一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法
专利汇可以提供一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤包括：步骤1，亚 硫酸 盐 处理DNA样品；步骤2，设计并合成PCR引物；步骤3，以标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为模板分别进行PCR扩增，并测定解链 温度 ；步骤4，对待测DNA样品进行PCR扩增；步骤5，加热PCR扩增产物至标准非甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度、和标准甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度之间；步骤6，进行消化；步骤7，进行二次PCR扩增并进行解链曲线测定，检测是否存在甲基化DNA。该方法在 肿瘤 早期检测、个性化 治疗 、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。，下面是一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法专利的具体信息内容。
1.一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1，采用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；
步骤2，在所要检测的基因序列中，选择含多个CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以所选序列的5’端的一部分作为正向PCR引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；
步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶，以荧光染料为指示剂，用所述正向PCR引物和反向PCR引物，在实时定量PCR扩增仪中进行扩增，并分别测定扩增产物的解链温度；
步骤4，在与步骤3相同的条件下，用所述PCR引物对待测DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使加热温度处于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度和标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度之间；
步骤6，立即将步骤5中的加热产物进行冷却，并用单链DNA特异性DNA内切酶将冷却后的体系进行消化；
步骤7，将步骤6所得消化产物作为PCR反应模板，使用所述正向PCR引物和反向PCR引物进行实时定量PCR扩增，并进行解链曲线测定；
步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为：如果在待测DNA样品中检测到与标准甲基化DNA相应PCR产物相一致的特征性解链曲线，则待测样品中存在甲基化DNA；反之，则不存在。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使所设计的PCR引物为18~32碱基长度，引物序列中CpG位点数量为0~3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；并使PCR扩增后的DNA片段大小为80~180碱基长度，使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在所述引物序列中的CpG位点的C位置，正向引物用C/T混合代替C，反向引物用G/A混合代替G。
4.根据全力要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6中，使用冰水浴对加热的PCR产物进行冷却。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应所用的DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；所述单链DNA特异性核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶、绿豆核酸酶中的一种或几种的混合；所述荧光染料为SYBR Green Ⅰ。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。
8.根据全力要求7所述的检测方法，其特征在于，
所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；
所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；
所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。
一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
步骤2，在所要检测的基因序列中，选择富含CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以所选序列的5’端的一部分作为正向PCR引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；
步骤3，用亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶，以荧光染料为指示剂，用所述正向PCR引物和反向PCR引物，在PCR扩增仪中进行扩增，并分别测定扩增产物的解链温度；
步骤4，在与步骤3相同的条件下，用所述PCR引物对待测DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使加热温度处于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度和标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度之间；
步骤6，立即将步骤5中的加热产物进行冷却，并用单链DNA特异性DNA内切酶将冷却后的体系进行消化；
步骤7，将步骤6所得消化产物作为PCR反应模板，使用所述正向PCR引物和反向PCR引物进行实时定量PCR扩增，并进行解链曲线测定；
步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为：如果在待测DNA样品中检测到与标准甲基化DNA相应PCR产物相一致的特征性解链曲线，则待测样品中存在甲基化DNA；反之，则不存在。
所述步骤1中，亚硫酸盐优选为亚硫酸钠，所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理方法为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。
所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；
所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。
具体实施方式
步骤1：采用亚硫酸盐处理待测DNA和已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA。
P16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。P16基因转录启动区的序列如下，有下划线的部分为所选的要检测的区域。
甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域；
CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG
非甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域；
TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGTGGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG
所设计的PCR引物
正向引物 5’- GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’
反向引物 5’- TTAAACAACGCCCCCRCCTCCAACAA-3’
然后，按照实施方式（一）所述的方法，进行检测。
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