利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
阅读：1043发布：2020-09-19
专利汇可以提供利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用基因敲入和核移植技术在转基因非人 哺乳动物 生产重组人丁酰胆 碱 酯酶的方法，具体地，本发明提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，所述构建物将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于乳腺特异表达蛋白基因位点并成功 转染 非人哺乳动物胚胎 成 纤维 细胞 ，幼年和成年 体细胞 ，或胚胎干细胞，利用体细胞核移植技术进行克隆从而获得新的个体，其所携带的人丁酰胆碱酯酶基因能使非人哺乳动物乳腺稳定表达并分泌人丁酰胆碱酯酶全酶或 单体 。本发明方法所生产的重组蛋白可用于 预防 和 治疗 神经毒剂和有机磷化合物中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他 农作物 、各种物件层面及 土壤 的有机磷化合物残留。，下面是利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件：
A1-B1-C-D1-E1-F (式I)
式中，
(i)A1为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
(ii)B1为剪接接受位点序列；
(iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
(iv)D1为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶cDNA3’末端UTR序列；
(v)E1为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内显子1区域；
(vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列。
2.一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式II中所示的元件：
A2-B2-C-D2-E2-F (式II)
式中，
(i)A2为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
(ii)B2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽；
(iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
(iv)D2为终止密码子或无；
(v)E2为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前；
(vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列。
3.如权利要求1或2所述的构建物，其特征在于，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BChE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BChE。
4.如权利要求1或2所述的构建物，其特征在于，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组：
(i)氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶；
(ii)氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；
(iii)氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1或2所述的构建物。
6.一种用于定点整合的“构建物－载体”组合，其特征在于，所述的组合包括(a)权利要求1或2所述的构建物；和(b)辅助进行基因敲入的TALEN载体，所述的TALEN载体表达特异性识别整合位点的TALEN酶和对整合位点进行切割的FokI酶。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞中含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求1或2所述的构建物。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组：乳腺上皮细胞，胚胎成纤维细胞，体细胞，胚胎干细胞，或胚胎新生细胞。
9.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)应用如权利要求7所述宿主细胞作为供体细胞转入去核卵母细胞，从而在体外形成胚胎；
(ii)将上一步骤的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而制得转基因非人哺乳动物；
其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。
10.一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)饲养雌性的、如权利要求9所述方法所制备的转基因非人哺乳动物，从而使所述动物在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和
(ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
11.一种乳汁原料，其特征在于，所述乳汁由雌性的、如权利要求9所述方法所制备的转基因非人哺乳动物所分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。
12.一种分离或纯化的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用权利要求10所述方法制备的。
13.一种制造药物组合物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
将(i)权利要求12所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。
14.权利要求12所述的重组蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制备预防和/或治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物。
利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰
胆碱酯酶的方法
技术领域
背景技术
[0002] 所谓转基因动物制药即是将药物蛋白基因导入到动物体内，例如牛或奶山羊，然后使药物从乳腺或其它器官中生产出来，通过提纯等工序制成基因工程药品。此法的特点是产量高，成本低，药物生物学活性稳定，高产量，高质量，能耗低，无污染；但技术较复杂，前期投资较高。近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的发明，转基因动物制药已成为研发非常活跃的领域。西方发达国家已有三十多年转基因动物制药开发历史，技术已趋成熟。最近，美国GTC公司在羊奶中生产的 (一种人体抗凝血蛋白)已获欧洲EMEA和FDA批准，进入欧洲和美国市场。这是第一个通过转基因在羊奶中生产的上市药品，对转基因工业界而言具有里程碑意义。中国虽然在此领域的科学研究已取得进展，但工业化则刚刚起步。
[0003] 胆碱酯酶是一类参与神经递质传递的酯酶总称，其主要功能是在神经胆碱能突触水解乙酰胆碱。此类突触存在于人类、其他脊椎动物及昆虫的神经系统。当这些突触不断发射信号时，肌肉、腺体和神经元会受到刺激或抑制。神经递质乙酰胆碱的作用是传递这些刺激信号，而胆碱酯酶通过水解乙酰胆碱阻止其信号传递。胆碱酯酶抑制物质如有机磷化合物或氨基甲酸酯类杀虫剂及药物能阻止乙酰胆碱水解，造成乙酰胆碱堆积，从而引起神经系统过度活跃。人类和其他动物若接触胆碱酯酶抑制物质，取决于其类型和数量，可造成从轻度如抽搐、颤抖等到严重如呼吸麻痹、惊厥等症状。在极端情况下，引起死亡。
[0004] 胆碱酯酶可由不同数量的催化和非催化亚基组成。这两种酶都由约600个氨基酸的亚单位组成并糖基化。根据其底物偏好和对选择性抑制剂的敏感性，胆碱酯酶分为两大类。那些优先水解乙酰胆碱酯类如乙酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂BW284C51敏感，被称为乙酰胆碱酯酶(AChE)，或乙酰胆碱乙酰水解酶(EC3.1.1.7)。乙酰胆碱酯酶又称真实型，特异型，纯正型，红细胞型，或I型胆碱酯酶，是一种膜结合糖蛋白，并以不同分子形式存在于红细胞、神经末梢、肺、脾和大脑灰质。乙酰胆碱酯酶在体内主要用于水解乙酰胆碱。
