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用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物

阅读：1020发布：2020-12-01

专利汇可以提供用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供针对特定神经蛋白的抗体及其使用方法。，下面是用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.结合BACE1的分离的抗体或其片段，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合BACE1的活性位点。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合BACE1的外结合位点。
4.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的高变区(HVR)序列：SEQ ID NO：7-19，22-26，28-30，35-47，56-79和118-122。
5.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的序列：
HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GFX30FX31X32X33X34IH(SEQ ID NO：
45)，其中X30＝N或T；X31＝S，L或Y；X32＝G或Y；X33＝Y或S；并且X34＝A，G或S；HVR-H2包含氨基酸序列X35X36ISPX37X38GX39TX40YADSVKG(SEQ ID NO：46)，其中X35＝A或G；X36＝W或S；X37＝A或Y；X38＝G或S；X39＝S或Y；并且X40＝D或S；并且HVR-H3包含氨基酸序列X41PX42X43X44X45X46X47MDY(SEQ ID NO：47)，其中X41＝Q或G；X42＝T或F；X43＝H或S；X44＝Y或P；X45＝Y或W；X46＝Y或V并且其中X47任选包含序列YAKGYKA(SEQ ID NO：48)。
6.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的序列：
HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GX71X72X73X74X75X76X77IH(SEQ ID NO：
120)，其中X71＝F或Y；X72＝F，N或T；X73＝F或Y；X74＝L，Q，I，S或Y；X75＝G或Y；X76＝Y或S；并且X77＝A，G或S；HVR-H2包含氨基酸序列X78X79ISPX80X81GX82X83X84YADSVKG(SEQ ID NO：121)，其中X78＝A或G；X79＝W或S；X80＝A，S，Q或Y；X81＝G或S；X82＝S，K，L或Y；X83＝T或Y；并且X84＝D或S；并且HVR-H3包含氨基酸序列X85PX86X87X88X89X90X91MDY(SEQ ID NO：122)，其中X85＝Q或G；X86＝T或F；X87＝H，Y或S；X88＝Y或P；X89＝Y或W；X90＝Y或V和其中X91任选包含序列YAKGYKA(SEQ ID NO：48)。
7.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的序列：
HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GX53X54X55X56GYGIH(SEQ ID NO：
68)，其中X53＝F或Y；X54＝T或F；X55＝F或Y；X56＝L，Q或I，HVR-H2包含氨基酸序列GWISPX57X58GX59X60DYADSVKG(SEQ ID NO：69)，其中X57＝A，S或Q；X58＝G或S；X59＝S，K或L；X60＝T或Y，其中HVR-H3序列包含氨基酸序列GPFX61PWVMDY(SEQ ID NO：70)，其中X61＝S或Y或SEQ ID NO：79的氨基酸序列。
8.权利要求5的抗体，所述抗体包含HVR-H1序列，所述HVR-H1序列包含氨基酸序列GFTFX13GYX14IH(SEQ ID NO：26)，其中X13＝S或L和X14＝A或G。
9.权利要求6的抗体，所述抗体包含HVR-H1序列，所述HVR-H1序列包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：
71-73。
10.权利要求6的抗体，所述抗体包含HVR-H2序列，所述HVR-H2序列包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：74-78。
11.权利要求6的抗体，所述抗体包含HVR-H3序列，所述HVR-H3序列包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：79。
12.权利要求6的抗体，所述抗体包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，所述HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列对应于对于图1(B)中的克隆YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29和YW412.8.51或图24(A)-(C)中的克隆所示的那些序列。
13.权利要求6的抗体，所述抗体包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，所述HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列对应于对于图2(B)中的克隆Fab12，LC6，LC9和LC10所示的那些序列。
14.权利要求6的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：22或23的HVR-H1序列，SEQ ID NO：
24的HVR-H2序列和SEQ ID NO：25的HVR-H3序列。
15.权利要求14的抗体，其中所述HVR-H1序列是SEQ ID NO：23。
16.权利要求6的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：28的HVR-H1序列，SEQ ID NO：29的HVR-H2序列，和SEQ ID NO：30的HVR-H3序列。
17.权利要求6的抗体，所述抗体包含VH链，所述VH链具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：20，21，27和80-98。
18.权利要求16的抗体，其中所述VH链氨基酸序列是SEQ ID NO：21。
19.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自下组的序列：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX17VX18X19X20X21A(SEQ ID NO：42)，其中X17＝S，D或V；X18＝S或A；X19＝S，T或N；X20＝A或S；X21＝V或L，HVR-L2包含氨基酸序列X22ASX23LYS(SEQ ID NO：43)，其中X22＝S，W，Y或L；X23＝F，S或W，并且HVR-L3包含氨基酸序列QQX24X25X26X27X28X29T(SEQ ID NO：44)，其中X24＝S，F，G，D或Y；X25＝Y，P，S或A；X26＝Y，T或N；X27＝T，Y，D或S；X28＝P或L；并且X29＝F，P或T。
20.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自下组的序列：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX17VX18X19X20X21A(SEQ ID NO：42)，其中X17＝S，D或V；X18＝S或A；X19＝S，T或N；X20＝A或S；X21＝V或L，HVR-L2包含氨基酸序列X62ASX63X64YX65(SEQ ID NO：118)，其中X62＝S，W，Y，F或L；X63＝F，S，Y或W；X64＝L或R；
X65＝S，P，R，K或W，并且HVR-L3包含氨基酸序列QQX66X67X68X69X70X71T(SEQ ID NO：119)，其中X66＝S，F，G，D或Y；X67＝Y，P，S或A；X68＝Y，T或N；X69＝T，Y，D或S；X70＝P，Q，S，K或L；并且X71＝F，P或T。
21.权利要求1的抗体，所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的序列：
HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX1VX2X3X4X5A(SEQ ID NO：17)，其中X1＝D或V；X2＝S或A；X3＝T或N；X4＝S或A；X5＝V或L，HVR-L2包含氨基酸序列X48ASX49X50YX51(SEQ ID NO：56)，其中X48＝S或F；X49＝F或Y；X50＝L或R；X51＝S，P，R，K或W，并且HVR-L3包含氨基酸序列QQFPTYX52PT(SEQ ID NO：57)，其中X52＝L，Q，S或K。
22.权利要求17的抗体，所述抗体包含HVR-L1序列，所述HVR-L1序列包含氨基酸序列RASQX1VX2X3X4X5A(SEQ ID NO：17)，其中X1＝D或V；X2＝S或A；X3＝T或N；X4＝S或A；
X5＝V或L。
23.权利要求19的抗体，所述抗体包含HVR-L2序列，所述HVR-L2序列包含氨基酸序列X6ASFLYS(SEQ ID NO：18)或X15ASX16LYS(SEQ ID NO：41)，其中X6＝S或L；X15＝S，W或Y；
并且X16＝S或W。
24.权利要求19的抗体，所述抗体包含HVR-L3序列，所述HVR-L3序列包含氨基酸序列QQX7X8X9X10X11X12T(SEQ ID NO：19)，其中X7＝S，F，G，D或Y；X8＝Y，P，S，或A；X9＝T或N；
X10＝T，Y，D或S；X11＝P或L；X12＝P或T。
25.权利要求19的抗体，所述抗体包含HVR-L1序列，所述HVR-L1序列包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：35。
26.权利要求20的抗体，所述抗体包含HVR-L2序列，所述HVR-L2序列包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：36-39和SEQ ID NO：58-64。
27.权利要求20的抗体，所述抗体包含HVR-L3序列，所述HVR-L3序列包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：11-16，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：65-67。
28.权利要求20的抗体，所述抗体包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，所述HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列对应于对于图1(A)中的克隆YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29和YW412.8.51和图23(A)-(C)中的克隆所示的那些序列。
29.权利要求20的抗体，所述抗体包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，所述HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列对应于对于图2(A)中的克隆Fab12，LC6，LC9和LC10所示的那些序列。
30.权利要求20的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的HVR-L1序列；
SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的HVR-L2序列；和选自由SEQ ID NO：11-16组成的组的HVR-L3序列。
31.权利要求30的抗体，其中所述HVR-L1序列是SEQ ID NO：7，所述HVR-L2序列是SEQ ID NO：9，并且所述HVR-L3序列是SEQ ID NO：12。
32.权利要求20的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：35的HVR-L1序列；选自由SEQ ID NO：36-39组成的组的HVR-L2序列和SEQ ID NO：40的HVR-L3序列。
33.权利要求20的抗体，所述抗体包含VL链序列，所述VL链序列具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-6，31-34和99-117。
34.权利要求33的抗体，其中所述VL链氨基酸序列是SEQ ID NO：2。
35.权利要求15的抗体，所述抗体还包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L1，含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L3。
36.权利要求34的抗体，所述抗体还包含VH链，所述VH链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
37.分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段结合表位，所述表位包含至少一个选自由以下各项组成的组的BACE1的氨基酸残基：SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；
317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP。
38.权利要求37的抗体，其中所述表位包含SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；317LYS；
327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP。
39.分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段结合表位，所述表位包含至少一个选自由以下各项组成的组的BACE1的氨基酸区域：SEQ ID NO：49的氨基酸315-318；SEQ ID NO：49的氨基酸331-335；SEQ ID NO：49的氨基酸370-381；及其任意组合。
40.权利要求39的抗体，其中所述表位包含SEQ ID NO：49的氨基酸315-318，331-335和370-381。
41.分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段结合BACE1的表位，并且经结合导致BACE1的P6和P7位点的结构的构象变化。
42.分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段结合BACE1的表位，并且经结合诱导SEQ ID NO：49的氨基酸218-231采取随机环结构。
43.权利要求37-42的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1的活性。
44.权利要求1-43中任一项的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
45.权利要求1-44中任一项的抗体，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
46.权利要求1-45中任一项的抗体，所述抗体是抗体片段。
47.权利要求1-45中任一项的抗体，所述抗体是全长IgG1抗体。
48.分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求1-47中任一项所述的抗体。
49.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求48所述的核酸。
50.产生抗体的方法，所述方法包括培养权利要求49所述的宿主细胞以产生所述抗体。
51.免疫缀合物，所述免疫缀合物包含权利要求1-47中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。
52.药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1-47中任一项所述的抗体和药用载体。
53.治疗患有神经疾病或病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的权利要求1-47中任一项所述的抗体。
54.减少患有神经疾病或病症或处于感染神经疾病或病症的风险的患者中的淀粉状蛋白斑的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的权利要求1-47中任一项所述的抗体。
55.抑制患有神经疾病或病症或处于发生神经疾病或病症的风险的患者中的淀粉状蛋白斑形成的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的权利要求1-47中任一项所述的抗体。
56.权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述神经疾病或病症选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病(AD)，外伤性脑损伤，卒中，青光眼，痴呆，肌营养不良(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，佩吉特病，外伤性脑损伤，雷维小体病，脊髓灰质炎后综合征，夏伊-德雷格综合征，橄榄体脑桥小脑萎缩，帕金森病，多系统萎缩，纹状体黑质变性，核上性麻痹，牛海绵状脑病，痒病，克-雅综合征，库鲁病，格-施-沙病，慢性消耗性疾病，致命性家族性失眠症，延髓性麻痹，运动神经元病，卡纳范病，亨廷顿病，神经元蜡样脂褐素沉积症，亚历山大病，图雷特综合征，门克斯扭结发综合征，科凯恩综合征，哈勒沃登-施帕茨综合征，拉福拉病，雷特综合征，肝豆状核变性，莱施-奈恩综合征，以及翁-隆综合征，皮克病，和脊髓小脑性共济失调。
57.权利要求56所述的方法，其中所述神经疾病或病症选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病，卒中，外伤性脑损伤和青光眼。
58.减少患者的淀粉状蛋白-β(Aβ)蛋白的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的权利要求1-47中任一项所述的抗体。
59.权利要求58所述的方法，其中所述患者患有神经疾病或病症，或处于感染神经疾病或病症的风险。
60.权利要求59所述的方法，其中所述神经疾病或病症选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病，卒中，外伤性脑损伤和青光眼。
61.诊断患者的神经疾病或病症的方法，所述方法包括将分离自所述患者的生物样品与权利要求1-47中任一项所述的抗体在适合所述抗体与BACE1多肽结合的条件下接触，并且检测在所述抗体和所述BACE1多肽之间是否形成复合物。
62.确定患者是否适合利用抗-BACE1抗体治疗的方法，所述方法包括将分离自所述患者的生物样品与权利要求1-47中任一项所述的抗体在适合所述抗体与BACE1多肽结合的条件下接触，并且检测在所述抗体和所述BACE1多肽之间是否形成复合物，其中在所述抗体和BACE1之间存在复合物指示患者适合利用抗-BACE1抗体治疗。
63.权利要求61或62所述的方法，其中所述生物样品选自由以下各项组成的组：血清，血浆，唾液，胃分泌物，粘液，脑脊液，淋巴液，神经组织，脑组织，心脏组织或血管组织。
64.权利要求1-47中任一项的抗体，其用作药物。
65.权利要求1-47中任一项的抗体，其用于治疗神经疾病，所述神经疾病选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病(AD)，外伤性脑损伤，卒中，青光眼，痴呆，肌营养不良(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，佩吉特病，外伤性脑损伤，雷维小体病，脊髓灰质炎后综合征，夏伊-德雷格综合征，橄榄体脑桥小脑萎缩，帕金森病，多系统萎缩，纹状体黑质变性，核上性麻痹，牛海绵状脑病，痒病，克-雅综合征，库鲁病，格-施-沙病，慢性消耗性疾病，致命性家族性失眠症，延髓性麻痹，运动神经元病，卡纳范病，亨廷顿病，神经元蜡样脂褐素沉积症，亚历山大病，图雷特综合征，门克斯扭结发综合征，科凯恩综合征，哈勒沃登-施帕茨综合征，拉福拉病，雷特综合征，肝豆状核变性，莱施-奈恩综合征，以及翁-隆综合征，皮克病，和脊髓小脑性共济失调。
66.权利要求1-47中任一项的抗体，其用于减少和/或抑制淀粉状蛋白-β(Aβ)蛋白产生。
67.权利要求1-47中任一项所述的抗体在制备药物中的用途。
68.权利要求67所述的用途，其中所述药物用于治疗神经疾病，所述神经疾病选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病(AD)，外伤性脑损伤，卒中，青光眼，痴呆，肌营养不良(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，佩吉特病，外伤性脑损伤，雷维小体病，脊髓灰质炎后综合征，夏伊-德雷格综合征，橄榄体脑桥小脑萎缩，帕金森病，多系统萎缩，纹状体黑质变性，核上性麻痹，牛海绵状脑病，痒病，克-雅综合征，库鲁病，格-施-沙病，慢性消耗性疾病，致命性家族性失眠症，延髓性麻痹，运动神经元病，卡纳范病，亨廷顿病，神经元蜡样脂褐素沉积症，亚历山大病，图雷特综合征，门克斯扭结发综合征，科凯恩综合征，哈勒沃登-施帕茨综合征，拉福拉病，雷特综合征，肝豆状核变性，莱施-奈恩综合征，以及翁-隆综合征，皮克病，和脊髓小脑性共济失调。
69.权利要求67所述的用途，其中所述药物用于减少和/或抑制淀粉状蛋白-β(Aβ)蛋白产生。
70.被抗体或其片段特异性识别的BACE1表位，所述BACE1表位包含至少一个对应于选自由以下各项组成的组的氨基酸的BACE1的氨基酸残基：SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；
317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP。
71.权利要求70所述的BACE1表位，其中所述表位包含对应于SEQ ID NO：49的
314SER；316GLU；317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP的氨基酸。
72.被抗体或其片段特异性识别的BACE1表位，所述BACE1表位包含至少一个选自由以下各项组成的组的BACE1的氨基酸区域：SEQ ID NO：49的氨基酸315-318；SEQ ID NO：40的氨基酸331-335；SEQ ID NO：49的氨基酸370-381；及其任意组合。
73.权利要求72所述的BACE1表位，其中所述表位包含SEQ ID NO：49的氨基酸
315-318，331-335和370-381。

说明书全文

用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求于2010年11月10日提交的美国临时申请号61/456,642,于2010年11月30日提交的美国临时申请号61/418,310,于2010年12月1日提交的美国临时申请号61/418,850和于2010年12月22日提交的美国临时专利申请号61/426,425的利益，所述全部申请通过引用完整地结合于本文中。
发明领域

[0003] 本发明总体涉及这样的抗体，所述抗体是BACE1拮抗剂，其例如抑制或降低BACE1活性，并且涉及包含所述抗体的组合物。另外的实施方案包括用于治疗和诊断多种神经疾病或病症的方法，以及减少患者中APP和/或Aβ多肽的方法。

[0004] 背景

[0005] 淀粉状变性不是单一的疾病实体，而是多样化组的进行性疾病过程，其表征为被称为淀粉状蛋白的蜡状、淀粉样蛋白质的胞外组织沉积，淀粉状蛋白累积于一种或多种器官或身体系统中。当淀粉状沉淀物累积时，它们开始干扰器官或身体系统的正常功能。存在至少15种不同类型的淀粉状变性。主要形式为没有已知前例的原发性淀粉状变性，跟随一些其他状况的继发性淀粉状变性，和遗传性淀粉状变性。

[0006] 许多老化的疾病是基于或相关于淀粉状蛋白样蛋白，并且被部分表征为促进致病的淀粉状蛋白或淀粉样物质的胞外沉积的形成，以及疾病的进展。这些疾病包括但不限于，神经病症如阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)，雷维小体痴呆(Lewy body dementia)，唐氏综合征(Down′s syndrome)，遗传性脑出血伴淀粉状变性(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis)(Dutch型)；Guam Parkinson-痴呆综合症状(Guam Parkinson-Dementia complex)。基于或相关于淀粉状蛋白样蛋白的其他疾病有进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)，多发性硬化(multiple sclerosis)，克-雅病(Creutzfeld Jacob disease)，帕金森病(Parkinson′s disease)，HIV相关痴呆(HIV-related dementia)，ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotropic lateral sclerosis))，成年型糖尿病(Adult Onset Diabetes)，老年性心脏淀粉状变性(senile cardiac amyloidosis)，内分泌肿瘤，等等，包括黄斑变性在内。

[0007] 多肽β-淀粉状蛋白(Aβ)可能在阿尔茨海默病(AD)的发病中起中心作用。Vassar等，J.Neurosci.29：12787-12794(2009)。Aβ多肽在CNS中累积导致突触功能障碍，轴突变性和神经元死亡。AD患者的脑显示显著神经病理病变的特征性病理学，如神经原纤维紊乱(NFTs)，和富含淀粉状蛋白的老年斑。淀粉状蛋白斑的主要成分是Aβ。这些病变与中枢神经系统(CNS)神经元群体的大量损失相关，并且其进展伴随与AD相关的临床痴呆。

[0008] Aβ是前体蛋白(β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP或APP))的蛋白水解产物。APP是I型跨膜蛋白，其相继被两个蛋白酶，β-和γ-分泌酶切割。β-分泌酶，被称为β-位淀粉状蛋白前体蛋白裂解酶1(BACE1)，首先将APP裂解以暴露Aβ的N末端，由此产生被称为C99的膜结合片段。Vassar等，J.Neurosci.，29：12787-12794(2009)和UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817(BACE1_HUMAN)。然后，γ-分泌酶能够将C99裂解以产生成熟的Aβ多肽。产生的Aβ具有异源C末端，其长度范围为38个氨基酸至43个氨基酸。42个氨基酸形式的Aβ(Aβ42)是纤维蛋白原形式的Aβ，并且在患有唐氏综合征的患者中过量产生，并且提示在AD的早期发病中起作用。Vassar等，J.Neurosci.29：12787-12794(2009)。BACE1因此变为治疗靶标，因为其抑制将可能抑制APP和Aβ产生。

[0009] 实际上，BACE1敲除小鼠(BACEl-/-)不产生脑Aβ，这证实了BACE1是主要的(如果不是唯一的)负责在脑中产生Aβ的酶。Roberds等，Human Mol.Genetics10：1317-1324(2001)。此外，AD模型中的BACE1敲除小鼠不形成淀粉状蛋白斑；认知缺陷和胆碱能功能障碍也得到拯救。McConlogue等，J.Biol.Chem.282：26326-26334(2007)；Ohno等，Neuron41：27-33(2004)；和Laird等，J.Neurosci.25：11693-11709(2005)。此外，BACE1杂合敲除小鼠具有减少的斑块形成，这表明BACE1活性的完全抑制对于斑块减少不是必要的。McConlogue等，J.Biol.Chem.282：26326-26334(2007)。

[0010] 最近，APP已经被证实是死亡受体6(DR6)的配体，其触发依赖于胱天蛋白酶的神经元细胞体死亡和轴突消减(axon pruning)。Nikolaev等，Nature457：981-989(2009)。此外，BACE1化合物抑制剂破坏轴突和细胞体的变性。同上。这些结果指向这样的模型，在所述模型中APP通过结合DR6可以促进AD。

[0011] 有利的是具有一种有效的BACE1的治疗性抑制剂以减少患有神经疾病和病症(如AD)的患者中的APP和Aβ产生。本文中提供的发明涉及这样的抑制剂，包括其在多种方法中的用途。

