8A示出了在3周培养期内微粒的产生指数增加，从而能够实现微粒的有效且大规模的生产。然后在1-6周连续CTX0E03培养内监测从单一Integra CELLine烧瓶收获的外来体的浓度，其中结果如下示出且描绘于图8B中：
[0396]
[0397] 这些结果显示当干细胞在多隔室生物反应器中培养数周、典型地至少三周时，外来体产生惊人地得到增强。
[0398] 实施例10：从Integra CELLine和标准(T175)培养系统获得的细胞的表型的表征。
[0399] 如实施例7中所述，使用Integra CELLine生物反应器和标准培养来培养CTX0E03细胞。使用标记物特异性抗体和荧光显微术证实DCX和GFAP蛋白质标记物的表达。
[0400] 在从细胞获得的样品中通过qRT-PCR检测DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF和IDO标记物的表达。在从标准(T175)培养获得的微粒和从培养3周的Integra CELLine系统获得的外来体之间比较标记物表达，针对标准(T175)培养中的CTX0E03细胞中的表达水平基线进行评估。
[0401] 发明者观察到从Integra CELLine系统获得的细胞的标记物表达与从标准方法获得的对照细胞相比的显著差异。与从标准培养获得的对照细胞相比，在Integra CELLine系统中培养的细胞中部分分化细胞的标记物增加若干倍(图9)。尤其显著的变化是标记物DCX1(双皮质素抗体，一种进入神经谱系的标记物)、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白，一种进入星形细胞谱系的标记物)、GDNF(神经胶质细胞源性神经营养因子)和IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)的表达增加。这表明在双隔室生物反应器中培养的神经干细胞部分分化成神经(DCX+)或星形细胞(GFAP+)谱系细胞。通过荧光显微术证实DCX和GFAP在Integra培养细胞中的表达，从而说明使用Integra CELLine生物反应器培养的CTX0E03细胞具有比标准CTX0E03细胞更加分化的神经元表型。
[0402] 实施例11：从Integra CELLine培养获得的外来体和从标准(T175)培养获得的微粒的miRNA表达谱的表征。
[0403] 使用Integra CELLine培养且在标准培养中在单隔室T-175烧瓶中培养CTX0E03细胞三周。如实施例7中所述，从Integra培养纯化外来体且从标准T-175培养纯化微粒。根据制造商的说明书，使用qRT-PCR图(Qiagen)，以miRNA阵列测定在从标准培养或Integra CELLine系统获得的外来体和微粒中表达的多种miRNA的相对表达水平，且转化为与标准CTX0E03细胞系对照组相比的倍数上调和下调水平(参见表3和图10)。这些数据显示从Integra CELLine培养系统3周获得的外来体、微粒和从标准单一烧瓶培养获得的细胞之间的差异miRNA表达谱。
[0404] 表3：相对于对照(CTX0E03细胞)，从标准培养获得的微粒或从Integra CELLine系统获得的外来体中的miRNA的倍数调节。
[0405]
[0406]
[0407] 使用以下等式由原始数据计算值：
[0408] ΔCT(样品/对照组)＝平均CT(GOI)-平均CT(HKC)
[0409] 倍数表达(样品/对照)＝2-(平均ΔCT)
[0410]
[0411] 如果(倍数变化)＞1那么(倍数调节)＝(倍数变化)
[0412]
[0413] 其中：
[0414] CT＝周期阈值
[0415] GOI＝所关注的基因(所研究的miRNA)
[0416] HKG＝看家基因(用于校正数据的参考miRNA)
[0417] 实施例12：总miRNA分析
[0418] 细胞可以使RNA穿梭到经确定为释放到细胞间隙中的微粒中。这允许基因编码的信息在细胞之间传递。我们这里将细胞外RNA统称为‘穿梭RNA’。我们的目的是使用Next Generation Sequencing全面分析由CTX0E03神经干细胞(NSC)释放的非编码RNA种类。
[0419] 非编码RNA被分为两个种类(小的和长的)。小的非编码RNA生物型包括核糖体RNA(rRNA)、小核仁(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)、其它RNA(misc_RNA，例如RMRP、穹窿体RNA、后生动物SRP和RNY)，且长的非编码RNA生物型包括长的非编码RNA(IncRNA)和大的基因间非编码RNA(lincRNA)。
[0420] 这里，我们表征从NSC源性外来体和微囊泡(MV)释放的穿梭RNA，包括小的和长的非编码RNA，并且与产生者NSC的RNA含量进行比较。
[0421] A)通过Agilent RNA生物分析器鉴别的细胞、外来体和微囊泡中的总RNA含量[0422] 如图14中所示，外来体和微囊泡中的RNA主要由小RNA种类组成。如针对分子梯所示，大多数核苷酸(nt)≤200。
[0423] B)RNA组成
[0424] 产生小RNA测序库以通过深度测序(Next Generation Sequencing)研究穿梭和细胞RNA的组成。结果示出于图15中。
[0425] C)来自标准(T175)培养的CTX0E03细胞、微囊泡和外来体miRNA表达的深度测序。
[0426] 深度测序是基于cDNA库的制备和随后测序并且提供关于微囊泡和外来体中的不同miRNA的总序列读出的信息。这些深度序列数据补充了上文所示的qRT-PCR阵列数据并且提供了细胞和微粒的miRNA谱的全面分析。不同于qRT-PCR阵列分析，深度测序并不局限于鉴别探针阵列中存在的序列，且因此待鉴别的序列并不需要事先知道。深度测序还提供直接读出和对极短序列测序的能力。然而，深度测序不是适于检测具有低表达的转录物。
[0427] 方法
[0428] 在对每一种样品构建1个经标记miRNA库后，通过深度测序鉴别亲本细胞中各种miRNA和通过差速离心纯化的其外来体(30-100μm)和微囊泡(100-1000μm)的存在。
[0429] 另外，设计用于高穿梭miRNA(例如hsa-miR-1246)的特异性引物并且用于实时反转录PCR(qRT-PCR)以追踪体内植入后的外来体/微囊泡。
[0430] 由GATC Biotech(德国)进行深度测序且需要对每一种样品制备经标记miRNA库，随后测序，并进行miRBase扫描：
[0431] ·经标记miRNA库(22到30nt)的构建
[0432] ○通过将特异性RNA适体连接到每一种样品的3'和5'端，随后反转录、扩增和纯化小RNA库(所含的小RNA部分的尺寸范围为22-30nt)来产生测序库。
[0433] ·在Illumina HiSeq 2000上进行测序(单一读取)
[0434] ○使用Illumina HiSeq 2000进行测序(单一读取)。对一个池的分析可以包括至多45,000,000次单一读取，并且每次读取长度至多50个碱基。通过使用FastQ Files来控制测序质量(序列和质量评分)。
[0435] ·如下进行对已知miRNA的鉴别：
[0436] ○从所得序列剪裁RNA适体且清除原始数据。群集原始数据并且对于每一个集群提供许多次读取。通过miRBase扫描(Ssearch)鉴别miRNA。
[0437] 结果
[0438] 相对于细胞，许多微囊泡和外来体miRNA是丰富的，表明细胞特别地分选miRNA用于细胞外释放。此外，miRNA含量在外来体和微囊泡中类似，表明在排出的微囊泡中选择性miRNA摄取的共同装置。在不希望受理论束缚的情况下，这可能表明分泌的微囊泡和外来体中的miRNA含量可以用作鉴别hNSC亚型的指纹。
[0439] 因此，深度测序分析鉴别hNSC外来体和微囊泡中的先前未报导的一组独特miRNA。排出的囊泡中的miRNA含量是类似的，但显示与hNSC相比优先的miRNA摄取。这些发现可以证实由对于hNSC先前未描述的穿梭miRNA介导的生物作用。
[0440] 结果详述于下表4到9中。数据也描绘于图11中，其清楚地示出了与细胞相比微囊泡和外来体中存在的显著不同的miRNA谱。总之，这些数据显示与细胞相比微囊泡和外来体中的hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532量的大幅度增加(读取计数)。在hsa-miR-4508、hsa-miR-4516、has-miR-3676-5p和hsa-miR-4485中也可见大大增加。可见某些miRNA的量(读取计数)的大幅度减少，包括hsa-let-7a-5p、has-miR-92b-3p、has-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-100-5p 和hsa-99b-5p。
[0441] 外来体中存在hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4492、hsa-miR-4508、hsa-miR-4516和hsa-miR-4532中的每一种是通过qRT-PCR(数据未示出)验证的。
[0442] 对深度测序结果和与细胞相比的相对倍数变化进行绘图证实了hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532在外来体和微囊泡中与细胞相比显著上调。这一比较也显示miRNA hsa-miR-3195是外来体和微囊泡中皆得到最大程度上调的miRNA。
