一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用
阅读：1024发布：2020-07-29
专利汇可以提供一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于细胞工程技术领域，具体公开了一种翻译控制 肿瘤 蛋白的单克隆 抗体 杂交瘤及其单克隆抗体与应用。所述杂交瘤细胞株于2014年10月20日保藏在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9811；本发明所述单克隆抗体能用于ELISA、 化学发光 、western‑blot、免疫 荧光 以及组织的免疫组织化学检测，为人翻译控制肿瘤蛋白功能研究和其作为 结直肠癌 肿瘤肝转移标志物的临床标本验证工作提供支持。用含有本发明单克隆抗体的 试剂 盒 进行检测时，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简便，无 放射性 污染，试剂盒成本低，临床适应性强，更适合用于我国临床临床检测筛查。，下面是一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用专利的具体信息内容。
1.一种含抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体是由抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1 分泌，所述细胞株于2014 年10 月20 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9811；
该免疫检测试剂盒中所含有的抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体包括由吖啶酯标记抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体和磁珠包被的抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体；
该免疫检测试剂盒中还包括：化学发光启动剂A，化学发光启动剂B和浓缩洗涤液；
其中，化学发光启动剂A为
65%HNO3 10.0ml，
过氧化脲 2.0g，
Prochin300 1mL，
双蒸水 1000mL；
化学发光启动剂B为
NaOH 10.0g，
Triton X-100 20mL，
Prochin300 1mL，
双蒸水 1000mL；
浓缩洗涤液为
Tris 24g，
NaCl 160g，
KCl 4g，
HCl 15mL，
去离子水 100mL。
一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体
与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞工程领域，具体地涉及一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用。
背景技术
[0002] 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是西方国家最常见的实体瘤，约占恶性肿瘤死亡率的10％。在美国结直肠癌居恶性肿瘤死因的第二位，每年大约有52,000例结直肠癌患者死亡。近年来，我国结直肠癌发病率也呈上升趋势，居第五位恶性死因。肝脏是结直肠癌最常见的远处转移器官，结直肠癌患者在疾病过程约有一半会进展为肝转移，其中30％的患者肝脏为惟一的转移部位，15～35％的结直肠癌患者初诊时发现同时性肝转移，20～25％的患者随后出现异时性肝转移。肝转移是结直肠癌常见死因，近一半以上患者会死于肝转移。结直肠癌肝转移患者如果放弃治疗则预后极差，中位生存时间为6～12个月，尽管经过全身化疗，但肝转移瘤无法切除患者的中位生存时间只有12～24个月，生存时间超过5年者罕见，结直肠癌同时性或异时性肝转移一直是困扰临床医生的难题，如何尽早发现结直肠癌肝转移，或在结直肠癌根治术后对于肝转移危险度进行评估，并指导术后治疗是目前面临的重要挑战。对结直肠癌术后肝转移发生危险进行预测，有助于术后进行有针对性的辅助治疗，从而提高整体生存率。
[0003] 结直肠癌肝转移是一复杂而连续的过程，首先癌细胞从原发癌灶脱离，降解胞外基质脱离原发灶进入门静脉，随后通过信号传导，在相关受体和因子的作用下到达肝脏，穿出血管重新粘附，进而在肝脏形成新生血管、再增殖，最终使肝转移灶形成。在此过程中各种粘附分子、血管新生因子、细胞外金属基质蛋白酶等都产生作用。目前临床上用以检测结直肠癌肝转移灶的方法主要是通过B超、CT,MR和DSA等影像学手段，但对肝转移灶的检查率仅为50～90％，而且对直径1cm以下的微小转移灶，很难做出明确的诊断，术中探查虽也可发现一些早期结直肠癌肝转移病灶，但当转移病灶直径小于4mm时，探查发现率大为降低。早期因临床症状不典型，CEA,CA 19-9等肿瘤标志物又缺乏特异性，诊断相对困难。无论是结直肠癌初次确诊时即己发现的肝转移，抑或根治术后再发生的肝转移，确诊时仅有l/4～
1/3的肝转移灶局限于一叶肝脏，大多数已经累及两叶，并且为多发，难以手术切除。因此，肝转移癌的早期正确诊断对指导治疗，改善预后非常重要。寻找有效且稳定的早期诊断结直肠 癌肝转移的生物学标志物，将对结直肠癌肝转移的临床诊断和治疗产生深远的影响。
1/3的肝转移灶局限于一叶肝脏，大多数已经累及两叶，并且为多发，难以手术切除。因此，肝转移癌的早期正确诊断对指导治疗，改善预后非常重要。寻找有效且稳定的早期诊断结直肠 癌肝转移的生物学标志物，将对结直肠癌肝转移的临床诊断和治疗产生深远的影响。