[0005] 那些优先水解其他类酯如丁酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(ISO-OMPA)敏感，被称为丁酰胆碱酯酶(BChE，EC3.1.1.8)。丁酰胆碱酯酶也被称为假性丁酰胆碱酯酶或非特异丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶优先使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为其体外反应底物。该酶存在于哺乳动物血浆、肝、胰、肠粘膜、中枢神经系统白质、平滑肌和心脏。丁酰胆碱酯酶的具体功能尚不明晰，它没有已知的特定自然底物，虽然它也水解乙酰胆碱。一般认为，它是乙酰胆碱酯酶在血液中的备用酶。
[0006] 尽管丁酰胆碱酯酶有因阻止有机磷化合物中毒而作为广泛应用药物的潜能，但由于供应受限目前无法广泛使用。由于提供保护所需的1:1化学计量比，需大量丁酰胆碱酯酶进行有效治疗。目前只能从人血浆中提取。远远不能满足各种需求。
[0007] 鉴于丁酰胆碱酯酶的重要药用潜力，研究主要集中利用基因工程方法研发和生产。不同于血浆生产酶类，重组丁酰胆碱酯酶传播传染性病原体包括病毒，如丙型肝炎和艾滋病毒的风险要低很多。据报道，重组丁酰胆碱酯酶已在下列系统中表达：大肠杆菌，显微注射爪蟾卵母细胞，体外昆虫细胞系及昆虫幼虫体内，家蚕，以及哺乳动物COS细胞和CHO细胞。然而，许多基因工程生产的丁酰胆碱酯酶只具备很少或没有体内酶活性，这些表达系统不足以产生足够数量可实际应用的丁酰胆碱酯酶。
[0008] 此外，虽然有利用转基因山羊奶生产出丁酰胆碱酯酶的研究，但由于转基因山羊是经配子微注射方法而获得，不仅周期长而且转基因效率很低，只有5%左右。由于转基因动物所产重组人丁酰胆碱酯酶为四聚体，二聚体和单体的混合物(PNAS104：13603-13608,2007)，不利于质量控制和后续加工，因此产业化难度较大。另外，由于重组人丁酰胆碱酯酶编码序列是随机整合于转基因山羊基因组，不能完全克服和解决随机整合点染色体位置效应作用的难题。因此个体间表达并分泌重组人丁酰胆碱酯的水平相差较大，无法得到表达载体所拥有的山羊自身内源性调控元件，如酪蛋白启动子，原有功能的正常体现。虽然绝缘体DNA序列在一些染色体区域可能起到克服位置效应的作用，但要完全克服和解决这一难题，只能将外源基因定点整合至转基因动物基因组。
[0009] 综上所述，现有技术中的各种表达或分离纯化系统或者不能生产或分离纯化足够数量具活性的重组人丁酰胆碱酯酶，或者所生产的具活性的重组人丁酰胆碱酯酶产品不均一化，因此本领域迫切需要开发新的稳定、高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。
发明内容
[0010] 本发明的目的就是提供一种稳定、高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。
[0011] 本发明的第一方面，提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件：
[0012] A1-B1-C-D1-E1-F (式I)
[0013] 式中，
[0014] (i)A1为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0015] (ii)B1为剪接接受位点序列；较佳地，所述的剪接接受位点序列为AG)；
[0016] (iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0017] (iv)D1为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶cDNA3’末端UTR序列；
[0018] (v)E1为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内显子1区域；
[0019] (vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列。
[0020] 在另一优选例中，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式Ia中所示的元件还可以是：
[0021] A1-B1-C-D1-E1a-F1 (式Ia)
[0022] 式中，
[0023] (i)A1为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0024] (ii)B1为剪接接受位点序列；较佳地，所述的剪接接受位点序列为AG)；
[0025] (iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0026] (iv)D1为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶cDNA3’末端UTR序列；
[0027] (v)E1a为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列；
[0028] (vi)F1为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内显子1区域。
[0029] 在另一优选例中，当所述供体构建物导入或整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0030] 在另一优选例中，所述的信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽。
[0031] 在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白。
[0032] 在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组：丁酰胆碱酯酶，血清白蛋白。
[0033] 本发明的第二方面，提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式II中所示的元件：
[0034] A2-B2-C-D2-E2-F (式II)
[0035] 式中，
[0036] (i)A2为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0037] (ii)B2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽；
[0038] 在另一优选例中，所述的2A衍生多肽为N端含RKRR的2A多肽；
[0039] (iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0040] (iv)D2为终止密码子或无；
[0041] (v)E2为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前；
[0042] (vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列。
[0043] 在另一优选例中，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式IIa中所示的元件：
[0044] A2-B2-C-D2-E2a-F2 (式IIa)
[0045] 式中，
[0046] (i)A2为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0047] (ii)B2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽；
[0048] 在另一优选例中，所述的2A衍生多肽为N端含RKRR的2A多肽；
[0049] (iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0050] (iv)D2为终止密码子或无；
[0051] (v)E2a为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列；
[0052] (vi)F2为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前。
[0053] 在另一优选例中，所述的定点整合是in-frame整合(不引入移码突变)。
[0054] 在另一优选例中，当定点整合位点刚好位于所述蛋白基因组序列的终止密码子之前从而保留该终止密码子时，所述的D2为无。
[0055] 在另一优选例中，当所述构建物导入或整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0056] 在另一优选例中，所述的信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽。
[0057] 在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白。