尽管对于外来体和微囊泡来说hsa-miR-3195的绝对读数在约40范围内，但细胞中不存在hsa-miR-3195。如以上实施例11中所示，也测试外来体、微粒和亲本细胞中的miRNA含量并且使用PCR阵列分析验证。通过qRT-PCR发现存在以下miRNA：hsa-let-7g-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-128、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-181a-5p,hsa-miR-182-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302c-3p、
hsa-miR-345-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-96-5p和hsa-miR-99a-5p。
尽管对于外来体和微囊泡来说hsa-miR-3195的绝对读数在约40范围内，但细胞中不存在hsa-miR-3195。如以上实施例11中所示，也测试外来体、微粒和亲本细胞中的miRNA含量并且使用PCR阵列分析验证。通过qRT-PCR发现存在以下miRNA：hsa-let-7g-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-128、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-181a-5p,hsa-miR-182-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302c-3p、
hsa-miR-345-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-96-5p和hsa-miR-99a-5p。
[0443] 表4：细胞EH
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453]
[0454] 表5：细胞EI
[0455]
[0456]
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466]
[0467]
[0468]
[0469]
[0470]
[0471] 表6：微囊泡EI
[0472]
[0473]
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478] 表8：微囊泡EH
[0479]
[0480]
[0481]
[0482] 表9：外来体EH
[0483]
[0484]
[0485]
[0486] D)通过在外来体、MV和产生者细胞中进行的GENCODE分析鉴别热门编码和非编码RNA
[0487]
[0488] 表10：每一种测试样品中通过使用GENCODE鉴别的序列读数总数
[0489] 如表11中所示，使用序列结果的GENCODE数据库分析，在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中鉴别出七种假定的新颖miRNA序列。(nb CTX0E0307EI MV读数因起始材料的量较低而错报-参见表10)。这些数据用图表示出于图16中，其示出了与细胞相比这些序列优先穿梭到外来体和微囊泡中。
[0490]
[0491] 表11：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别假定的新颖miRNA序列。CTX0E03 07EI MV读数因起始材料的量较低而错报(表1)。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0492] 新颖miRNA的验证
[0493] AC079949.1-201(SEQ ID NO：738)
[0494] 基因：AC079949.1 ENSG00000239776
[0495] ＞１２dna：染色体 染色体：GRCh37：12：127650616：127650672：1
[0496] GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG
[0497] 对于AC079949.1-201假定的成熟miRNA，使用http://mirna.imbb.forth.gr/MatureBayes.html(一种使用Naive Bays分类器发现miRNA前体序列内的成熟miRNA的工具)将gaccaggguccggugcggagug(SEQ ID NO:745)鉴别为可能的5'茎成熟miRNA。使用AGGGTCCGGTGCGGAGT(SEQ ID NO:746)引物序列对其存在进行验证。将这个序列输入mirbase(http://www.mirbase.org/)且发现以下miRNA具有类似序列：黄牛(Bos taurus)miR-2887-1(登记No.MIMAT0013845)。
[0498] bta-miR-2887：9-20(SEQ ID NO：747)
[0499]
[0500] 通过对经纯化外来体反转录miRNA进行qRT-PCR来测试这种新颖miRNA的存在。
[0501] 使用AC079949的3'茎，序列TGCGGAGTGCCCTTTGTCCT(SEQ ID NO：748)进行相同分析，但在这种情况下在mirbase中未鉴别出类似miRNA。
[0502] AP000318.1-201(SEQ ID NO：739)
[0503] 基因：AP000318.1 ENSG00000266007
[0504] ＞21 dna：染色体 染色体：GRCh37：21：35677430：35677493：1
[0505] CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG
[0506] 对于AP000318.1-201假定的成熟miRNA，ggagggcccaaguccuucugau(SEQ ID NO：744)被鉴别为可能的5′茎成熟miRNA。使用GGAGGGCCCAAGTCCTTCTGAT(SEQ ID NO：749)引物序列对其存在进行验证。腐生水果线虫(Caenorhabditis remanei)miR-55茎-环被鉴别为类似miRNA。再次通过qRT-PCR进行引物验证。
[0507] crm-miR-55-5p：4-17(SEQ ID NO：750)
[0508]
[0509] AL161626.1-201(SEQ ID NO：740)
[0510] 基因：AL161626.1 ENSG00000241781
[0511] ＞9 dna：染色体 染色体：GRCh37：9：79186731：79186787：1
[0512] CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC
[0513] 对于AL161626.1-201假定的成熟miRNA，ggcggagugcccuucuuccugg(SEQ ID NO：743)被鉴别为可能的5′茎成熟miRNA。使用CGGAGTGCCCTTCTTCCT(SEQ ID NO：751)引物序列对其存在进行验证。玉米(Zea mays)miR164c茎-环和二穗短柄草(Achypodium distachyon)miR164f茎-环被鉴别为类似miRNA。再次通过qRT-PCR进行引物验证。
[0514] zma-miR164c-3p：4-15(SEQ ID NO：752)
[0515]
[0516] AC004943.1(SEQ ID NO：741)
[0517] 基因：AC004943.1 ENSG00000265573
[0518] ＞16 dna：染色体 染色体：GRCh37：16：72821592：72821672：-1
[0519] GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGG
[0520] CGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC
[0521] AL121897.1(SEQ ID NO：742)
[0522] 基因：AL121897.1 ENSG00000264308
[0523] ＞20 dna：染色体 染色体：GRCh37：20：30865503：30865591：1
[0524] GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGG
[0525] CCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC
[0526] 其它RNA(misc_RNA)，包括新颖假定的RNA
[0527] Misc_RNA是其它RNA的缩写，一系列其它小RNA的泛称。其它转录物特点并不由其它RNA钥匙定义。
[0528] 使用GENCODE序列数据集所鉴别的热门的先前已知和新颖的misc_RNA的列表：
[0529]
[0530] 表12：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别misc_RNA，包括假定的新颖misc_RNA。(CTX0E03 07EI MV读数因起始材料的量较低而错报-参见表10)。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0531] 在misc_RNA中，发现以下序列优先地在外来体和MV中向下或向上穿梭：分别是向上穿梭的RPHI、RMRP和VTRNA1-1和向下穿梭的Y_RNA.725-201和Y_RNA.125-201。RPHI是核糖核酸酶P RNA组分H1。RMRP基因编码线粒体RNA加工核糖核酸内切酶的RNA组分，该核糖核酸内切酶在线粒体DNA复制的引发位点裂解线粒体RNA。这种RNA也与端粒酶反转录酶催化亚单位相互作用以形成独特核糖核蛋白复合物，该复合物具有RNA依赖性RNA聚合酶活性和产生可以被加工成小干扰RNA的双链RNA。VTRNA1-1是穹窿体RNA组分1。穹窿体是大细胞质核糖核蛋白且其由一种穹窿体主蛋白、MVP、2种穹窿体少数蛋白、TEP1和PARP4以及未翻译RNA组分VTRNA1-1构成。Y_RNA.725-201和Y_RNA.125-201是新颖