[0004] 翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)，又称P21(小鼠TCTP)、P23(人TCTP)、Q23，是一类广泛存在于动物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族，人类TPT1基因编码的蛋白称fortilin，是一类新的抗凋亡蛋白质。最初认为TCTP是一类生长相关蛋白，近年的研究提示TCTP具有非常重要的生物学功能，包括调节细胞周期的进程和恶性转移、钙结合蛋白、细胞外组胺释放蛋白、抗凋亡及抗疟疾作用等。TCTP能够增强细胞的转移能力，在结肠癌肝转移病人血清中的含量显著升高。检测TCTP在血清中的表达量对于监控结直肠癌的转移有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有结直肠癌肝转移检测技术所存在的不能及时正确诊断的缺陷，提供一种分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述细胞株可分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述杂交瘤细胞株分泌的抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体。
[0007] 本发明的第三个目的是提供上述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的应用。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予实现的：
[0010] 一种分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1，其分类命名为人翻译控制肿瘤蛋白(Hu-TCTP)单克隆抗体杂交瘤细胞，所述细胞株于2014年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9811，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0011] 上述杂交瘤细胞株的制备方法如下：取血清效价大于1：104的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合；用含20％小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的人翻译控制肿瘤蛋白包被ELISA板进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白的杂交瘤细胞株。
[0012] 由上述杂交瘤细胞株分泌获得的抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体为IgG1型，轻链均为κ链。
[0013] 所述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的制备方法：应用保藏编号为CGMCC No.9811的杂交瘤细胞株以1×106/只的量注入石蜡预处理的8～10周龄的BALB/c雌性小鼠 腹腔，饲养观察10～14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，并通过Sepharose S-200分子筛脱盐，PBS洗脱，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。
[0014] 上述任意一种抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体在制备肿瘤诊断试剂中的应用；优选地，所述肿瘤为结直肠癌。
[0017] 本发明中人翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019] 目前尚未有国产化的TCTP的抗体，国外有一些公司比如Novus Biologicals等有可以检测TCTP的抗体产品，尽管可以用于免疫组化、ELISA、Western blot等实验，但是抗体的价格通常较昂贵，此外，像Abcam抗体以多抗居多，虽然特异性尚可，但是效价较低，另外一些公司的抗体产品，与重组表达蛋白结合效果尚可，但是与天然TCTP蛋白反应效果不佳。因此限制了该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研究进展。
[0020] 本发明以重组人翻译控制肿瘤蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的阳性，并用此纯化抗体对结直癌细胞SW480和Lovo进行Western-blot证明该抗体可以识别天然变性的人翻译控制肿瘤蛋白。
[0021] 本发明将此纯化抗体用于进行结直癌细胞Lovo的免疫荧光染色以及肝癌组织的免疫组化染色证明其能识别天然的人翻译控制肿瘤蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究人人翻译控制肿瘤蛋白的功能和开发人人翻译控制肿瘤蛋白的临床诊断试剂奠定了基础，为其作为肿瘤临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。