[0012] 本文中引用的所有参考资料，包括专利申请和出版物，通过引用完整地结合。

[0013] 概述

[0014] 本发明提供BACE1拮抗剂抗体及其使用方法。具体地，所述抗体抑制或降低BACE1的活性。

[0015] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性。特别地，所述抗体结合BACE1的活性位点或BACE1的外结合位点(exosite)。

[0016] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含至少一个选自由以下各项组成的组的高变区(HVR)序列：SEQ ID NO：7-19，22-26，28-30，35-47，56-79和118-122。

[0017] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含至少一个选自由以下各项组成的组的序列：HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GFX30FX31X32X33X34IH(SEQ ID NO：45)，其中X30＝N或T；X31＝S，L或Y；X32＝G或Y；X33＝Y或S；并且X34＝A，G或S；HVR-H2包含氨基酸序列X35X36ISPX37X38GX39TX40YADSVKG(SEQ ID NO：46)，其中X35＝A或G；X36＝W或S；X37＝A或Y；X38＝G或S；X39＝S或Y；并且X40＝D或S；并且HVR-H3包含氨基酸序列X41PX42X43X44X45X46X47MDY(SEQ ID NO：47)，其中X41＝Q或G；X42＝T或F；X43＝H或S；X44＝Y或P；X45＝Y或W；X46＝Y或V和其中X47任选包括序列YAKGYKA(SEQ ID NO：48)。备选地，所述抗体包含HVR-H1序列，所述HVR-H1序列包含氨基酸序列GFTFX13GYX14IH(SEQ ID NO：26)，其中X13＝S或L和X14＝A或G；或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；以及SEQ ID NO：28。

[0018] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含至少一个选自由以下各项组成的组的序列：HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GX71X72X73X74X75X76X77IH(SEQ ID NO：120)，其中X71＝F或Y；X72＝F，N或T；X73＝F或Y；X74＝L，Q，I，S或Y；X75＝G或Y；X76＝Y或S；并且X77＝A，G或S；HVR-H2包含氨基酸序列X78X79ISPX80X81GX82X83X84YADSVKG(SEQ ID NO：121)，其中X78＝A或G；X79＝W或S；X80＝A，S，Q或Y；X81＝G或S；X82＝S，K，L或Y；X83＝T或Y；并且X84＝D或S；并且HVR-H3包含氨基酸序列X85PX86X87X88X89X90X91MDY(SEQ ID NO：122)，其中X85＝Q或G；X86＝T或F；X87＝H，Y或S；X88＝Y或P；X89＝Y或W；X90＝Y或V，并且其中X91任选包括序列YAKGYKA(SEQ ID NO：48)。备选地，所述抗体包含HVR-H1序列，所述HVR-H1序列包含氨基酸序列GX53X54X55X56GYGIH(SEQ ID NO：68)，其中X53＝F或Y；X54＝T或F；X55＝F或Y；X56＝L，Q或I；或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：71-73。备选地，所述抗体包含HVR-H2序列，所述HVR-H2序列包含氨基酸序列GWISPX57X58GX59X60DYADSVKG(SEQ ID NO：69)，其中X57＝A，S或Q；X58＝G或S；X59＝S，K或L；X60＝T或Y；或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：74-78。备选地，所述抗体包含HVR-H3序列，所述HVR-H3序列包含氨基酸序列GPFX61PWVMDY(SEQ ID NO：70)，其中X61=S或Y；或SEQ ID NO：79的氨基酸序列。

[0019] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-H1序列，所述HVR-H1序列包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：71-73。

[0020] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-H2序列，所述HVR-H2序列包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：74-78。

[0021] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-H3序列，所述HVR-H3序列包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：79。

[0022] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，所述HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列对应于对于图1(B)中的克隆YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29和YW412.8.51所述的那些或对于图2(B)中的克隆Fab12，LC6，LC9和LC10所述的那些或图24A-C中所述的那些克隆。

[0023] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：22或23的HVR-H1序列，SEQ ID NO：24的HVR-H2序列和SEQ ID NO：25的HVR-H3序列。在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：23的HVR-H1序列，SEQ ID NO：24的HVR-H2序列和SEQ ID NO：25的HVR-H3序列。在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：28的HVR-H1序列，SEQ ID NO：29的HVR-H2序列，和SEQ ID NO：30的HVR-H3序列。

[0024] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含选自SEQ ID NO：71-73的HVR-H1序列，选自SEQ ID NO：74-78的HVR-H2序列和选自SEQ ID NO：79的HVR-H3序列。

[0025] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含可变重(VH)链，所述可变重(VH)链具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：20，21，27和80-98。在一方面中，所述抗体包含SEQ ID NO：21的VH链氨基酸序列。

[0026] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含至少一个选自下组的序列：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX17VX18X19X20X21A(SEQ ID NO：42)，其中X17＝S，D或V；X18＝S或A；X19＝S，T或N；X20＝A或S；X21＝V或L，HVR-L2包含氨基酸序列X22ASX23LyS(SEQ ID NO：43)，其中X22＝S，W，Y或L；X23＝F，S或W，并且HVR-L3包含氨基酸序列QQX24X25X26X27X28X29T(SEQ ID NO：44)，其中X24＝S，F，G，D或Y；X25＝Y，P，S或A；X26＝Y，T或N；X27＝T，Y，D或S；X28＝P或L；并且X29＝F，P或T。

[0027] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含至少一个选自下组的序列：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX17VX18X19X20X21A(SEQ ID NO：42)，其中X17＝S，D或V；X18＝S或A；X19＝S，T或N；X20＝A或S；X21＝V或L，HVR-L2包含氨基酸序列X62ASX63X64YX65(SEQ ID NO：118)，其中X62＝S，W，Y，F或L；X63＝F，S，Y或W；X64＝L或R；X65＝S，P，R，K或W，并且HVR-L3包含氨基酸序列QQX66X67X68X69X70X71T(SEQ ID NO：119)，其中X66＝S，F，G，D或Y；X67＝Y，P，S或A；X68＝Y，T或N；X69＝T，Y，D或S；X70＝P，Q，S，K或L；并且X71=F，P或T。

[0028] 在某些实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L1序列，所述HVR-L1序列包含氨基酸序列RASQX1VX2X3X4X5A(SEQ ID NO：17)，其中X1＝D或V；X2＝S或A；X3＝T或N；X4＝S或A；
X5＝V或L，或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：35。

[0029] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L2序列，所述HVR-L2序列包含氨基酸序列X6ASFLYS(SEQ ID NO：18)，其中X6＝S或L或X15ASX16LYS(SEQ ID NO：41)，其中X15＝S，W或Y，并且X16＝S或W，或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：36-39.

[0030] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L3序列，所述HVR-L3序列包含氨基酸序列QQX7X8X9X10X11X12T(SEQ ID NO：19)，其中X7＝S，F，G，D或Y；X8＝Y，P，S，或A；X9＝T或N；
X10＝T，Y，D或S；X11＝P或L；X12＝P或T，或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：11-16和SEQ ID NO：40。

[0031] 在某些实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L1序列，所述HVR-L1序列包含氨基酸序列RASQX1VX2X3X4X5A(SEQ ID NO：17)，其中X1＝D或V；X2＝S或A；X3＝T或N；X4＝S或A；
X5＝V或L，或选自由SEQ ID NO：7组成的组的氨基酸序列。

[0032] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L2序列，所述HVR-L2序列包含氨基酸序列X48ASX49X50YX51(SEQ ID NO：56)，其中X48＝S或F；X49＝F或Y；X50＝L或R；X51＝S，P，R，K或W，或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：58-64。

[0033] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L3序列，所述HVR-L3序列包含氨基酸序列QQFPTYX52PT(SEQ ID NO：57)，其中X52＝L，Q，S或K，或选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：65-67。

[0034] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，所述HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列对应于对于图1(A)中的克隆YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29和YW412.8.51所述的那些或对于图2(A)中的克隆Fab12，LC6，LC9和LC10所述的那些或对于图23A-C中的克隆所述的那些。

[0035] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的HVR-L1序列；选自由以下各项组成的组的HVR-L2序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：58-64；和选自由以下各项组成的组的HVR-L3序列：SEQ ID NO：11-16和65-67。在另一方面中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：7的HVR-L1序列，SEQ ID NO：9的HVR-L2序列和SEQ ID NO：12的HVR-L3序列。

[0036] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：35的HVR-L1序列。

[0037] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：9-10，36-39或58-64的HVR-L2序列。

[0038] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：11-16，40或65-67的HVR-L3序列。

[0039] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含可变轻(VL)链序列，所述可变轻(VL)链序列具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-6，31-34和99-117。在一方面中，所述VL链氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

[0040] 在另一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含SEQ ID NO：23的HVR-H1序列，SEQ ID NO：24的HVR-H2序列，SEQ ID NO：25的HVR-H3序列，SEQ ID NO：7的HVR-L1，SEQ ID NO：9的HVR-L2和SEQ ID NO：12的HVR-L3。

[0041] 在一个实施方案中，提供结合BACE1的分离的抗体，其中所述抗体降低或抑制BACE1多肽的活性并且包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VL链和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH链。

[0042] 在另一个实施方案中，提供分离的抗体，所述分离的抗体结合一个表位，所述表位包含至少一个选自由以下各项组成的组的BACE1的氨基酸残基：SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP。在某些实施方案中，所述抗体结合BACE1的一个表位，所述表位包含氨基酸：SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；
317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP。

[0043] 在其他实施方案中，所述抗体结合BACE1的一个表位，所述表位包含至少一个选自由以下各项组成的组的BACE1的氨基酸区域：SEQ ID NO：49的氨基酸315-318；SEQ ID NO：49的氨基酸331-335；SEQ ID NO：49的氨基酸370-381；及其任意组合。在一个实施方案中，所述抗体结合BACE1的一个表位，所述表位包含SEQ ID NO：49的氨基酸315-318，331-335和370-381。

[0044] 在另一个实施方案中，所述抗体结合BACE1的一个表位，其经结合导致BACE1的P6和P7位点的结构的构象变化。在另一个实施方案中，所述抗体结合包括SEQ ID NO：49的氨基酸218-231的BACE1的表位从而采取随机环结构。

[0045] 本发明的抗体可以以任何数目的形式。例如，本发明的抗体可以是人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。在其他方面中，本发明的抗体是全长抗体或其片段(例如，包含抗原结合组件的片段)。在本发明的其他方面中，所述抗体是单克隆抗体。在另一方面中，本发明的抗体可以连接到或缀合到试剂或部分，例如细胞毒性剂，以产生免疫缀合物。

[0046] 在一个实施方案中，提供药物制剂，其包含本发明的抗体和药用载体。在另外的实施方案中，提供编码编码本发明的抗体的分离的核酸，以及包含编码本发明的抗体的核酸的载体。在另一方面中，提供包含编码本发明的抗体的核酸的宿主细胞，以及产生本发明的抗体的方法，所述方法包括在适于产生所述抗体的条件下培养包含编码本发明的抗体的核酸的宿主细胞。

[0047] 在另一个实施方案中，提供治疗患有神经疾病或病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的本发明的抗体。

[0048] 在另一个实施方案中，提供在患有神经疾病或病症或处于感染神经疾病或病症的风险的患者中减少淀粉状蛋白斑，或抑制淀粉状蛋白斑形成的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的本发明的抗体。

[0049] 在一个实施方案中，减少患者的Aβ蛋白的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的本发明的抗体。在一方面中，患者患有神经疾病或病症，或处于感染神经疾病或病症的风险。

[0050] 在另一个实施方案中，提供抑制患者的轴突变性的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的本发明的抗体。

[0051] 在另一个实施方案中，诊断患者的神经疾病或病症的方法，所述方法包括将分离自所述患者的生物样品与本发明的抗体在适于所述抗体与BACE1多肽结合的条件下接触，并且检测在所述抗体和所述BACE1多肽之间是否形成复合物。

[0052] 在一个实施方案中，确定患者是否适合利用抗-BACE1抗体治疗的方法，所述方法包括将分离自所述患者的生物样品与本发明的抗体在适于所述抗体与BACE1多肽结合的条件下接触，并且检测在所述抗体和所述BACE1多肽之间是否形成复合物，其中在所述抗体和BACE1之间存在复合物表明患者适合利用抗-BACE1抗体治疗。在一方面中，所述患者患有神经疾病或病症，或处于感染神经疾病或病症的风险。

[0053] 在一方面中，可以用于诊断神经疾病或病症；或用于预测应答性，确定患者对利用BACE1抗体的治疗的适当性的生物样品包括但不限于流体如血清，血浆，唾液，胃分泌物，粘液，脑脊液，淋巴液等，或获得自生物体的组织或细胞样品如神经组织，脑组织，心脏组织或血管组织。

[0054] 在本发明的方法的一方面中，所述患者是哺乳动物。在另一方面中，所述患者是人。在另一方面中，所述神经疾病或病症选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病(AD)，外伤性脑损伤(traumatic brain injury)，卒中，青光眼，痴呆，肌营养不良(muscular dystrophy)(MD)，多发性硬化(multiple sclerosis)(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化(cystic fibrosis)，安吉尔曼综合征(Angelman’s syndrome)，利德尔综合征(Liddle syndrome)，佩吉特病(Paget’s disease)，外伤性脑损伤，雷维小体病(Lewy body disease)，脊髓灰质炎后综合征(postpoliomyelitis syndrome)，夏伊-德雷格综合征(Shy-Draeger syndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellar atrophy)，帕金森病(Parkinson′s disease)，多系统萎缩(multiple system atrophy)，纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)，核上性麻痹(supranuclear palsy)，牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy)，痒病(scrapie)，克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)，库鲁病 (kuru)，格- 施- 沙病 (Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)，慢性消耗性疾病(chronic wasting disease)，致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia)，延髓性麻痹(bulbar palsy)，运动神经元病(motor neuron disease)，卡纳范病
(Canavan disease)，亨廷顿病(Huntington′s disease)，神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronal ceroid-lipofuscinosis)，亚历山大病(Alexander′s disease)，图雷特综合征(Tourette′s syndrome)，门克斯扭结发综合征(Menkes kinky hair syndrome)，科凯恩综合征(Cockayne syndrome)，哈勒沃登-施帕茨综合征(Halervorden-Spatz syndrome)，拉福拉病(lafora disease)，雷特综合征(Rett syndrome)，肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration)，莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)，和翁-隆综合征(Unverricht-Lundborg syndrome)，痴呆(包括但不限于，皮克病(Pick′s disease)，和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia))。在一方面中，所述神经疾病或病症是阿尔茨海默病。

[0055] 在一个实施方案中，提供由抗体或其片段特异性识别的BACE1表位，所述表位包含至少一个对应于选自有以下各项组成的组的氨基酸的BACE1的氨基酸残基：SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；317LYS；327GLN；330CYS；331TRY；332GLN；335THR；和378ASP。在一方面中，所述BACE1表位包含对应于SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；317LYS；327GLN；
330CYS；331TRY；332GLN；335THR；和378ASP的氨基酸。

[0056] 在一个实施方案中，由抗体或其片段特异性识别的BACE1表位，所述表位包含至少一个选自有以下各项组成的组的BACE1的氨基酸区域：SEQ ID NO：49的氨基酸315-318；SEQ ID NO：49的氨基酸331-335；SEQ ID NO：49的氨基酸370-381；及其任意组合。在一方面中，所述BACE1表位包含SEQ ID NO：49的氨基酸315-318，331-335和370-381。

[0057] 附图简述

[0058] 图1A-1B显示获得自首次用于实验类型的天然多样性噬菌体展示文库的克隆YW412.8和亲和力成熟形式的YW412.8的轻和重链氨基酸序列，如在实施例1(A)中所述。图1A显示轻链序列比对。图1B显示重链序列比对。在图1A和1B中，每个克隆的HVR序列由加框的区域指示，其中第一框指示HVR-L1(SEQ ID NO：7和8-图1A)或HVR-H1(SEQ ID NO：22和23-图1B)，第二框指示HVR-L2(SEQ ID NO：9和10-图1A)或HVR-H2(SEQ ID NO：24-图1B)，而第三框指示HVR-L3(SEQ ID NO：11-16-图1A)或HVR-H3(SEQ ID NO：
25-图1B)。

[0059] 图2A-2B显示获得自首次用于实验类型的合成多样性噬菌体展示文库的克隆Fab12和亲和力成熟形式的Fab12的轻和重链氨基酸序列，如在实施例1(B)中所述。图2A显示轻链序列比对。图2B显示重链序列比对。在图2A和2B中，每个克隆的HVR序列由加框的区域指示，其中第一框指示HVR-L1(SEQ ID NO：35-图2A)或HVR-H1(SEQ ID NO：28-图2B)，第二框指示HVR-L2(SEQ ID NO：36-39-图2A)或HVR-H2(SEQ ID NO：29-图2B)，而第三框指示HVR-L3(SEQ ID NO：40-图2A)或HVR-H3(SEQ ID NO：30-图2B)。

[0060] 图3A和3B显示来自分离自合成的多样性噬菌体展示文库的轻和重链Fab的HVR或CDR序列，如在实施例1(B)中所述。编号是根据Kabat等的命名法。图3A公开了如SEQ ID NO：133的"CDRL1″序列，如SEQ ID NO：134的"CDRL2″序列，如SEQ ID NO135-144、141和145-152的″CDRL3″序列，以及如SEQ ID NO153-159，158，160-161，159，158，162，161，和163-167的"CDRH1″序列，都分别以出现的次序列出。图3B公开了如SEQID NO168-177，174，171，178-182，177，和183的"CDRH2″序列，以及如SEQ ID NO184-202的"CDRH3″序列，都分别以出现的次序列出。

[0061] 图4提供显示鉴定自天然多样性和合成的多样性噬菌体展示文库的不同克隆对BACE1的抑制的图。在均相时间分辨荧光(HTRF)测定中测试所述克隆对BACE1的抑制，如实施例1(A)中所述的。所有YW系列抗体都以500nM的浓度，除了YW434.6抗体，其以320nM的浓度被测试。抗体12.IgG，14.IgG LC6.IgG，LC9.IgG，LC10.IgG和LC11.IgG以1μM的浓度测试。

[0062] 图5是这样的图，其显示在HTRF测定中在鉴定自合成的多样性噬菌体展示文库的抗-BACE1Fab存在下的BACE1的活性，如在实施例1(B)中所述。线对应于在BACE1和底物(PBS对照)存在下的100％活性(0％抑制)，和在不存在BACE1情况下的100％抑制。

[0063] 图6显示亲和力成熟的抗-BACE1Fab的CDR或HVR序列，如在实施例1(B)中所述。编号是根据Kabat等的命名法。竞争ELISA比率是在单点(one-point)竞争ELISA测定中在溶液中不存在20nM BACE1或存在20nM BACE1作为竞争者的情况下ELISA 信号的比率，如在实施例1(B)中所述。图6公开了"CDRL1″序列，如SEQ ID NO133，133，133，133，133和203；″CDRL2″序列，如SEQ ID NO134，134和204-207；″CDRL3″序列，如SEQ ID NO208-209，145，145和145-146；″CDRH1″序列，如SEQ ID NO157，157，158，158，158和162，″CDRH2"序列，如SEQ ID NO172，172，171，171，171和178；以及"CDRH3″序列，如SEQ ID NO188，188，195，195和195-196，都分别以出现的次序列出。

[0064] 图7A-7C包括这样的图，所述图显示来自利用亲和力成熟的抗-BACE克隆进行的竞争性ELISA测定的数据，如在实施例1(B)中所述。Fab展示噬菌体和固定在平板上的BACE1之间的结合与在溶液中的BACE1的连续稀释进行竞争。图7A、7B和7C显示亲本和相应的亲和力成熟的抗体的竞争曲线。

[0065] 图8A-8C显示这样的图，其显示在HTRF酶测定中抗-BACE1Fab对BACE1的抑制，如在实施例1(B)中所述。纯化的Fab对个体抗-BACE1克隆的抑制活性在HTRF酶测定中被测量。OM99-2( 目录号496000)，是BACE1的合成的肽抑制剂，并被用作阳性对照。图8A、8B和8C是亲本和相应的亲和力成熟的衍生物的抑制曲线。在该测定中，OM99-2的IC50是11nM。

[0066] 图9A提供这样的图，该图显示亲和力成熟的YW412.8.31抗-BACE1抗体对人重组BACE1的体外酶活性的影响，使用在HTRF测定中具有增强的对BACE1的敏感性的长肽底物(左图)，或在FRET测定中具有增强的对BACE1的敏感性的短肽底物(右图)，如在实施例2(B)中所述。OM99-2( 目录号496000)，BACE1的合成的肽抑制剂，β-分泌
酶抑制剂IV( 目录号565788)，BACE1的小分子抑制剂(BACE1SMI)和不结
合BACE1的IgG抗体被用作对照。图9B-1和9B-2还提供这样的图，该图显示在YW412.8.31或对照IgG抗体存在下，人重组BACE1胞外结构域，人重组BACE2胞外结构域，或组织蛋白酶D胞外结构域对具有增强的对BACE1的敏感性的短肽底物的体外酶活性，如在实施例
2(B)中所述。

[0067] 图10显示在重组淀粉状蛋白前体蛋白(APP)在293-HEK细胞中的加工过程中利用不同抗-BACE1抗体(LC6，LC9，YW412.8，YW412.8.30，YW412.8.31和YW412.8.51)进行的实验的结果，如在实施例2(C)中所述。不结合BACE1 的IgG抗体用作对照。

