一种组织工程化搏动组织的构建方法
阅读：531发布：2023-03-08
专利汇可以提供一种组织工程化搏动组织的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医学工程技术和再生医学领域，具体涉及一种组织工程化搏动组织的制备方法。本发明将棕色脂肪来源的干细胞诱导为窦房结样细胞，种植于胶原海绵上，在体外构建组织工程化的窦房结样搏动组织。本发明获得了一种具有起搏特性的组织工程化组织，为筛选 心律失常 药物等研究提供了一种组织模型，为 治疗 病态窦房结综合征、房室传导阻滞所致心律失常 疾病 带来了希望。，下面是一种组织工程化搏动组织的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种组织工程化搏动组织的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、起搏细胞的获取
将小鼠、大鼠的肩胛间棕色脂肪组织，利用二次消化法、II型胶原酶，分离出棕色脂肪来源的干细胞；具体步骤如下：棕色脂肪0.1-1克，置于4℃ PBS中清洗，移入离心管中，加入
0.2-2ml 0.1%的II型胶原酶高糖DMEM中，剪碎；将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入
5-20ml的0.1%的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM，37℃消化45 min，期间反复震荡混匀；3000rpm离心
1-3分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第一次滤液；再向上述离心管中加入1-10ml的0.1%的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM，37℃消化20 min，期间反复震荡混匀；3000rpm离心1分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并入另一离心管中，加入1-5ml 10%的FBS/DMEM，1500rpm离心3分钟，吸去上层漂浮的白色脂肪；所述的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM中还含有1%BSA；
起搏细胞的诱导：吸弃上清，加入15%的FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35mm培养皿中或6孔板中，每皿/孔接种7.0×106个细胞，加适量15%的FBS/DMEM培养基，放于37℃细胞培养箱培养，每3天换一次液；
在培养过程中，加入80ng/ml 的Dikkopf-1，培养至10-14天，每2-3天换一次液；
鉴定起搏细胞；
B、起搏细胞-胶原海绵复合体的构建
胶原海绵的准备：将胶原海绵剪成0.8×0.6×0.2 cm大小，消毒备用；
起搏细胞的准备：将原代培养13天的脂肪来源的干细胞制成细胞悬液，调至细胞密度为1.0×107个/ml；
起搏细胞-胶原海绵复合体的构建：将起搏细胞均匀接种于胶原海绵上，总量100μl，静置1小时后，用15%的FBS/DMEM培养基培养7天。
2.一种如权利要求1所述的组织工程化搏动组织的构建方法得到的组织工程化搏动组织。
3.一种如权利要求2所述的组织工程化搏动组织在制备治疗严重缓慢型心律失常移植物中的应用。
4.一种如权利要求2所述的组织工程化搏动组织在筛选抗心律失常药物中的应用。
一种组织工程化搏动组织的构建方法
技术领域
背景技术
[0003] 在这些方法中，基因转染的方法有可能引起心律失常。而且，外源性基因在体内难以有效地调控，体内存留病毒载体。细胞移植可以克服基因转染的缺陷，但移植的细胞极易在心脏内迁移、弥散，不能形成稳定统一的心脏节律点，而且目前用于移植的细胞不适合用于临床生物心脏起搏器的构建：成体窦房结细胞、幼稚心肌细胞不仅来源困难，而且对移植部位微环境适应能力差；胚胎干/祖细胞不仅来源困难，还存在伦理学问题，而且其在体内的分化方向亦难以精确控制。针对上述基因转染和细胞移植治疗病态窦房结综合征和房室传导阻滞存在的问题和面临的困难，并综合考虑生物起搏治疗研究的现状，寻找容易获取的起搏细胞，在体外与天然的支架材料复合，构建组织工程化的自发性搏动组织，将之移植到心脏中修复或再建心脏起搏点，应为严重缓慢型心律失常治疗课题的理想解决方案。不仅如此，组织工程化的搏动组织还可以为临床心血管药物的筛选提供组织学水平的平台。