[0058] 在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组：丁酰胆碱酯酶，血清白蛋白。
[0059] 在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BChE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BChE。
[0060] 在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组：
[0061] (i)氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶；
[0062] (ii)氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；
[0063] (iii)氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0064] 在另一优选例中，所述的重组蛋白编码序列选自下组：
[0065] (i)核苷酸序列如SEQ ID No.:4所示的重组人丁酰胆碱酯酶编码DNA序列；
[0066] (ii)核苷酸序列如SEQ ID No.:5所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列；
[0067] (iii)核苷酸序列如SEQ ID No.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。
[0068] 本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面或第二方面所述的构建物。
[0069] 本发明的第四方面，提供了一种用于定点整合的“构建物－载体”组合，所述的组合包括(a)本发明第一方面或第二方面所述的构建物；和(b)辅助进行基因敲入的TALEN载体，所述的TALEN载体表达特异性识别整合位点的TALEN酶和对整合位点进行切割的FokI酶。
[0070] 本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞中含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第一或第二方面所述的构建物。
[0071] 在另一优选例中，所述的宿主细胞用本发明第四方面所述的“构建物－载体”组合共同转染后，还从基因组中敲除所述F、E1a或E2a中的抗性基因。
[0072] 在另一优选例中，所述的敲除是通过Cre酶处理。
[0073] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞(非生殖细胞)，更佳地选自山羊、绵羊、牛、兔、啮齿动物(大鼠、小鼠)。
[0075] 在另一优选例中，所述的体细胞为成年或幼年细胞。
[0076] 本发明的第六方面，提供了一种制备转基因非人哺乳动物的方法，包括步骤：
[0077] (i)应用如本发明第五方面提供的宿主细胞作为供体细胞转入去核卵母细胞，从而在体外形成胚胎；
[0078] (ii)将上一步骤的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而制得转基因非人哺乳动物；
[0079] 其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。
[0080] 在另一优选例中，所述的转基因非人哺乳动物为雌性。
[0081] 在另一优选例中，相对于整合位点所对应的乳腺特异表达蛋白而言，所述的转基因非人哺乳动物所分泌的乳汁中所含的该乳腺特异表达蛋白仍为野生型。
[0082] 在另一优选例中，所述的转基因非人哺乳动物所分泌的乳汁中含有的乳腺特异表达蛋白为野生型（当2A衍生多肽为N端含RKRR的2A多肽时，可导致该衍生多肽被完全切除，从而形成野生型乳腺特异表达蛋白）。
[0083] 本发明的第七方面，提供了一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，包括步骤：
[0084] (i)饲养雌性的、如本发明第六方面所述方法所制备的转基因非人哺乳动物，从而使所述动物在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和
[0085] (ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0086] 本发明的第八方面，提供了一种乳汁原料，所述乳汁由雌性的、如本发明第六方面所述方法所制备的转基因非人哺乳动物所分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。
[0087] 在另一优选例中，所述的乳汁中含有的乳腺特异表达蛋白为野生型。
[0088] 本发明的第九方面，提供了一种分离或纯化的重组蛋白，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用本发明第七方面所述方法制备的。
[0089] 本发明第十方面，提供了一种制造药物组合物的方法，该方法包括步骤：
[0090] 将(i)本发明第九方面所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。
[0091] 本发明第十一方面，提供了本发明第九方面所述的重组蛋白的用途，用于(i)制备预防和/或治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物。
[0092] 根据本发明方法所产生的重组人丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶单体和丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白氨基酸序列分别见SEQ ID NO.:1、2和3。根据本发明方法所产生的重组人丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶单体和丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列分别见SEQ ID NO.:4、5和6。
[0094] 图1A显示了本发明一个实例中山羊β-酪蛋白基因内显子1敲入供体构建物示意图。SA-BChE，具剪接接受位点的BChE编码序列；图1B为载体示意图；图1C为载体经Notl酶切后的电泳图(1%琼脂糖)，其中1列为酶切消化载体，2为DNA分子量标记。
[0095] 图2A显示了本发明一个实例中山羊β-酪蛋白基因外显子8敲入供体构建物示意图，2A-BChE，2A多肽-BChE编码序列；图2B显示了2A-BChEβ-酪蛋白基因敲入供体载体示意图。
[0096] 图3A显示了本发明一个实例中山羊β-酪蛋白基因内显子1敲入TALEN核酸酶载体示意图；图B显示了载体经酶切后的电泳图(1%琼脂糖)，其中1列为DNA分子量标记；2列为TALEN-R BamHI+HindIII双切酶；3列为TALEN-R EcoRI+Notl双切酶；4列为TALEN-LBamHI+HindIII双切酶；5列为TALEN-L EcoRI+Notl双切酶。
[0098] 图5显示了本发明一个实例中山羊β-酪蛋白基因内显子1敲入供体构建物在TALEN载体帮助下整合于内显子1示意图。SA-BChE，具剪接接受位点的BChE编码序列。
[0099] 图6显示了本发明一个实例中山羊β-酪蛋白基因外显子8敲入供体构建物在TALEN载体帮助下整合于外显子8示意图。2A-BChE，2A多肽-BChE编码序列。
[0100] 图7显示了本发明一个实例中从羊奶纯化的丁酰胆碱酯酶变性银染SDS-电泳图。1，非转基因山羊奶；2，转基因山羊奶；3，人丁酰胆碱酯酶单体阳性对照；4，从羊奶纯化的丁酰胆碱酯酶。
[0101] 发明详述
[0102] 本发明人经过广泛而深入的研究，利用乳腺特异表达蛋白基因组序列，采用特定的转基因构建物，从而在不影响转基因非人哺乳动物正常表达所述乳腺特异表达蛋白的前提下，首次成功地在乳腺中实现丁酰胆碱酯酶的特异性稳定高效表达。在此基础上完成了本发明。
[0103] 具体地，本发明人利用非人哺乳动物乳腺特异表达蛋白DNA调控序列和3’末端序列，构建乳腺特异表达蛋白基因敲入供体构建物，将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于该乳腺特异表达蛋白基因位点。所述位点包括(a)内含子1区域或(b)终止密码子之前区域；优选的，所述位点包括(a)内含子1区域或(b)最后一个外显子编码序列与终止密码子之间的区域。在载体的3’末端亦连接了NEO抗性基因和Cre-LoxP序列，用于细胞转染筛选和NEO抗性基因序列的切除。本发明使用该基因敲入供体构建物和TALEN载体共同转染非人哺乳动物胚胎成纤维细胞，幼年和成年体细胞，或胚胎干细胞，筛选同源重组的阳性细胞作为供体，利用体细胞核移植技术进行克隆从而获得新的个体，其所携带的人丁酰胆碱酯酶基因能在乳腺特异表达蛋白DNA调控序列指导下在非人哺乳动物乳腺稳定表达并分泌人丁酰胆碱酯酶全酶或单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。本发明方法不仅转化效率高、生产周期短，而且能稳定高效生产全酶和均一单体产品，易于进行质量控制和后续加工，因此特别适合大规模产业化应用。在此基础上完成了本发明。应用本发明方法所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷化合物残留。