[0068] 图11A-11D提供这样的图，该图显示YW412.8.31抗-BACE1抗体对重组或内源淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的加工的作用，如在实施例2(C)中所述。图11A显示来自使用稳定表达野生型人APP的293-HEK细胞的实验的结果。BACE1SMI是小分子BACE1抑制剂，其被用作对照(化合物8e-Charrier等，J.Med.Chem.51：3313-3317(2008)。图11B显示来自使用培养自野生型CD1小鼠的E13.5背根神经节神经元的实验的结果。另外的实验使用来自野生型CD1小鼠的E16.5皮层神经元(图11C)和E16.5培养的海马神经元(图11D)的培养物进行。

[0069] 图12A-12C提供吸收到原发性小鼠神经元中的YW412.8.31抗-BACE1抗体的图像，如在实施例2(D)中所述。图12A显示YW412.8.31抗-BACE1抗体向神经元中的胞内小泡中的内化。将胚胎皮层神经元在37℃温育达指定的时间。利用α-人-Alexa568在表面(非透化的)或内部(透化的)细胞部分上检测结合的YW412.8.31。大部分的信号被内化。通过利用指定的用于脉管部分的标记物进行共染色，内化的YW412.8.31被定位于以下亚细胞部分：早期核内体(TfR)；反式高尔基网络(VAMP4)和溶酶体(LAMP1)。比例尺条＝65μm(顶部)和20μm(底部)。图12B显示：在两个不同温度和三个不同时间点，抗-BACE1抗体摄入E13.5背根神经节(DRG)神经元中，如图中所示。细胞被透化以允许标记胞内BACE1抗体。在非透化的细胞中，仅外部结合的YW412.8.31抗-BACE1抗体被标记。图12(C)显示YW412.8.31抗-BACE1抗体摄入到来自表达BACE1的小鼠或BACE1敲除小鼠的E16.5皮层神经元中。

[0070] 图13提供来自实施例3(A)的ELISA结果的图示，其将YW412.8抗-BACE1抗体与其自身、另一种抗-BACE1抗体(LC6)，活性位点BACE1结合肽(OM99-2(目录号496000))和外结合位点BACE1结合肽(BMS1)(Kornacker等，Biochemistry44：
11567-11572(2005)中的肽1)的竞争性结合相比较。

[0071] 图14显示与人BACE1胞外结构域共结晶的Fab YW412.8.31的结构的不同视图，如在实施例3(B)中所述。Fab结合在分泌酶活性位点远侧的BACE1外结合位点，该外结合位点与已知与具有BACE1抑制性质的某些肽相互作用的另一个外结合位点部分重叠。

[0072] 图15提供Fab YW412.8.31与人BACE1胞外结构域的相互作用的局部放大图。BACE1以表面表示显示，而Fab被显示为带状物。加点的表面指示BACE1表位。

[0073] 图16A和16B显示检测在野生型小鼠中BACE1对Aβ1-40水平的贡献的实验的结果。检测BACE1+/+小鼠中的Aβ1-40水平对比BACE1-/-小鼠中的Aβ1-40水平。以单剂量的对照IgG抗体或抗-BACE YW412.8.31抗体给小鼠用药，如在实施例4中所述。图16A显示检测在小鼠中BACE1对Aβ1-40产生的贡献的遗传研究的结果。在BACE1敲除小鼠(BACE1-/-)中观察到的Aβ1-40水平为BACE1的特异性抑制剂如何改变野生型小鼠中的Aβ1-40产生提供了对照。图16B显示用药对照IgG或抗-BACE1YW412.8.31(50mg/kg)在用药后24或48小时对血浆和CNS(皮层)中Aβ1-40产生的影响。通过向C57B1/6小鼠进行IV注射递送单剂量的对照IgG或抗-BACE1抗体(50mg/kg)。24或48小时后，收集血浆和脑样品以分析Aβ1-40。血浆Aβ1-40减少35％(在24小时)，皮层Aβ1-40减少～20％。绘制的值是平均值(±SEM)*p＜0.01；**p＜0.001。

[0074] 图17A-17B提供实施例4中所述的体内YW412.8.31抗-BACE1抗体实验的结果。图17A显示在用YW412.8.31抗-BACE1抗体以两个不同浓度处理(与赋形剂对照处理相比)的小鼠的血浆和海马中观察到的Aβ1-40水平的图。图17B是个体药物动力学对比药效学读数的图，指示对于YW412.8.31抗-BACE1抗体，PK/PD关系存在于该小鼠模型中。

[0075] 图18A和18B显示来自实验的比较，其中hAPP-转基因小鼠被全身(图A，与在为比较而重新绘制的图17A中描述的相同的实验)或通过连续ICV输注(图B)用药以YW412.8.31抗-BACE1抗体。在图18A中，动物通过IP注射(3剂量@Q4D)接收赋形剂
或抗-BACE1抗体(30或100mg/kg)。在最后的剂量后2小时，收集血浆和脑样品以分析Aβ1-40和Aβ1-42。以30和100mg/kg的抗-BACE1抗体，血浆Aβ1-40和Aβ1-42减少至～30％对照水平。海马Aβ1-40和Aβ1-42被高剂量的抗-BACE1(100mg/kg)减少(13-22％)，皮层Aβ1-40和Aβ1-42显示减少的趋势(12-18％)。在图18B中，通过单侧ICV输注递送对照IgG或抗-BACE1抗体7天。以两种剂量都观察到Aβ1-40和Aβ1-42的一致减少：在皮层中(15-23％)，在海马中(15-20％)。图C显示在全身对比ICV递送后抗-BACE1抗体在脑中的水平。绘制的值是平均值(±SEM)*p＜0.05；**p＜0.001

[0076] 图19A和19B显示经由IV注射递送到BALB/C小鼠的单剂量的YW412.8.31抗-BACE1(1或10mg/kg)的PK分析(图19A)。分析血清PK直至用药后21天。使用两个分开的PK测定：一个测定检测血清中的所有抗-BACE1(总mAb)，而一个测定仅检测血清中未结合的抗-BACE1(游离mAb)。BACE1+/+，BACE1+/-和BACE1-/-小鼠中的单剂量PK分析确认了在初始研究中观察到的非线性，并且表明提高的清除率确实是靶标介导的(图19B)。

[0077] 图20A和20B显示通过IV递送用药以对照IgG或YW412.8.31抗-BACE1抗体(30mg/kg)的食蟹猴的PK分析。使用猴吸附的山羊抗-人IgG多克隆抗体(Bethyl，Montgomery，TX)测量在猴血清(图20A)和CSF样品(图20B)中的总抗-BACE1或对照抗体浓度，如在实施例5中所述。

[0078] 图21A-21D是如在实施例5中所述的实验的结果，在所述实验中通过IV递送给食蟹猴用药以对照IgG或抗-BACE1抗体YW412.8.31。阴影线显示个体动物的数据，实线显示组平均。在7天、2天以及在用药前采样血浆和CSF以设置每个个体猴中Aβ1-40基线水平的平均值。在不同时间测量血浆Aβ1-40(图21A)和CSF Aβ1-40(图21B)。在基线血浆(图21C)和CSF(图21D)Aβ1-40动物间的可变性也被显示。

[0079] 图22A和22B显示在野生型小鼠中在全身用药YW412.8.31后的Aβ产生。图22A是这样的图，其显示在通过IP注射向C57B1/6J小鼠给药单剂量的对照IgG或
YW412.8.31(100mg/kg)后的Aβ1-40产生。4小时后，收集血浆和脑样品以分析Aβ1-40。血浆Aβ1-40减少了48％，但是在该范例中前脑Aβ1-40未减少。图22B是这样的图，其显示在通过
3次IP注射(每次相隔4天)给药对照IgG或YW412.8.31(30或100mg/kg)后的Aβ1-40产生。在最后剂量4小时后，收集血浆和脑样品以分析Aβ1-40。血浆Aβ1-40减少了50-53％，而前脑Aβ1-40当以30mg/kg用药时未减少，而当以100mg/kg用药时减少了42％。绘制的值是平均值(±SEM)*p＜0.0001

[0080] 图23A-23C显示克隆YW412.8.31和亲和力成熟形式的YW412.8.31的轻链氨基酸序列。图23A-23C显示完全轻链序列比对。每个克隆的HVR序列由加框的区域指示，其中第一框指示HVR-L1(SEQ ID NO：7-图23A)，第二框指示HVR-L2(SEQ ID NO：9和58-64-图23B)，而第三框指示HVR-L3(SEQ ID NO：12和66-67-图23C)。

[0081] 图24A-24C显示克隆YW412.8.31和亲和力成熟形式的YW412.8.31的重链氨基酸序列。图24A-24C显示完全重链序列比对。每个克隆的HVR序列由加框的区域指示，其中第一框指示HVR-H1(SEQ ID NO：24和71-73-图24A)，第二框指示HVR-H2(SEQ ID NO：24和74-78-图24B)，而第三框指示HVR-H3(SEQ ID NO：25和79-图24C)。

[0082] 图25A和B显示这样的图，所述图显示在如在实施例6中所述的HTRF测定中YW412.8.31和亲和力成熟的克隆对BACE1的抑制。测试克隆YW412.8.31.3S；
YW412.8.31.9S；YW412.8.31.25S；YW412.8.31.58S；YW412.8.31.53；YW412.8.31.69；
YW412.8.31.77；YW412.8.31.81S和YW412.8.31.89S抑制BACE1的蛋白酶活性的能力。

[0083] 发明实施方案详述

[0084] 定义

[0085] 用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

[0086] “亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。用于测量结合亲合力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。

[0087] “亲和力成熟的”抗体指这样的抗体，在该抗体的一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变，导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有提高。

[0088] 术语“抗-β-分泌酶抗体”、“抗-BACE1抗体”、“结合β-分泌酶的抗体”和“结合BACE1的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合BACE1抗体以致所述抗体可以用作靶向BACE1中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-BACE1抗体与不相关的、非BACE1蛋白结合的程度低于所述抗体与BACE1结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合BACE1的抗体的解离常数(Kd)≤1μM，-8 -8≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10 M以下，例如10 M-13 -9 -13
至10 M，例如10 M至10 M)。在某些实施方案中，抗-BACE1抗体结合在来自不同物种和同种型的BACE1中保守的BACE1表位。

[0089] 术语″抗体″在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。

[0090] ″抗体片段″是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab′，Fab’-SH，F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

[0091] 与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。本文中提供一个示例性竞争测定。

[0092] 术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和/或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同来源或物种。

[0093] 抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

[0094] 术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死211 131 125
亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At ，I ，I ，
90 186 188 153 212 32 212
Y ，Re ，Re ，Sm ，Bi ，P ，pb 和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥
(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

[0095] “效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

[0096] 试剂例如药物制剂的″有效量″是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。

[0097] 术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pr0230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

[0098] ″构架″或″FR″是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

[0099] 术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

[0100] 术语″宿主细胞″、″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″被可交换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括″转化体″和″转化的细胞″，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

[0101] “人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

[0102] “人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型K I。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

[0103] “人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

[0104] 术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和
96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102。(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102。
(见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。

[0105] “免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

[0106] “个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

[0107] ″分离的″抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

[0108] ″分离的″核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

[0109] “分离的编码抗-BACE1抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

[0110] 术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。

[0111] “裸抗体”是指没有缀合异源部分(如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

[0112] ″天然抗体″是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(K)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

[0113] 术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应征、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。

[0114] 相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX 操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

[0115] 在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：

[0116] 100乘以X/Y比值

[0117] 其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。

[0118] 术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

[0119] “药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

[0120] 除非另外说明，术语“BACE1”当在本文中使用时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然β-分泌酶1(也被称为β-位淀粉状蛋白前体蛋白裂解酶1，膜相关天冬氨酸蛋白酶2，memapsin2，天冬氨酰蛋白酶2或Asp2)。该术语包括“全长”未加工的BACE1以及由细胞内加工产生的任何形式的BACE1。该术语还包括天然存在的BACE1的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性BACE1多肽的氨基酸序列显示在以下SEQ ID NO：49中，并且有人BACE1、同种型A的序列，如在Vassar等，Science286：735-741(1999)中报道的，该文献通过引用完整地结合于本文中。

[0121] MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIWRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSWDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWCCLRCLRQQHDDFADDISLLK(SEQ ID NO：49)

[0122] 存在数种其他同种型的人BACE1，包括同种型B、C和D。参见UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817，其通过引用完整地结合于本文中。同种型B显示在SEQ ID NO：
50中并且与同种型A(SEQ ID NO：49)不同在于它缺失氨基酸190-214(即缺失SEQ ID NO：
49的氨基酸190-214)。同种型C显示在SEQ ID NO：51中并且与同种型A(SEQ ID NO：49)不同在于它缺少氨基酸146-189(即缺失SEQ ID NO：49的氨基酸146-189)。同种型D显示在SEQ ID NO：52中并且与同种型A(SEQ ID NO：49)不同在于它缺少氨基酸146-189和
190-214(即缺失SEQ ID NO：49的氨基酸146-189和190-214)。

[0123] 用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。

[0124] 术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(VH和VL，分别地)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等Kuby thImmunology，6 ed.，W.H.Freeman和Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature352：624-628(1991)。

[0125] 术语″载体″当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为″表达载体″。

[0126] 术语″神经病症″或″神经疾病″指的是或描述了哺乳动物的中枢和/或周围神经系统中的疾病或病症。神经疾病的实例包括但不限于以下列表的疾病和病症。神经病病症是神经系统的疾病或异常，其表征为不适当或不受控的神经信号传导或对其的缺乏，并且包括但不限于，慢性疼痛(包括感受伤害的疼痛(由对身体组织的损伤引起的疼痛，包括癌相关的疼痛)，神经性疼痛(由神经、脊髓或脑中的异常引起的疼痛)，和精神性疼痛(完全或大部分相关于心理障碍)，头痛，偏头痛，神经病，以及常常伴随这样的神经病病症的症状和综合征如眩晕或恶心。淀粉状变性是一组疾病和病症，其与在CNS中的胞外蛋白质沉积物相关，其包括但不限于，继发性淀粉状变性，年龄相关性淀粉状变性，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知损伤(mild cognitive impairment，MCI)，雷维小体痴呆，唐氏综合征，遗传性脑出血伴淀粉状变性(Dutch型)；Guam Parkinson-痴呆综合症状，脑淀粉状血管病，亨廷顿病，进行性核上性麻痹，多发性硬化；克-雅病，帕金森病，传递性海绵状脑病，HIV相关痴呆，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，包涵体肌炎(inclusion-body myositis，IBM)，和涉及β-淀粉状蛋白沉积的眼病(即，黄斑变性，玻璃疣相关视神经病变和白内障)。CNS的癌症表征为一个或多个CNS细胞(即，神经细胞)的异常增殖，并且包括但不限于，胶质瘤(glioma)，多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)，脑膜瘤(meningioma)，星细胞瘤(astrocytoma)，听神经瘤(acoustic neuroma)，软骨瘤(chondroma)，少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)，成神经管细胞瘤(medulloblastomas)，神经节神经胶质瘤(ganglioglioma)，神经鞘瘤(Schwannoma)，神经纤维瘤(neurofibroma)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，和硬膜外、髓内或硬膜内肿瘤。眼疾病或病症是眼睛的疾病或病症，为本文的目的，眼睛被视为受制于BBB的CNS器官。眼病或病症包括但不限于，巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症(即，巩膜炎(scleritis)、角膜炎(keratitis)、角膜溃疡(corneal ulcer)，角膜擦伤(corneal abrasion)，雪盲(snow blindness)，电光性眼炎(arc eye)，Thygeson浅层点状角膜病变(Thygeson’s superficial punctate keratopathy)，角膜新生血管化(corneal neovascularisation)，富克斯营养不良(Fuchs’dystrophy)，圆锥形角膜(keratoconus)，干燥性角膜结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)，虹膜炎(iritis)和葡萄膜炎(uveitis))，晶状体的病症(即，白内障(cataract))，脉络膜和视网膜的病症(即，视网膜脱离(retinal detachment)，视网膜劈裂症(retinoschisis)，高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)，视网膜病(retinopathy)，早产儿视网膜病，老年性黄斑变性(age-related macular degeneration)，黄斑变性(macular degeneration)(湿性或干性)，视网膜外膜(epiretinal membrane)，色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)和黄斑水肿(macular edema))，青光眼(glaucoma)，悬浮物(floaters)，视神经和视觉通路的病症(即，莱伯遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy)和视觉盘玻璃疣(optic disc drusen))，眼肌/双眼移动调节/折射的病症(即，斜视，眼肌瘫痪(ophthalmoparesis)，进行性外部眼肌麻痹(opthalmoplegia)，内斜视，外斜视，远视，近视，散光，屈光不正，老花眼和眼肌麻痹)，视觉障碍和失明(即，弱视，莱伯先天性黑矇(Lever’s congenital amaurosis)，暗点，色盲(color blindness)，全色盲(achromatopsia)，夜盲症(nyctalopia)，失明(blindness)，河盲(river blindness)和微眼炎/缺损(micro-opthalmia/coloboma))，红眼，阿盖耳罗伯逊瞳孔(Argyll Robertson pupil)，角膜真菌病(keratomycosis)，干眼病和无虹膜(aniridia)。CNS的病毒或微生物感染包括但不限于由以下引起的感染，病毒(即，流感，HIV，脊髓灰质炎病毒，风疹，)，细菌(即，奈瑟氏球菌属(Neisseria sp.)，链球菌属(Streptococcus sp.)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，变形菌属(Proteus sp.)，大肠杆菌(E.coli)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，肺炎球菌属(Pneumococcus sp.)，脑膜炎球菌属(Meningococcus sp.)，嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)，和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))和其他微生物如真菌(即，酵母，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))，寄生虫(即，弓形虫(toxoplasma gondii))或变形虫(amoebas)，导致CNS病理生理学，包括但不限于，脑膜炎，脑炎，脊髓炎，血管炎和脓肿(abscess)，其可以是急性的或慢性的。CNS的炎症是这样的炎症，其由对CNS的损伤导致，所述损伤可以是物理损伤(即，由于事故，手术，脑创伤，脊髓损伤，脑震荡(concussion)所致的)或由于或相关于一种或多种CNS的其他疾病或病症(即，脓肿，癌症，病毒或微生物感染)的损伤。当用于本文中时，CNS的缺血是指一组病症，其相关于脑部的异常血流或血管行为或其病因，并且包括但不限于，局部脑缺血(focal brain ischemia)，全局脑缺血(global brain ischemia)，卒中(即，蛛网膜下出血和脑内出血(intracerebral hemorrhage))，和动脉瘤。神经退行性疾病是一组疾病和病症，其相关于CNS中神经细胞丧失功能或死亡，并且包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)，亚历山大病，阿尔珀斯病(Alper’s disease)，肌萎缩性侧索硬化，运动失调性毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)，Batten病(Batten disease)，科凯恩综合征，基层皮质变性(corticobasal degeneration)，由淀粉状变性引起或与其相关的变性，弗里德赖希共济失调症(Friedreich’s ataxia)，额颞叶变性(emporal lobar degeneration)，Kennedy病(Kennedy’s disease)，多系统萎缩，多发性硬化，原发性侧索硬化，进行性核上性麻痹，脊髓性肌萎缩，横贯性脊髓炎，雷夫叙姆病(Refsum’s disease)，和脊髓小脑性共济失调。CNS的发作疾病和病症涉及CNS中的不适当和/或异常电导，并且包括但不限于，癫痫(即，失神发作(absence seizures)，失张力发作(atonic seizures)，良性运动性癫痫(benign Rolandic epilepsy)，儿童期失神(childhood absence)，阵挛发作(clonic seizures)，复杂部分发作(complex partial seizures)，额叶性癫痫(frontal lobe epilepsy)，发热性癫痫发作(febrile seizures)，婴儿痉挛(infantile spasms)，少年肌阵挛性癫痫(juvenile myoclonic epilepsy)，青少年期失神癫痫(juvenile absence epilepsy)，伦-格综合征(Lennox-Gastaut syndrome)，兰-克综合征(Landau-Kleffner Syndrome)，Dravet综合征(Dravet’s syndrome)，Otahara综合征(Otahara syndrome)，West综合征(West syndrome)，肌肉阵挛性发作(myoclonic seizures)，线粒体病(mitochondrial disorders)，进行性肌阵挛性癫痫(progressive myoclonic epilepsies)，精神性发作(psychogenic seizures)，反射性癫痫(reflex epilepsy)，Rasmussen综合征(Rasmussen′s Syndrome)，简单部分发作(simple partial seizures)，继发性全身性癫痫发作(secondarily generalized seizures)，颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy)，阵挛性发作(toniclonic seizures)，强直发作(tonic seizures)，精神运动发作(psychomotor seizures)，边缘叶癫痫(1imbic epilepsy)，部分性癫痫发作(partial-onset seizures)，全身发作性癫痫发作(generalized-onset seizures)，癫痫持续状态(status epilepticus)，腹型癫痫(abdominal epilepsy)，失神型发作(akinetic seizures)，植物神经性发作(autonomic seizures)，大量双侧肌阵挛(massive bilateral myoclonus)，月经性癫痫(catamenial epilepsy)，跌倒发作(drop seizures)，情绪性发作(emotional seizures)，病灶性发作(focal seizures)，发笑发作(gelastic seizures)，贾克森扩布(Jacksonian March)，拉福拉病(Lafora Disease)，运动性发作(motor seizures)，多病灶性发作(multifocal seizures)，夜发作(nocturnal seizures)，光敏性发作(photosensitive seizure)，假性发作(pseudo seizures)，感觉性发作(sensory seizures)，微小发作(subtle seizures)，sylvan发作(sylvan seizures)，戒断发作(withdrawal seizures)，和视反射发作(visual reflex seizures))。行为障碍是CNS的病症，其表征为就受折磨的受试者而言的异常行为，并且包括但不限于，睡眠障碍(sleep disorders)(即，失眠(insomnia)，深眠状态(parasomnias)，夜惊(night terrors)，昼夜节律睡眠障碍(circadian rhythm sleep disorders)，和发作性睡病(narcolepsy))，心境障碍(mood disorders)(即，抑郁(depression)，自杀性抑郁(suicidal depression)，焦虑(anxiety)，慢性情感障碍(chronic affective disorders)，恐怖病(phobias)，惊恐发作(panic attacks)，强迫性障碍(obsessive-compulsive disorder)，注意力缺陷伴多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder)(ADHD)，注意缺陷障碍(attention deficit disorder)(ADD)，慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)，广场恐怖症(agoraphobia)，创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder)，双相性精神障碍(bipolar disorder))，进食障碍(即，厌食症(anorexia)或贪食症(bulimia))，精神病(psychoses)，发育行为障碍(developmental behavioral disorder)(即，自闭症(autism)，雷特综合征(Rett’s syndrome)，Aspberger综合征(Aspberger’s syndrome))，人格障碍和精神障碍(即，精神分裂症(schizophrenia)，妄想障碍(delusional disorder)，等)。溶酶体贮积症(Lysosomal storage disorder)是代谢病症，在一些情况中其与CNS相关或具有CNS特异性症状；这样的病症包括但不限于泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)，戈谢病(Gaucher’s disease)，法布里病(Fabry disease)，粘多糖贮积症(I，II，III，IV，V，VI和VII型)，糖原贮积病(glycogen storage disease)，GMl神经节苷脂贮积症(GMl-gangliosidosis)，异染性脑白质病变(metachromatic leukodystrophy)，Farber病(Farber’s disease)，卡纳范脑白质营养不良(Canavan’sleukodystrophy)，和神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses)1型和2型，尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)，Pompe病(Pompe disease)，和克拉伯病(Krabbe’s disease)。