[0022] 本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达人翻译控制肿瘤蛋白全长蛋白，其氨基酸序列为NP_003286.1，全长172个氨基酸。与国外现有抗体相比，应用成本较低，能够适用于ELISA，Western blot、等各种蛋白检测实验，本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。该抗体的应用将为人翻译控制肿瘤蛋白功能研究和其作为结直肠癌肿瘤肝转移标志物的临床标本验证工作提供支持。附图说明
[0023] 图1是本发明单抗A1亚型鉴定结果。
[0024] 图2是本发明单抗A1对结直癌细胞SW480和Lovo免疫印迹的结果以及阴性对照结果，其结合条带的分子量为23kDa附近。
[0025] 图3是本发明单抗A1对结直癌细胞SW480和Lovo免疫荧光染色的结果以及普通光镜下的对照结果(显微镜放大倍数200倍)。
[0026] 图4是本发明单抗A1对肝癌组织免疫组织化学染色的结果以及阴性对照结果(显微镜放大倍数100倍)。
具体实施方式
[0027] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明的思路，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0028] 实施例1杂交瘤细胞株的制备
[0029] 1、重组人翻译控制肿瘤蛋白抗原制备：从结直肠癌细胞Lovo中调取TCTP基因构建原核重组表达载体pET22b(+)/TCTP，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达，利用Ni Sepharose亲和层析纯化柱进行纯化，获得纯度达90％以上的重组人TCTP蛋白(TCTP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。
[0030] 其中，扩增人翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的引物序列为：
[0031] 上游引物：5'-GTCGGATCCATGATTATCTACCGG-3'(SEQ ID NO：2)；
[0032] 下游引物：5'-TTGCGGCCGCTTAACATTTTTCCATTTCTAAACCA-3’(SEQ ID NO：3)；
[0033] 其中，上游引入BamH I内切酶位点，下游引入Not I内切酶位点。
[0034] 2、小鼠免疫：取纯化的TCTP重组蛋白与250μl Bentonite佐剂混合，以100μg/500μl的量腹部皮下多点注射BALB/c小鼠，间隔三周以1100μg/500μl的量腹部皮下多点注射BALB/c小鼠，从第三次免疫开始，每次免疫后的第二周尾静脉采集小鼠血，间接ELISA方法检测血清效价达到1:50000以上后准备融合，融合前3天，尾静脉注射加强免疫一次，抗原剂量100μg。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。
[0035] 3、免疫血清效价测定：采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取30μg TCTP重组蛋白溶解于10ml 0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，使用PBS(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含10％新生牛血清封闭液200μl/孔，37℃封闭1h，使用PBS(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天尾静脉采血，鼠免疫血清用含2％新生牛血清10mM PBS以10-1～10-8 倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃1h，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光20min，加50μl/孔2M H2SO4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
[0036] 4、杂交瘤的制备：取血清效价大于1：104的小鼠，融合前3天，取重组抗原与等体积的PBS混匀后，以每只100μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP20按10：1的比例混合，500×g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物500×g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷)轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。
培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换HT培养液(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)培养三天，通过间接ELISA方法筛选出能与TCTP重组蛋白反应的杂交瘤细胞(以与阴性血清A 450的比值大于2.1判为阳性)，更换1640完全培养基。
培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换HT培养液(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)培养三天，通过间接ELISA方法筛选出能与TCTP重组蛋白反应的杂交瘤细胞(以与阴性血清A 450的比值大于2.1判为阳性)，更换1640完全培养基。