misc_RNA且其功能尚未确定。
misc_RNA且其功能尚未确定。
[0532] 后生动物其它RNA
[0533] 信号识别粒子RNA，也称为7SL、6S、ffs或4.5S RNA，是信号识别粒子(SRP)核糖核蛋白复合物的RNA组分。SRP是一种普遍保守性核糖核蛋白，其引导细胞内蛋白质的运输并且允许其被分泌。SRP RNA以及一种或多种SRP蛋白质有助于信号肽的结合和释放。这种复合物的RNA和蛋白质组分高度保存，但在不同生物界之间不同。
[0534] 使用GENCODE序列数据集所鉴别的热门后生动物misc_RNA的列表：
[0535]
[0536] 表13：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别信号识别粒子RNA(misc_RNA)。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0537] RRNA(核糖体RNA)
[0538] 核糖体RNA(rRNA)形成称为核糖体并且导出到细胞质中以帮助将信使RNA(mRNA)中的信息翻译成蛋白质的蛋白质合成细胞器的一部分。真核生物核糖体(80S)rRNA组分是：大单位(rRNA 5S、5.8S和28S)、小单位(rRNA 18S)。rRNA 28S和5.8S都是选择性地在外来体和MV中向上穿梭。
[0539] 使用GENCODE序列数据集所鉴别的热门rRNA的列表：
[0540]
[0541] 表14：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别rRNA序列。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0542] 小核仁RNA：snoRNA
[0543] 小核仁RNA(snoRNA)是一类小RNA分子，其主要指导其它RNA(主要是核糖体RNA、转移RNA和小核RNA)的化学改性。存在两类主要snoRNA，与甲基化有关的C/D盒snoRNA和与假尿苷化有关的H/ACA盒snoRNA。
[0544] 使用GENCODE序列数据集所鉴别的热门snoRNA的列表：
[0545]
[0546] 表15：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别snoRNA序列。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0547] 小核RNA(snRNA)
[0548] 小核核糖核酸(snRNA)，也常被称为U-RNA，是组成称为U1、U2、U4、U5和U6的主要剪接体并且参与若干个RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用的一类小RNA分子。其主要功能是加工核内的前mRNA(hnRNA)。还显示其有助于调控转录因子(7SK RNA)或RNA聚合酶II(B2RNA)，并且维持端粒。
[0549] 使用GENCODE序列数据集所鉴别的热门snRNA的列表：
[0550]
[0551] 表16A：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别snRNA序列。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0552] LincRNA和新颖lincRNA
[0553] 大的基因间非编码RNA(lincRNA)正成为不同细胞过程的关键调节因子。测定个别lincRNA的功能仍然是个难题。长的非编码RNA(长ncRNA、lncRNA)是长于200个核苷酸的非蛋白质编码转录物。
[0554] 使用GENCODE序列数据集所鉴别的热门的先前已知和新颖的lincRNA的列表：
[0555]
[0556] 表16B：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE鉴别lincRNA和假定的新颖lincRNA序列。转录物ID是取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0557] 与在外来体与微囊泡中相比GAS5lincRNA在产生者细胞中高度表达(在外来体和微囊泡中均下调)。
[0558] mRNA
[0559] 也鉴别编码序列mRNA。
[0560]
[0561] 表17：在外来体(EXO)、微囊泡(MV)和产生者细胞中使用GENCODE。转录物ID取自Ensembl数据库(www.ensembl.org)。
[0562] 实施例12：结论
[0563] 深度序列分析的主要范围是鉴别神经干细胞源性囊泡(外来体和微囊泡)中的其miRNA组分。这种分析鉴别出一组新的已知和新颖miRNA，其优先穿梭到外来体和MV中。在mirbase数据库中已经包括的所鉴别的miRNA是hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4492、hsa-miR-4508、hsa-miR-4516、hsa-miR-4532，且新颖miRNA是AC079949.1、AP000318.1、AL161626.1、AC004943.1、AL121897.1。通过qRT-PCR在外来体中验证热门穿梭miRNA，包括新颖miRNA。
[0564] 如本文所示，穿梭RNA的粒径分布主要是在20至200nt范围内且其它RNA种类被细胞释放到细胞间隙中。通过深度测序和GENCODE序列集分析，我们发现非编码RNA转录物的较大复杂性和多样性。我们通过详细评估扩展这一分析且这导致发现外来体和微囊泡中的其它非编码RNA优先向上(定义为log2倍数变化≥2)和向下(定义为log2倍数变化≤-2)穿梭。差异性穿梭的非编码RNA存在于几乎所有非编码RNA亚型，核糖体RNA(rRNA)、小核仁(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)、其它RNA(misc_RNA，例如RMRP、穹窿体RNA、后生动物SRP和RNY)和大的基因间非编码RNA(lincRNA)中。
[0565] 所检测的RNA种类在细胞和穿梭RNA中的不等分布结合越来越多的证据证明其在基因调控中的作用强烈地暗示细胞特异性释放这些RNA以改进靶细胞的功能。
[0566] 实施例13：蛋白质组分析
[0567] 方法
[0568] 使用差速超速离心由CTX0E03细胞Integra培养(第2周)制备外来体和微囊泡部分。在改良RIPA缓冲液(50mM Tris HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1％SDS、0.1％Triton X100、10mM DTT、1×完全蛋白酶抑制剂(Roche)和1×PhosStop磷酸酶抑制剂(Roche))中使外来体和微囊泡破裂且使其经受使用1mL结核菌素注射器和25号针进行手动剪切。在破裂后使用Qubit荧光计(Invitrogen)再定量样品。将20μg每一种样品加载到4-12％SDS-PAGE凝胶(Novex，Invitrogen)上。将凝胶的每个泳道切成四十段且根据以下方案使用机器人(ProGest，DigiLab)处理凝胶切片：
[0569] a)依序用25mM碳酸氢铵、乙腈洗涤；
[0570] b)在60℃下用10mM二硫苏糖醇还原，随后在室温下用50mM碘乙酰胺烷基化；
[0571] c)在37℃下用胰蛋白酶(Promega)消化4小时；
[0572] d)用甲酸猝灭；
[0573] e)不经过进一步处理直接通过质谱分析法分析上清液。
[0574] 质谱分析法
[0575] 通过nano LC/MS/MS用与ThermoFisher Q Exactive接口的Waters NanoAcquity HPLC系统分析每一种凝胶消化物。将肽加载到捕集柱上且在75μm分析柱上以350nL/min洗脱；两个管柱都填充了Jupiter Proteo树脂(Phenomenex)。以数据依赖性方式操作质谱仪，其中在Orbitrap中分别以70,000FWHM和17,500FWHM分辨率进行MS和MS/MS。
[0576] 外来体
[0577] 通过质谱分析法在通过超速离心纯化的外来体中鉴别出2572种蛋白质。从Integra培养初期(第2周)分离外来体。所有2572种蛋白质的基因名称和相应SWISSPROT登记号(括号中)列于表18(按基因名称的字母顺序)中且100种最丰富蛋白质以丰度递减次序列于表19中。特征性外来体标记物CD9、CD81和Alix(也称为PDCD6IP)存在于最丰富的100种蛋白质中。
[0578]
[0579]
[0580]
[0581]
[0582]
[0583]
[0584]
[0585]
[0586]
[0587]
[0588]
[0589]
[0590]
[0591]
[0592]
[0593] 表18：CTX0E03外来体中所鉴别的所有2572种蛋白质的基因名字和SWISSPROT登记号(按基因名称的字母顺序列出)。
[0594]
[0595]
[0596]
[0597]
[0598] 表19：在CTX0E03外来体中所观察到的100种最丰富蛋白质(名称和SwissProt登记号)
[0599] 微囊泡
[0600] 通过质谱分析法在从Integra培养初期(第2周)分离且藉由在10,000×g下离心纯化的微囊泡中鉴别出2940种蛋白质。所有2940种蛋白质的基因名称和相应SWISSPROT登记号(括号中)列于表20(按基因名称的字母顺序)中且100种最丰富蛋白质以丰度递减次序列于表21中。
[0601]
[0602]
[0603]
[0604]
[0605]
[0606]
[0607]
[0608]
[0609]
[0610]
[0611]
[0612]
[0613]
[0614]
[0615]
[0616]
[0617]