[0004] Yamada等认为小鼠棕色脂肪组织中存在心脏祖细胞，分离的棕色脂肪来源的干细胞（brown adipose-derived stem cells,BASCs）部分可以定向分化为自发跳动的心肌样细胞（Yamada Y,et al.Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium.Biochem Biophys Res Commun.2006;342:662–670）。Liu改进了Yamada的BASCs分离方法，得到更高比例的中心肌样细胞(Liu Z,et al.Efficient Isolation of Cardiac Stem Cells from Brown Adipose.J Biomed Biotech.2010;doi:10.1155/2010/104296)，本发明人所在的实验室在前期的工作中，进一步改进了组织消化、细胞分离的方法，并证明了跳动的心肌样细胞具有起搏细胞特征。
[0005] 目前国内、外尚无构建组织工程化搏动组织的研究报道，仅Choi等（Choi YH,et al.2006,Cardiac conduction through engineered tissue.Am J Pathol.2006;169(1):72-85.）利用骨骼肌细胞和基质胶（matrigel）在体外构建了一个组织体，并将之移植到大鼠心脏冠状沟心外膜下，对再建房室传导通路做了初步的尝试。结果表明该构建物可以和周围宿主心肌建立电机械耦联，并且允许房室之间有电冲动传导。但该组织体不是组织工程化搏动组织，因为它不能自发地搏动，只是将心房的冲动传导至心室。
[0006] 构建的组织工程化搏动组织的意义还在于，它可以作为筛选抗心律失常药物的一种组织模型。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种组织工程化搏动组织的构建方法。
[0008] 本发明人所在的实验室在前期工作中改进了Yamada的BASCs分离方法，得到更高比例的中心肌样细胞，我们进一步改进了分离培养方法，得到的跳动的心肌细胞可以高达40%（阳性细胞和总细胞的比例）。经进一步鉴定，这种自发跳动的心肌样细胞具有起搏细胞的特性。
[0009] 本发明人设想，利用这种自发跳动的心肌样细胞--起搏细胞作为种子细胞，以天然生物材料为支架材料，体外构建组织工程化的自发性搏动组织。将来可以将其移植至心脏重建窦房结或新的起搏点，达到治疗病态窦房结综合和严重房室传导阻滞等严重缓慢型心律失常的目的；同时也可以作为筛选心律失常药物的一种组织模型。
[0010] 本发明的主要技术方案是将棕色脂肪来源的干细胞诱导为窦房结样细胞，种植于胶原海绵上，在体外构建组织工程化的窦房结样搏动组织。
[0011] 本发明的技术关键在于：
[0012] （1）如何在体外获得足够数量的、活力好的能用于组织工程构建的起搏细胞。我们在前期的工作中，已将棕色脂肪来源的脂肪来源的干细胞诱导为起搏细胞，但诱导率尚不高，诱导获得的起搏细胞数量尚不能满足组织工程构建的需求。因此，在不影响细胞活力的前提下，提高起搏细胞的诱导率，即提高起搏细胞的数量是用起搏细胞和胶原海绵构建组织工程搏动组织的关键之一；
[0013] （2）如何使起搏细胞在胶原海绵上增殖，并进一步分化为起搏细胞。种子细胞在支架材料上的增殖、分化受种植的密度、时机、方式的影响。因此，控制种子细胞种植的密度、时机、方式等，是利用起搏细胞和胶原海绵构建组织工程搏动组织的关键之二。
[0014] 本发明提供了一种组织工程化搏动组织的构建方法，该方法包括以下步骤：
[0015] A、起搏细胞的获取
[0016] （A1）取动物棕色脂肪组织，利用二次消化法、II型胶原酶，分离出棕色脂肪来源的干细胞；
[0017] 所述的动物棕色脂肪组织，可以取自小鼠、大鼠等动物的肩胛间棕色脂肪组织等。