[0104] 1.丁酰胆碱酯酶
[0105] 如本文所用，“丁酰胆碱酯酶”指用本发明转基因动物乳腺生物反应器平台稳定大规模生产出的重组人丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶包括丁酰胆碱酯酶及同工酶，或衍生物，或变异体，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体与其他蛋白(如白蛋白)的融合蛋白。
[0106] 可用于本发明的丁酰胆碱酯酶没有特别限制，可以是来源于任何生物体的丁酰胆碱酯酶，优选来自于哺乳动物(如灵长类动物)，更佳地来源于人。此外，应理解，“丁酰胆碱酯酶”包括野生型或突变型(包括截断型)的丁酰胆碱酯酶，只要该突变型丁酰胆碱酯酶保留或保持了野生型丁酰胆碱酯酶的解毒活性。
[0107] 人丁酰胆碱酯酶cDNA序列已被克隆(美国专利号5215909)。此外，美国专利号5248604揭示了人类乙酰胆碱酯酶的非糖基化的变异体。野生型人类丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列，以及几个丁酰胆碱酯酶变异体单一氨基酸的变化，在美国专利号6001625也有披露。
[0108] 在本发明中，特别优选的是截断型丁酰胆碱酯酶，尤其是去除了C末端的多个lys残基所获得的BCHE，例如截断的、不含C末端最后40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶(简称为“delC40-BChE”)。因为3个赖氨酸残基处于被删除的40个残基中，生产出的规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化处理的有效性。
[0109] 实验表明，截断的delC40-BChE显示与原酶具同样催化性能。
[0110] 另一种优选方式是截断型丁酰胆碱酯酶与其他蛋白(如白蛋白)形成的融合蛋白。
[0111] 本发明蛋白由于成分均一，因此特别适合进行后加工或修饰，以便获得改善的性能，其中包括(但并不限于)：聚乙二醇修饰等。
[0112] 聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能。多肽或蛋白吸附亲水性PEG分子后，能提高水溶性并形成一个屏障，以防止酶降解、肾脏清除、与细胞表面蛋白发生相互作用和形成中和抗体，从而延长多肽或蛋白的半衰期。
[0114] 2.丁酰胆碱酯酶选择
[0115] 丁酰胆碱酯酶正常情况下形成球状四聚体，分子量约为340kDa。该形式最稳定，首选用于治疗目的。野生型，变异体，和人工丁酰胆碱酯酶可通过根据本发明的转基因哺乳动物而产生。由此产生的丁酰胆碱酯酶具有中和和/或水解有机磷农药，毒气，琥珀酰胆碱，或可卡因的能力。
[0116] 根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶所包含的氨基酸序列与发现的哺乳动物丁酰胆碱酯酶序列最好基本相同，更好与人丁酰胆碱酯酶序列基本相同。本发明所生产的丁酰胆碱酯酶可为四聚体，三聚体，二聚体，或单体。本发明所产生的丁酰胆碱酯酶最好具有与自然人丁酰胆碱酯酶基本类似的糖基化属性。根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶最好与人血清白蛋白融合以增加其血浆半衰期。
[0117] 1).四聚体丁酰胆碱酯酶
[0118] 根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶最好是四聚体形式。该形式更稳定，并具有较长的血浆半衰期，从而增加其疗效。丁酰胆碱酯酶在CHO细胞的重组表达被发现不是以更稳定的四聚体形式存在，而是包括约55%二聚体，10%-30%四聚体和15-40%单体(Biochem J327:747-757，1997)。有研究表明，富含脯氨酸的胶原尾部蛋白的N-末端氨基酸序列可将乙酰胆碱酯酶组装成四聚体(J Biol Chem272:3016-3021,1997；J Biol Chem272:22840-22847，1997)。因此，为了提高根据本发明所产生的丁酰胆碱酯酶的四聚体含量，编码丁酰胆碱酯酶的DNA序列可包含富含脯氨酸附属区域(PRAD)，该区域帮助组装重组丁酰胆碱酯酶亚单位(例如，单体，二聚体和三聚体)从而形成四聚体。该区域最好包括至少6个残基，后跟至少10个脯氨酸残基。一个在本发明中PRAD的实例包括下列氨基酸序列Glu-Ser-Thr-(Gly)3-(Pro)10。该PRAD可能被包括在一个编码PRAD和丁酰胆碱酯酶的双顺反子表达构建体，或在不同的表达构建体。此外，PRAD编码可定向附于丁酰胆碱酯酶编码。本发明还包括在重组丁酰胆碱酯酶混合物中添加合成的(例如，聚脯氨酸)或天然存在的PRAD，以诱导丁酰胆碱酯酶重排为四聚体。
[0119] 2).非四聚体丁酰胆碱酯酶
[0120] 虽然四聚体丁酰胆碱酯酶是有机磷中毒预防和治疗的最有效形式，本发明也包括已表明底物活性的其他形式的丁酰胆碱酯酶(例如，单体，二聚体和三聚体)。然而，非四聚体形式丁酰胆碱酯酶在体内不太稳定的观察不能排除它们在体内应用的有效性。非四聚体较高剂量或更频繁在体内给药可以导致满意的治疗结果。
[0121] 丁酰胆碱酯酶非四聚体可用于许多并不需要在体内给药的场合，如清理用于存储有机磷化合物的场地，以及军事设备有机磷的去污。作为体外应用，这些非四聚体可制成海绵，喷雾剂，清洁溶液或其他材料用于清洁设备和人员。非四聚体也可应用于已暴露于有机磷化合物的人类患者的皮肤和外衣。非四聚体也可以作为障碍物和密封剂用于化学战中军事服装和防毒面具的接缝和关闭处。
[0122] 此外，生产规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化的有效性。聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能，从而延长重组蛋白的半衰期。
[0123] 3).产生编码突变体丁酰胆碱酯酶的核酸序列
[0124] 野生型人丁酰胆碱酯酶氨基酸序列载于编号为6001625的美国专利，该专利还公开了在117位由组氨酸取代甘氨酸残基(定义为G117H)的突变体丁酰胆碱酯酶。该突变体丁酰胆碱酯酶已被证明对由有机磷化合物引起的失活特别耐受(Biochemistry36：786-795，1997)。许多在本领域已知的方法，如PCR，位点定向体外诱变技术，包括连接子插入，嵌套删除，连接子扫描，和寡核苷酸介导的诱变等，可用于在编码丁酰胆碱酯酶核酸序列引入突变。这类突变型丁酰胆碱酯酶，其催化性能，温度分布，稳定性，循环时间和与可卡因或其他底物及/或特定的有机磷化合物的亲和性可发生改变；其四聚体，二聚体或单体形成可增加或减少；或其它所需功能发生改变。在本发明中，可应用这些编码突变型丁酰胆碱酯酶的核酸序列。
[0125] 一种优选的方法，如核酸序列或DNA的“混洗”(shuffling)，可产生重组编码突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列的资料库，用于产生和识别突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列。将所获资料库在一个合适的宿主细胞系表达以筛选和生产具有所需特性的突变型丁酰胆碱酯酶。
[0126] 另一种优选的方法，如利用计算机模型进行分子动力学模拟(PNAS102：16656-16661，2005)，可用于模拟能更有效水解有机磷化合物的丁酰胆碱酯酶蛋白结构稳定优化环境，从而发现比野生型丁酰胆碱酯酶更有效催化有机磷化合物的突变型丁酰胆碱酯酶。
[0127] 4).自然存在的丁酰胆碱酯酶变异体
[0128] 丁酰胆碱酯酶编码基因在人类有四个主要的等位基因形式和其他25个与遗传缺陷有关的形式(见表1)。四个主要的等位基因形式为Eu，Ea，Ef和Es。Eu为野生具全功能的等位基因，含表型EuEu或UU。Ea等位基因被称为非典型丁酰胆碱酯酶,含纯合子表型(EaEa=AA)的人血清对大多数酶底物只有微弱反应，并显示对地布卡因抑制酶活性抵抗力增加。Ef等位基因也产生较弱酶活性，但呈现对氟化物抑制抵抗力增加。Es与缺乏酶活性(沉默)有关。
[0129] 某些人群携带非典型丁酰胆碱酯酶编码基因，他们能正常水解乙酰胆碱，但不能水解一种常用麻醉剂，如琥珀酰胆碱。这个问题常见于一种非典型变异体Es，其中3-6%的白人人口为杂合子，约0.05%为纯合子。另一个变型体，E1，导致纯合子血清丁酰胆碱酯酶催化活性完全缺失。携带非典型或沉默丁酰胆碱酯酶编码基因人群手术后可能发生呼吸暂停。因此，该类人群服用重组丁酰胆碱酯酶可减轻或防止长时间手术后呼吸暂停。
[0130] 表1.人丁酰胆碱酯酶表型结构基础
[0131]