[0618] 表20：CTX0E03微囊泡中所鉴别的所有2940种蛋白质的基因名字和SWISSPROT登记号(按基因名称的字母顺序列出)。
[0619]所鉴别的蛋白质 登记号
肌动蛋白，细胞质2 P63261
组蛋白H4 P62805
组蛋白H2B Q99879
组蛋白H3.2 Q71DI3
组蛋白H2B 1型 P23527
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 P04406
组蛋白H2A 2型-A Q6FI13
泛素-40S核糖体蛋白S27a P62979
膜联蛋白A2 P07355
α-烯醇酶 P06733
丙酮酸激酶同工酶M1/M2 P14618
60S核糖体蛋白L6 Q02878
组蛋白H2B 2型-E Q16778
热休克同源71kDa蛋白 P11142
肌动蛋白，α心肌1 P68032
热休克蛋白HSP 90-β P08238
组蛋白H2B 1型-J P06899
延伸因子1-α1 P68104
微管蛋白β-2C链 P68371
60S核糖体蛋白L18 Q07020
微管蛋白β链 P07437
肌动蛋白，细胞质2 P63261
组蛋白H4 P62805
组蛋白H2B Q99879
组蛋白H3.2 Q71DI3
组蛋白H2B 1型 P23527
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 P04406
组蛋白H2A 2型-A Q6FI13
泛素-40S核糖体蛋白S27a P62979
膜联蛋白A2 P07355
α-烯醇酶 P06733
丙酮酸激酶同工酶M1/M2 P14618
60S核糖体蛋白L6 Q02878
组蛋白H2B 2型-E Q16778
热休克同源71kDa蛋白 P11142
肌动蛋白，α心肌1 P68032
热休克蛋白HSP 90-β P08238
组蛋白H2B 1型-J P06899
延伸因子1-α1 P68104
微管蛋白β-2C链 P68371
60S核糖体蛋白L18 Q07020
微管蛋白β链 P07437
[0620]40S核糖体蛋白S2 P15880
40S核糖体蛋白S11 P62280
组蛋白H2B 3型-B Q8N257
微管蛋白α-1B链 P68363
40S核糖体蛋白S3 P23396
40S核糖体蛋白S3a P61247
组蛋白H2A 1型-D P20671
延伸因子2 P13639
热休克蛋白HSP 90-α P07900
GTP结合核蛋白Ran P62826
60S核糖体蛋白L4 P36578
40S核糖体蛋白S9 P46781
抑制蛋白-1 P07737
60S核糖体蛋白L13a P40429
磷酸甘油酸激酶1 P00558
脂肪酸合成酶 P49327
膜联蛋白A1 P04083
组蛋白H2A.Z P0C0S5
波形蛋白 P08670
40S核糖体蛋白S6 P62753
膜突蛋白 P26038
肽酰基-脯氨酰基顺反异构酶A P62937
60S核糖体蛋白L26 P61254
60S核糖体蛋白L3 P39023
40S核糖体蛋白S8 P62241
60S核糖体蛋白L28 P46779
埃兹蛋白(Ezrin) P15311
40S核糖体蛋白S4，X同工型 P62701
60S核糖体蛋白L7a P62424
60S核糖体蛋白L13 P26373
60S核糖体蛋白L7 P18124
40S核糖体蛋白S23 P62266
60S核糖体蛋白L5 P46777
真核生物启动因子4A-I P60842
40S核糖体蛋白S24 P62847
微管蛋白β-2B链 Q9BVA1
60S核糖体蛋白L8 P62917
40S核糖体蛋白S11 P62280
组蛋白H2B 3型-B Q8N257
微管蛋白α-1B链 P68363
40S核糖体蛋白S3 P23396
40S核糖体蛋白S3a P61247
组蛋白H2A 1型-D P20671
延伸因子2 P13639
热休克蛋白HSP 90-α P07900
GTP结合核蛋白Ran P62826
60S核糖体蛋白L4 P36578
40S核糖体蛋白S9 P46781
抑制蛋白-1 P07737
60S核糖体蛋白L13a P40429
磷酸甘油酸激酶1 P00558
脂肪酸合成酶 P49327
膜联蛋白A1 P04083
组蛋白H2A.Z P0C0S5
波形蛋白 P08670
40S核糖体蛋白S6 P62753
膜突蛋白 P26038
肽酰基-脯氨酰基顺反异构酶A P62937
60S核糖体蛋白L26 P61254
60S核糖体蛋白L3 P39023
40S核糖体蛋白S8 P62241
60S核糖体蛋白L28 P46779
埃兹蛋白(Ezrin) P15311
40S核糖体蛋白S4，X同工型 P62701
60S核糖体蛋白L7a P62424
60S核糖体蛋白L13 P26373
60S核糖体蛋白L7 P18124
40S核糖体蛋白S23 P62266
60S核糖体蛋白L5 P46777
真核生物启动因子4A-I P60842
40S核糖体蛋白S24 P62847
微管蛋白β-2B链 Q9BVA1
60S核糖体蛋白L8 P62917
[0621]60S核糖体蛋白L15 P61313
60S核糖体蛋白L10 P27635
过氧化物氧还蛋白-1 Q06830
角蛋白，I型细胞骨架14 P02533
14-3-3蛋白θ P27348
40S核糖体蛋白S18 P62269
转酮酶 P29401
60S核糖体蛋白L24 P83731
组蛋白H1.5 P16401
丝切蛋白-1 P23528
二氢嘧啶酶相关蛋白3 Q14195
60S核糖体蛋白L21 P46778
60S核糖体蛋白L36 Q9Y3U8
钠/钾转运ATP酶亚单位α-1 P05023
40S核糖体蛋白S16 P62249
T-复合蛋白1亚单位γ P49368
异源核核糖核蛋白A1 P09651
60S核糖体蛋白L14 P50914
热休克70kDa蛋白1A/1B P08107
T-复合蛋白1亚单位θ P50990
60S核糖体蛋白L30 P62888
蛋白S100-A6 P06703
40S核糖体蛋白SA P08865
CD44抗原 P16070
60S核糖体蛋白L35a P18077
微管蛋白β-3链 Q13509
T-复合蛋白1亚单位δ P50991
4F2细胞表面抗原重链 P08195
T-复合蛋白1亚单位β P78371
肌凝蛋白-9 P35579
腺苷高半胱氨酸酶 P23526
细丝蛋白-A P21333
脂肪酸结合蛋白，脑 O15540
富含豆蔻酰化丙氨酸C-激酶底物 P29966
T-复合蛋白1亚单位η Q99832
成束蛋白 Q16658
果糖-二磷酸缩醛酶A P04075
60S核糖体蛋白L10 P27635
过氧化物氧还蛋白-1 Q06830
角蛋白，I型细胞骨架14 P02533
14-3-3蛋白θ P27348
40S核糖体蛋白S18 P62269
转酮酶 P29401
60S核糖体蛋白L24 P83731
组蛋白H1.5 P16401
丝切蛋白-1 P23528
二氢嘧啶酶相关蛋白3 Q14195
60S核糖体蛋白L21 P46778
60S核糖体蛋白L36 Q9Y3U8
钠/钾转运ATP酶亚单位α-1 P05023
40S核糖体蛋白S16 P62249
T-复合蛋白1亚单位γ P49368
异源核核糖核蛋白A1 P09651
60S核糖体蛋白L14 P50914
热休克70kDa蛋白1A/1B P08107
T-复合蛋白1亚单位θ P50990
60S核糖体蛋白L30 P62888
蛋白S100-A6 P06703
40S核糖体蛋白SA P08865
CD44抗原 P16070
60S核糖体蛋白L35a P18077
微管蛋白β-3链 Q13509
T-复合蛋白1亚单位δ P50991
4F2细胞表面抗原重链 P08195
T-复合蛋白1亚单位β P78371
肌凝蛋白-9 P35579
腺苷高半胱氨酸酶 P23526
细丝蛋白-A P21333
脂肪酸结合蛋白，脑 O15540
富含豆蔻酰化丙氨酸C-激酶底物 P29966
T-复合蛋白1亚单位η Q99832
成束蛋白 Q16658
果糖-二磷酸缩醛酶A P04075
[0622]60S核糖体蛋白L27 P61353
60S核糖体蛋白L17 P18621
异源核核糖核蛋白A2/B1 P22626
60S核糖体蛋白L10a P62906
60S核糖体蛋白L35 P42766
60S核糖体蛋白L17 P18621
异源核核糖核蛋白A2/B1 P22626
60S核糖体蛋白L10a P62906
60S核糖体蛋白L35 P42766
[0623] 表21：在CTX0E03微囊泡中所观察到的100种最丰富蛋白质(名称和SwissProt登记号)
[0624] 蛋白质组数据的讨论
[0625] 在外来体和微囊泡中皆检测到CD63(也称为MLA1和TSPAN30)、TSG101(也称为ESCRT-I复合物亚单位TSG101)、CD109(也称为150kDa TGF-β-1结合蛋白)和thy-1(也称为CD90)。
[0626] 也检测到其它四跨膜蛋白：在外来体部分中检测到四跨膜蛋白-4、-5、-6、-9和14；在微囊泡中检测到四跨膜蛋白-6和-14。
[0627] 在外来体而非微囊泡中检测到CD133(也称为AC133、Prominin-1、PROM 1、PROML1和MSTP061)。
[0628] 未在外来体或微囊泡中检测到CD53(也称为MOX44和TSPAN25)、CD82(也称为KAI1、SAR2、ST6和TSPAN27)、CD37(也称为TSPAN26)和CD40配体(也称为CD40LG、CD40L和TNFSF5)。
[0629] 在外来体和微囊泡部分中皆检测到巢蛋白、GFAP和微管蛋白β-3链(也称为TUBB3)，其中微管蛋白β-3链在两个部分中在前100种蛋白质中尤为突出。未检测到Sox2、DCX、GALC、GDNF和IDO。
[0630] 未检测到选择素和TNFRI(也称为TNF受体1、TNFRSF1A、TNFAR和TNFR1)。