[0018] 所述的二次消化法，具体为：取棕色脂肪约0.1-1克，置于4℃PBS中清洗，移入离心管中，加入0.2-2ml0.1%的II型胶原酶高糖DMEM中（含1%BSA），剪碎；将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入5-20ml的0.1%的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM（含1%BSA），37℃消化45min，期间反复震荡混匀；3000rpm离心1-3分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第一次滤液；再向上述离心管中加入1-10ml的0.1%的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM（含1%BSA），37℃消化20min，期间反复震荡混匀；3000rpm离心1分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并入另一离心管中，加入1-5ml10%(体积比)的FBS/DMEM，1500rpm离心3分钟，吸去上层漂浮的白色脂肪；
[0019] （A2）起搏细胞的诱导
[0020] 吸弃上清，加入15%(体积比)的FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35mm培养皿中或6孔板中，每皿/孔大约接种7.0×106个细胞，加适量15%(体积比)的FBS/DMEM培养基，放于37℃细胞培养箱培养，每3天换一次液；
[0021] 在培养过程中，加入80ng/ml的Dikkopf-1(一种Wnt通路的抑制剂)，每2-3天换一次液，培养10-14天。
[0022] （A3）鉴定起搏细胞
[0023] 相差显微镜观察步骤A2获得的细胞形态、搏动情况。免疫化学染色检测心肌细胞和起搏细胞相关标志：肌动蛋白（Actinin）、肌钙蛋白（Troponin T/Troponin I）、缝隙连接蛋白（Cx40，Cx30.2）、起搏细胞特征蛋白-超极化激活环核苷酸门控通道（hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN)；用激光共聚焦显微镜进行胞内钙离子变化的测定；用膜片钳、微电极阵列细胞外电生理记录仪记录细胞外和细胞内电位，自发性动作电位；检测分化后的细胞对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应；透射电镜观察细胞超微结构。
[0024] B、起搏细胞-胶原海绵复合体的构建
[0025] （B1）胶原海绵的准备：将胶原海绵剪成0.8×0.6×0.2cm大小，消毒备用；
[0026] （B2）起搏细胞的准备：将原代培养13天的脂肪来源的干细胞（已分化为起搏细胞）制成细胞悬液，调至细胞密度为1.0×107个/ml；
[0027] （B3）起搏细胞-胶原海绵复合体的构建：将起搏细胞均匀接种于胶原海绵上，总量大约100μl，静置1小时后，用15%的FBS/DMEM培养基培养7天。
[0028] 本发明构建的起搏细胞-胶原海绵复合体的体外鉴定：
[0029] 1、搏动频率观察：构建的起搏细胞-胶原海绵复合体会产生自发性的搏动。
[0030] 2、起搏细胞-胶原海绵复合体的电生理学特征：使用光学电位检测仪（Optical mapping）或微电极阵列细胞外电生理记录仪，可以检测到复合体产生自发性的动作电位。
[0031] 3、药学理检测：同起搏细胞的检测，分别检测搏动组织对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应。异丙肾上腺素使起搏组织搏动频率增加，心得安则可以阻断异丙肾上腺素的作用；乙酰胆碱使起搏组织搏动频率减少，而阿托品可以阻断乙酰胆碱的作用。
[0033] 5、免疫组织化学检测起搏细胞的标志物：将构建的组织工程化搏动组织进行冰冻切片，常规免疫组织化学检测组织内心肌细胞和起搏细胞相关标志：起搏组织中细胞表达肌动蛋白（Actinin）、肌钙蛋白（Troponin T/Troponin I）、缝隙连接蛋白（Cx40，Cx30.2）和起搏细胞特征蛋白-HCN。
[0034] 6、电镜观察复合体内细胞的超微结构，以及细胞之间的连接。细胞内有不规则的肌丝，细胞与细胞之间形成了缝隙连接。
[0035] 本发明方法中用到的百分比，未加特殊说明的，均为质量/体积百分比[0036] 本发明方法中用到的II型胶原酶高糖DMEM（含1%BSA），具体配方为：0.1%II型胶原酶，高糖DMEM（4.5%葡萄糖），1%BSA。
[0037] 本发明方法中用到的FBS/DMEM，是指DMEM里含有FBS。
[0038] 本发明采用的二次消化可以比一次消化增加10%的细胞量。