[0132] 数字代表信号肽被裂解后成熟野生型人丁酰胆碱酯酶残基的位置。
[0133] 5).丁酰胆碱酯酶单体-人血清白蛋白融合蛋白
[0134] 根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶要实现血浆稳定性和较长半衰期的另一种方法是提供重组丁酰胆碱酯酶单体与人血清白蛋白(HSA)融合。该融合蛋白具有高血浆稳定性和全身均匀分布，具弱免疫原性或无免疫原性。例如，HSA可以通过一个含6个甘氨酸和1个丝氨酸的连接肽融合于丁酰胆碱酯酶N-末端或C-末端。
[0135] 3.用于乳腺特异表达的供体构建物构建
[0136] 应用于本发明的基因工程方法系标准已知程序(如“分子克隆实验室手册”第二版等)。这些标准的分子生物学技术，可以用来准备本发明的用于乳腺特异表达的供体构建物，该构建物可包括一个或多个以下基本组件。
[0137] 1).启动子
[0138] 这些序列可衍生自哺乳动物的乳腺特异性基因。适合的乳腺特异性启动子和其他基因序列包括：乳清酸性蛋白(WAP)启动子(美国专利号5831141和6268545；Proc Natl Acad Sci USA84：1299-1303，1987)；αS1-酪蛋白(美国专利号5750172和6013857，PCT公开号WO91/08216和WO93/25567)；αS2-酪蛋白，β-酪蛋白(美国专利号5304489；Nucleic Acids Res16：1027-1041，1988)；κ-酪蛋白(Gene174：27-34，1996；Transgenic Res5：271-279，1996)；β-乳球蛋白(Biochem J310：637-641，1995)；和α-乳清蛋白(Eur J Biochem186：43-48，1989；PCT公开号WO88/01648)。
[0139] 2).内含子
[0140] 含有内含子序列(即基因组序列)的核酸序列相比无内含子的序列表达量较高。因此，在转录起始位点和转译起始密码子之间及3’末端和转译终止密码子之间，或丁酰胆碱酯酶编码核酸序列内部插入内含子序列可导致该酶较高表达水平。这样的内含子序列，包括5’端剪接位点(供体位点)和3’端剪接位点(受体位点)，至少被100个非编码序列碱基对分开。这些内含子序列可衍生自其启动子被用来驱动丁酰胆碱酯酶表达的基因，自然丁酰胆碱酯酶基因，或其它合适基因的基因组序列。应选择这样的内含子序列，以尽量减少表达盒内重复序列的存在，因为这样的重复序列可增加重组机会，从而造成结构不稳定。
这些内含子最好位于丁酰胆碱酯酶编码核酸序列之内，与自然人丁酰胆碱酯酶基因的内含子/外显子结构类似。
这些内含子最好位于丁酰胆碱酯酶编码核酸序列之内，与自然人丁酰胆碱酯酶基因的内含子/外显子结构类似。
[0141] 3).2A多肽编码序列
[0142] 2A多肽是发现于病毒中的一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列，类似于IRES，利用2A可以实现单一启动子同时表达两个基因。它也广泛存在于各类真核细胞。与IRES不同的是，下游蛋白表达量不会减少。但剪切后2A多肽残基与上游蛋白连为一体，可在上游蛋白和2A多肽间加入一种Furin蛋白酶剪切点（4个碱性氨基酸残基，如Arg-Lys-Arg-Arg）以从上游蛋白末端完全切除2A多肽残基。
[0143] 4).信号序列
[0144] 每个载体将另外包括能提供从宿主细胞分泌重组丁酰胆碱酯酶的信号序列。这样的信号序列存在于能分泌其蛋白产物的自然基因。本发明可采用来自于丁酰胆碱酯酶基因，宿主细胞特异性表达基因(例如，酪蛋白)，或另一个其蛋白产物已知分泌基因(例如，人碱性磷酸酶，蜂毒，免疫球蛋白轻链蛋白Igκ，及CD33)，或可合成的信号序列。
[0145] 5).终止区域
[0146] 每个载体将另外包括核酸序列，该序列包含转录终止和多聚腺苷酸化序列。该序列被链接于丁酰胆碱酯酶编码核酸序列的3’末端。这些序列可包括其5’端区域驱动丁酰胆碱酯酶表达基因的3’末端和多聚腺苷酸化信号(即非人哺乳动物乳腺特异表达蛋白基因的3’末端)。或者，这样的序列来自于该序列已被证明可以调节转录后mRNA稳定性的基因(例如，那些来自于牛生长激素基因，β-珠蛋白基因，或SV40早期启动子区域的序列)。
[0147] 6).其他功能
[0148] TALEN序列针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如剔出、敲入或点突变。该载体引入TALEN序列，具有高活性，使乳腺特异表达蛋白基因位点丁酰胆碱酯酶基因序列敲入操作变得更加简单、方便。在载体的3’末端亦连接了NEO抗性基因和Cre-LoxP序列，用于细胞转染筛选和NEO抗性基因序列的切除。
[0149] 载体还包括利于表达结构克隆和繁衍的载体序列。用于本发明并在领域中已知的的标准载体包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体，病毒载体，和酵母人工染色体。载体序列可包含在大肠杆菌中繁衍的复制原点；SV40的复制原点；用于宿主细胞选择的青霉素，新霉素，或嘌呤霉素抗性基因；和/或扩增显性选择标记基因(如二氢叶酸还原酶基因)及其他感兴趣的基因。
[0150] 4.转染细胞系体外生成
[0151] 本发明的表达盒可被体外转染入宿主细胞中。体外宿主细胞最好是哺乳动物细胞系，包括乳腺上皮(MAC-T)细胞，胚胎成纤维细胞，幼年和成年体细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞。
[0152] 哺乳动物细胞体外培养方法在领域里早已建立(Animal Cell Culture:A Practical Approach3rd Edition.J Masters，ed Oxford University Press and Basic Cell Culture2nd Edition.Davis，JM ed Oxford University Press，2002)。转染技术在领域里早已成熟，包括电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，磷酸钙介导的转染，或病毒介导的转染等。进行稳定转染宿主细胞操作，最好是用本发明制备的载体DNA导入。转染的体外细胞系可通过NEO抗性基因进行筛选。细胞系的基因组DNA通过PCR和/或Southern印迹进行分析鉴定。然后，同源重组阳性细胞NEO抗性基因通过Cre-LoxP系统进行切除。NEO序列切除后，细胞系的基因组DNA通过PCR和/或Southern印迹进行分析鉴定。
[0153] 5.转基因哺乳动物的产生
[0154] 上述稳定转染的宿主细胞可用作核移植供体转移至卵母细胞受体(Nature385：810-813，1997)。核移植所用稳定转染宿主细胞，并不需要是多能或全能性。比如，可以使用稳定转染的胚胎成纤维细胞(Science280：1256-8，1998；Biol Reprod64：849-856，2001)。
卵母细胞受体在核移植前需去核。核移植后，卵母细胞被转移到一个假孕母性以怀孕和分娩。所产后代为全转基因。
卵母细胞受体在核移植前需去核。核移植后，卵母细胞被转移到一个假孕母性以怀孕和分娩。所产后代为全转基因。
[0155] 转基因在动物，组织或相关细胞基因组DNA中的存在，及转基因拷贝数可通过在相关领域中公认的技术包括杂交和PCR技术而确认。
[0156] 直接通过转基因方法产生的全转基因后代可被用于繁殖以维持转基因品系，及特性描述或分离重组丁酰胆碱酯酶。由乳腺特异性启动子驱动的转基因表达可诱导和维持转基因动物哺乳期；所收集的乳汁可用于重组酶的纯化和特性描述。对于转基因雌性，可通过怀孕或服用激素诱导哺乳期。对于转基因雄性，可通过服用激素诱导哺乳期(Biotechnology12：699-702，1994)。哺乳期通过持续收集乳汁而维持。
[0157] 6.重组丁酰胆碱酯酶的纯化
[0158] 重组丁酰胆碱酯酶可应用普鲁卡因胺亲和层析方法从分泌丁酰胆碱酯酶转染细胞体外培养液和转基因动物表达丁酰胆碱酯酶乳腺乳汁中分离(Biochemistry36：786-795，1997)。
[0159] 从培养液纯化时，在应用普鲁卡因胺分析柱程序前将培养液离心或过滤以除去细胞碎片。培养液也可通过超滤浓缩。
[0160] 从乳汁纯化时，在应用普鲁卡因胺分析柱程序前，可通过常规方法(如使用切向流系统)来去除酪蛋白和脂肪。为提高重组丁酰胆碱酯酶纯度，可应用一些附加步骤如蓝色琼脂糖CL-6B层析或过硫酸铵分馏加离子交换层析。酶的纯度可通过反相HPLC评估。纯化后的重组丁酰胆碱酯酶可用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300区分四聚体和单体。
[0161] 7.丁酰胆碱酯酶特点检测分析