[0631] 在外来体和微囊泡部分中皆检测到整合素α-2、-3、-4、-5、-6、-7、-V和整合素β-1、-4和-8。仅在微囊泡中检测到整合素β-3和-5。
[0632] 在外来体和微囊泡中皆检测到I类MHC抗原(例如HLA_A1、HLA-A2和HLA-B27)。
[0633] 在外来体和微囊泡中皆检测到细胞粘着分子(例如CADM1、CADM4、ICAM1、JAM3、L1CAM、NCAM)。
[0634] 在外来体和微囊泡部分中检测到细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白、波形蛋白、角蛋白、连环蛋白、肌萎缩蛋白、神经丝多肽、微管相关蛋白、微管蛋白、桥粒斑蛋白、网格蛋白、血小板亲和蛋白、胞裂蛋白、血影蛋白、踝蛋白、纽带蛋白和斑联蛋白)。
[0635] 在外来体和微囊泡中皆检测到GTP酶、网格蛋白、伴侣蛋白、热休克蛋白(例如Hsp90、Hsp70)、剪接因子、翻译因子、膜联蛋白和生长因子(例如TGF-β)。
[0636] 在外来体和微囊泡中皆检测到半乳糖凝集素-3、TIMP-1、凝血栓蛋白-1、EGF受体和CSK。
[0637] 图18比较了来自外来体和微囊泡的蛋白质组数据。图18A说明了从第2周Integra培养系统分离的每一个微粒群体内的独特蛋白质数目。图18B比较了与从第2周Integra培养系统分离的每一个微粒群体内的所鉴别的蛋白质相关的生物过程。外来体和微囊泡内所鉴别的蛋白质与极类似的生物过程相关。
[0638] 仅在外来体中发现与生物素代谢相关的蛋白质且仅在微囊泡中鉴别出色氨酸生物合成和牛磺酸/α-亚麻酸代谢所涉及的蛋白质。
[0639] 图18C将CTX0E03蛋白质组与Lai等人2012中所公开的间质干细胞外来体蛋白质组进行比较，其中在从间质干细胞释放的外来体中鉴别出总共857种蛋白质。
[0640] 图18D将与MSC源性外来体(Lim 2012)内所鉴别的蛋白质相关的生物过程与本发明的神经干细胞源性外来体进行比较。发现仅与MSC源性外来体相关的三种生物过程是(按重要性递减次序)：哮喘；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；和原发性免疫缺陷。发现仅与神经干细胞源性外来体相关的三十种生物过程示出于图19中；所鉴别的最重要的生物功能与RNA聚合酶有关。
[0641] 由MSC源性外来体和NSC源性外来体皆参与的197种生物过程的进一步比较显示当与MSC外来体相比时，NSC外来体含有RNA降解、核糖体和剪接体所涉及的显著更多的过程。
[0642] 以上比较指示NSC源性外来体和MSC源性外来体(如由Lim等人2012所表征)之间的许多显著差异。与Lim小组所鉴别的外来体中极低/不存在相比，鉴别为存在于NSC外来体中的4个最显著生物差异全都与和遗传物质的产生、包装、功能和降解(即RNA聚合酶、RNA降解、核糖体和剪接体)相关的蛋白质有关。
[0643] 实施例14：微粒的粒径分布
[0644] 进行NanoSight分析以测定从在Integra Celline系统中培养1、2、3、4、5和6周的CTX0E03细胞分离的微囊泡(“mv1”到“mv6”)和外来体(“exo1”到“exo6”)的粒径和浓度。所有结果都是基于5次重复测量。
[0645] 使用纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis；NTA)测量粒度分布。NTA检测在溶解状态下粒子的运动且将其与粒径联系起来。计算所有样品的众数和中值粒度。使用最大灵敏度相机设置分析外来体样品以捕捉最小囊泡。使用较小灵敏度相机设置分析微囊泡样品以防止大囊泡的过度曝光。结果，在样品中未检测到一些较小囊泡。虽然较小囊泡存在于MV样品中，但这些在质量方面只占样品的较小百分比。
[0646] 用荧光膜特异性染料(CellMaskTM)标记一定比例的Exo1且NTA分析与该TM
CellMask 标记的组合证实通过NTA检测到的情况对应于膜囊泡(数据非示出)。
CellMask 标记的组合证实通过NTA检测到的情况对应于膜囊泡(数据非示出)。
[0647] 结果示出于下表22和图17中。
[0648] 外来体显示在第六周尺寸减小，众数尺寸从约110nm到约70nm或中值尺寸从约130nm到约75nm。70nm到150nm总尺寸范围与本领域中所述的来自其它细胞类型的外来体尺寸一致。如实施例8和图6中所报导，在培养细胞6周后所观察到的外来体的直径尺寸减小到约70nm与从已经在多隔室生物反应器中培养6周的CTX0E03细胞分离的外来体的功效增加有关。
[0649] 应注意到，微囊泡和外来体的浓度在图17的六周时期内降低，大致地反映了所观察到的功效随时间改善。
[0650] 不出所料，微囊泡较大，其中众数直径为约150nm-200nm或中值直径为约180nm-350nm。
[0651]
[0652]
[0653] *大聚集体。
[0654] 表22：CTX0E03微囊泡和外来体的粒径分布。
[0655] 实施例15c-mycERTAM慢病毒条件永生化的来源于脐带血的人CD34+祖细胞产生的微粒
[0656] 来源于脐带血的人CD34+祖细胞用c-mycERTAM慢病毒条件永生化。定量RT-PCR确证了c-mycERTAM mRNA在感染慢病毒的来源于脐带血的人CD34+祖细胞中存在(如图20A所示)。
[0657] 随后进行western杂交分析取自细胞培养上清的外来体。样品的分析具体按下述完成：
[0658] 1、从两个细胞上清样品中浓缩外来体，每个样品体积1ml，用外来体捕获免疫珠；
[0659] 2、通过SDS-PAGE和western杂交分析普通的外来体相关蛋白的表达(Alix和HSP70)，包括标准化对照和带有的分析标记物表达已知且蛋白组分已知的参照样品。
[0660] 分析的材料
[0661] 等分细胞培养基的上清于三瓶1.5ml的小瓶，分离自CD34和条件永生化CD34c-mycERTAM细胞，保存于-80℃待处理。
[0662] 活性描述
[0663] 外来体从预清理的上清中通过与外来体捕获免疫珠4℃孵育过夜来捕获并浓缩。
[0664] 回收免疫珠后，剩余的上清120.000x g超速离心2小时沉淀残留的外来体(如果还有)并检查免疫捕获的效率。
[0665] 汇集的免疫沉淀与超速离心的沉淀每个对应于1ml原始的上清样品，裂解并上样到胶上，western杂交分析Alix(一种蛋白，在细胞内多泡体水平参与货物蛋白的浓缩与分选并被包含进入IL囊泡中，在所有外来体中普遍表达)和HSP70(促进多蛋白复合物组装的分子伴侣，参与多肽穿过细胞膜的移位，在大多数表皮样人细胞外来体中表达)。
[0666] 浓缩上清过浓，因此不适合进行western杂交分析。
[0667] 分析的总体结果：
[0668] 对照样品：我们首先对一种对照样品进行了该流程，其是来源于人细胞培养基的上清，表明1ml样品足以获取高表达的信号。
[0669] 我们从培养了72小时、汇合度达到80％的细胞培养基收集对照样品上清，使1ml6
条件培养基对应于1,1x10个细胞，其具有总外来体蛋白浓度8.3μg/ml上清的总量。
条件培养基对应于1,1x10个细胞，其具有总外来体蛋白浓度8.3μg/ml上清的总量。
[0670] 我们点了纯化自相同人细胞培养基上清的3种不同浓度的外来体作为参照来评估条带的浓度。
[0671] 如同预期，免疫沉淀样品(取自1ml上清)产生的信号相当于5-10μg纯化的外来体。结果如图20B所示。
[0672] 样品：细胞培养基上清
[0673] CD34
[0674] CD34c-mycERTAM
[0675] 取自样品上清的外来体用外来体捕获免疫珠(基于结合的四跨膜蛋白作为通常的外来体标记物)成功地浓缩。
[0676] 免疫沉淀(IP)后加载的样品显示Alix的表达所对应的总量为不到1μg外来体，而在两个样品之间察觉不到有明显的区别：CD34+与CD34+c-mycERTAM细胞都产生外来体。应该使用一种不同的方法进行精确的定量比较。样品的HSP70表达表现为阴性(可能是由于组织/细胞类型)。这些结果如图20C所示。
[0677] 前面已经表明使用过的免疫珠从细胞上清中沉淀下来了所有外来体，对此残留的上清超速离心后不存在信号已证实。对于分析的样品也同样得到了证实。
[0678] 本发明的实施例包括：
[0679] 1.一种神经干细胞微粒。
[0680] 2.根据实施例1所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒是外来体、微囊泡、膜颗粒、膜囊泡、外来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来囊泡。
[0681] 3.根据实施例1或2所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒来源于神经干细胞系。
[0682] 4.根据实施例3所述的神经干细胞微粒，其中所述神经干细胞系是条件永生化的和/或生长于无血清培养基中。
[0683] 5.根据实施例4所述的神经干细胞微粒，其中所述神经干细胞系是具有ECACC登记No.04091601的CTX0E03、具有ECACC登记No.04110301的STR0C05和具有ECACC登记No.04092302的HPC0A07。
[0684] 6.根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒具有：
[0685] (a)如通过电子显微镜术所测定的介于30nM和1000nM之间或介于30nM和200nM之间或介于30nM和100nM之间的尺寸；或
[0686] (b)1.1-1.2g/ml的蔗糖密度。
[0687] 7.根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒，其包含RNA。
[0688] 8.根据实施例7所述的神经干细胞微粒，其中所述RNA是mRNA和/或miRNA。