[0037] 5、筛选分泌抗人TCTP单克隆抗体的杂交瘤细胞：间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2～3次，直至到100％细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗TCTP单克隆抗体细胞株15株。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。并将其中一株命名为MQ-ANTI-TCTP-1，该细胞株于2014年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9811。
[0038] 6、杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1分泌抗体的产量分析：将杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1在96微孔板上培养，为了分析其产生抗体的产量，用细胞融合10～12天的上清进行分析。两种融合蛋白GST、GST-TCTP被用于ELISA，杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1分泌的抗体A1与GST-TCTP的OD450为1.53，抗体A1与GST的OD450为0.12。
[0039] ELISA的具体方法为：96孔聚苯乙烯板上包覆30ug融合蛋白，4℃过夜。用洗脱缓冲液(含有0.05％(V/V)Tween-20的PBS)将板洗脱3次。向微孔中加入含10％小牛血清 的PBS，37℃封闭2h。将杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1的培养上清液加入微孔中(100uL/孔)，37℃孵育1h。洗版后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体，37℃孵育1h。洗脱缓冲液洗板三次，每孔加入100μl TMB显色，15～30分钟后，加入2M H2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。
[0040] 实施例2抗TCTP单克隆抗体的制备及特性测定
[0041] 一、单克隆抗体的制备：将实施例1获得的杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1以1×106/只的量注入液体石蜡预处理的8～10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察6～7天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。7～10天后采集小鼠腹水，12000rpm离心10min收集上清，用ProteinGharose(购自GE公司)进行纯化：将ProteinG填料装于纯化柱中，将纯化柱与Akta纯化仪连接，用平衡缓冲液(按照说明书提供的方法配制)平衡5个柱体积，待纯化的腹水用平衡缓冲液稀释10倍后以1.5ml/min速度上样，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集抗体峰，洗脱的抗体立即用Tri-Hcl(PH9.0)中和。Bradford法测定抗体浓度。纯化抗体于-20℃保存。杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1制备的抗体命名为抗体A1。
[0042] 二、单克隆抗体的特性鉴定：
[0043] 1、抗体浓度的测定：使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定抗体A1的浓度，其浓度为1.15mg/ml。
[0044] 2、抗体亚型鉴定：采用Hbt公司的鼠单抗亚型鉴定抗体A1的亚型，该抗体的亚型均为IgG1型，轻链均为κ链。
[0045] 3、抗体A1的Western blot鉴定：收集结直癌细胞(Lovo、HT29、SW620和SW480)，用1×SDS裂解缓冲液裂解后上样，经12％SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次10min，1：800加入单克隆抗体A1，室温孵育1h后，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次10min，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育1h，TTBS洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml 系列Western化学发光底物反应液(A:B＝1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。单克隆抗体A1均出现单一的特异性条带，结果如图1所示。
[0046] 4、抗体的免疫荧光共聚焦鉴定：收集结直癌细胞Lovo，铺于玻璃片上生长过夜， PBS洗涤细胞，使用预冷的多聚甲醛固定细胞，分别加入单克隆抗体A1(1:500稀释)，37℃孵育1h，以PBS为阴性对照。PBS洗片后1:1000加入荧光标记羊抗鼠二抗(Sigma)，37℃孵育1h，PBS洗片后，荧光显微镜下观察，经抗TCTP单克隆抗体A1染色的细胞均观察到绿色荧光(波长488nm)，如图2所示。结果证明单克隆抗体A1可识别天然的人TCTP蛋白。