[0162] 所述检测方法可用来从转染细胞培养液和转基因动物乳汁中分析重组丁酰胆碱酯酶活性，稳定性，结构特征，以及体内功能。体外丁酰胆碱酯酶活性检测各种方法已在领域公知(J Biol Chem253：361-366，1978；Biochemistry36：786-795，1997；Biotechnol Appl Biochem31：226-229，2000；Biochem J327：747-757，1997)。通过使用Ellman活性测定待测样品是否存在重组丁酰胆碱酯酶活性(Biochem Pharmacol7：88-95，1961)。通过非变性的4-30%聚丙烯酰胺梯度凝胶与2mM二乙氧膦酰硫胆碱碘化物作为底物染色可估算丁酰胆碱酯酶活性水平(Biochemistry36：786-795，1997)，这种方法是一种采用2MM丁酰硫代胆碱作为底物的变形实验(J Histochem Cytochem12：219，1964)。使用这些方法以丁酰硫代胆碱或乙酰硫代胆碱作为底物，丁酰胆碱酯酶的催化活性包括Km，Vmax，和Kcat值可被确定。其他在领域中已知的方法亦可被用于评估胆碱酯酶功能包括电测法，分光光度法，色谱法，和辐射方法等。纯化后的重组丁酰胆碱酯酶可用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300区分四聚体和单体。丁酰胆碱酯酶的四聚体，二聚体和单体的相对含量，也可通过非变性的4-30%聚丙烯酰胺梯度凝胶与2mM二乙氧膦酰硫胆碱碘化物作为底物染色估算(Biochemistry36：786-795，1997)。一些单克隆抗体可用于重组丁酰胆碱酯酶功能域的特性描述。可以使用竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)定量样品中丁酰胆碱酯酶蛋白的浓度。重组丁酰胆碱酯酶特性可进一步被在本领域中熟知的标准技术包括N-末端测序，碳水化合物含量测定(尤其是末端唾液酸含量)，胰蛋白酶和碳水化合物定位，和体外稳定性测定。例如，可分析重组丁酰胆碱酯酶单糖和寡糖基团的成份，分布和结构(Biochemistry36：7481-7489，1997)。
[0163] 重组丁酰胆碱酯酶样品对有机磷中毒或可卡因毒性潜在的临床有效性可在体外和体内进行评估。例如，潜在底物梭曼，沙林和塔崩的体外有机磷酸酐水解酶活性可在pH稳态下使用含重组丁酰胆碱酯酶溶液测量。重组丁酰胆碱酯酶中和VX和二乙氧膦酰硫胆硷的活性可在微量滴定板使用修饰的Ellman方法进行测量，以OP化合物替换丁酰硫代胆碱作为底物。丁酰胆碱酯酶催化水解可卡因的效应可用经温度平衡后240nm Gilford分光光度计记录(Mol Pharmacol55：83-91，1999)。
[0164] 重组丁酰胆碱酯酶样品在体内的半衰期和对有机磷中毒的保护作用可在动物模型中评估，如啮齿类或灵长类动物(Toxicol Applied Pharm145：43-53，1997；J Pharmacol Exp Ther259：633-638，1991；Pharmacol Biochem Behav46：889-896，1993；Biochem Pharmacol41：37-41，1991；Life Sciences72：125-134，2002)。重组丁酰胆碱酯酶血液峰浓度可经动物肌内注射后被测定(Biochem Pharmacol45：2465，1993)。同样，重组丁酰胆碱酯酶样品在体内的半衰期和对可卡因毒性的保护作用可在动物模型中评估(J Toxicol Clin Toxicol34：259-266，1996；Toxicol Appl Pharmacol145：363-371，1997)。
[0165] 8.应用
[0166] 本发明所涉及的丁酰胆碱酯酶包括丁酰胆碱酯酶及同工酶，或衍生物，或变异体，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体与白蛋白的融合蛋白，可用于预防和治疗神经毒气中毒，有机磷农药中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。
[0167] 暴露于有机磷化合物可以导致各种各样的症状，这取决于化合物的毒性，所涉及化合物的浓度，曝露的途径，及持续曝露的时间。在轻度曝露情况下，可能会出现如疲劳，虚弱，头晕，流涕，支气管分泌物增加，恶心，视力模糊等症状。中度症状可能包括胸闷，头痛，出汗，流泪，流涎，大汗，呕吐，视野狭窄，及肌肉抽搐等。严重症状包括腹部绞痛，不自主排尿和腹泻，肌肉震颤，抽搐，步态蹒跚，瞳孔缩小，血压下降(异常低的血压)，心跳缓慢，呼吸困难，昏迷，甚至死亡。有机磷中毒的严重病例只出现在持续每天吸收有机磷农药后，或暴露于毒性最大的有机磷化学战剂。当有机磷农药中毒的症状开始出现，一般不可能判断中毒是否轻微或严重。在许多情况下，当出现皮肤污染时，症状可迅速从轻微发展至严重，即使污染区域被清洗。一些毒性最大的有机磷化合物被用作神经毒剂包括塔崩(GA)，甲基对硫磷，沙林(GB)，VX，梭曼(GD)，二异丙基氟磷酸，及PB。这些化合物很容易通过皮肤吸收，并可被吸入或摄入。无论引入途径如何，神经毒剂中毒的症状通常相似。
[0168] 一些最常用的有机磷农药包括乙酰甲胺磷(乙酰甲胺磷)，丙硫特普杀虫剂，谷硫磷(Guthion)，克百威(呋喃丹，F制剂)，硫磷(Trithion)，毒虫畏(Birlane)，毒死蜱(Dursban，Lorsban)，蝇毒磷(Co-Ral)，巴毒磷(Ciodrin，Ciovap)，育畜磷(Ruelene)，吸磷(Systox)，二嗪(Spectracide)，敌敌畏(DDVP,Vapona)，百治磷(Bidrin)，乐果等。常用的氨基甲酸酯类农药包括涕灭威(Temik)，恶虫(Ficam)，合杀威，甲萘威(西维因)，克百威(呋喃丹)，伐虫脒(Carzol)，甲硫威(Mesurol)，灭多威(Lannate，Nudrin)，杀线威(Vydate)，抗蚜威(pinmicarb，Pirimor)和残杀威(Baygon)。
[0169] 本发明提供了一种有机磷中毒的治疗方法，包括给所需对象(如病人)施用治疗有效剂量的本发明的重组丁酰胆碱酯酶。本发明还提供了治疗和改善因暴露于有机磷化合物而导致的症状，以及预防因暴露于这些化合物而出现症状的方法。这些方法涉及在曝露于有机磷化合物之前、之中、或之后，给受试者施用有效剂量的重组丁酰胆碱酯酶。
[0170] 本发明还涉及用于治疗手术后琥珀酰胆碱诱导呼吸暂停和可卡因中毒的方法。这些方法包括给手术后琥珀酰胆碱诱导呼吸暂停或可卡因中毒病人施用有效剂量的重组丁酰胆碱酯酶。
[0171] 本发明具有以下主要优点：
[0172] (1)人丁酰胆碱酯酶高稳定表达。本发明首次提出利用非人哺乳动物乳腺特异表达蛋白DNA调控序列和3’末端序列，构建乳腺特异表达蛋白基因敲入供体构建物，将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于乳腺特异表达蛋白基因位点；当所述含乳腺特异表达蛋白基因敲入供体构建物整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺稳定表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0173] (2)药品高活性，人源化。由于转基因动物体系属高等真核生物体系，解决了转译后修饰的问题，保证了药品的生物学活性。此外，基因来源于人，解决了异体排斥问题。
[0174] (3)高产量，高质量。转基因动物以乳腺作为生物反应器应用多，效果好。奶天然蛋白总量在3%左右，其主要乳蛋白含量占总蛋白二分之一。因此，可获得高产量和高纯度的转入蛋白。这有助于降低制药成本，简化纯化工作。并且由于纯化步骤减少,生物药品活性易于保持,质量提高。
[0175] (4)高效益，低成本。经测算，利用细胞培养方法生产1克药物蛋白，成本需800-5000美元，而利用转基因动物只需0.02-0.5美元。奶牛每年可产纯蛋白40公斤，奶山羊2.5-5公斤，家兔0.1公斤。所以产量高，单位成本低。
[0177] （6）转基因动物能保持正常生理代谢反应。乳腺是一个外分泌器官，由于乳汁不进入体内循环，因此不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。
[0178] (7)降低大动物转基因费用，缩短转基因动物生产周期。本发明先将目的基因预先转入到体细胞中，然后从转染细胞中筛选含所需整合位点的细胞用于克隆，不仅可选择表达量合适的细胞系作为克隆核供体，而且可大幅缩短制备转基因动物的时间。
[0179] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0180]SEQ ID NO.: 类型 序列说明
1 氨基酸序列 人丁酰胆碱酯酶
2 氨基酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体(delC40-BChE)
3 氨基酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白
4 核苷酸序列 人丁酰胆碱酯酶编码序列
5 核苷酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体编码序列
6 核苷酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码序列
7-20 核苷酸序列 引物
1 氨基酸序列 人丁酰胆碱酯酶
2 氨基酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体(delC40-BChE)