[0689] 9.根据实施例8所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、两种、三种或四种。
[0690] 10.根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒，其包含以下一种或多种：
[0691] (a)脂质，选自神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和/或磷脂酰胆碱；
[0692] (b)miRNA，任选地选自hsa-let-7g、hsa-miR-101、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-126、hsa-miR-128、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-130a、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-155、hsa-miR-15a、hsa-miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-182、hsa-miR-183、hsa-miR-185、hsa-miR-18b、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-195、hsa-miR-20a、hsa-miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-218、hsa-miR-301a、hsa-miR-302a、hsa-miR-302c、hsa-miR-345、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-7、hsa-miR-9、hsa-miR-93、hsa-miR-96和hsa-miR-99a；
[0693] (c)四跨膜蛋白，任选地选自CD63、CD81、CD9、CD53、CD82和/或CD37；
[0694] (d)TSG101、Alix、CD109和/或thy-1；和/或
[0695] (e)CD133。
[0696] 11.根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒，其包含表19或表21中所出现的蛋白质中的至少10种。
[0697] 12.根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒，其包含神经干细胞或神经干细胞条件培养基的至少一种生物活性。
[0698] 13.根据实施例12所述的神经干细胞微粒，其中所述至少一种生物活性是再生活性。
[0699] 14.根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒，其用于疗法中。
[0700] 15.根据实施例14所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法是再生疗法。
[0701] 16.根据实施例14或15所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法是用于
[0702] (i)神经病症、疾病或缺损，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风或ALS；
[0703] (ii)溶酶体贮积症；
[0704] (iii)心血管病症，例如心肌梗死、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃疡、伤口愈合；
[0705] (iv)肺病，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、特发性肺动脉高血压、囊性纤维化和哮喘；
[0706] (v)代谢或炎症性病症，例如糖尿病(I或II)、类风湿关节炎、骨关节炎、狼疮、克罗恩氏病、肠易激综合征或移植物抗宿主病；
[0707] (vi)精神病症，例如：抑郁症、躁郁症、精神分裂症或自闭综合征病症(例如自闭症、亚斯伯格综合征或瑞特综合征)；
[0708] (vii)视网膜致盲疾病，例如年龄相关黄斑变性、斯塔加特病、糖尿病性视网膜病或视网膜色素变性；和
[0709] (viii)脱髓鞘病，例如多发性硬化症、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脑白质营养不良、格巴二氏综合征、抗MAG周围神经病和恰克-马利-杜斯氏症。
[0710] 17.根据实施例14到16所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法改善功能和/或认知恢复。
[0711] 18.根据实施例14到17所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法是对中风、外周动脉疾病或视网膜致盲疾病的疗法。
[0712] 19.根据实施例14到17所述的神经干细胞微粒，其中：
[0713] (i)所述微粒是外来体且疗法是对需要组织替换、再生或修复的疾病或病状的疗法；或
[0714] (ii)所述微粒是微囊泡且所述疗法是对需要血管生成的疾病或神经疾病、病症或缺损的疗法。
[0715] 20.一种根据任一前述实施例所述的神经干细胞微粒在制造用于治疗疾病的药剂中的用途。
[0716] 21.一种产生根据实施例1到13所述的神经干细胞微粒的方法，其包括从神经干细胞条件培养基分离微粒。
[0717] 22.一种产生干细胞微粒的方法，其包括从干细胞条件培养基分离微粒，其中：
[0718] (i)所述干细胞条件培养基包含一种或多种组分，其诱导所述干细胞将微粒释放到所述培养基中；
[0719] (ii)在低氧条件下培养所述干细胞；
[0720] (iii)将所述干细胞与不同细胞类型共培养；
[0721] (iv)在多隔室生物反应器中培养所述干细胞；和/或
[0722] (v)使所述干细胞部分分化。
[0723] 23.根据实施例22所述的方法，其中所述干细胞是任选地根据实施例3到5中任一项所述的神经干细胞。
[0724] 24.根据实施例22(i)或从属于实施例22(i)时的实施例23所述的方法，其中所述一种或多种组分选自：转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(INF-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
[0725] 25.根据实施例22(iii)、从属于实施例22(iii)时的实施例23或24所述的方法，其中所述不同细胞类型是内皮细胞。
[0726] 26.一种根据实施例22到25中任一项所述的方法可获得的微粒。
[0727] 27.一种组合物，其包含根据任何实施例1到13或26中任一项所述的微粒和药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。
[0728] 28.一种用于用以产生根据实施例1到13或26中任一项所述的微粒的方法中的试剂盒，其包含：(a)培养基；(b)神经干细胞；(c)任选地根据实施例22到24所述的一种或多种组分；(d)任选地适合用作对照的根据实施例1到13或26中任一项所述的微粒；(e)任选地适于特异性检测所产生微粒的检测剂；和(f)使用所述试剂盒产生根据实施例1到13或26中任一项所述的微粒的说明书。
[0729] 29.一种筛选改变干细胞的微粒产率的试剂的方法，其包括使干细胞与候选试剂接触并观察所接触的干细胞的微粒产率与对照相比是增加还是减少。
[0730] 30、一种制备干细胞微粒的方法，其包括以下步骤：
[0731] (i)在允许干细胞分化的环境中培养所述干细胞；
[0732] (ii)收集所述细胞产生的微粒。
[0733] 31、根据实施例30所述的方法，其中所述允许干细胞分化的环境是在多隔室生物反应器中培养，例如所述生物反应器含有被一个或多个膜或隔层分隔的至少两个隔室，所述膜或隔层将含有细胞的隔室与一个或多个含有气体和/或培养基的隔室分隔开。
[0734] 32、根据实施例31所述的方法，其中所述培养超过7天。
[0735] 33、根据实施例30-32中任一项所述的方法，其还包括从干细胞条件培养基中分离微粒。
[0736] 34、根据实施例33所述的方法，其中所述干细胞条件培养基包含一种或多种刺激干细胞将微粒释放到培养基中的添加剂组分或药剂。
[0737] 35、根据实施例34所述的方法，其中所述一种或多种组分选自转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(INF-γ)和/或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
[0738] 36、根据实施例33-35中任一项所述的方法，其中所述干细胞在低氧条件下培养。
[0739] 37、根据实施例33-36中任一项所述的方法，其中所述干细胞与不同类型细胞共培养。
[0740] 38、根据实施例37所述的方法，其中所述不同类型细胞是内皮细胞。
[0741] 39、根据实施例30到38中任一项权利要求所述的方法，其中所述干细胞是神经干细胞。
[0742] 40、根据实施例39所述的方法，其中所述干细胞为神经干细胞系。
[0743] 41、根据实施例40所述的方法，其中所述神经干细胞系是条件永生化的。
[0744] 42、根据实施例40或41所述的方法，其中所述神经干细胞系是具有ECACC登记No.04091601的CTX0E03；或具有ECACC登记No.04110301的STR0C05；或具有ECACC登记No.04092302的HPC0A07。