[0047] 5、抗体的免疫组化鉴定：从南方医院收集石蜡包埋的肝癌组织，利用纯化后的单克隆抗体A1(1:500稀释)进行免疫组化染色，使用福建迈新公司的免疫组化试剂盒，染色方法参照迈新试剂盒说明书，DAB显色，阴性对照组以PBS代替一抗，结果发现经单克隆抗体A1染色的组织标本上在细胞质中均发现棕色颗粒，如图3所示。在结直肠癌肿瘤肝转移模型中细胞的免疫组化染色结果证明单克隆抗体A1可识别天然的人TCTP蛋白。
[0048] 实施例3一种检测TCTP的化学发光检测试剂盒
[0049] 所述试剂盒的制备方法如下：
[0050] 1、吖啶酯标记抗体：
[0051] 1)将0.1mg抗体(Santa Cruz Biotechnology.Catalog Number:sc-30124)加入超滤离心管(50KD)中，8000r/min离心5～6min进行浓缩。将浓缩后的抗体加入200uL PB缓冲液，8000～9000r/min离心5～6min，弃掉滤液，再加入200uL PB缓冲液，按上述方法离心，此步骤重复5～6次。
[0052] 2)将几次离心后的离心管取出，弃掉滤液，把离心柱反转，2000～3000r/min离心1min，收集滤液，整个过程收集抗体大约200μL。
[0053] 3)用预处理后的抗体与吖啶盐按100：1质量比充分混匀，震荡16～20小时即可。
[0054] 4)将标记吖啶盐的抗体用稀释液稀释至终所需要的浓度，存放于2～8℃。
[0055] 2、磁珠包被抗体：
[0056] 1)用漩涡混合器充分混匀悬浮磁珠，取1mL(10mg)悬浮液到离心管中；
[0057] 2)将离心管置于磁分离器上1分钟(或更长时间如果需要)小心移去上清[0058] 3)加入1ml连接缓冲液(0.1M MES)，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁珠；
[0059] 4)加入40ul偶合剂1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐；
[0060] 5)加入抗体A1；
[0061] 6)用漩涡混合器充分混匀悬浮磁珠，室温旋转过夜；
[0062] 7)用TBST洗脱缓冲液稀释至4mg磁珠/ml，2～8℃保存。
[0063] 3、TCTP标准品的制备：用TCTP纯品配置校准品，浓度分别为0、0.39、1.56、6.25、25.00、100.00ng/mL。
[0064] 4、化学发光启动剂A的组成如下：
[0065]
[0066] 化学发光启动剂B的组成如下：
[0067]
[0068] 5、浓缩洗涤液的组成如下：
[0069]
[0070] 调整pH值至7.0，使用时用双蒸水20倍稀释。
[0071] 利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简便，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适应性强，更适合用于我国临床临床检测筛查。
[0072] 二、上述化学发光试剂盒的具体使用方法，具体操作如下：
[0074] 2、分别将各浓度点的校准品和待测样本50μL加入相应塑料管，然后加磁珠化的抗体50μL；
[0075] 3、37℃温育30分钟；
[0076] 4、用稀释后的洗涤液洗5次，注满洗涤液，每次浸泡20秒；
[0077] 5、将吖啶酯标记物50μL加入塑料管，37℃温育30分钟；
[0078] 6、用稀释后的洗涤液洗5次，注满洗涤液，每次浸泡20秒；
[0079] 7、加入化学发光启动剂A、B各50μL，直接测量其发光强度(RLU)，测量时间0.5秒 /管；
[0080] 8、以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测RLU值在标准曲线上查出该样本的TCTP抗原浓度。
[0081] 三、按照本领域中常规的制造及鉴定规程对实施例3中制备的检测试剂盒进行检定，结果见下表1。
[0082] 表1试剂盒的技术指标检测结果 检验项目 检验标准 检验结果
准确性 平均回收率在92％-100％ 96.1％
特异性 与其类似物的交叉反应率≤0.01％ ＜0.01％
精密性 ≤15％(n＝10) 6.3％
灵敏度 ≤0.5ng/mL 0.1ng/mL
稳定性 各试剂组分置37℃至少7天 符合以上标准
准确性 平均回收率在92％-100％ 96.1％
特异性 与其类似物的交叉反应率≤0.01％ ＜0.01％
精密性 ≤15％(n＝10) 6.3％
灵敏度 ≤0.5ng/mL 0.1ng/mL
稳定性 各试剂组分置37℃至少7天 符合以上标准
[0083] 以上结果表明TCTP化学发光免疫分析测定试剂盒的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全符合要求的。
[0084] 四、所述试剂盒与市场上的酶联免疫试剂盒对病人血样测值的比较：使用本发明的试剂盒与酶联免疫蛋白检测试剂盒同时检测50份病人标本，两种试剂盒的比较结果见下表2。
[0085] 表2两种试剂盒的检测结果比较
[0086]
[0087] 从所列检测结果数据分析，本发明试剂盒在50份阳性标本中检出40份阳性，阳性率为80％，而酶免试剂盒检出35份阳性，阳性率为70％。结果显示本试剂盒的检测结果与临床具有更高的符合率，更便于推广应用，安全可靠。
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