[0127] 组合物和方法

[0128] 在一方面中，本发明部分基于结合BACE1并且降低和/或抑制BACE1活性的抗体。在某些实施方案中，提供结合到BACE1的活性位点或外结合位点的抗体。

[0129] 示例性抗-BACE1抗体

[0130] 在一方面中，本发明提供抗-BACE1抗体，所述抗-BACE1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：22，23，26，28，45，68，71，72，73或120的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：24，29，46，69，74，75，76，
77，78或121的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，30，47，70，79或122的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7，8，17，35或42的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，10，18，36-39，41，43，56，58，59，60，61，62，63，64或118的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11-16，19，40，44，57，65，66，67或119的HVR-L3。

[0131] 在一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个，至少两个，或所有三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：22，23，26，28，45，68，71-73或120的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：24，29，46，69，74-78或121的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，30，47，70，79或122的HVR-H3。

[0132] 在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：
24或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：79。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：28。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：29。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：30。

[0133] 在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：22；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：24；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：23；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：24；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：28；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：29；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：30。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：23；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：74；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：23；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：75；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：71；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：24；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：72；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：24；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：23；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：76；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25，或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：23；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：77；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：79，或者所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：73；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：78；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25。

[0134] 在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7，8，17，35和42；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，10，18，36-39，41，43，56，58-64或118；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：11-16，19，40，44，57，65-67或119。

[0135] 在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：35。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-L2，所述包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：36-39。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40。

[0136] 在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：11，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：16，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：10；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：15。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：35；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：36；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：35；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：37；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：35；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：38；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：35；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：39；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40。

[0137] 在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：58；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：65，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：59；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：66，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：67，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：60；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：67，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：61；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：65，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：59；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：66，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：62；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：67，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：63；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或者所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：64；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。

[0138] 在另一方面中，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：22，23，26，28，45，68，71-73或120(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：24，29，46，69，74-78或121和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：25，30，47，70，79或122；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：7，8，17，35或42，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：9，10，18，36-39，41，43，56，58-64或118，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：11-16，19，40，44，57，65-67或119。

[0139] 在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：23；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：24；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：25；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：12。

[0140] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GFX30FX31X32X33X34IH(SEQ ID NO：45)，其中X30＝N或T；X31＝S，L或Y；X32＝G或Y；X33＝Y或S；并且X34＝A，G或S；其中HVR-H2包含氨基酸序列X35X36ISPX37X38GX39TX40YADSVKG(SEQ ID NO：46)，其中X35＝A或G；X36＝W或S；X37＝A或Y；X38＝G或S；X39＝S或Y；并且X40＝D或S；并且其中HVR-H3包含序列X41PX42X43X44X45X46X47MDY(SEQ ID NO：47)，其中X41＝Q或G；X42＝T或F；X43＝H或S；X44＝Y或P；X45＝Y或W；X46＝Y或V，并且其中X47任选包括序列YAKGYKA(SEQ ID NO：48)。

[0141] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GX71X72X73X74X75X76X77IH(SEQ ID NO：120)，其中X71＝F或Y；X72＝F，N或T；X73＝F或Y；X74＝L，Q，I，S或Y；X75＝G或Y；X76＝Y或S；并且X77＝A，G或S；HVR-H2包含氨基酸序列X78X79ISPX80X81GX82X83X84YADSVKG(SEQ ID NO：121)，其中X78＝A或G；X79＝W或S；X80＝A，S，Q或Y；X81＝G或S；X82＝S，K，L或Y；X83＝T或Y；并且X84＝D或S；并且HVR-H3包含氨基酸序列X85PX86X87X88X89X90X91MDY(SEQ ID NO：122)，其中X85＝Q或G；X86＝T或F；X87＝H，Y或S；X88＝Y或P；X89＝Y或W；X90＝Y或V，并且其中X91任选包括序列YAKGYKA(SEQ ID NO：48)。

[0142] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX17VX18X19X20X21A，(SEQ ID NO：42)其中X17＝S，D或V；X18＝S或A；X19＝S，T或N；X20＝A或S；X21＝V或L，其中HVR-L2包含氨基酸序列X22ASX23LYS(SEQ ID NO：43)，其中X22＝S，W，Y或L；X23＝F，S或W，并且其中HVR-L3包含氨基酸序列QQX24X25X26X27X28X29T(SEQ ID NO：44)，其中X24＝S，F，G，D或Y；X25＝Y，P，S或A；X26＝Y，T或N；X27＝T，Y，D或S；X28＝P或L；并且X29＝F，P或T。

[0143] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自下组的序列：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX17VX18X19X20X21A(SEQ ID NO：42)，其中X17＝S，D或V；X18＝S或A；X19＝S，T或N；X20＝A或S；X21＝V或L，其中HVR-L2包含氨基酸序列X62ASX63X64YX65(SEQ ID NO：118)，其中X62＝S，W，Y，F或L；X63＝F，S，Y或W；X64＝L或R；X65＝S，P，R，K或W，并且HVR-L3包含氨基酸序列QQX66X67X68X69X70X71T(SEQ ID NO：119)，其中X66＝S，F，G，D或Y；X67＝Y，P，S或A；X68＝Y，T或N；X69＝T，Y，D或S；X70＝P，Q，S，K或L；并且X71=F，P或T。

[0144] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX1VX2X3X4X5A(SEQ ID NO：17)，其中X1＝D或V；X2＝S或A；X3＝T或N；X4＝S或A；X5＝V或L，其中HVR-L2包含氨基酸序列X6ASFLYS(SEQ ID NO：18)，其中X6＝S或L，并且其中HVR-L3包含氨基酸序列QQX7X8X9X10X11X12T(SEQ ID NO：19)，其中X7＝S，F，G，D或Y；X8＝Y，P，S，或A；X9＝T或N；X10＝T，Y，D或S；X11＝P或L；X12＝P或T。

[0145] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX1VX2X3X4X5A(SEQ ID NO：17)，其中X1＝D或V；X2＝S或A；X3＝T或N；X4＝S或A；X5＝V或L，其中HVR-L2包含氨基酸序列X48ASX49X50YX51(SEQ ID NO：56)，其中X48＝S或F；X49＝F或Y；X50＝L或R；X51＝S，P，R，K或W，其中HVR-L3包含氨基酸序列QQFPTYX52PT(SEQ ID NO：57)，其中X52＝L，Q，S或K。

[0146] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GFTFX13GYX14IH(SEQ ID NO：26)，其中X13＝S或L和X14＝A或G，其中HVR-H2包含氨基酸序列GWISPAGGSTDYADSVKG(SEQ ID NO：24)，并且其中HVR-H3包含氨基酸序列GPFSPWVMDY(SEQ ID NO：25).

[0147] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3，其中HVR-H1包含氨基酸序列GX53X54X55X56GYGIH(SEQ ID NO：68)，其中X53＝F或Y；X54＝T或F；X55＝F或Y；X56＝L，Q或I，其中HVR-H2包含氨基酸序列GWISPX57X58GX59X60DYADSVKG(SEQ ID NO：69)，其中X57＝A，S或Q；X58＝G或S；X59＝S，K或L；X60＝T或Y，并且其中HVR-H3序列包含氨基酸序列GPFX61PWVMDY(SEQ ID NO：70)，其中X61＝S或Y。

[0148] 在某些实施方案中，所述抗体包含至少一个选自以下的序列：HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO：35)，其中HVR-L2包含氨基酸序列X15ASX16LYS(SEQ ID NO：41)，其中X15＝S，W或Y和X16＝S或W，并且其中HVR-L3包含氨基酸序列QQYSYSPFT(SEQ ID NO：40)。

[0149] 在某些实施方案中，如以上所提供的抗-BACE1抗体的任意一个或多个氨基酸在以下HVR位置被置换：

[0150] 在HVR-H1(SEQ ID NO：26)中：位置5和8；

[0151] 在HVR-L1(SEQ ID NO：17)中：位置5，7，8，9和10；

[0152] 在HVR-L2(SEQ ID NO：18)中：位置1，或者在HVR-L2(SEQ ID NO：41)中，位置1和4；以及

[0153] 在HVR-L3(SEQ ID NO：19)中：位置3，4，5，6，7和8。

[0154] 在某些实施方案中，置换是保守置换，如本文中提供的。在某些实施方案中，任意一个或多个以下置换可以以任意组合进行：

[0155] 在HVR-H1(SEQ ID NO：26)中：位置5处的丝氨酸或亮氨酸和位置8处的丙氨酸或甘氨酸；

[0156] 在HVR-L1(SEQ ID NO：17)中：位置5处的天冬氨酸或缬氨酸；位置7处的丝氨酸或丙氨酸；位置8处的苏氨酸或天冬酰胺；位置9处的丝氨酸或丙氨酸和位置10处的缬氨酸或亮氨酸；

[0157] 在HVR-L2(SEQ ID NO：18)中：位置1处的丝氨酸或亮氨酸，或HVR-L2(SEQ ID NO：41)位置1处的丝氨酸、酪氨酸或色氨酸或位置4处的酪氨酸、丝氨酸或色氨酸；和[0158] 在HVR-L3(SEQ ID NO：19)中：位置3处的丝氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或酪氨酸；位置4处的酪氨酸或脯氨酸，位置5处的丝氨酸，丙氨酸，苏氨酸或天冬酰胺；位置
6处的酪氨酸，苏氨酸，天冬氨酸或丝氨酸，位置7处的天冬氨酸，丝氨酸，脯氨酸或亮氨酸和位置8处的脯氨酸或苏氨酸。

[0159] 在某些实施方案中，置换是保守置换，如本文中所提供的。在某些实施方案中，任意一个或多个以下置换可以以任意组合进行：

[0160] 在HVR-H1(SEQ ID NO：26)中：S5L和A8G；

[0161] 在HVR-L1(SEQ ID NO：17)中：D5V；S7A；T8N；S9A和V10L；

[0162] 在HVR-L2(SEQ ID NO：18)中：S1L，或者在HVR-L2(SEQ ID NO：41)中，位置S1W或Y和S4W；以及

[0163] 在HVR-L3(SEQ ID NO：19)中：位置S3F、G、D或Y1；Y4P、S或A；T5N；T6Y、D或S；P7L和P8T。

[0164] 在某些实施方案中，如以上所提供的抗-BACE1抗体的任意一个或多个氨基酸在以下HVR位置被置换：

[0165] 在HVR-H1(SEQ ID NO：120)中：位置2，3，5，6，7和8；

[0166] 在HVR-H2(SEQ ID NO：121)中：位置1，2，6，7，9，10，和11；

[0167] 在HVR-H3(SEQ ID NO：122)中：位置1，3，4，5，6，7，和8

[0168] 在HVR-L1(SEQ ID NO：42)中：位置5，7，8，9和10；

[0169] 在HVR-L2(SEQ ID NO：118)中：位置1，4，5和7；以及

[0170] 在HVR-L3(SEQ ID NO：119)中：位置3，4，5，6，7和8。

[0171] 在某些实施方案中，置换是保守置换，如本文中所提供的。

[0172] 以上置换的可能的组合被如上所述的SEQ ID NO：42-47和118-122的共有序列所涵盖。

[0173] 在任何以上实施方案中，抗-BACE1抗体被人源化。在一个实施方案中，抗-BACE1抗体包含如在任何以上实施方案中的HVR，和还包含接纳体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在另一个实施方案中，抗-BACE1抗体包含如在任何以上实施方案中的HVR，和还包含VH或VL，其包含SEQ ID NO：1-6，20，21，27，31-34，80-98和99-117的FR1，FR2，FR3，或FR4序列。

[0174] 在另一方面中，抗-BACE1抗体包含重链可变结构域(VH)序列，该序列与选自以下的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性：SEQ ID NO：20，21，27和80-98。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，而包含该序列的抗-BACE1抗体保持结合BACE1和/或抑制或减弱BACE1活性的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失在SEQ ID NO：20，21，27和80-98中。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-BACE1抗体包含SEQ ID NO：20，21，27或80-98中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：22，
23，26，28，45，68，71，72，73或120，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：24，
29，46，69，74，75，76，77，78或121，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：
25，30，47，70，79或122。

[0175] 在一方面中，本发明提供抗-BACE1抗体，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含图1(B)，2(B)和24(A)中的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含图1(B)，2(B)和24(B)中的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含图1(B)，2(B)和24(C)中的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含图1(A)，2(A)和23(A)中的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含图1(A)，2(A)和23(B)中的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含图1(A)和2(A)和23(C)中的氨基酸序列。

[0176] 在另一方面中，提供抗-BACE1抗体，其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，所述结构域与选自以下的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性：SEQ ID NO：1-6，31-34和99-117。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-BACE1抗体保持结合BACE1和/或抑制或降低BACE1活性的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：1-6，31-34和99-117中总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-BACE1抗体包含SEQ ID NO：1-6，31-34或99-117中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7，8，17，35或42；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，10，18，36-39，41，43和56，58-64或118；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：11-16，19，40，44，57，65，66，67或119。

[0177] 在另一方面中，提供抗-BACE1抗体，其中所述抗体包含如在任何以上提供的实施方案中的VH，和如在任何以上提供的实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别包含SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：2中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。

[0178] 在另一个方面中，本发明提供抗体，所述抗体结合与本文中提供的抗-BACE1抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供这样的抗体，其结合与包含选自SEQ ID NO：20，21，27和80-98的VH序列和选自SEQ ID NO：1-6，31-34和99-117的VL序列的抗-BACE1抗体相同的表位。在某些实施方案中，提供这样的抗体，其结合与包含分别在SEQ ID NO：
21和SEQ ID NO：2中的VH和VL序列的抗-BACE1抗体相同的表位。

[0179] 在某些实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内的表位，所述表位包含至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个氨基酸，所述氨基酸对应于SEQ ID NO：49的氨基酸314SER，316GLU，317LYS，318PHE，319PRO，327GLN，328LEU，329VAL，330CYS，331TRP，332GLN，333ALA，335THR，337PRO，340ILE，
375THR，378ASP，380CYS，426PHE。

[0180] 在某些实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内的表位，所述表位包含至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个氨基酸，所述氨基酸对应于SEQ ID NO：49的氨基酸314SER；316GLU；317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；335THR；和378ASP。在其他实施方案中，构象表位包含对应于以下的氨基酸：SEQ ID NO：49的314SER；316GLU；317LYS；327GLN；330CYS；331TRP；332GLN；
335THR；和378ASP。要理解，在BACE1表位中鉴定的氨基酸对应于人BACE1同种型A的序列。然而，所述BACE1构象表位含包括在BACE1的其他变体和同种型中的相应氨基酸，并且所述表位可以包括除指定残基以外的氨基酸。

[0181] 在某些实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内的表位，所述表位包含至少一个，至少两个或至少三个BACE1的氨基酸区域，所述氨基酸区域对应于SEQ ID NO：49的氨基酸315-318；SEQ ID NO：49的氨基酸331-335；SEQ ID NO：49的氨基酸370-381；或其任意组合。在一个实施方案中，抗体结合BACE1的一个表位，所述表位包含SEQ ID NO：49的氨基酸315-318，331-335和370-381。

[0182] 在另一个实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内的表位，这导致：在结合后相对于未结合抗体的BACE1，BACE1的P6和/或P7位点的构象变化(Turner等，Biochemistry44：105-112(2005))。在另一个实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1的表位，这诱使BACE1的SEQ ID NO：49的氨基酸218-231采取随机环结构。BACE1的SEQ ID NO：49的氨基酸218-231以α-螺旋结构存在于结合底物的复合物中。

[0183] 在另一个实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内的位点，如在图14和15中所示的以及在BACE1和抗-BACE1抗体、YW412.8.31的晶体结构中所示(实施例3(B))。

[0184] 在其他实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内的外结合位点。在一个实施方案中，BACE1内的外结合位点与Kornacker等，Biochem.44：11567-11573(2005)鉴别的外结合位点是相同的外结合位点。在一个实施方案中，提供这样的抗体，其与在Kornacker等，Biochem.44：11567-11573(2005)(该参考文献通过引用完整地结合于本文中)中鉴别的肽(即，肽1，2，3，1-11，1-10，1-9，1-8，1-7，1-6，2-12，3-12，4-12，5-12，6-12，7-12，8-12，9-12，10-12，4，5，6，5-10，5-9，Y5A，P6A，Y7A，F8A，I9A，P10A和L11A)竞争结合BACE1。

[0185] 在另一个实施方案中，提供这样的抗体，其如本文所述的任何抗-BACE1抗体那样竞争结合(例如，结合相同的表位)。

[0186] 在本发明的另一个方面中，根据任何以上实施方案的抗-BACE1抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗-BACE1抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1抗体或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。

[0187] 在另一个方面中，根据任何以上实施方案的抗-BACE1抗体可以单独地或组合地结合任何如在以下部分1-7中所述的特征：

[0188] 1.抗体亲合力

[0189] 在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，-8 -8 -13≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10 M以下，例如10 M至10 M，-9 -13
例如，10 M至10 M)。

[0190] 在一个实施方案中，Kd通过用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量，如由以下测定所述的。Fab对抗原的溶液结合亲合力通过在125
存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的( I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293：
865-881(1999))。为了确定测定的条件，将多孔板(Thermo Scientific)
用5μg/ml的在50mM 碳酸钠(pH9.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附
125
板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[ I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(与在Presta等，癌症研究(Cancer Res).57：4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中以在室温进行温育(例如1小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20 洗涤8次。当
TM
所述板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20 ；Packard)，并将所述板在TM
TOPCOUNT γ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。

[0191] 根据另一个实施方案，Kd是通过表面等离子共振测定法使用或仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原
CM5芯片在～10个应答单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至
5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约TM
25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20 )表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型( Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图
计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离子
6 -1 -1
共振测定法，结合速率超过10M s ，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分TM
光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO 分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

[0192] 2.抗体片段

[0193] 在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，请参见Hudson等Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，请参见，例如，Pluckthün，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York)，269-315页(1994)；还请参见WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvage receptor)结合表位残基和具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

[0194] 双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

[0195] 单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。

[0196] 抗体片段可以通过不同技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。

[0197] 3.嵌合和人源化抗体

[0198] 在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

[0199] 在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例如CDRs(或其部分)源自非人类抗体，且FRs(或其部分)是源自人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。

[0200] 人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature(自然)332：
323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods(方法)36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)Padlan，Mol.Immunol.(分子免疫学)28：489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall′Acqua等人，Methods36：43-60(2005)(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osbourn等人，Methods(方法)36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，83：252-260(2000)(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。

[0201] 可用于人源化的人类构架区包括，但不限于，使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993))；源自特定亚群的轻链或重链可变区的人类抗体共同序列的构架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：22611-22618(1996))。

[0202] 4.人抗体

[0203] 在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.(当前药学观点)5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.(当前免疫学观点)20：450-459(2008)。