[0745] 43、根据实施例40-42中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞系生长于无血清培养基中。
[0746] 44、根据实施例39-43中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞表达标记物Nestin、Sox2、GFAP、βIII-微管蛋白、DCX、GALC、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种。
[0747] 45、根据实施例39-44中任一项所述的方法，其中所述微粒是外来体且所述外来体表达DCX、GFAP、GALC、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种。
[0748] 46、根据实施例30至45中任一项所述的方法，其中所述微粒中至少有两、三、四、五、六或七种miRNA与在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中相比被上调或下调；所述上调或下调通过倍数调节所计算。
[0749] 47、根据实施例30至46中任一项所述的方法，其中所述微粒为外来体，所述外来体以高于在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中所表达的水平表达以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种：hsa-miR-146b-5p、hsa-let-7c、hsa-miR-99a、hsa-miR-132、hsa-miR-378、hsa-miR-181a、hsa-let-7b、hsa-miR-100、hsa-let-7e、hsa-miR-23b、hsa-miR-185、hsa-let-7i、hsa-let-7a、hsa-let-7d、hsa-let-7g、hsa-miR-222、hsa-let-7f、hsa-miR-218、hsa-miR-24、hsa-miR-9、hsa-miR-126、hsa-miR-134、hsa-miR-128和hsa-miR-155；所述更高的水平通过倍数调节所计算。
[0750] 48、根据实施例30至47中任一项所述的方法，其中所述微粒为外来体，所述外来体以低于在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中所表达的水平表达以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种：hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-210、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-424、hsa-miR-195、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-103a、hsa-miR-16、hsa-miR-125a-5p、
hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-345、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-17、hsa-miR-7、hsa-miR-106b、hsa-miR-101、hsa-miR-302a、hsa-miR-301a、hsa-miR-183、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-15a、hsa-miR-182、hsa-miR-33a、hsa-miR-96和hsa-miR-18b；所述更高的水平通过倍数调节所计算。
hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-345、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-17、hsa-miR-7、hsa-miR-106b、hsa-miR-101、hsa-miR-302a、hsa-miR-301a、hsa-miR-183、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-15a、hsa-miR-182、hsa-miR-33a、hsa-miR-96和hsa-miR-18b；所述更高的水平通过倍数调节所计算。
[0751] 49、根据实施例30至48中任一项所述的方法，其中所述微粒包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、两种、三种或四种。
[0752] 50、根据实施例30至49中任一项所述的方法，其还进一步包括将外源性核酸、脂类、蛋白质、药物或前药中的一种或多种加载于分离或纯化的微粒中。
[0753] 51、根据实施例50所述的方法，其中所述外源性核酸是能够使一种或多种病理学基因沉默的siRNA。
[0754] 52、一种根据实施例30至51中任一项所述的方法可获得的微粒。
[0755] 53、一种微粒，其是外来体；所述外来体表达DCX、GFAP、GALC、TUBB3、GDNF和IDO中的一种或多种。
[0756] 54、根据实施例52-53中任一项所述的微粒，其中所述外来体以高于在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中所表达的水平表达以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种：hsa-miR-146b-5p、hsa-let-7c、hsa-miR-99a、hsa-miR-132、hsa-miR-378、hsa-miR-181a、hsa-let-7b、hsa-miR-100、hsa-let-7e、hsa-miR-23b、hsa-miR-185、hsa-let-7i、hsa-let-7a、hsa-let-7d、hsa-let-7g、hsa-miR-222、hsa-let-7f、hsa-miR-218、hsa-miR-24、hsa-miR-9、hsa-miR-126、hsa-miR-134、hsa-miR-128和hsa-miR-155；所述更高的水平通过倍数调节所计算。
[0757] 55、根据实施例52-54任一项所述的微粒，其中所述外来体以低于在标准T-175烧瓶中培养的相应干细胞中所表达的水平表达以下miRNA中的一种、两种、三
种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种：hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-210、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-424、hsa-miR-195、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-103a、hsa-miR-16、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-345、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-17、hsa-miR-7、hsa-miR-106b、hsa-miR-101、hsa-miR-302a、hsa-miR-301a、hsa-miR-183、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-15a、hsa-miR-182、hsa-miR-33a、hsa-miR-96和hsa-miR-18b；所述更低的水平通过倍数调节所计算。
种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种：hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-210、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-424、hsa-miR-195、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-103a、hsa-miR-16、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-345、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-17、hsa-miR-7、hsa-miR-106b、hsa-miR-101、hsa-miR-302a、hsa-miR-301a、hsa-miR-183、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-15a、hsa-miR-182、hsa-miR-33a、hsa-miR-96和hsa-miR-18b；所述更低的水平通过倍数调节所计算。
[0758] 56、根据实施例52-55中任一项所述的微粒，其中所述微粒包括hsa-miR-1246,hsa-miR-4492,hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的一种、两种、三种或四种。
[0759] 57、根据实施例52-56中任一项所述的微粒，其用于疗法中。
[0760] 58、根据实施例57所述的微粒，其中所述疗法是用于
[0761] (i)神经病症、疾病或缺损，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风或ALS；
[0762] (ii)溶酶体贮积症；