[0039] 本发明最初采用I型胶原酶，用于棕色脂肪细胞上消化效果差，而II型胶原酶对棕色脂肪细胞的消化效果好，有利于起搏细胞的分离。
[0040] 本发明采用的Dikkopf-1(一种Wnt通路的抑制剂)，比不用Dikkopf-1又增加10%的细胞量。
[0041] 本发明欲将起搏细胞种植于三维支架上构建起搏组织，在众多生物材料中作了筛选，发现本发明的棕色脂肪组织来源的干细胞在胶原海绵上面长得非常好，本发明进一步地在接种的方法、密度、在培养皿中静置的时间等影响细胞生长的因素上作子选择，从而成功构建起搏组织。
[0042] 本发明还提供了根据上述方法制备得到的组织工程化起搏组织。
[0044] 图1起搏细胞的肌丝样结构（透射电镜示超微结构）；
[0045] 图2起搏细胞接种于胶原海绵上（HE染色）。
具体实施方式
[0046] 现结合实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0047] 实施例中的胶原海绵由无锡贝迪生物有限公司提供。
[0048] 实施例1：将小鼠棕色脂肪组织来源的脂肪来源的干细胞诱导为起搏细胞[0049] 1.脂肪来源的干细胞的分离、培养
[0050] （1）切开小鼠肩胛间皮肤，去除肩胛间棕色脂肪组织被覆的白色脂肪层，取棕色脂肪约0.4克，即刻置于4℃PBS中洗3次，移入5ml离心管中，加入0.8ml0.1%II型胶原酶高糖DMEM中（含1%BSA），剪碎。
[0051] （2）将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入10ml的0.1%Ⅱ型胶原酶高糖DMEM（含1%BSA），37℃消化45min，期间反复震荡混匀。3000rpm离心1min，吸上清用100目滤网过滤，进入（4）。
[0052] （3）再向上述离心管中加入5ml的0.1%Ⅱ型胶原酶高糖DMEM（含1%BSA），37℃消化20min，期间反复震荡混匀。3000rpm离心1min，吸上清用100目滤网过滤，进入（4）。
[0053] （4）将上述2次所得滤液吸入15ml离心管中，加入3ml10%FBS/DMEM，1500rpm×3min，吸去上层漂浮的白色脂肪，1500rpm×3min。
[0054] 2.起搏细胞的高比例诱导
[0055] （1）吸弃上清，加入15%FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35mm培养皿中或6孔板中，每皿/孔大约接种7.0×106个细胞，加适量15%FBS/DMEM培养基，放于37℃细胞培养箱培养，每3天换一次液。
[0056] （2）在培养的第一个3天内，加入80ng/ml Dikkopf(Dkk)-1，一种Wnt通路的抑制剂。换液后细胞继续培养10天，3天换一次液。
[0057] 3.起搏细胞的鉴定
[0058] （1）相差显微镜观察：上述细胞在15%FBS/DMEM培养基中培养，BASCs会增殖、分化。3天时即可在相差显微镜下发现一些自发跳动的细胞，1周即可定向分化成肌管状细胞及部分小圆形细胞，该分化的肌管状细胞或圆形细胞能够自发跳动，跳动频率从80-200次/分钟不等，平均跳动频率为130次/分钟，部分圆形细胞可见微弱搏动。
[0059] （2）脂肪来源的干细胞分化的起搏细胞特征蛋白表达检测：分化1周的细胞做免疫化学染色，可见细胞表达心肌细胞和起搏细胞相关标志：肌动蛋白（Actinin）（呈明显肌节结构）、肌钙蛋白（Troponin T/Troponin I）、缝隙连接蛋白（Cx40，Cx30.2）、起搏细胞特征蛋白-超极化激活环核苷酸门控通道（hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN)。具体方法与常规的免疫细胞化学方法相同。
[0060] （3）细胞内自发钙瞬变测定：采用Fluo-4,AM对单细胞的胞浆游离钙离子变化进行检测。用10μM的Fluo-4,AM加0.5μl的20%F127在37℃孵育细胞15min，然后用标准细胞外液清洗2-3遍，静置15-20min后在激光共聚焦显微镜进行胞内钙离子变化的测定。实验中可用额定电压额定频率的连续电场刺激，同时记录钙瞬变。起搏细胞可以产生自发性的钙瞬变。
[0061] （4）细胞自发动作电位记录：在电流钳模式下，用膜片钳记录细胞外和细胞内电位。标准的细胞外液含（mM）：150NaCl，5KCl，2CaCl2，1MgCl2，10HEPES，10D-glucose，pH=7.40。电极内液含（mM）:130K gluconate,10kCl，2MgCl2，10HEPES，2.5Mg-ATP，0.25Na-GTP,