[0204] 可通过向已经经过修饰因而对于抗原攻击刺激产生完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。这些动物通常含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这些转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.(自然生物技术)23：TM
1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSE 技术的美国专利第6,075,181号及第
6，150,584号；描述技术的美国专利第5,770,429号；描述K-M
技术的美国专利第7,041,870号，及描述技术的美国专利申请公开号
US2007/0061900。这些动物产生的完整抗体的人类可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合。

[0205] 人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤细胞系已经描述。(参见例如Kozbor J.Immunol.(免疫学杂志 )，133：3001(1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术及应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；并且Boerner等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，147：86(1991)。)通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA，103：
3557-3562(2006)中描述。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology(组织学和组织病理学 )，20(3)：
927-937(2005)，及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology(实验和临床药学方法和发现)，27(3)：185-91(2005)中描述。

[0206] 也可通过分离选自源自人噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文描述自抗体文库选择人抗体的技术。

[0207] 5.源自文库的抗体

[0208] 可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O′Brien等人编，人Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature(自然)348：552-554；Clackso等人，Nature(自然)352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)248：161-175(Lo编，人Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：
299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；
Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；并且 Lee 等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)中描述。

[0209] 在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述在其中筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常呈现单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志志)，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括例如：美国专利第5,750,373号，及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。

[0210] 从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。

[0211] 6.多特异性抗体

[0212] 在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对BACE1而另一种是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至BACE1的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达BACE1的细胞。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。

[0213] 制造多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein及Cuello，Nature(自然)305：537(1983)；WO93/08829；及 Traunecker 等人，EMBO J.10：3655(1991))，及“凸起 - 入 - 孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体的静电导引作用(WO2009/089004A1)；
将两种或两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号，及Brennan等人Science(科学)，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：
6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。

[0214] 本文中也包括具有三个或三个以上功能性抗原结合位点的经工程改造抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US2006/0025576A1)。

[0215] 本文中的抗体或片段也包括包含结合至BACEl以及另一不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb或“DAF”(例如参见US2008/0069820)。

[0216] 7.抗体变体

[0217] 在某些实施方案中，涵盖本文中所提供抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要其来提高抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入其中和/或对其进行置换。可进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，其限制条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。

[0218] a)置换、插入和缺失变体

[0219] 在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的相关位点包括HVRs和FRs。保守性置换显示在表1中在“保守性置换”的标题下。更多实质性变化于表1中的“示例性置换”的标题下提供且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。可将氨基酸置换引入相关抗体中并筛选具有所需活性，例如保持/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或提高的ADCC或CDC的产物。

[0220] 表1

[0221]

[0222]

[0223] 可根据常见侧链特性将氨基酸分组：

[0224] (1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

[0225] (2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；

[0226] (3)酸性：Asp、Glu；

[0227] (4)碱性：His、Lys、Arg；

[0228] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

[0229] (6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。

[0230] 非保守性置换将需要将一种这些种类中的成员换成另一种类。

[0231] 一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体的某些生物学特性相对于亲本抗体改变(例如提高)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将实质上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变异抗体呈现于噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。

[0232] 可在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可于HVR“热点”也即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207：179-196(2008))；并且/或于SDRs(a-CDRs)，其中测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自第二文库重新选择而获得的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O′Brien等人编人Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链重组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)中任一种将多样性引入经选择以供成熟的可变基因中。随后产生第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中随机选择数个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化特定地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

[0233] 在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文中所提供的保守性置换)。这些改变可在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

[0234] 适用于鉴别可靶向以供诱变的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”如Cunningham及Wells(1989)Science(科学)，244：1081-1085所述。在此方法中，残基或靶残基的群(例如诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu的带电残基)经鉴别且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。

[0235] 氨基酸序列插入物包括长度在一个残基至含有一百个或一百个以上残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合体。

[0236] b)糖基化变体

[0237] 在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。

[0238] 若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接的分支链双触角寡糖。参见例如Wright等人，TIBTECH15：26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改良特性的抗体变体。

[0239] 在一实施方案中，提供具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于根据MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn297连接的糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，例如如WO2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，也即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有提高的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta，L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开文本的实例包括US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；
US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；
WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)。能够产生脱除岩藻糖基的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108Al，Presta，L；及WO2004/056312Al，Adams等人，尤其实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)；
Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。

[0240] 进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖经GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如于WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；及US2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体于例如WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju，S.)；
及WO1999/22764(Raju，S.)中描述。

[0241] c)Fc区域变体

[0242] 在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗涉及异常血管发生和/或血管通透性或渗漏的疾病或病症的有效性。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

[0243] 在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为某些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的活体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/衰竭。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcyR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。介导ADCC的初级细胞、NK细胞仅表达FcyRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcyRIII。FcR在造血细胞上的表达于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-492(1991)的第464页上的表3中总结。评定相关分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例于美国专利
5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)166：1351-1361(1987))中描述。或TM
者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI 非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)及非放射性细胞毒性测定
(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，相关分子的ADCC活性可于体内评定，例如在例如Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：652-656(1998)中所揭示的动物模型中评定。也可进行Clq结合测定以证明抗体无法结合Clq且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879及WO2005/100402中的Clq及C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参
见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)；
Cragg，M.S.等人，Blood(血液)101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.及M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及活体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Intl.Immunol.(国际免疫学)18(12)：
1759-1769(2006))。

[0244] 效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或两个以上位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

[0245] 描述某些与FcRs的结合提高或减少的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312，及 Shields等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志 )9(2)：
6591-6604(2001))。

[0246] 在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处置换。

[0247] 在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(也即，通过提高或降低)，例如如美国专利第6，194,551号、WO99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.(免疫学杂志)164：4178-4184(2000)中所述。

[0248] US2005/0014934A1(Hinto等人)中描述具有增加的半衰期及提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人J.Immunol.(免疫学杂志）117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.(免疫学杂志）24：249(1994))。那些抗体包含具有一或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一或多者处具有置换(例如置换Fc区残基434)的那些Fc变体(美国专利第7,371,826号)。

[0249] 关于Fc区变体的其他实例，也参见Duncan及Winter，Nature(自然)322：738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO94/29351。

[0250] d)经半胱氨酸工程改造的抗体变体

[0251] 在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，经置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团通过定位于抗体的可接近位点处且可用于将抗体结合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，任一或多个以下残基可经半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利第7,521,541号中所述，产生经半胱氨酸工程改造的抗体。

[0252] e)抗体衍生物

[0253] 在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三恶烷三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有制造优势。
聚合物可具有任何分子量，且可有分支或无分支。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，且若连接一种以上聚合物，则其可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物数目和/或类型可以基于包括，但不限于，以下的考虑因素来确定：要提高的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。

[0254] 在另一实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)102：11600-11605(2005))。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质部分加热至可杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。

[0255] B.重组方法和组合物

[0256] 抗体可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗BACE2抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗BACE2抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

[0257] 为了重组产生抗-BACE2抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

[0258] 用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237,5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，人a出版社，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

[0259] 除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.(自然生物技术)24：210-215(2006)。

[0260] 适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

[0261] 还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177,6,040,498,TM6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES技术)。

[0262] 也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等，遗传病毒学杂志(J.Gen Virol.)36：
59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等，Annals N.Y. Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；并且FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4216(1980))；并且骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，在分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，ed.，人a Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

[0263] C.测定

[0264] 本文中提供的抗-BACE1抗体可以对其物理/化学特性和/或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。

[0265] 1.结合测定和其他测定

[0266] 在一方面，测试本发明的抗体的抗原结合活性，例如，通过已知方法如ELISA、蛋白质印迹等。

[0267] 在另一方面中，可以使用竞争测定以鉴定与本文所述的任何抗体或Fabs，例如，YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29，YW412.8.51，Fab12，LC6，LC9，LC10竞争结合BACE1的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合被本文所述的任何抗体或Fabs(例如，YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29，YW412.8.51，Fab12，LC6，LC9，LC10)结合的相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于定位一个抗体结合哪个表位的详细的示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols(表位绘图流程)，”Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)卷66(人a Press，Totowa，NJ)中提供。

[0268] 在示例性竞争测定中，在溶液中温育固定的BACE1，所述溶液包含与BACE1结合的第一标记抗体(例如，YW412.8，YW412.8.31，YW412.8.30，YW412.8.2，YW412.8.29，YW412.8.51，Fab12，LC6，LC9，LC10)如被测试其与所述第一抗体竞争结合BACE1的能力的第二未标记抗体。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在这样的溶液中温育固定的BACE1，所述溶液包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体。在允许所述第一抗体与BACE1结合的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并且测量与固定的BACE1结合的标记的量。如果相对于对照样品在测试样品中与固定的BACE1结合的标记的量显著降低，则说明所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合BACE1。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratory Manual(抗体：实验室手册)ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

[0269] 2.活性测定

[0270] 在一方面中，提供用于鉴别具有生物学活性的抗-BACE1抗体的测定。生物学活性可以包括，例如，抑制或降低BACE1天冬氨酰蛋白酶活性；或抑制或降低BACE1对APP的裂解；或抑制或降低Aβ产生。还提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体。

[0271] 在某些实施方案中，测定本发明的抗体的这样的生物学活性。例如，可以在均相时间分辨荧光HTRF测定或微流体毛细管电泳(MCE)测定(如在实施例1和2(B)中所详述的)，使用合成的底物肽，测试BACE1蛋白酶活性。

[0272] 简言之，均相时间分辨荧光(HTRF)测定可以用于测量BACE1天冬氨酰蛋白酶活性，其中使用淀粉状蛋白前体蛋白BACE1酶切位点肽。例如，将Bi27肽(Biotin-KTEEISEVNLDAEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO：53)，American Peptide Company))，与预先与抗-BACE抗TM体在BACE反应缓冲液(50mM乙酸钠pH4.4和0.1％CHAPS)中在384孔板(Proxiplate ，Perkin-Elmer)中温育的BACE1结合。将蛋白水解反应混合物在环境温度温育75分钟并且通过加入5μL HTRF检测混合物使其猝灭，所述HTRF检测混合物含有在检测缓冲液(200mM Tris pH8.0，20mMEDTA，0.1％BSA，和0.8M KF)中的2nM链霉抗生物素-D2和150nM的标记有铕穴状化合物的抗-淀粉状蛋白β抗体。将最终的反应混合物在环境温度温育60分TM
钟，并且使用EnVision Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer)以320nm的激发波长和615和665nm的发射波长测量TR-FRET信号。

[0273] MCE测定反应可以在标准酶促反应中进行，起始于将底物加入酶和4x化合物，其含有人BACE1(胞外结构域)，淀粉状蛋白前体蛋白β分泌酶活性位点肽(FAM-KTEEISEVNLDAEFRWKK-CONH2(SEQ ID NO：55))，50mM NaOAc pH4.4和0.1％CHAPS。在于环境温度温育60分钟后，将每个反应中的产物与底物分离，使用12-吸式(sipper)微流体芯片，在(两者都来自Caliper Life Sciences)上分析。产物与底物的分离通过使用制造商的优化软件选择电压和压力来优化。使用HTS Well Analyzer软件(Caliper Life Sciences)，从电泳图计算底物转化率。

[0274] 此外，可以在体内在表达BACE1底物如APP的细胞系中，或在表达BACE1底物，如人APP的转基因小鼠中测试BACE1蛋白酶活性，如在实施例2(C)和4中所述。

[0275] 此外，可以利用抗-BACE1抗体在动物模型中测试BACE1蛋白酶活性。例如，多种神经疾病和病症的动物模型，以及用于检验与这些模型相关的病理过程的相关技术，在本领域中是容易获得的。多种神经疾病的动物模型包括非重组和重组(转基因)动物。非重组动物模型包括，例如，啮齿动物，例如，鼠模型。这样的模型可以通过使用标准技术例如皮下注射、尾静脉注射、脾移植、腹膜内移植和在肾囊下移植将细胞引入到同源小鼠中来建立。体内模型包括卒中/脑缺血的模型，神经退行性疾病的体内模型，如帕金森氏病的小鼠模型；阿尔茨海默病的小鼠模型；肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)的小鼠模型；脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)的小鼠模型；局部(focal)和全局(global)脑缺血的小鼠/大鼠模型，例如，颈总动脉阻塞或大脑中动脉阻塞模型；或在离体(ex vivo)的完整胚胎培养物中。作为一个非限制性的实例，存在多个本领域已知的阿尔茨海默病的小鼠模型((参见例如Rakover等，Neurodegener.Dis.(2007)；4(5)：392-402；Mouri等，FASEB J.(2007)Jul；21(9)：2135-48；Minkeviciene等，J.Pharmacol.Exp.Ther.(2004)Nov；311(2)：677-82和Yuede等，Behav Pharmacol.(2007)Sep；18(5-6)：347-63)。
可以在已知的体外或体内测定模式中进行多种测定，如本领域中已知的和在文献中描述的。不同的这样的动物模型也可以获得自厂商如Jackson Laboratory。另外的动物模型测定描述于实施例4和5。

[0276] D.免疫缀合物

[0277] 本发明也提供包含本文中的抗-BACE1抗体与一或多种细胞毒性剂，例如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素缀合的免疫缀合物。

[0278] 在一实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括，但不限于，美坦生类化合物(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP0425235B1)；奥利司他汀(auristatin)，如单甲基奥利司他汀药物(monomethylauristatin)部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号，及第7,498,298号)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第
5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第
5,877,296号；Hinman等人，Cancer Res.(癌症研究)53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.(癌症研究)58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(参见Kratz等人Current Med.Chem.13：477-523(2006)；
Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)97：
829-834(2000)；Dubowchik 等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12：1529-1532(2002)；
King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利第6,630,579号)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特赛紫杉醇(tesetaxel)及奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(trichothecene)；及CC1065。

[0279] 在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与酶促活性毒素或其片段缀合，酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)。

[0280] 在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与放射性原子缀合形成211 131 125 90
放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At 、I 、I 、Y 、
186 188 153 212 32 212
Re 、Re 、Sm 、Bi 、P 、pb 及Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123及碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

[0281] 抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶合剂制得，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。举例来说，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science(科学)238：1098(1987)中所述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体结合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。举例来说，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。

[0282] 本文中的免疫缀合物或ADCs明确涵盖，但不限于，用交联剂试剂制备的这些缀合物，该等交联剂试剂包括，但不限于：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交联剂试剂可商购获得(例如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。

[0283] E.用于诊断和检测的方法和组合物

[0284] 在某些实施方案中，本文中提供的任何抗-BACE1抗体可以用于检测BACE1在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如血清、血浆、唾液、胃分泌、粘液、脑脊液、淋巴液、神经元组织、脑组织、心脏组织或血管组织。

[0285] 在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗-BACE1抗体。在另一个方面中，提供检测BACE1在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗-BACE1抗体在允许抗-BACE1抗体与BACE1结合的条件下接触，并检测在抗-BACE1抗体和BACE1之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗-BACE1抗体被用于选择适合利用抗-BACE1抗体的治疗的受试者，例如其中BACE1是用于选择患者的生物标记物。

[0286] 可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括神经退行性疾病(包括但不限于，雷维小体病，脊髓灰质炎后综合征，夏伊-德雷格综合征，橄榄体脑桥小脑萎缩，帕金森病，多系统萎缩，纹状体黑质变性，Tau病变(tauopathy)(包括但不限于，阿尔茨海默病和核上性麻痹)，朊病毒病(prion disease)(包括但不限于，牛海绵状脑病，痒病，克-雅综合征，库鲁病，格-施-沙病，慢性消耗性疾病，和致命性家族性失眠症)，卒中，肌营养不良，多发性硬化，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，Paget综合征(Paget’s syndrome)，外伤性脑损伤，延髓性麻痹，运动神经元病，和神经系统异退行性(heterodegenerative)病症(包括但不限于，卡纳范病，亨廷顿病，神经元蜡样脂褐素沉积症，亚历山大病，图雷特综合征，门克斯扭结发综合征，科凯恩综合征，哈勒沃登-施帕茨综合征，拉福拉病，雷特综合征，肝豆状核变性，莱施-奈恩综合征，和翁-隆综合征)，痴呆(包括但不限于，皮克病，和脊髓小脑性共济失调)。

[0287] 在某些实施方案中，提供标记的抗-BACE1抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例32 14 125 3 131
性标记包括但不限于，放射性同位素 p，C， I，H，和 I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

[0288] F.药物制剂

[0289] 如本文所述的抗-BACE1抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵、氯化六羟季铵、氯苄烷铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
本文中的示例性药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20( Baxter
International，Inc.)。某些示例性sHASEGPs及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186及2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

[0290] 示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

[0291] 本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

[0292] 可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)中。

[0293] 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

[0294] 欲用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如借助通过无菌过滤膜的过滤而轻易地实现。

[0295] G治疗方法和组合物

[0296] 本文中提供的任何抗-BACE1抗体可以用于治疗方法。

[0297] 在一方面中，提供用作药物的抗-BACE1抗体。在另外的方面中，提供用于治疗神经疾病或病症(例如，AD)的抗-BACE1抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的抗-BACE1抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗-BACE1抗体，其用于治疗患有神经疾病或病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的抗-BACE1抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的至少一种另外的治疗剂。在其他实施方案中，本发明提供抗-BACE1抗体，其用于减少或抑制处于神经疾病或病症(例如，AD)的风险或患有所述神经疾病或病症的患者中的淀粉状蛋白斑形成。在某些实施方案中，本发明提供抗-BACE1抗体，其用于减少或抑制个体中Aβ产生的方法，所述方法包括向所述个体给药有效的抗-BACE1抗体。根据任何以上实施方案的“个体”优选是人。在某方面中，用于本发明的方法的抗-BACE抗体降低或抑制BACE1活性。例如，抗-BACE1抗体降低或抑制BACE1裂解APP的能力。

[0298] 在另一个方面中，本发明提供抗-BACE1抗体在制备或生产药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗神经疾病或病症。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗神经疾病或病症的方法，所述方法包括向患有神经疾病或病症的个体给药有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制BACE1活性。在另一个实施方案中，所述药物用于在个体中抑制Aβ产生或斑块形成的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的所述药物以抑制Aβ产生或斑块形成。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。

[0299] 在另一个方面中，本发明提供用于治疗阿尔茨海默病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有AD的个体给药有效量的抗-BACE1抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。

[0300] 在另一个方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含任何本文提供的抗-BACE1抗体，例如，用于任何以上治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗-BACE1抗体和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗-BACE1抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。

[0301] 在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。

[0302] 这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。本发明的抗体还可以与放射疗法一起使用。

[0303] 本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

[0304] 本发明的某些实施方案提供穿过血脑屏障的抗体或其片段。某些神经退行性疾病与血脑屏障的渗透性提高相关，以致抗体或其活性片段可以容易地被引入到脑中。当血脑屏障保持完整时，存在数种已知方法用于穿过血脑屏障运输分子，所述方法包括但不限于，物理方法，基于脂质的方法，以及基于受体和通道的方法。

[0305] 运输抗体或其片段穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于，完全绕开血脑屏障，或通过在血脑屏障中生成开口。绕行法包括但不限于，向脑中直接注射(见例如，Papanastassiou等，Gene Therapy9：398-406(2002))和将递送装置移入脑中TM(见例如，Gill等，Nature Med.9：589-595(2003)；和 Gliadel Wafers ，Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于，超声(见例如，美国专利公布号2002/0038086)，渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrierand its Manipulation(血脑屏障及其操作的意义)，卷
1&2，Plenum Press，N.Y.(1989)))，通过例如缓激肽或渗透剂(permeabilizer)A-7的渗透化(见例如，美国专利号5,112,596,5,268,164,5,506,206,和5,686,416),以及用包含编码抗体或其片段的基因的载体转染横跨血脑屏障的神经元(见例如，美国专利公布号
2003/0083299)。

[0306] 基于脂质的运输抗体或其片段穿过血脑屏障的方法包括但不限于，将抗体或其片段包封在脂质体中，所述脂质体与抗体结合片段结合，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(见例如，美国专利申请公布号20020025313)，以及将抗体或其活性片段包被在低密度脂蛋白颗粒(见例如，美国专利申请公布号20040204354)或脱脂载酯蛋白E(见例如，美国专利申请公布号20040131692)中。

[0307] 本发明的抗体将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。

[0308] 为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述抗体的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20或例如约6剂量的所述抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。然而，其它治疗方案可以是有用的。该疗法的进展可以容易地通过常规方法和测定来监测。

[0309] 要理解，任何以上制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物进行以代替抗-BACE1抗体或作为抗-BACE1抗体的补充。

[0310] H.制品

[0311] 在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物结合，对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针头和注射器。

[0312] 要理解，任何以上制品可以包括本发明的免疫缀合物以代替抗-BACE1抗体或作为抗-BACE1抗体的补充。实施例

[0313] 以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。

[0314] 实施例1：抗-BACE1抗体的制备和表征

[0315] 特异性结合BACE1的抗体通过以下方法制备：淘选(panning)针对人BACE1胞外结构域、SEQ ID NO：49的氨基酸1-457的两个不同类型的噬菌体展示抗体文库(一个具有天然多样性(VH和VH/VL)，另一个在被人工限制为具体氨基酸组(YSGX)的特定CDR区中具有多样性)。