3 氨基酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白
4 核苷酸序列 人丁酰胆碱酯酶编码序列
5 核苷酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体编码序列
6 核苷酸序列 人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码序列
7-20 核苷酸序列 引物
[0181] 实验材料：化学试剂购自Sigma-Aldrich公司；所用内切酶和其他分子生物学试剂购于NEB和Promega公司；培养基购自Gibco公司。
[0182] 实施例1.山羊β-酪蛋白基因敲入供体构建物No.1构建
[0183] 1.1整合于山羊β-酪蛋白基因内显子1的β-酪蛋白基因敲入供体构建物构建：
[0184] (i)使用含SacI，NotI，SalI位点和部分山羊β-酪蛋白基因5’端同源臂序列的顺式引物如SEQ ID NO.:7所示，和位于山羊β-酪蛋白启动子内显子1中游内切位点含BamHI位点的反式引物如SEQ ID NO.:8所示，以从山羊血液分离的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，从而获得2kb的扩增产物(5'同源臂序列)，该扩增产物接着通过SacI-BamHI酶切被克隆到pCDNA1-Neo质粒（Invitrogen公司）而形成pbCN5-Neo。
[0185] (ii)应用含BamHI位点，山羊β-酪蛋白信号序列和部分人丁酰胆碱酯酶cDNA序列的顺式引物如SEQ ID NO.:9所示，及含XhoI，AscI，AgeI，PmeI位点和部分人丁酰胆碱酯酶cDNA3’端序列的反式引物如SEQ ID NO.:10所示，经PCR扩增，从人丁酰胆碱酯酶cDNA克隆(ATCC＃65726)获得人丁酰胆碱酯酶cDNA。该1.7kb PCR产物被克隆至pGEM-T Easy质粒(Promega公司)。经测序验证后，经BamHI-XhoI消化从而获得丁酰胆碱酯酶基因插入子。纯化后的丁酰胆碱酯酶基因插入子经BamHI-XhoI位点连接至上述pbCN5-Neo质粒以生成pbCN5-BChE-Neo质粒。
[0186] (iii)3’同源臂序列制备：使用含AgeI位点和部分山羊β-酪蛋白内显子1DNA序列的顺式引物如SEQ ID NO.:11所示和含AscI位点及部分山羊β-酪蛋白内显子1下游DNA序列的反式引物如SEQ ID NO.:12所示，以山羊基因组为模板，通过DNA扩增获得约2kb的PCR产物（包括内显子1下游序列），作为3’同源臂序列。
[0187] (iv)用AgeI-AscI酶切上述pbCN5-BChE-Neo质粒，用AgeI-AscI酶切的PCR产物，然后进行连接反应，从而形成pbCN-BChE-Neo质粒。
[0188] (v)应用含AscI位点，LoxP序列和部分Neo编码序列的顺式引物如SEQ ID NO.:13所示，及含XhoI，SalI，NotI，位点，LoxP序列和部分Neo编码序列的反式引物如SEQ ID NO.:14所示，经PCR扩增，从上述pCDNA1-Neo质粒获得含Neo抗性基因的、约1.5kb PCR扩增产物。该扩增产物通过AscI-XhoI位点连接至以上pbCN-BChE-Neo质粒以生成pbCN-BChEKI1-Neo质粒(图1)。
[0189] 1.2(1)通过基因合成的方法，合成约8kb长DNA片段包括：
[0190] (a)SalI，NotI，AscI位点和山羊β-酪蛋白基因5’臂端DNA序列；
[0191] (b)FseI位点，SA位点，β-酪蛋白信号肽编码序列和人丁酰胆碱酯酶编码序列；
[0192] (c)AgeI，PmeI位点，Lox-P位点和Neo基因序列；
[0193] (d)ApaI，SwaI位点，山羊β-酪蛋白基因3’臂端DNA序列和NotI，SalI位点。
[0194] (2)上述8kb长DNA片段通过SalI位点与pUC57连接形成β-酪蛋白基因内显子1敲入载体pUC57-SA-BChE（图1）。
[0195] 实施例2.山羊β-酪蛋白基因敲入供体构建物No.2构建
[0196] 2.1整合于山羊β-酪蛋白基因外显子8的β-酪蛋白基因敲入供体构建物构建：
[0197] (i)使用含SacI，NotI，SalI位点和部分山羊β-酪蛋白基因序列的顺式引物如SEQ ID NO.:15所示和含AgeI位点，部分2A-多肽编码序列和部分山羊β-酪蛋白基因序列的反式引物如SEQ ID NO.:16所示，以从山羊血液分离的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，从而获得2kb的扩增产物，该扩增产物接着通过SacI-AgeI酶切被克隆到实施例1中所述pbCN-BChEKI1-Neo而形成pbCN52-Neo。
[0198] (ii)应用含AgeI位点，部分2A-多肽编码序列，山羊β-酪蛋白信号序列和部分人丁酰胆碱酯酶cDNA序列的顺式引物如SEQ ID NO.:17所示，及含XhoI，AscI，BamHI位点和部分人丁酰胆碱酯酶cDNA3’端序列的反式引物如SEQ ID NO.:18所示，经PCR扩增，从上述pbCN-BChEKI1获得人丁酰胆碱酯酶cDNA。该1.7kb PCR产物被克隆至pGEM-T Easy质粒(Promega公司)。经测序验证后，经AgeI-XhoI消化从而获得丁酰胆碱酯酶基因插入子。纯化后的丁酰胆碱酯酶基因插入子经AgeI-XhoI位点连接至上述pbCN52-Neo质粒以生成pbCN52-2A-BChE-Neo质粒。
[0199] (iii)用BamHI-AscI酶切上述pbCN52-2A-BChE-Neo质粒，并与经BamHI-AscI酶切的1.2kb PCR产物连接，从而形成pbCN-2A-BChE-Neo质粒。该PCR产物(3'同源臂序列)包括外显子8下游，是使用含BamI位点和部分山羊β-酪蛋白外显子8，9DNA序列的顺式引物如SEQ ID NO.:19所示)和含AscI位点及部分山羊β-酪蛋白基因3’DNA序列的反式引物如SEQ ID NO.:20所示，从山羊基因组DNA扩增而来。
[0200] (iv)应用含AscI位点，LoxP序列和部分Neo编码序列的顺式引物如SEQ ID NO.:13所示，及含XhoI，SalI，NotI，位点，LoxP序列和部分Neo编码序列的反式引物如SEQ ID NO.:14所示，经PCR扩增，从pCDNAI-Neo质粒获得含Neo抗性基因的、约1.5kb PCR扩增产物。该扩增产物通过AscI-XhoI位点连接至上述pbCN-2A-BChE-Neo质粒以生成pbCN-2A-BChEKI2-Neo质粒(图2)。
[0201] 2.2(1)通过基因合成的方法，合成约6.8kb长DNA片段包括：
[0202] (a)SalI，NotI，AscI位点和山羊β-酪蛋白基因5’臂端DNA序列；
[0203] (b)FseI位点，SA位点，β-酪蛋白信号肽编码序列和人丁酰胆碱酯酶编码序列；
[0204] (c)AgeI，PmeI位点，Lox-P位点和Neo基因序列；
[0205] (d)ApaI，SwaI位点，山羊β-酪蛋白基因3’臂端DNA序列和NotI，SalI位点。
[0206] (2)上述6.8kb长DNA片段通过SalI位点与pUC57连接形成β-酪蛋白基因外显子8敲入载体pUC57-2A-BChE（图2）。
[0207] 实施例3 TALEN载体构建：
[0208] 根据通过基因合成的方法构建TALEN载体（图3）。
[0209] 实施例4.转基因种羊的产生
[0210] 无菌手术切取大约1g左右的山羊乳腺实质组织，放入细胞培养液中尽快带回无菌间；组织块用含青霉素(300IU／mL)、链霉素(300IU／mL)的Hanks液洗涤3次洗去乳迹和血污后，再去除脂肪和结缔组织，并将腺泡组织剪成小块。剪碎的组织块置I型胶原酶+透明质酸酶的消化液中消化4-5小时后，收集分散的单细胞，并用培养液洗3遍后调整细胞浓度接种到培养皿中。置37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，待细胞贴壁后，更新培养液，此后每3天换液1次。待细胞生长到基本铺满培养皿底部后，用0.25%胰蛋白酶或0.15%胰蛋白酶与0.02%EDTA的混合液控时消化单层细胞，传代数次获得纯化的山羊乳腺上皮细胞。并将含GFP质粒提取、纯化后，电穿孔（Invitrogen Neon Transfection System）转化体外培养的第4代山羊乳腺上皮细胞以确定细胞电转染效率。用D-hanks′液洗涤并重悬细胞
6
2-3次，然后用穿孔液重悬细胞1x10cells/mL，添加1μg GFP质粒DNA混合。取100μl进行电穿孔后转移至培养瓶中培养；2天后添加G418筛选培养。图4显示经电转染后的GFP阳性山羊乳腺上皮细胞。应用山羊乳腺上皮细胞转染转基因表达盒，既能根据转染细胞分子生物学特征筛选阳性细胞，又能让阳性转染细胞经激素激活其β-酪蛋白基因启动子表达目的蛋白从而进一步筛选阳性细胞供核移植(NT)使用。
6