0.4Na-GTP,pH=7.2。其中细胞内微电极记录中，微电极内灌3M的KCl。细胞外记录玻璃微电极的电阻在2-4M（两步拉制），细胞内记录微电极电阻在30-50M（一步拉制）。所有的实验均在室温（22-25℃）进行。起搏细胞可以产生自发性的动作电位。
0.4Na-GTP,pH=7.2。其中细胞内微电极记录中，微电极内灌3M的KCl。细胞外记录玻璃微电极的电阻在2-4M（两步拉制），细胞内记录微电极电阻在30-50M（一步拉制）。所有的实验均在室温（22-25℃）进行。起搏细胞可以产生自发性的动作电位。
[0062] （5）药理学检测：检测分化后的细胞对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应，连续刺激并记录同一细胞在不同药物及不同浓度下的反应。所有实验均在室温下进行（22-25℃），每次换药如是同种药物从低浓度换到高浓度直接换，如果换不同药物先洗2遍并记录洗后跳动次数。起搏细胞对上述药物有相应的反应。
[0063] （6）细胞透射电镜观察超微结构：常规固定、包埋，根据先前观察的细胞位置取样，进行制片，电镜观察。电镜下，起搏细胞内有不规则的肌丝（图1）。
[0064] 实施例2：诱导获得的起搏细胞种植到胶原海绵构建组织工程化搏动组织[0065] 1.起搏细胞-胶原海绵复合体的构建
[0066] （1）胶原海绵的准备：胶原海绵直接购自商业公司（无锡贝迪生物有限公司），将胶原海绵剪成0.8×0.6×0.2cm大小，用钴60照射12小时以上消毒备用。
[0067] （2）起搏细胞的准备：0.25%胰酶消化原代培养13天（15%FBS/DMEM，最初3天加80ng/ml Dikkopf(Dkk)-1）的脂肪来源的干细胞（90%以上已分化为起搏细胞），5min，
1500rpm离心5min。弃上清，制成细胞悬液，调至细胞密度为1.0×107个/ml。
1500rpm离心5min。弃上清，制成细胞悬液，调至细胞密度为1.0×107个/ml。
[0068] （3）起搏细胞-胶原海绵复合体的构建：体视显微镜下使用微量注射器将细胞悬液分4点均匀接种于胶原海绵上，总量大约100μl，细胞密度约为1.0×107个/cm3。37℃，5%CO2培养箱中放置1-2小时，加适量15%FBS/DMEM培养基培养7天，隔天换一次液。
[0069] 2.起搏细胞-胶原海绵复合体的体外鉴定
[0070] （1）搏动频率观察：构建的起搏细胞-胶原海绵复合体会产生自发性的跳动。
[0071] （2）HE染色观察起搏细胞在起搏细胞-胶原海绵复合体生长：将上述生长7天的起搏细胞-胶原海绵复合体制备成石蜡切片进行HE染色，步骤如下：苏木素液染10min，自来水冲洗，75%盐酸乙醇溶液分化30s，水洗1h，95%乙醇1～2min，伊红复染1～2min，95%乙醇1～2min，脱水透明，中性树胶封片。通过HE染色观察细胞-胶原海绵复合体中种子细胞生长均匀、接触紧密，起搏细胞与胶原海绵复合良好（图2）。
[0072] （3）免疫组织化学检测起搏细胞的标志物：将构建的组织工程化搏动组织进行冰冻切片，常规免疫组织化学检测组织内心肌细胞和起搏细胞相关标志：肌动蛋白（Actinin）、肌钙蛋白（Troponin T/Troponin I）、缝隙连接蛋白（Cx40，Cx30.2）、起搏细胞特征蛋白-HCN。搏动组织内上述标志为阳性。
[0073] （4）起搏细胞-胶原海绵复合体的电生理学特征：使用光学电位检测仪（Optical mapping）或微电极阵列细胞外电生理记录仪可检测到起搏细胞-胶原海绵复合体的起搏电位，证明所构建细胞-胶原海绵复合体是一组织工程化搏动组织，具有类似窦房结的特性。
[0074] （5）药学理检测：同起搏细胞的检测，分别检测搏动组织对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应。异丙肾上腺素使起搏细胞搏动频率增加，心得安则可以阻断异丙肾上腺素的作用；乙酰胆碱使起搏细胞搏动频率减少，而阿托品可以阻断乙酰胆碱的作用。
[0075] （6）细胞透射电镜观察超微结构：常规固定、包埋，进行制片，电镜观察。电镜下，起搏细胞内有不规则的肌丝，细胞与细胞之间建立了缝隙连接。
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