[0316] A.天然多样性文库分选和筛选以鉴别抗-BACE-1抗体

[0317] 噬菌体展示的抗-BACE1克隆的选择

[0318] 将生物素化的人BACE-1(SEQ ID NO：49的1-457)用作用于文库分选的抗原。针对在交替的neutravidin/链霉亲和素板上预先捕获的生物素化的BACE-1，将天然多样性噬菌体文库分选五轮。对于第一轮分选，首先将NUNC96孔Maxisorp免疫平板用10μg/mL neutravidin(Fisher Scientific，#21125)包被，并且用噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)和0.05％(v/v)Tween20)封闭过夜。首先，在30分钟内将10μg/mL生物素化的BACE-1捕获在免疫平板上。随后将用噬菌体封闭缓冲液PBST预封闭的抗体噬菌体文库VH(见例如，Lee等，J.Immunol.Meth.284：119-132(2004))和VH/VL(参见Liang等，J.Mol.Biol.366：815-829(2007))加入所述板中，并且在室温温育过夜。在第二天用PBT(含0.05％Tween20的PBS)各平板洗涤10次，并且在30分钟内用1mL50mM HC1和500mM NaCl将结合的噬菌体洗脱，并且用600μL的
1MTris碱(pH8.0)中和。回收的噬菌体在大肠杆菌XL-1Blue细胞中扩增。在随后的选择TM
轮期间，首先使增殖的噬菌体文库预吸收50ul在PBST/BSA中的 MyOne 链霉
亲和素T1(Invitrogen，#65601)，并且在室温温育30分钟。将与neutravidin结合的噬菌体颗粒从噬菌体库中除去，并除去然后将未结合的噬菌体加入展示在链霉
亲和素板上的BACE-1抗原，并且温育时间减为2-3小时。平板洗涤的严格性逐渐增加。

[0319] 在5轮淘选后，观察到显著的富集。从VH和VH/VL文库分选中挑取96个克隆以确定它们是否特异性地结合人BACE-1。对这些克隆的可变区进行PCR测序以鉴定独特序列克隆。选择以超过背景至少5x结合人BACE-1的42个独特噬菌体抗体，并且使其转型为全长IgGs以用于在体外细胞测定中进行评估。

[0320] 通过以下方法使目的克隆转型为IgG：分别将个体克隆的VL和VH区克隆到LPG3和LPG4载体中，并且在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达，并且使用蛋白质A柱层析进行纯化。

[0321] 抗-BACE1抑制克隆的选择

[0322] BACE1是天冬氨酰蛋白酶，其通常在邻近其跨膜结构域、接近细胞表面的位点处裂解淀粉状蛋白前体蛋白。因此，在体外使用均相时间分辨荧光(HTRF)测定评估以上鉴定的抗体调节BACE1对特定BACE1底物的蛋白水解活性的能力。

[0323] HTRF测定进行如下。将两微升的375nM Bi27(生物素-KTEEISEVNLDAEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO：53)，American Peptide Company))，即具有置换从而增加了对BACE1裂解的敏感性的淀粉状蛋白前体蛋白BACE1裂解位点肽，与3μL的125nM与抗-BACE抗体预温育的BACE1在BACE反应缓冲液(50mM乙酸钠pH4.4和0.1％CHAPS)中在384孔TM
板(Proxiplate ，Perkin-Elmer)中结合。将蛋白水解反应混合物在环境温度温育75分钟，并且通过加入5μL HTRF检测混合物将其猝灭，所述HTRF检测混合物含有在检测缓冲液(200mM Tris pH8.0，20mM EDTA，0.1％BSA，和0.8M KF)中的2nM链霉亲和素-D2和150nM的标记有铕穴状化合物的6E10抗-淀粉状蛋白β抗体(Covance，Emoryville，CA)。将最终反应混合物在环境温度温育60分钟，并且使用EnVision Multilabel Plate TM
Reader (Perkin-Elmer)以320nm的激发波长和615和665nm的发射波长测量TR-FRET信号。缺少BACE1酶(0BACE)的反应和含有缺少抗-BACE1抗体的反应(PBS(100％BACE1活性)用作对照。

[0324] 在鉴定自天然多样性文库的42个测试的抗体中，选择最佳的BACE1抑制剂，即YW412.8，用于亲合力成熟。参见图4。

[0325] 抗-BACE1抑制克隆的亲合力成熟

[0326] 如下地构建文库以使YW412.8抗体亲合力成熟。在所有CDR-L3位置含有终止密码子(TAA)并且在M13噬菌体的表面上展示单价Fab)的噬菌粒pW0703(来源于噬菌粒pV0350-2b(Lee等，J.Mol.Biol.340，1073-1093(2004))充当用于从天然多样性文库嫁接目的克隆的重链可变结构域(VH)以用于亲合力成熟的文库模板。将硬性(hard)和软性(soft)随机化策略用于亲合力成熟。对于硬性随机化，使用设计为模拟天然人抗体的氨基酸随机化一个具有三个轻链CDR的选定位置的轻链文库，并且所设计的DNA简并性如在Lee等(J.Mol.Biol.340，1073-1093(2004))中所述。对于软性随机化，靶向CDR-L3的位置91-94和96，CDR-H1的28-31和34-35，CDR-H2的50、52和53-58，CDR-H3的95-99和100A处的残基；并且选择CDR环的两个不同组合，L3/H1/H2和L3/H3，用于随机化。为获得软性随机化条件(其在选定位置引入约50％的突变率)，利用有利于野生型核苷酸的碱基的70-10-10-10混合物合成诱变的DNA(Gallop等，J.Med.Chem.37：1233-1251(1994))。

[0327] 如下地进行对亲合力提高的Fab的选择。对亲合力提高噬菌体文库进行第一轮的平板分选，之后是四或五轮的溶液分选。对于第一轮的平板分选，针对由neutravidin包被的平板(NUNC Maxisorp板)捕获的10μg/ml生物素化的靶标(BACE1)，分选文库，其中噬菌体输入为约2OD/ml，在1％BSA和0.05％Tween20中在室温进行2小时。在第一轮的平板分选后，进行溶液分选以提高选择的严格性。对于溶液分选，将增殖自第一轮平板分选的1OD/ml噬菌体与100nM生物素化的靶标蛋白质(所述浓度是基于亲本克隆噬菌体IC50值)在含有1％Superblock(Pierce Biotechnology)和0.05％Tween20的100μl缓冲液中在室温温育30分钟。将混合物进一步用1％Superblock稀释10x，并且将100μl/孔施用于neutravidin包被的孔(5μg/ml)在室温达15分钟，并且温和地振动以使生物素化的靶标结合噬菌体。将所述孔用PBS和0.05％Tween20洗涤十次。为确定背景结合，将含有噬菌体以及未被生物素化的靶标的对照孔捕获在neutravidin包被的平板上。将结合的噬菌体用0.1N HCl洗脱达20分钟，用1/10体积的1MTris pH11中和，滴定，并且增殖以用于次轮。
接下来，以增加的选择严格性再进行两轮溶液分选。第一轮通过将生物素化的靶标蛋白质浓度从100nM降至5nM进行结合速率选择。第二轮是通过在室温加入过量的未生物素化的靶标蛋白质(100倍以上)以竞争掉较弱的结合者来进行解离速率选择。并且，噬菌体输入被降低(0.1～0.5OD/ml)以降低背景噬菌体结合。

[0328] 从第四轮筛选中挑取菌落，并且将其在37℃在150μl/孔的含有50μg/ml羧苄青霉素和1E10/ml KO7噬菌体的2YT培养基中在96-孔板(Falcon)中过夜培养。从同一个平板，挑取XL-1感染的亲本噬菌体的菌落作为对照。将96-孔Nunc Maxisorp平板用100μl/孔neutravidin(2μg/ml)在PBS中在4℃过夜或在室温2小时。将所述平板用
65μl的1％BSA封闭30分钟，并用40μl的1％Tween20再封闭30分钟，之后加入生物素化的靶标蛋白质(2μg/ml)，并且在室温温育15分钟。

[0329] 将噬菌体上清液在含有或不含10nM靶标蛋白质的ELISA(酶偶联免疫吸附测定)缓冲液(含0.5％BSA，0.05％Tween20的PBS)中1：10稀释，总体积100μl，并且在室温在F平板(NUNC)中温育至少1小时，以用于单点竞争测定。将75μl的含有或不含靶标蛋白质的混合物一起(side by side)转移至由neutravidin包被的平板捕获的靶标蛋白质。将所述平板温和振动15分钟以使未结合的噬菌体被捕获到neutravidin捕获的靶标蛋白质。将所述平板用PBS-0.05％Tween20洗涤至少五次。通过在ELISA缓冲液中加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-M13抗体(1：5000)并在室温温育30分钟来量化结合。将所述平板用PBS-0.05％Tween20洗涤至少五次。接下来，将100μl/孔的1：1比率的3，3′，5，
5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(H2O2)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))添加到所述孔中，并且在室温温育5分钟。通过向每孔加入100μl1M磷酸(H3PO4)并允许在室温温育5分钟来终止反应。使用标准ELISA平板读数器在450nm测定每孔中黄色的OD(光密度)。通过以下公式计算OD下降(％)：

[0330] OD450nm下降(％)＝[(含有竞争者的孔的OD450nm)/(不含竞争者的孔的OD450nm)]*100。

[0331] 与亲本噬菌体的孔的OD450nm下降(％)(100％)相比，挑取这样的克隆用于序列分析，对于人和鼠靶标两者所述克隆具有的OD450nm下降(％)低于50％。选择独特克隆用于噬菌体制备以通过与亲本克隆的比较确定针对靶标的结合亲合力(噬菌体IC50)。将亲合力提高最大的克隆转型为人IgG1用于抗体产生以及进一步通过使用BIAcore的表面等离子共振和其他体外或体内测定的结合动力学分析。

[0332] 选自天然多样性噬菌体文库的YW412.8的轻链和重链HVR区的序列显示在图1(A)和1(B)中。此外，获得自YW412.8抗体的亲合力成熟的五个抗体也被测序，并且轻链和重链HVR序列也显示在图1(A)和1(B)中。在这些抗体中显示可变性的轻链HVR区的共有氨基酸序列有：HVR-L1：Arg Ala Ser Gln X1Val X2X3X4X5Ala(SEQ ID NO：17)，其中X1选自天冬氨酸和缬氨酸，X2选自丝氨酸和丙氨酸，X3选自苏氨酸和天冬酰胺，X4选自丙氨酸和丝氨酸，并且X5选自缬氨酸和亮氨酸；HVR-L2：X6Ala Ser Phe Leu Tyr Ser(SEQ ID NO：18)，其中X6选自丝氨酸和亮氨酸；和HVR-L3：Gln Gln X7X8X9X10X11X12Thr(SEQ ID NO：19)，其中X7选自丝氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，天冬氨酸和酪氨酸，X8选自酪氨酸，脯氨酸，丝氨酸和丙氨酸，X9选自苏氨酸和天冬酰胺，X10选自苏氨酸，酪氨酸，天冬氨酸和丝氨酸，X11选自脯氨酸和亮氨酸，并且X12选自脯氨酸和苏氨酸。在这些抗体中，仅重链高变区H1展示可变性，并且该区域的共有序列是：HVR-H1：Gly Phe Thr Phe X13Gly Tyr X14Ile His(SEQ ID NO：26)，其中X13选自丝氨酸和亮氨酸，并且X14选自丙氨酸和甘氨酸。

[0333] B.合成的多样性文库分选和筛选以鉴定抗-BACE-1抗体

[0334] 已经构建了在互补决定区(CDR)具有有限化学多样性的最低限度合成抗体文库，并且证实其有效于获得针对多种蛋白质的高亲合力抗体结合者，如之前在Fellouse，F.A.等J. Mol.Biol.373：924-940(2007)中所述的。将被指定为YSGX文库的合成的多样性文库用于通过溶液分选搜寻针对BACE1的抑制抗体。对结合的淘选进行五轮，如以下所述。

[0335] 如之前所述，使用用于Fab-噬菌体展示的噬菌粒(pF1359)(Fellouse，F.A.等，J.Mol.Biol.373：924-940(2007)中的文库D)构建被指定为YSGX文库的用于初级分选的10
文库。所述文库的多样性为约2x10 。

[0336] 对于亲合力成熟，对于来源于初级分选的选定的克隆，利用固定的CDRH将所有三种CDRL随机化。将三种类型的寡核苷酸用于随机化。类型I使用简并密码子TMC，其仅编码Tyr和Ser。类型II使用常规三聚体亚磷酰胺混合物(trimer phosphoramidite mix)，其以等摩尔比率含有Tyr，Ser，Gly和Trp的密码子。类型III使用以以下摩尔比编码10个氨基酸残基的三聚体亚磷酰胺混合物：Tyr(30％)，Ser(15％)，Gly(15％)，Trp(10％)，以及Phe，Leu，His，Asp，Pro，Ala，各5％。将突变引入用于CDR-L3的寡核苷酸以使在原始模板上的KpnI位点在突变后沉默。对于CDR-L1长度变化为3至10个氨基酸，对于CDR-L2长度变化为7氨基酸，而对于CDR-L3长度变化为2-10个氨基酸。将所述寡核苷酸适当地汇集在一起以形成最终的寡核苷酸组，即混合在一个类型内的具有不同长度的所有L1、L2和L3寡核苷酸，然后将所有三种类型混合在一起分别作为CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3的寡核苷酸组。将Kunkel诱变用于代替所有CDR-LC位置。在Kunkel诱变(Kunkel，T.A.等，Methods Enzymol.154：367-382(1987))后，将DNA纯化并用KpnI在37℃处理3小时以消化模板DNA。然后对纯化的DNA进行电泳以用于文库构建。

[0337] 噬菌体展示的抗-BACE1克隆的选择

[0338] 将生物素化的人BACE-1(SEQ ID NO：49的1-457)用作文库分选的抗原。对于13
第一轮淘选，将20μg的生物素化的BACE1与1ml的文库以1x10 pfu/ml的浓度在4℃温育1.5h。在15分钟内利用200μl之前已经用封闭缓冲液(PBS，0.5％(w/v)牛血清清蛋白)封闭的 MyOne链霉亲和素捕获与靶标结合的噬菌体。将结合的噬菌体用
0.1M HC1洗脱，并立即用1M Tris碱中和。按照之前所述的标准实验方案(Sidhu，S.S.等Methods Enzymol.328：333-363(2000))扩增洗脱的噬菌体。与第一轮相同地进行第二轮，使用10μg的生物素化的BACE1与400μl的扩增的噬菌体温育。对于其后的所有轮，将
2μg生物素化的BACE1与400μl的扩增的噬菌体温育。在15分钟内，使用之前已经用Neutravidin或链霉亲和素包被(在各轮之间交替)并用封闭缓冲液封闭的Maxisorp免疫平板(NUNC)捕获与生物素化的BACE1结合的噬菌体。

[0339] 在五轮选择后，由生长在96-孔规格(format)中的个体克隆制备噬菌体。并且将培养物上清液在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，0.5％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，0.1％(v/v)Tween20(Sigma-Aldrich)(PBT缓冲液)中稀释三倍用于噬菌体点ELISA。将稀释的噬菌体上清液与被固定在Neutravidin包被的384-孔Maxisorp免疫平板(NUNC)上的生物素化的BACE1温育1小时。将所述平板用PBS，0.05％(v/v)Tween20(PT缓冲液)洗涤六次，并且与辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(1：5000稀释在PBT缓冲液中)(GE Healthcare)温育30分钟。将平板用PT缓冲液洗涤六次并用PBS洗涤两次，利用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺/H2O2过氧化物酶底物(Kirkegaard-Perry Laboratories)显影15分钟，利用1.0MH3PO4猝灭，并且在450nm利用分光光度法读取吸光度。

[0340] 抗-BACE1抑制克隆的选择

[0341] 对YSGX文库的淘选导致鉴定出18个结合BACE1的独特克隆。参见图3。将对应于这些克隆的Fab蛋白质纯化如下。将终止密码子引入重链和在噬菌粒上编码Fab的基因3之间。将所得的噬菌粒转化到大肠杆菌菌株3488中。将单菌落在37℃在补充以50μg/ml的羧苄青霉素的30mlLB培养基中培养过夜。将过夜培养物(5ml)接种到500ml的补充以羧苄青霉素(50μg/ml)的完全C.R.A.P.培养基中，并且在30℃生长24h。使用蛋白质A琼脂糖小珠通过标准方法纯化Fab蛋白质。

[0342] 使用HTRF酶活性测定，筛选纯化的Fab的针对BACE1的抑制活性，如上所述。Fab2，5，8，12，14和19被鉴定为BACE1的抑制剂，而Fab23被鉴定为活化剂。参见图5。

[0343] 进一步表征Fab2，5，8，12，14和19以确定其结合表位。在噬菌体竞争ELISA中，所有6种抗体的纯化的Fab的组被用于与结合到平板捕获的BACE1的个体Fab展示噬菌体竞争，如以下所述的。

[0344] 挑取选定克隆的单个菌落(在XL1blue细胞中)，并使其在1ml补充以50μg/ml羧苄青霉素、10μg/ml 四环素和M13KO7的2YT肉汤中在37℃生长2小时。将卡那霉素(25μg/ml)加入所述培养物，将其继续培养6小时。将培养物转移至30ml补充以50μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的2YT肉汤中，并在37℃生长过夜。收集噬菌体，并且如前所述进行纯化(Sidhu，S.S.等Methods Enzymol.328：333-363(2000))。将纯化的Fab展示噬菌体连续稀释于PBT缓冲液中，并测试其与被固定在平板上的BACE1的结合。选择产生80％饱和信号的固定的噬菌体浓度用于随后的竞争ELISA。通过以下方法进行所述竞争：将固定的、亚饱和的Fab展示噬菌体与BACE1的连续稀释液温育1h，然后将其转移至固定有BACE1的平板达15分钟以捕获未结合的噬菌体。然后将所述平板洗涤8次，并且通过抗-M13-HRP检测结合的噬菌体。

[0345] 纯化的Fab5可以与BACE1与噬菌体展示的Fab8和12而不是Fab2、14和19的结合竞争。与该数据一致，纯化的Fab8可与噬菌体展示的Fab5和12竞争。一并考虑，这些数据表明Fab5、8和12结合BACE1上的相同或重叠的表位。基于这些纯化的Fab中的任何一个可与Fab14展示噬菌体和Fab19展示噬菌体中的任何一个竞争的事实，Fab14和19也可与彼此竞争。这提示，这两个抗体结合相同或重叠的表位，所述表位不同于Fab5，8和12的表位。在噬菌体ELISA测定中，Fab2展示噬菌体不能被任何纯化的Fab蛋白(包括Fab2自身在内)竞争掉，提示Fab2和BACE1之间的结合是非特异性的。因此，Fab2被排除作为亲合力成熟的候选者。

[0346] 抗-BACE1抑制克隆的亲合力成熟

[0347] 为提高通过初始淘选方法获得的亲本抑制抗体的结合亲合力，设计新的噬菌体文库，所述文库随机化Fab5，8，12，14和19的所有三种CDR-LC。基于其不同的表位，这五种抗体被分为两个亚组-Fab5，8和12作为组1，而Fab14和19作为组2。纯化个体克隆的单链DNA(ssDNA)作为文库构建的模板。将组1的ssDNA模板汇集在一起用于亲合力成熟文库1(设计作LC-libl)，而组2的ssDNA模板被汇集在一起用于文库2(LC-lib2)。基于天然氨基酸对分子识别的功能能力，在随机化的CDR内限制化学多样性。参见Birtalan，S.等Mol Biosyst.6：1186-1194(2010)。最低限度多样性(Tyr和Ser二元密码子)，半最低限度多样性(Tyr，Ser，Gly和Trp三元密码子)以及其中涉及10个氨基酸的额外多样性被混合以便获得高亲合力。如上所述地，使用相同组的寡核苷酸库以同时地随机化全部三个CDR-LC来构建两个亲合力成熟文库，LC-lib1和LC-lib2。对于亲合力成熟，对于来源于初级分选的选定的克隆，在CDR-HC(互补决定区-重链)固定的情况下随机化所有三个CDR-LC(互补决定区-轻链)。

[0348] 类似地进行对初始获得的抗体的亲合力成熟的文库的筛选，如上所述。利用在溶液中的生物素化的BACE1对文库进行3轮分选，这导致在结合方面的富集大于100倍。对于第1轮，将2μg的生物素-BACE1与噬菌体展示的Fab文库温育。对于第2和第3轮，将20nM和5nM生物素化的BACE1分别与扩增的噬菌体温育。在单点竞争ELISA中筛选来自两个文库中的每一个的克隆(96)，其中在溶液中使用20nM的BACE1以与噬菌体颗粒竞争结合固定于平板的BACE1，如以下所述。

[0349] 通过使用之前用2μg/ml的Neutravidin在4℃包被过夜并且用封闭缓冲液封闭的384-孔Maxisorp Immunoplate在15分钟内捕获2μg/ml生物素化的BACE1来制备固定有BACE1的平板。将来自生长在96-孔规格中的个体克隆的培养物上清液在PBT缓冲液中稀释20倍，并且与(或不与)20nM BACE1在室温温育1小时。将混合物转移至固定有BACE1的平板并且温育15分钟。将所述平板用PT缓冲液洗涤六次，并且如上所述地通过抗-M13-HRP检测结合的噬菌体。来自在溶液中不存在BACE1的孔的ELISA信号与来自在溶液中存在BACE1的孔的ELISA信号之间的比率指示该克隆的亲合力，其中较高的比率指示较高的亲合力。