[0763] (iii)心血管病症，例如心肌梗死、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃疡、伤口愈合；
[0764] (iv)肺病，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、特发性肺动脉高血压、囊性纤维化和哮喘；
[0765] (v)代谢或炎症性病症，例如糖尿病(I或II)、类风湿关节炎、骨关节炎、狼疮、克罗恩氏病、肠易激综合征或移植物抗宿主病；
[0766] (vi)精神病症，例如：抑郁症、躁郁症、精神分裂症或自闭综合征病症(例如自闭症、亚斯伯格综合征或瑞特综合征)；
[0767] (vii)视网膜致盲疾病，例如年龄相关黄斑变性、斯塔加特病、糖尿病性视网膜病或视网膜色素变性；和
[0768] (viii)脱髓鞘病，例如多发性硬化症、脑瘫、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脑白质营养不良、格巴二氏综合征、抗MAG周围神经病和恰克-马利-杜斯氏症。
[0769] 59、一种组合物，其包括根据实施例52-56任一项所述的微粒和干细胞；任选地，其中所述干细胞是微粒所来源的干细胞，例如其中所述干细胞是具有ECACC登记No.04091601的CTX0E03。
[0770] 60、根据实施例59所述的组合物，其用于疗法中。
[0771] 61、根据实施例60所述的组合物，其中所述干细胞和微粒施用：
[0772] (i)以单一药物组合物形式共同施用；
[0773] (ii)同时或同步但分开施用；或，
[0774] (iii)分别且依序施用，例如其中施用所述细胞和微粒之间的持续时间是一小时、一天、一周、两周或两周以上。
[0775] 62、根据实施例60-61中任一项所述的组合物，其中所述治疗诱导接受微粒所来源的干细胞的宿主的耐受性，典型地是免疫耐受性；或其中对干细胞的耐受性通过施用干细胞以及所述的微粒来增加。
[0776] 参考文献
[0777] Ambros等人RNA 2003.9:277-279
[0778] Banerjee,S.,Williamson,D.,Habib,N.,Gordon,M.,Chataway,J.(2011)Age and Ageing 40:7-13
[0779] Chung等人,Cell Stem Cell,2,113-117,2008
[0780] Ding,D.C.,Shyu,W.C.,Lin S.Z.(2011)Cell Transplant 20:5-14
[0781] Einstein,O.,Ben-Hur,T.(2008)Arch Neurol 65:452-456
[0782] Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy. 第 20版,ISBN:0683306472
[0783] Hassani Z,O'Reilly J,Pearse Y,Stroemer P,Tang E,Sinden J,PriceJ,Thuret S."Human neural progenitor cell engraftment increases neurogenesis and microglial recruitment in the brain of rats with stroke."PLoS One.2012；
7(11):e50444.doi:10.1371/journal.pone.0050444.电子版2012年11月21日。
7(11):e50444.doi:10.1371/journal.pone.0050444.电子版2012年11月21日。
[0784] Hodges等人Cell Transplant.2007；16(2):101-15
[0785] Horie,N.,Pereira,N.P.,Niizuma,K.Sun,G.等人(2011)Stem Cells29:274-285。
[0786] Katsuda,Kosaka,Takeshita,Ochiya.Proteomics 2013,00,1-17
[0787] Katsuda,Tsuchiya,Kosaka,Yoshioka,Takagaki,Oki,Takeshita,Sakai,Kuroda,Ochiya.Scientific Reports 2013,3:1197,第1-11页。
[0788] Klimanskaya等人,2006,Nature 444:481-485
[0789] Kornblum,Stroke 2007,38:810-816
[0790] Lai等人"Proteolytic Potential of the MSC Exosome Proteome:Implications for an Exosome-Mediated Delivery of Therapeutic Proteasome".International Journal of Proteomics(2012)Article ID 971907,14页。
[0791] Littlewood,T.D.,Hancock,D.C.,Danielian,P.S. 等 人 (1995)Nucleic Acid Research 23:1686-1690。
[0792] Miljan,E.A. 和 Sinden,J.D.(2009)Current Opinion in MolecularTherapeutics 4:394-403
[0793] Miljan EA,Hines SJ,Pande P,Corteling RL,Hicks C,ZbarskyV,Umachandran,M,Sowinski P,Richardson S,Tang E,Wieruszew M,Patel
S,Stroemer P,Sinden JD.Implantation of c-mycER TAM immortalized human
mesencephalic-derived clonal cell lines ameliorates behavior dysfunction in a rat model of Parkinson's disease.Stem Cells Dev.2009年3月；18(2):307-19
S,Stroemer P,Sinden JD.Implantation of c-mycER TAM immortalized human
mesencephalic-derived clonal cell lines ameliorates behavior dysfunction in a rat model of Parkinson's disease.Stem Cells Dev.2009年3月；18(2):307-19
[0794] Mitchell等人Journal of Immunological Methods 335(2008)98-105
[0795] Pollock等人,Exp Neurol.2006年5月；199(1):143-55。
[0796] Mark F Pittenger；Alastair M Mackay；Stephen C Beck；Rama K Jaiswal等人Science；1999年4月2日；284,5411
[0797] Smith,E.J.,Stroemer,R.P.,Gorenkova,N.,Nakajima,M.等人(2012)Stem Cells30:785-796。
[0798] Stevenato,L.,Corteling,R.,Stroemer,P.,Hope,A. 等 人 (2009)BMCNeuroscience 10:86
[0799] Stroemer,P.,Patel,S.,Hope,A.,Oliveira,C.,Pollock,K.,Sinden,J.(2009)Neurorehabil Neural Repair 23:895-909。
[0800] Théry,C.,Ostrowski,M.,Segura,E. 等 人 (2009)Nature Reviews Immunology9:581-593
[0801] Their等人,"Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells".Cell Stem Cell.2012年3月20日。
[0802] Timmers,L.,Lim,S.K.,Arslan,F.,Armstrong,J.S.等人(2007)Stem Cell Res1:129-137
[0803] Yuan,S.J.,Martin,J，，Elia,J.,Flippin,J.等人(2011)PLoS ONE 6:e17540
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种含银复合凝胶敷料及其制备方法 | 2021-07-02 | 0 |
| 暗疮消炎水 | 2021-02-15 | 3 |
| 用于肌肉生长的方法和组合物 | 2022-05-03 | 2 |
| 一种用于治疗股骨头坏死和脉管炎的中药制剂 | 2020-06-28 | 4 |
| 一种细胞因子基因型检测芯片及其用途 | 2021-10-23 | 0 |
| 使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法 | 2021-11-11 | 5 |
| 一种治疗跌打伤科接骨散 | 2021-05-13 | 6 |
| 基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒 | 2020-07-08 | 1 |
| Cupredoxin家族多肽在癌症治疗中的用途 | 2020-10-17 | 6 |
| 淋巴结疾病智能诊断系统中的数据处理方法 | 2021-10-23 | 1 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