2-3次，然后用穿孔液重悬细胞1x10cells/mL，添加1μg GFP质粒DNA混合。取100μl进行电穿孔后转移至培养瓶中培养；2天后添加G418筛选培养。图4显示经电转染后的GFP阳性山羊乳腺上皮细胞。应用山羊乳腺上皮细胞转染转基因表达盒，既能根据转染细胞分子生物学特征筛选阳性细胞，又能让阳性转染细胞经激素激活其β-酪蛋白基因启动子表达目的蛋白从而进一步筛选阳性细胞供核移植(NT)使用。
[0211] 从第27-30天的奶山羊胚胎中分离出胚胎细胞，主要含胚胎成纤维细胞，并在Dulbecco改良Eagle培养液中经38℃，5%二氧化碳培养，辅以20%胎牛血清(FBS)和20微克/毫升庆大霉素。当细胞达70%融合时，经0.05%胰蛋白酶-EDTA处理，收集细胞，计数，用10%DMSO和90%FBS等份冻结。少量细胞置于玻片进行细胞遗传学分析。解冻染色体正常的冷冻细胞用于转染β-酪蛋白基因敲入载体DNA以产生稳定细胞系。稳定细胞系通过脂质介导的基因转移法而产生。
[0212] 实施例1或2的上述β-酪蛋白基因敲入内显子1供体构建物或外显子8供体构建物分别与构建的TALEN载体(通过电穿孔（Invitrogen Neon Transfection System）)h或根据制造商的说明使用脂质共同转染到细胞中，并经G418筛选。阳性细胞经PCR，DNA印迹和FISH分析，和激素诱导蛋白表达从而筛选出合适稳定克隆。这些细胞克隆通过Cre-LoxP系统切除NEO抗性基因。外显子8供体载体上与β-酪蛋白相连的2A衍生多肽可通过引入的酶剪切点（RKRR），从而从β-酪蛋白末端完全切除，这样在转基因动物中仍产生野生型β－酪蛋白，从而有利于减少生理副作用。经上述处理和筛选的细胞株，供核移植(NT)使用（图5和图6）。筛选过的阳性细胞置于24或96孔内经DMEM+10%FBS培养，直至100%融合。然后用低浓度血清培养液(DMEM+0.5%FBS+20微克/毫升庆大霉素)置换，细胞经38℃，5%二氧化碳培养4-8天直至核移植。核移植前，供体细胞经0.05%胰蛋白酶-EDTA处理，清洗2次，与含1%BSA EmCare培养液混合。
[0213] 10-15卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，每个在50毫升覆盖矿物油的成熟培养液中经38℃，5%二氧化碳培养。成熟培养液包含M199辅以小牛LH(0.02单位)，小牛FSH(0.02单位)，雌二醇-17β(1微克/毫升)，0.2mM丙酮酸钠，卡那霉素(50微克/毫升)，和10%热灭活的羊血清。23-24小时的成熟期过后，通过振荡位于EmCare培养液含1毫克/毫升透明质酸酶内的卵丘-卵母细胞复合体1-2分钟以去除卵丘细胞。裸露的卵母细胞用处理介质(EmCare含1%FBS)清洗，并返回到成熟培养液中。卵母细胞去核过程在卵母细胞裸露后1小时内启动。
[0214] Hoechst染色的卵母细胞，其细胞质经短暂接触紫外线以确定染色体位置，室温下(24-26℃)在没有加入细胞松弛素B的处理介质(EmCare含1%FBS)中进行去核处理，并观察和记录整个去核过程。取出的细胞质通过暴露于UV光线以检测染色体和极体的存在。
[0215] 去核卵母细胞和分散的供体细胞在处理介质中操作。用吸管将小于20微米具平滑质膜的供体细胞拾取和滑入去核卵母细胞的卵周隙，细胞-卵母细胞质立即融合。4-6个融合体为1组在1个覆盖山梨糖醇融合培养液(0.25M山梨糖醇，100mM醋酸钙，
0.5mM乙酸镁，0.1%BSA)，500毫米间隙的融合腔电极之间手动对齐。用BTX Electrocell Manipulator200对融合体作1个2.39千伏/厘米的简短融合脉冲(15毫秒)，然后放入含25微升培养液(修饰的SOFaa培养液含0.35mM磷酸盐和8毫克/毫升BSA)孔内，叠加矿物油，在38.5-39℃，5%二氧化碳，7%氧气和88%氮气中培养。1小时后在立体显微镜下观察融合。尚未融合的细胞如上所述进行第二次融合脉冲。2-3小时后，应用钙离子霉素和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)方法激活融合体(Dev Biol166：729–739，1994)，在DMAP中培养2.5-4小时，用处理介质洗涤，放入含25微升培养液(低磷酸盐SOFaa培养液或G1.2)孔内，叠加矿物油(平均每孔含10个胚胎)。卵裂发育(2-4细胞期)在36小时能观察到。第3天胚胎移植至同步的处于第2天周期的羊代孕母体。所有代孕山羊在妊娠35日和60日经超声波检查，并记录胎儿发育。妊娠147天或148天注射8mg地塞米松(Azium)，12小时间隔第2次和第3次注射同样药物以诱导分娩，第3次注射加上125毫克clorprostenol(Estrumate)。记录新羊数目和出生体重。
0.5mM乙酸镁，0.1%BSA)，500毫米间隙的融合腔电极之间手动对齐。用BTX Electrocell Manipulator200对融合体作1个2.39千伏/厘米的简短融合脉冲(15毫秒)，然后放入含25微升培养液(修饰的SOFaa培养液含0.35mM磷酸盐和8毫克/毫升BSA)孔内，叠加矿物油，在38.5-39℃，5%二氧化碳，7%氧气和88%氮气中培养。1小时后在立体显微镜下观察融合。尚未融合的细胞如上所述进行第二次融合脉冲。2-3小时后，应用钙离子霉素和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)方法激活融合体(Dev Biol166：729–739，1994)，在DMAP中培养2.5-4小时，用处理介质洗涤，放入含25微升培养液(低磷酸盐SOFaa培养液或G1.2)孔内，叠加矿物油(平均每孔含10个胚胎)。卵裂发育(2-4细胞期)在36小时能观察到。第3天胚胎移植至同步的处于第2天周期的羊代孕母体。所有代孕山羊在妊娠35日和60日经超声波检查，并记录胎儿发育。妊娠147天或148天注射8mg地塞米松(Azium)，12小时间隔第2次和第3次注射同样药物以诱导分娩，第3次注射加上125毫克clorprostenol(Estrumate)。记录新羊数目和出生体重。
[0216] 实施例5.转基因种羊及后代的检测和繁殖
[0217] 克隆新羊出生后约4天取血进行PCR分析以确认转基因。扩增后，DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳分离。应用Roche Diagnostics公司DIG系统Southern印迹(BMC Biotechnol5：9，2005)，基于在同样质重PCR阴性山羊基因组DNA中混合不同浓度表达质粒DNA和克隆山羊基因组DNA之间比较化学发光信号强度，对转基因动物的转基因拷贝数进行评估与确认。用荧光原位杂交技术(FISH)(Chromosoma102：325-332，1993)确认转基因山羊的转基因整合位点。转基因克隆羊与奶山羊种羊交配，获得转基因后代，转基因后代母羊，再进行交配、产子，获得转基因羊奶。用Ellman法在转基因克隆母羊奶检测重组人丁酰胆碱酯酶表达浓度。从雄性转基因山羊精子库通过对非转基因母山羊进行人工授精以扩大转基因山羊种群。
[0218] 实施例6.重组人丁酰胆碱酯酶的纯化
[0219] 所有纯化程序在20℃±2℃进行，除非另有说明。
[0220] 含重组人丁酰胆碱酯酶羊奶(实施例3)通过切向流过滤系统除去脂肪和酪蛋白，超过80%的重组人丁酰胆碱酯酶被回收。用7个柱床体积的缓冲液含10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，140mM NaCl，清洗澄清的乳汁(乳清)，并使用30kD过滤器进行浓缩。乳清加样到经相同缓冲液平衡过的HQ50离子交换柱(Applied BioSystems)。收集含重组人丁酰胆碱酯酶的洗脱液。同一交换柱用10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，1M氯化钠缓冲液清洗以移除任何捕获的杂质。HQ50洗脱液随后加载到预先用10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，140mM NaCl缓冲液平衡过的普鲁卡因胺亲合柱。用10个柱床体积的相同平衡缓冲液洗涤该柱，用
10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，500mM NaCl缓冲液洗脱蛋白。纯化蛋白经无菌过滤，并保存于4℃。用Ellman法检测纯化重组人丁酰胆碱酯酶活性，并测定总蛋白质浓度。蛋白纯度和结构(包括测定四聚体，二聚体或单体)通过SDS-PAGE银染法染色（图7）和反相HPLC测定。
10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，500mM NaCl缓冲液洗脱蛋白。纯化蛋白经无菌过滤，并保存于4℃。用Ellman法检测纯化重组人丁酰胆碱酯酶活性，并测定总蛋白质浓度。蛋白纯度和结构(包括测定四聚体，二聚体或单体)通过SDS-PAGE银染法染色（图7）和反相HPLC测定。
[0221] 其中，图7中3为人丁酰胆碱酯酶单体的阳性对照(约90kd)，而4为从羊奶纯化的本发明丁酰胆碱酯酶单体。
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