[0350] 来自LC_lib1的五个克隆具有的来自不存在BACE1的孔的ELISA信号与来自存在BACE1的孔的ELISA信号之间的比率＞4，而来自LC_lib2的一个克隆的比率＞3。两个克隆，被指定为LC4和11，来源于Fab5；三个克隆，LC6，LC9和LC10，来源于Fab12，而LC40来源于Fab14(图6)。

[0351] 为评估这6个克隆的亲合力，进行噬菌体竞争ELISA，如上所述，并且确定IC50值(图7)。IC50值通过以下方式确定：使用Kaleidagraph(Synergy Software)将数据拟合为由Marquardt(Marquardt，D.W.SIAMJ.Appl.Math.11：431-441(1963))开发的四参数逻辑方程，并且显示在以下表2中。

[0352] 表2

[0353]

[0354] *亲本

[0355] 相比于其相应的亲本，所有LC克隆实际上都显示提高的亲合力。显著地，与亲本相比，将两个Trp残基引入CDR-L2将Fab12衍生物的亲合力提高超过100倍。

[0356] 纯化6个克隆的Fab蛋白，并对其进行HTRF酶活性测定，如上所述。OM99-2( 目录号496000)，其是一种BACE1的肽抑制剂，被用作对照。对于
以5作为亲本的抗体，Fab LC4显示显著提高的抑制，而LC11丧失抑制活性。来自Fab14的衍生物LC40也丧失其抑制活性。Fab12，Fab LC6，LC9和LC10的亲合力提高的衍生物在其抑制活性方面通常显示约20倍的提高(图8)。基于该测定，Fab LC6是最佳抑制剂并且显示几乎100％的酶活性抑制，而其他Fab是部分抑制剂，具有约60-70％的抑制程度(图
8)。测试的不同Fab的IC50值显示在以下表3中。IC50OM99-2在该测定中为11nM。

[0357] 表3

[0358]Fab ID IC50(nM)
Fab5* 130
LC4 480
LC11 n.d.
Fab12* n.d.
LC9 140

[0359]Fab ID IC50(nM)
LC10 180
LC6 160
Fab14* 740
LC40 n.d.
＊亲本

[0360] Fab12的轻和重链HVR区的序列显示在图2(A)和2(B)中。Fab12的通过亲合力成熟产生的三种抗体的轻和重链HVR序列同样显示在图2(A)和2(B)中。在这些抗体中，仅轻链HVR-L2显示可变性：HVR-L2：X15AlaSer X16Leu Tyr Ser(SEQ ID NO：41)，其中X15选自丝氨酸，色氨酸和酪氨酸而X16选自丝氨酸和色氨酸。在四种抗体中三个重链HVR区中的每个是相同的。

[0361] Fab被克隆为IgG抗体以用于如下的其他应用。将选定的Fab的轻链和重链的可变结构域克隆到具有人轻链或重链(人IgGl)恒定结构域的基于pRK5的质粒中用于在293T细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的瞬时IgG表达。使用蛋白质A琼脂糖小珠通过标准方法纯化IgG蛋白质。

[0362] 实施例2：进一步表征抗-BACE1抗体

[0363] 如上所述，依据功能和在BACE1上结合的表位来鉴定抗体。使用下述测定进一步表征亲本和亲和力成熟的抗体。

[0364] A.结合动力学

[0365] 评估YW412.8.31的结合动力学。简言之，抗-BACE1IgG的结合亲合力通过表面等离子共振(SPR)使用BIAcoreTM-3000仪器来测量。YW412.8.31抗-BACE1人IgG由包被在CM5生物传感器芯片上从而获得约100个应答单位(RU)的小鼠抗-人Fc抗体(GE Healthcare，货号BR-1008-39)来捕获。对于动力学测量，在25℃以30μl/min的流速注射在PBT缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)中的人BACE1ECD或鼠BACE1ECD(氨基酸1-457)的两倍连续稀释液(0.98nM至125nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcoreTM Evaluation Software3.2版本)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算作比率koff/kon。YW412.8.31在pH7.0结合的结果显示在表4中。

[0366] 表4-通过BIAcoreTM测量的抗-BACE1抗体的结合动力学值

[0367]

[0368] YW412.8.31与BACE1在pH7.0和5.0的结合被确认。这是重要的，因为BACE1在酸性pH，推测地在内吞小泡和/或反式高尔基体网络中活性最佳。

[0369] B.体外抑制测定

[0370] 此外，使用两种活性测定：HTRF测定和微流体毛细管电泳(MCE)测定，利用人重组的BACE1的胞外结构域，在体外评估抗体调节BACE1对特定BACE底物的蛋白水解活性的能力。

[0371] 在HTRF测定中测试亲和力成熟的YW412.8.31抗-BACE1抗体，如在实施例1中所述。BACE1的合成的肽抑制剂，OM99-2( 目录号496000)，BACE1的小分子抑制剂(β-分泌酶抑制剂IV，目录号5657688)和不结合BACE1的IgG抗
体被用作对照。参见图9(图A)(长肽)。此外，与HTRF反应相同地，也进行使用短FRET肽(Rh-EVNLDAEFK-猝灭剂(SEQ ID NO：54)，Invitrogen)的反应。如上地测量产生自对照反应的荧光产物，但是是以545nm的激发波长和585nm的发射波长进行。使用GraphPad TM
Prism5 (LaJolla，CA)分析获得的数据。参见图9(图A)(短肽)。

[0372] 在384-孔微平板中以20μL/孔的终体积进行MCE测定反应。标准酶促反应，通过将10μL2X底物添加到5μL的4x酶和5mL的4x化合物来起始，所述4x化合物包含12nM人BACE1胞外结构域，1mM淀粉状蛋白前体蛋白β分泌酶活性位点肽(FAM-KTEEISEVNLDAEFRWKK-CONH2(SEQ ID NO：55))，50mMNaOAc pH4.4和0.1％CHAPS。将相同的反应条件用于人BACE2酶的胞外结构域(5nM)和组织蛋白酶D的胞外结构域(6nM， )。在环境温度温育60分钟后，分离每个反应中的产物和底物，使用12-吸式(sipper)微流体芯片，在 (两者都来自Caliper Life Sciences)上分析。产物与底物的分离通
过使用制造商的优化软件选择电压和压力来优化。分离缓冲液含有100mM HEPES pH7.2，
0.015％Brij-35，0.1％包被试剂(coating reagent)#3，10mM EDTA和5％DMSO。分离条件使用-500V的下游电压，-2250V的上游电压和-1.2psi的筛选压力。产物和底物荧光在488nm的波长被激发，并在530nm的波长检测。使用HTS Well Analyzer软件(Caliper Life Sciences)，从电泳图计算底物转化率。

[0373] 来自使用YW412.8.31抗体的HTRF和MCE测定的结果显示在图9中。在长肽测定中观察到的该抗体的IC50为1.7nM，最大抑制达到77％。此外，YW412.8.31抗体在短肽测定中具有的IC50为17nM。此外，在微流体毛细管电泳测定中YW412.8.31抗-BACE1抗体以80pM的IC50抑制BACE1活性，而不抑制人BACE2或组织蛋白酶D，一种溶酶体天冬氨酰蛋白酶。对YW412.8.31抗体的SPR分析也证实抗体不结合BACE2，其是与BACE1关系最近的蛋白酶。这些数据在一起表明YW412.8.31抗体是有效和选择性的BACE1拮抗剂。对该抗体进行进一步的表征以更好的理解其功能。

[0374] 基于细胞的抑制测定

[0375] 为确定观察到的抗-BACE1抗体对APP加工的体外抑制作用是否也存在于细胞环境中，进行体内研究。如下地，评估抗体在稳定表达野生型人淀粉状蛋白前体蛋白的WT 4293-HEK细胞中抑制Aβ1-40产生的能力。将293-APP 细胞以3x10 细胞/孔的密度在96-孔板中接种过夜。将50μl的含有抗-BACE1抗体或对照IgGl抗体的新鲜培养基(DMEM+10％FBS)与所述细胞在37℃温育24小时。一种三环小分子BACE1抑制剂(BACE1SMI)也被用作对照((化合物8e-Charrier，N.等J.Med.Chem.51：3313-3317(2008))。收集细胞培养基(cellular media)并根据制造商的说明使用Aβ1-40 测定(CisBio)来测定Aβ1-40的存在。Aβ1-40值对如使用CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay(Promega)确定的细胞生存力进行归一化。实验至少进行三次，并且将每个实验中的每个点重复两次。
使用四参数非线性回归曲线拟合程序(Kaleidagraph，Synergy Software)对数据进行作图。

[0376] 也在分离自小鼠的背根神经节、皮层神经元和海马神经元中进行类似的研究。简言之，解离的神经元培养物制备自E13.5背根神经节(DRG)，E16.5皮层神经元和E16.5海马神经元。将神经元在体外培养五天。将含有YW412.8.31抗-BACE抗体或对照IgGl的新鲜培养基与神经元温育24小时。收集培养基并根据制造商的说明使用 Rodent/Human(啮齿动物/人)(4G8)Aβ40Ultrasensitive kit(超灵敏试剂盒)测定Aβ40的存在。Aβ40值对如使用CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay(Promega)确定的细胞生存力进行归一化。实验至少进行三次，并且将每个点重复两次。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(Kaleidagraph，Synergy Software)对数据进行作图。

[0377] 与非BACE1IgG抗体抑制剂相比，所有测试的抗-BACE1抗体(LC6，LC9，YW412.8，YW412.8.30，YW412.8.31和YW412.8.51)抑制在表达APP的293细胞中的Aβ1-40产生。参见图10。

[0378] 如在图11中所示，YW412.8.31抗-BACE1抗体抑制在表达APP的293细胞中的Aβ1-40产生，其程度类似于BACE1SMI对照，IC50为17nM而最大减少为～90％。在DRG神经元中观察到类似的结果，其中以最高浓度的YW412.8.31，Aβ40产生减少约50％，而IC50为8.4nM。YW412.8.31抗-BACE1抗体还抑制在皮层和海马神经元中的Aβ40产生，其中IC50为2.3-2.6nM。这些发现表明抗-BACE1抗体与之前在体外观察到的类似的作用于细胞。此外，YW412.8.31抗体表现为在CNS的神经元中显示最佳效力。

[0379] 抗-BACE1抗体的胞内定位

[0380] 已知BACE1表达于胞内，尤其是在高尔基体中。为确定YW412.8.31是否在胞内环境中与BACE1相互作用，进行内化研究。一组神经元培养物制备自E13.5背根神经节(DRG)外植体，并且第二组神经元培养物制备自来自BACE1+/+或BACE1-/-小鼠的E16.5解离的皮层神经元，并且分别将其在37℃培养24或72小时。在30分钟至2小时的时间内将含有0.5μM YW412.8.31抗-BACE1抗体的培养基加入所述培养物中，并且在4℃或37℃温育。
在处理后，用PBS将未结合的抗体彻底洗去。在室温用4％多聚甲醛将培养物固定20分钟，并且还利用0.1％Triton X-100对选定的样品进行渗透化。根据制造商的指导，使用第二Alexa568缀合的抗-人IgGl抗体(Molecular Probes)检测结合的抗体。

[0381] 在高温样品中，发现大部分的抗体信号是内化的。如在图12(B)中可见，在37℃当细胞被透化从而允许用第二抗体检测YW412.8.31抗-BACE1抗体时，可以在DRG轴突中在细胞内检测到BACE1。相反，当在4℃低温孵育DRG以防止内化时，或当细胞未被透化从而不允许YW412.8.31的胞内检测时，在细胞表面检测到非常少的BACE1。抗体内化到神经元中取决于BACE1结合，因为其仅在来自BACE1+/+动物的皮层神经元中可以检测，而在来自BACE1-/-动物的神经元中不可检测(比较图12(C)的中间图和右图)。

[0382] 此外，在YW412.8.31抗-BACE1抗体或对照IgG存在下将小鼠皮层神经元培养10分钟或3小时，其后通过免疫染色检测抗体。神经元培养物制备自E15.5解离的皮层神经元，并且培养14DIV。在10分钟至3小时内将含有1μM YW412.8.31的培养基加入到培养物中，并且在37℃温育。在处理后利用HBSS将未结合的抗体彻底洗去。在室温用2％多聚甲醛将培养物固定10分钟，然后利用0.1％Triton X-100进行渗透化，或不仅进行该处理。使用Alexa568缀合的抗-人IgGl第二抗体(Molecular Probes)检测结合的抗体。在非透化的细胞中分析YW412.8.31定位，以观察有多少结合在细胞的表面上，并且在透化的细胞中分析YW412.8.31定位，以观察有多少抗体被内化。检测到的大部分抗体信号定位于细胞内，而在细胞表面上几乎没有观察到抗体染色(图12(A))。在仅10分钟的YW412.8.31处理后内化是明显的，表明抗体被早期核内体积极地吸收。大部分YW412.8.31信号是点状的，表明其可能包含在小泡内。

[0383] 为更好地定位YW412.8.31定位的亚细胞部分，我们利用不同小泡部分的标记物进行共染色：早期核内体(运铁蛋白受体，TfR)，反式高尔基体网络(TGN)(VAMP4)，和溶酶体(LAMP1)。利用抗-TfR(Novus，目录号NB100-64979)，抗-VAMP4(Novus，目录号NB300-533)或抗-LAMP1(BD Pharmingen，目录号553792)对细胞进行共染色。YW412.8.31免疫反应性与早期核内体和TGN的标记物共定位，而不与溶酶体的标记物共定位(图12(A))。该模式与抗体定位于其中BACE1活跃的部分相一致。

[0384] 实施例3：抗-BACE1抗体结合位点表征

[0385] 进行进一步的研究以鉴定特定抗-BACE1抗体与人BACE1的结合位点。在一组实验中，在存在或不存在已知的活性位点或外结合位点BACE1结合肽的情况下评估所述抗体与BACE1(hBACE1)的结合从而确定哪些抗体显示竞争性结合。在第二组实验中，将抗-BACE1Fab与人BACE1胞外结构域共结晶以确定三维结合位点。

[0386] A.竞争性结合

[0387] 作为间接确定本发明的抗-BACE1抗体在BACE1上的结合位点的方法，进行竞争性ELISA。简言之，将抗体YW412.8IgG(1μg/ml)包被在NUNC96孔Maxisorp免疫平板上，在4℃过夜，并且利用封闭缓冲液PBST(PBS和1％BSA和0.05％Tween20)在室温封闭1小时。
将抗-BACE1抗体YW412.8或hBACE1结合肽的连续稀释液与预定量的生物素化的hBACE1温育，并在室温温育60分钟。然后将所述连续稀释液加入到YW412.8包被的平板中并在室温温育30分钟。随后，用洗涤缓冲液(含有0.05％T-20的PBS)洗涤平板，并通过加入标记有辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素在室温显影30分钟。然后洗涤所述平板，并利用四甲基联苯胺(TMB)底物显影。在630nm的波长，使用标准技术，测量与捕获的生物素化的hBACE1结合的HRP缀合的链霉亲和素。

[0388] 为确定用于以上竞争ELISA测定的生物素化的靶标蛋白的最佳浓度，将NUNC96孔Maxisorp免疫平板如上所述地包被和封闭。将生物素化的靶标的连续稀释液与抗体包被的平板在室温温育30分钟。然后用PBST洗涤所述平板，之后与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素在室温温育30分钟。结合信号的检测如上所述。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(Kaleidagraph，Synergy Software)对数据进行作图。从曲线拟合确定生物素化的hBACE1的亚饱和浓度，并且应用于以上竞争ELISA。

[0389] 如预期的，YW412.8与自己竞争结合hBACE1(图13)。在YW412.8和活性位点抑制剂肽OM99-2( 目录号496000)之间没有观察到竞争。在LC6和YW412.8抗-BACE1抗体以及已知的外结合位点结合肽BMS1(来自Kornacker等，Biochemistry44：
11567-11572(2005)的肽1)之间观察到竞争。结合在一起，这些结果表明YW412.8结合在不同于用于APP裂解的BACE1活性位点的BACE1外结合位点处。图13中曲线的形状提示YW412.8、LC6和BMS1可以具有在BACE1上的重叠的结合位点。

[0390] B.晶体结构

[0391] 为更好地理解YW412.8抗体与BACE1的相互作用，将YW412.8.31Fab与人重组BACE1胞外结构域的胞外结构域共结晶。

[0392] 蛋白质表达和纯化

[0393] BACE1(SEQ ID NO：49的氨基酸57-453)的蛋白质表达和纯化。通过Blue Heron合成带有C端His6标签的DNA(SEQ ID NO：210)，将其克隆到pET29a(+)载体(Novagen)中，并转化到BL21(DE3)细胞(Invitrogen)中。表达在37℃进行4小时，利用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。利用微流体化机(microfluidizer)裂解细胞，并且分离包涵体(其含有BACE1)，并用TE(10mM Tris pH8.0和1mM乙二胺四乙酸(EDTA))缓冲液洗涤两次。使用7.5M尿素，100mMAMPSO pH10.8和100mMβ-巯基乙醇(BME)在室温进行蛋白质溶液化达2小时，之后在12,000rpm离心30分钟。然后将上清液用7.5M尿素，100mMAMPSO pH10.8稀释以获得约1.5-2.0的OD280。通过以下方法进行蛋白质重折叠：首先将溶液化的BACE1按1：20稀释在冷水中，然后将样品在4℃温和搅拌3周以允许重折叠发生。重折叠的BACE1的纯化涉及3个柱层析步骤。首先，将BACE1加样到用20mM Tris pH8.0和0.4M尿素预平衡的50ml Q琼脂糖凝胶Fast Flow(GE Healthcare)柱上，并用
0-0.5M NaCl的盐梯度洗脱。收集峰级分，用20mM Tris pH8.0缓冲液稀释5倍，并加样到SourceTM15Q柱(GE Healthcare)上。使用0-0.3M NaCl的梯度用于洗脱BACE1。收集含有TM
BACE1蛋白的级分，浓缩并在Superdex S75柱(GE Healthcare)上在25mM Hepes pH7.5，
150mM NaCl中进一步纯化。

[0394] 在大肠杆菌中表达YW412.8.31Fab，并将细胞体在PBS，25mM EDTA和1mM PMSF中解冻。将混合物均质化，两次通过微流体化机，和在12,000rpm离心60分钟。然后以5ml/min将上清液加样到蛋白质G柱上。将该柱用PBS洗涤至基线，并且用0.58％乙酸洗脱蛋白。收集含有YW412.8.31Fab的级分，并将其加样到用20mM MES，pH5.5平衡的SP-琼脂糖TM凝胶柱上，并用0至0.25M NaCl的盐梯度洗脱Fab。在Superdex S75柱上在25mM Hepes pH7.5和150mM NaCl中进一步纯化Fab。

[0395] 结晶

[0396] 将纯化的BACE1蛋白(SEQ ID NO：49的氨基酸57至453)与纯化的YW412.8.31Fab以1：1.5的摩尔比(过量的Fab)昆合。将复合物在冰上孵育1小时并在S20026/60凝胶过滤柱(GE Healthcare)上纯化以将其与过量的Fab分离。然后将复合物浓缩到15mg/ml。通过坐滴蒸汽扩散法进行结晶，其中将1μl的BACE1/Fab复合物溶液与1μl的含有20％PEG4000，0.1MTris pH8.5和0.2M乙酸钠的孔溶液混合。然后将结晶液滴在19℃孵育。晶体在4天后出现，并且继续生长2天以上。然后收集晶体，并在含有母液和20％甘油的冷冻保护液中速冻。

[0397] 数据收集和结构测定

[0398] 使用单色 X 射线束 (12658.4eV) 在 Stanford Synchrotron Radiation Facility(Stanford同步辐射装置)(SSRL)束线7-1收集衍射数据。X射线检测装置是ADSC量子-315CCD检测器，其被放置在距离晶体430mm处。将旋转法应用于单晶以用于收集完整数据组，其中每帧摆动0.5°并且总的楔(wedge)大小为180°。然后将数据指标化，积分，并使用程序 (HLK Research，Inc.)换算(scaled)。

[0399] 使用分子置换 (MR)法利用程序 Phaser(Read，R.J.，Acta Cryst.D57：1373-1382(2000))解析结构。Matthews系数计算结果指示每个不对称单位由一个
BACE1/Fab复合物和48％溶剂组成。因此，进行MR计算以搜寻包含包括Fab的N-和
C-结构域，以及BACE1胞外结构域的三个亚基的组。分开搜寻N端和C端Fab结构域
以允许灵活的弯角(elbow angle)。Fab亚基的搜索模型来源于HGFA/Fab复合物的晶体结构(PDB编码：2R0L，Wu，Y.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA104：19784-19789(2007))。
BACE1的搜索模型来自公开的BACE1结构，所述BACE1结构的PDB编码：1FKN(Hong，L.等Science290：150-153(2000))。在BACE1/Fab界面发生显著的构象变化。利用程序COOT(Crystallographic Object-Orientation Toolkit(面向对象的晶体学工具包))(Emsley&Cowtan，Acta.Cryst.D60：2126-2132(2004))进行手工重建。反复利用程序REFMAC5(Murshudov，G.N.等，Acta Cryst.D53：240-255(1997))和PHENIX(Python-based Hierarchical Environment for Integrated Xtallography(基于Python的用于积分的X射线晶体学的分层环境))(Adams，P.D.等Acta.Cryst.D66：213-221(2010))使用最大相似度靶标函数进行结构精修以获得0.221的最终R因子和0.274的Rfree。结构精修的统计数据显示在表5中。

[0400] 表5-晶体学数据统计

[0401]1

[0402] Rsym＝∑|Ihi-Ih|/∑Ihi，其中Ihi是经换算的第i次对反射h的对称相关观察的强度，并且Ih是平均值。2

[0403] 括号中的值是最高分辨率壳层的值。

[0404] 3Rcryst＝∑h|Foh-Fch|/∑hFoh，其中Foh和Fch是反射h的观察的和计算的结构因子振幅。

[0405] 4对不包括在精修中的5％随机选择的反射计算Rfree的值。

[0406] 晶体衍射，并且在分辨率精修结构。BACE1在复合物中的总体结构极为类似于其游离形式(Hong等，Science290：150-153(2000))，该游离形式可以以 RMSD在96％(373/385)的残基的Cα碳位置处对齐。YW412.8.31Fab在BACE1分子表面上覆盖的表面积，并且不结合在活性位点附近。所述表位包含被Hong等(Science290：
150-153(2000))指示为环C(全长BACE1的氨基酸315-318)，D(全长BACE1的氨基酸
331-335)，和F(全长BACE1的氨基酸370-381)的结构元件，所述结构元件紧凑地定位与三维空间中。此外，在YW412.8.31结合位点处和附近的BACE1的部分采取构象变化，并且导致0.71的形状互补评分，这与强结合相一致。认为抗体诱导的构象变化促进分泌酶活性的变构抑制。

[0407] Fab结合到远离淀粉状蛋白前体蛋白的BACE1活性位点的外结合位点，其与之前被鉴定为一组BACE1结合肽的结合位点的外结合位点(Kornacker等，Biochemistry44：11567-11572(2005)部分重叠(图14)。重和轻链都参与相互作用(图15)。与游离形式(其中BACE1表位区域是更加动态的，如由高温因子所指示的)不同，结合抗体的结构被稳定化在独特构象中，所述构象使分泌酶的P6和P7位点变形(Turner等，Biochemistry44：
105-112(2005))。与所述位点邻近，SEQ ID NO：49的氨基酸218-231(AGFPLNQSEVLASV(SEQ ID NO：126)(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：1456-1460(2000)中的残基157-170(氨基酸编号始于BACE1的成熟蛋白酶结构域))，其在结合底物的复合物中采取α-螺旋结构，在抗体复合物中变为随机环，这不利地影响APP蛋白水解裂解，可能是通过防止APP以有催化能力的方式进入BACE1催化裂缝中。该结构表位包括包含在晶体结构中定位在距离YW412.8.31Fab的任何部分4埃内的一个或多个原子的BACE1的氨基酸残基。在以下表
6中，Fab轻链残基属于L链，而Fab重链残基属于H链。BACE1氨基酸的残基编号是基于BACE1的全长序列(SEQ ID NO：49)。Fab氨基酸的残基编号是基于Kabat编号方案(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。

[0408] 表6-定位在YW412.8.31-BACE1结合界面中的残基

[0409]BACE1残基 Fab残基
314SER H26GLY
316GLU H27PHE
317LYS H28THR
318PHE H30LEU
319PRO H31GLY
327GLN H32TYR
328LEU H53ALA
329VAL H58ASP
330CYS H94ARG
331TRP H96PRO
332GLN H97PHE
333ALA H98SER
335THR H99PRO
337PRO H100TRP
340ILE
375THR L49TYR
378ASP L53PHE
380CYS L55TYR
426PHE L56SER
L94TYR

[0410] 详细的原子相互作用是以极性相互作用的范德华接触(van der Waals contact)的形式。极性相互作用包括氢键和盐桥。以下的表7包括BACE1和YW412.8.31Fab之间的成对极性相互作用的列表。Fab轻链残基属于L链，而Fab重链残基属于H链。BACE1氨基酸的残基编号是基于BACE1的全长序列(SEQ ID NO：49)。Fab氨基酸的残基编号是基于Kabat编号方案。

[0411] 表7-BACE1和YW412.8.31Fab之间的成对极性相互作用

[0412]BACE1残基---Fab残基
314SER---H98SER
317LYS---H58ASP
327GLN---H53ALA
330CYS---H31GLY
331TRP---H98SER
331TRP---H32TYR
332GLN---H32TYR
378ASP---H32TYR
316GLU---L94TYR
332GLN---L55TYR
335THR---L49TYR

[0413] 如下所示，在BACE2和组织蛋白酶D中的相应区域中，YW412.8.31抗体BACE1表位中的氨基酸组成保守性差。在YW412.8.31抗体的表位中的此种氨基酸差异与以下观察相一致：该抗体针对BACE1具有高度选择性。编号是基于BACE1的全长序列(SEQ ID NO：49)。BACE2和组织蛋白酶D的序列基于其各自的晶体结构被对准至BACE1。YW412.8.31BACE1表位中的残基被加框。

[0414]

[0415] 实施例4：体内表征-小鼠

[0416] 在体内评估YW412.8.31的作用。为了确定BACE1特异性抑制剂可能获得的最大Aβ1-40减少，检验BACE1对BACE1-/-小鼠(与BACE1+/+对照相比)的血浆和前脑中的Aβ1-40产生的贡献。在BACE1-/-小鼠中，血浆Aβ1-40信号减少45％，而脑Aβ1-40信号减少80％(图16，图A)。这些结果提示BACE1的确是前脑中的主要β-分泌酶，但是在外周，BACE1仅负责部分的Aβ1-40产生，剩余的来自另一种β-分泌酶。

[0417] 在理解了BACE1对Aβ产生的贡献的情况下，评估在hAPP转基因和野生型小鼠中抗-BACE1抗体YW412.8.31调节淀粉状蛋白形成加工的能力。

[0418] hAPP转基因小鼠

[0419] 简言之，通过腹膜内注射每四天用30mg/kg或100mg/kg YW412.8.31抗体或赋形剂处理5月龄的表达人APP的小鼠，总共三剂(即，在第1天，第5天，和第9天)。在最终剂量后两小时对动物进行安乐死。收集血清，血浆和脑并处理。使用淀粉状蛋白β(Aβ)ELISA检验试剂盒根据制造商的说明(The Genetics Company)分析血浆、皮层和海马的可溶Aβ1-40和Aβ1-42水平。在血清和脑匀浆上进行药物动力学分析。

[0420] 结果显示：在30mg/kg和100mg/kg YW412.8.31抗体剂量水平，血浆Aβ1-40和Aβ1-42水平都减少至对照水平的约30％(图17(A)，上图，以及图18，图A)。然而，与在以下讨论的野生型小鼠中观察到的相比，以100mg/kg剂量水平的YW412.8.31抗体，Aβ1-40和Aβ1-42在脑中的水平仅减少15-22％(图17(A)，底图，以及图18，图A)。YW412.8.31抗体在处理过的动物的脑中的浓度以依赖剂量的方式提高，其中在30mg/kg处理的动物中观察到的抗体在脑中的浓度为4.8±3.6nM，而在100mg/kg处理的动物中观察到的抗体在脑中的浓度为14.0±9.3nM，这证实了腹膜内给药的更高剂量的抗体的确转换为在脑中观察到的更高剂量的抗体。个体药物动力学对药效学读数作图提示对于该模型中的该抗体存在PK/PD关系(图17(B))。

[0421] 也进行类似的实验，其中通过连续ICV输注将YW412.8.31抗-BACE1抗体全身地或直接地递送到hAPP转基因小鼠脑中。对于ICV递送，经由单侧植入的Alzet渗透性迷你泵(型号2001)连续递送抗体达7天。递送的YW412.8.31抗体的量为0.041mg/天(低剂量)或0.41mg/天(高剂量)；将0.33mg/天的对照IgG递送至对照组。在安乐死时，收集血浆、皮层和海马并通过ELISA(The Genetics Company)根据制造商的说明分析可溶Aβ1-40和Aβ1-42的水平。

[0422] 下表8显示YW412.8.31抗体在以30mg/kg或100mg/kg(通过全身递送)用药的或以0.041mg/天和0.41mg/天(通过ICV递送)用药的小鼠的脑中的浓度。

[0423] 表8

[0424]

[0425] 然而，虽然在输注后抗体在脑中的水平高，但是Aβ减少是中等的处于15-23％，并且相似于利用全身递送观察到的的减少(图18，图B)。该观察提示虽然高剂量全身注射可能能够降低hAPP转基因小鼠中的Aβ水平，但是下降是中等的。认为hAPP转基因小鼠中下降的效力是动物模型的结果，因为脑中的高浓度，相当于全身递送后血清中的浓度，没有进一步减少Aβ产生。此外，hAPP转基因小鼠的脑中的减少与在野生型小鼠中观察到的和以下所述的相比是中等的。因此，转基因hAPP小鼠对于研究抗-BACE1的体内作用可能不是理想的。同样从疾病角度来看，野生型小鼠是用于抗体效力的更适当的模型，因为压倒性多数的阿尔茨海默病患者群体带有野生型APP等位基因。

[0426] 野生型小鼠

[0427] 也在野生型小鼠中评估抗-BACE1抗体YW412.8.31调节淀粉状蛋白形成加工的能力。简言之，如上所述地进行实验。将单剂量的对照IgG抗体或YW412.8.31抗-BACE1抗体(50mg/kg)通过静脉内(IV)注射全身地递送到野生型小鼠。24或48小时后，收集血浆和脑样品并分析Aβ1-40水平。使用夹心ELISA按照与以下描述的用于测量总的抗-BACE1抗体浓度的过程相似的过程测定血浆和脑中总小鼠Aβ1-40的浓度。简言之，将对Aβ1-40的C端具有特异性的兔多克隆抗体(Millipore，Bedford，MA)包被在平板上，并将生物素化的抗-小鼠Aβ单克隆抗体M3.2(Covance，Dedham，MA)用于检测。在血浆中该测定具有的定量下限值为1.96pg/ml，在脑中为39.1Pg/g。如在图16、图B中所示，血浆Aβ1-40减少35％而皮层Aβ1-40减少20％。

[0428] 进行利用野生型C5781/6J小鼠的额外实验，其中全身施用100mg/kg的YW412.8.31或对照IgG。测定在单次腹膜内(IP)注射四小时后在经处理的动物的血浆和前脑中的Aβ1-40水平。从动物收集血液，通过心脏穿刺以分离血浆。在PBS灌注后，收集脑并且将来自一个脑半球(hemibrain)的前脑预备在PK缓冲液(1％NP-40，在PBS中，含有Roche完全蛋白酶抑制剂)中，而来自另一个脑半球的前脑在5M GuHCL，50mM Tris pH8.0中被均质化，并进一步稀释在酪蛋白封闭缓冲液(0.25％酪蛋白/0.05％叠氮化钠，20μg/ml抑酶肽/5mM EDTA，pH8.0/10μg/ml亮抑酶肽，在PBS中)中用于Aβ1-40分析。

[0429] 如在图22、图A中所示，100mg/kg剂量能够将血浆Aβ1-40减少对照水平的～50％，并且类似于之前描述的BACE1敲除水平。然而，在给药后4小时没有检测到前脑中Aβ1-40的变化。该早期时间点可能太靠近YW412.8.31的给药以致看不到在脑中的作用。可能需要给药后的较长的时间阶段以观察脑中减少的Aβ，特别是因为在24小时在以较低剂量(50mg/kg)处理的野生型小鼠中观察到Aβ的减少，如上所述。血清中的YW412.8.31浓度非常高，在给药后4小时为1040±140μg/mL(6.9±0.9μM)。脑中的YW412.8.31浓度低得多，在0.7±0.4μg/g(4.7±2.7nM)，这表示在血清中～0.07％的浓度，非常近似预测的抗体到CNS中的0.1％稳态穿透(Reiber和Felgenhauer，Clin.Chim.Acta.163：319-328(1987)。
重要地，在脑中获得的抗体浓度(4.7±2.7nM)接近之前观察到的细胞IC50(图11)。因此，抗-BACE1抗体在体内高度有效，如通过血浆Aβ1-40减少至在BACE1敲除小鼠中观察到的水平所证实的。然而，到向小鼠给药后4小时时，单次全身剂量不导致脑减少，最有可能是因为该时间点过早以至于不能观察到任何效果。

[0430] 进行另外的实验以测定通过重复用药升高的脑抗体水平的作用。每4天通过腹腔注射以30或100mg/kg给药YW412.8.31抗体或对照IgG，总计3个剂量。在该研究中，测量在最后的剂量后4小时的经处理的动物的血浆和前脑中的Aβ1-40水平。再一次，在以30和100mg/kg多次用药后观察到血浆Aβ1-40水平减少～50％(图22，图B)。显著地，观察到在高剂量的抗-BACE1的情况下前脑Aβ1-40减少42％，虽然在低剂量未观察到减少。在每4天分别以30和100mg/kg给药后，血清中的YW412.8.31抗体浓度为480±210和1500±440μg/mL，而脑中的浓度为0.9±0.6μg/g(5.9±4.3nM)和3.0±1.6μg/g(20±10nM)。因此，如预测的，更高的脑中的抗体水平导致Aβ水平的极大减少。值得注意地，与100mg/kg剂量相比，在30mg/kg剂量的情况下外周Aβ水平没有差异，提示在30mg/kg获得最大外周抑制，并且因此，简单地降低外周Aβ水平不足以降低脑水平。

[0431] 此外，在以YW412.8.31抗-BACE1抗体在野生型和BACE1敲除小鼠中用药后，获得PK数据。参见图19。单剂量的抗-BACE1(1或10mg/kg)经由IV注射递送到BALB/C小鼠。分析血清PK至用药后21天。

[0432] 如下地测量小鼠血清和脑样品中的总抗-BACE1抗体浓度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量小鼠血清和脑样品中的抗体浓度。将NUNC384孔Maxisorp免疫平板(Neptune，NJ)包被以驴抗-人IgG、Fc片段特异性多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)的F(ab’)2片段，在4℃过夜。第二天，用含有0.5％牛血清清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)将平板在室温封闭1小时。将每种抗体(对照IgG和抗-BACE1)用作标准以量化各自的抗体浓度。在使用微平板洗涤器(Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)以含有0.05％Tween20的PBS洗涤平板后，将稀释在含有0.5％BSA，0.35M NaCl，0.25％CHAPS，5mM EDTA，0.05％Tween20和15ppm Proclin的PBS中的标准品和样品在平板上在室温孵育2小时，同时温和搅拌。利用辣根过氧化物酶缀合的F(ab’)2羊抗-人IgG、Fc特异性多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch)检测结合的抗体。最终，使用底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)对平板进行显影。在Multiskan Ascent检测仪(Multiskan Ascent reader)(Thermo Scientific，Hudson，NH)上以450nm(参比630nm)的波长测量吸光度。从标准曲线使用四参数非线性回归程序确定浓度。在血清中该测定的定量下限(LLOQ)值为3.12ng/ml，而在脑中为15.6ng/g。

[0433] 按照如上所述的类似过程，使用作为包被物(coat)的BACE1ECD和用于检测的抗-人IgG、Fc特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)检测小鼠中的游离YW412.8.31抗体浓度。在血清中游离抗-BACE1小鼠ELISA的LLOQ值为0.626ng/ml，而在脑中为3.13ng/g。

[0434] 使用两个单独的PK测定：一个测定用于检测血清中的所有YW412.8.31(总mAb)，而一个测定仅用于检测血清中未结合的YW412.8.31(游离mAb)。观察到的PK动力学是非线性的，并且其中YW412.8.31浓度＜10μg/mL的样品的总mAb值与游离mAb值之间的差异提示靶标介导的清除。参见图19、图A。此外，总mAb和未结合的mAb之间的差异指示血清中的一些YW412.8.31可能结合可溶的BACE1。在BACE1+/+、BACE1+/-和BACE1-/-小鼠中的单剂量PK分析证实在初始研究中观察到的非线性，并且指示提高的清除率的确是靶标介导的。BACE1-/-小鼠显示线性PK。参见图19(图B)。

[0435] 实施例5：体内表征-猴

[0436] 通过IV递送利用对照IgG或YW412.8.31抗-BACE1抗体(30mg/kg)给食蟹猴用药。在用药前多至7天对血浆和CSF进行采样以建立每个个体动物中的平均基线Aβ1-40水平，然后在用药后的不同时间采样。使用即作为包被物又用于检测的猴-吸附的羊抗-人IgG多克隆抗体(Bethyl，Montgomery，TX)测量猴血清和CSF样品中的总抗-BACE1或对照抗体浓度(图20)。使用作为包被物的BACE1ECD以及用于检测的猴-吸附的羊抗-人IgG抗体(Bethyl)来测定猴中的游离抗-BACE1抗体浓度。在血清或CSF中，总的和游离抗-BACE1猴测定的LLOQ值都是6.25ng/ml。PK是如对于在猴中用药的IgGl所预期的，并且显示预测的暴露(exposure)。

[0437] 还测定来自测试的食蟹猴的血浆和CSF的Aβ1-40水平。简言之，使用MSD MA6000人(6E10)Aβ试剂盒(目录号K111BVE-2，Meso Scale Diagnostics)，根据制造商的说明，测定血浆中总食蟹猴Aβ1-40的浓度。将对于Aβ1-40的C端具有特异性的捕获抗体预包被在平板上，并且将Sulfo-Tag抗-Aβ单克隆抗体6E10用于检测。在血浆中该测定的定量下限值为49.4pg/ml。使用夹心ELISA测定CSF中总食蟹猴Aβ1-40的浓度。将对于Aβ1-40的C端具有特异性的兔多克隆抗体(目录号AB5737，Millipore，Bedford，MA)包被在平板上，并将生物素化的抗-Aβ单克隆抗体6E10(目录号SIG-39340，Covance，Dedham，MA)用于检测。在CSF中该测定的定量下限值为15.6pg/ml。

[0438] 如在图21(图A)中所示，在所有个体中，血浆Aβ1-40水平减少基线的～50％。在整个7天观察期中，50％最大血浆Aβ减少是持续的。YW412.8.31抗-BACE1抗体的血清浓度-时间特征曲线(profile)表现为类似于对于对照IgG抗体所观察到的，提示在线性范围内动力学类似于被用药的典型的IgGl的动力学(图20，图A)。在给药后15分钟的第一次样品收集时，观察到～800μg/mL的峰值血清抗体浓度，并且到用药后7天时跌至232μg/mL。值得注意地，在用药后测量的所有时间点，YW412.8.31的血清浓度都超过细胞IC50(～2.5nM，参见图11)。

[0439] CSF Aβ1-40水平，如在图21(图B)中所示，尽管可变，在用药后1天和3天显示达50％的减少，之后在用药后的第7天显示向基线Aβ返回的趋势。基线血浆和CSF水平的可变性显示在图21(图C和D)中。在动物中，基线血浆水平相当一致，而CSF Aβ1-40水平高度可变。因此，将所有Aβ1-40测量值对每个个体猴的基线进行归一化。

[0440] 这些数据显示，单剂量的YW412.8.31在猴中显著减少血浆和CSF Aβ水平。在CSF中，在这段时间内观察到0.2-0.3μg/ml的YW412.8.31浓度，其转换为～2nM(图20，图B)。从该数据，推断出，YW412.8.31的脑浓度在相似范围内。比较PK和PD数据，这些结果显示：在7天的时间，药物在血浆中的暴露足以最大地抑制Aβ产生，而在所检验的剂量水平(30mg/kg)，CSF中的药物浓度接近细胞IC50并且瞬时降低脑中的Aβ水平。概括地，这些数据提供强有力的证据，即全身给药抗-BACE1可以降低脑中的BACE1活性，如通过非人灵长动物中的CSF Aβ测量确定的。

[0441] 实施例6：YW412.8.31抗体的亲合力成熟

[0442] 根据由之前所述的晶体结构提供的结构数据的指导，YW412.8.31抗体进行亲和力成熟。将与BACE1接触的抗体残基突变以增强YW412.8.31抗体的亲合力。通过该策略制备的亲和力成熟的克隆被命名为YW412.8.31xS。YW412.8.31亲和力成熟的克隆也通过软性随机化所有CDR的寻靶来制备，如之前所述的，并且被命名为YW412.8.31x。结合BACE1的克隆的重链可变序列和轻链可变序列描绘于图23(A)-(C)和24(A)-(C)中。

[0443] 在基于细胞的HTRF测定中检验结合BACE1的克隆的BACE1蛋白酶抑制，如之前在实施例2C中所述的。该测定的结果显示在图25A和25B中。图25B显示来自用不同的亲和力成熟的抗-BACE1抗体以指定的浓度处理24小时的初级皮层神经元的Aβ1-40产生(pg/mi)的结果。数个测试的抗体抑制BACE1，其抑制水平相似于利用YW412.8.31所观察到的。

[0444] ＊＊＊＊＊＊＊＊＊

[0445] 虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

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