一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法
专利汇可以提供一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种利用二乙 氨 乙基葡聚糖提高基因 转染 猪皮转染效率的方法，包括如下步骤：1)制备待转染的猪 皮肤 ；2)使用浓度为500－5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖对108PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。本发明中二乙氨乙基葡聚与Ad5重组腺病毒载体混合后转染猪皮肤细胞时，其携带的阳离子可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子，降低了腺病毒载体和细胞表面之间的静电排斥 力 ，从而增加腺病毒载体与猪皮肤细胞的相互 接触 ，提高腺病毒载体对猪皮肤的转染效率。，下面是一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法专利的具体信息内容。
1、一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法， 其特征在于包括如下步骤：
1)制备待转染的猪皮肤；
2)使用浓度为500-5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖对108PFU/ml Ad5 重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；
3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是巴马香猪 皮肤。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是小于6个 月猪龄的猪皮肤。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是4-6月龄 的巴马香猪皮肤。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤的厚度为 0.1-1.0毫米。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中所述Ad5重 组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中所述孵育具 体为：4℃孵育10-20分钟。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述转染具 体是在CO2培养箱内37℃转染1-3小时。
9、权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)具体为：将步骤2) 制备的转染液按0.8-2.2ml/cm2的比例对步骤1)制备的猪皮肤在CO2 培养箱内37℃转染1-3小时。
10、权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)具体为：将步骤2) 制备的转染液按1ml/cm2的比例对步骤1)制备的猪皮肤在CO2培养箱内 37℃转染2小时。
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种提高携带外源基因的 重组腺病毒载体转染猪皮效率的方法。
背景技术
深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患 者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取 得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中 公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异 体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高 度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差 异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。
专利申请号为00103528.2，发明名称是“一种用重组基因转染的异 体皮肤”的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基 因CTLA4Ig对猪皮肤进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细 胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局 部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。
但是，由于Ad5腺病毒载体和被转染细胞表面均带负电荷，相互之间 存在静电排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因 CTLA4Ig对猪皮肤组织细胞的转染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才 能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。
发明内容
实现本发明目的的技术方案如下：
一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法，包 括如下步骤：
1)制备待转染的猪皮肤；
2)使用浓度为500-5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖对108PFU/ml Ad5 重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；
3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。
其中，步骤1)所述猪皮肤是任何一种品系的猪皮肤，优选巴马香猪 皮肤，进一步优选小于6个月猪龄的猪皮肤，最优选4-6月龄的巴马香 猪皮肤。所述猪皮肤的厚度为0.1-1.0毫米，优选0.4-0.6毫米。
其中，步骤2)中所述Ad5重组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因， 可按照专利申请号为00103528，发明名称是“一种用重组基因转染的异 体皮肤”的专利申请公开的方法制备CTLA4Ig重组基因和含有CTLA4Ig 重组基因的Ad5腺病毒载体。
其中，步骤2)中所述孵育具体为：4℃孵育10-20分钟。
其中，步骤3)中所述转染具体是在CO2培养箱内37℃转染1-3小 时。
其中，步骤3)具体为：将步骤2)中处理后的转染液按0.8-2.2ml/cm2 的比例对步骤1)中处理后的猪皮肤在CO2培养箱内37℃转染1-3小时。
其中步骤3)优选将步骤2)制备的转染液按1ml/cm2的比例对步骤1) 制备的猪皮肤在CO2培养箱内37℃转染2小时。
本发明中使用的二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)是一种常见的 带有阳离子基团的有机分子，其阳离子基团二乙氨乙基(DEAE)结合有 一定的阳离子，当其与Ad5重组腺病毒载体采用适合的比例混合后转染猪 皮肤细胞时，可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子基团，降低了腺病 毒载体和细胞表面之间的静电排斥力，从而增加腺病毒与细胞的相互接 触，提高腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。
本发明在体外利用二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)对Ad5重组腺 病毒载体转染液进行处理，以此处理后的腺病毒转染液对猪皮组织进行 转染，与未经处理的腺病毒转染相比，发现可以提高转染效率75-130倍， 大大的提高了基因转染的效率，降低了生产成本。而且试验表明，二乙 氨乙基葡聚糖不会引起腺病毒载体和细胞的变性或失活，因此可以很好 地发挥协助腺病毒载体对猪皮肤的转染作用。
附图说明
图1为CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线图。
具体实施方式
实施例1利用本发明方法制备CTLA4Ig基因转染猪皮
步骤1：取皮消毒
将猪处死后用洗衣粉清洗外部皮肤，手术刀刮毛，再用5％碘伏消毒， 酒精脱色后无菌取皮，在洁净环境下用皮鼓将猪皮剖成厚度层为0.6mm 厚度皮块备用。
步骤2：二乙氨乙基葡聚糖对Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体的处理
使用浓度为500-5000μg/ml的二乙氨乙基葡聚糖(SIGMA公司产品) 对108PFU/ml Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体进行震荡混合，在4℃下孵育10-20 分钟，制备成转染液。
步骤3：腺病毒载体转染
将步骤2中处理后的转染液按1ml/1cm2的比例对步骤1中处理后的 皮片进行转染，转染条件为：CO2培养箱内37℃转染2h，同时以未经二乙 氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)处理的腺病毒转染液为对照对步骤1中 处理后的皮片进行转染，对照组处理措施除腺病毒转染液未经二乙氨乙 基葡聚糖处理外，其余处理措施及转染条件和二乙氨乙基葡聚糖处理组 完全一致。
实施例2二乙氨乙基葡聚糖处理组与对照组的目的基因转入量比较
提取实施例1中二乙氨乙基葡聚糖处理组和对照组中的基因组总DNA (提取方法参照《分子克隆实验指南》(第3版)：463-471。科学出版社)。 然后进行目的基因转染的定量检测，以确定目的基因的转入量。目的基 因转染的定量检测的方法如下：
用目的引物与内参引物分别对样品DNA进行扩增。
目的引物：5’AGGTCAAGTTCAACTGGTACG 3’，见SEQ ID NO：1。
5’CTTGTACTCCTTGCCATTCA 3’，见SEQ ID NO：2。
内参引物：5’TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC 3’，见SEQ ID NO：3。
5’GGTGGAATCATACTGGAACAT 3’，见SEQ ID NO：4。
定量PCR反应程序：
95℃ 3min
94℃ 30s
60℃ 30s
读板
40个循环
72℃ 3min
95℃ 1min
55℃ 1min
熔解曲线从55℃到95℃，每0.5℃循环一次10s。
目的基因的量比上内参基因的量即为目的基因的导入量。实验结果 表明经用二乙氨乙基葡聚糖处理的腺病毒转染猪皮后目的基因导入量较 未经处理的腺病毒转染猪皮提高了75-130倍。
实施例3ELISA检测二乙氨乙基葡聚糖处理组和对照组的腺病毒转染 猪皮后猪皮组织中CTLA4Ig的表达量的比较
1)样品准备
将实施例1转染后的猪皮组织继续培养48小时，然后将不同处理的 猪皮组织在灭菌烧杯或一次性培养皿中用灭菌PBS漂洗三次，在一次性 培养皿内剪碎，每张皮片加1.5ml灭菌PBS用匀浆器在离心管内制备匀 浆，再离心5000r/min，3min取上清作为样品；培养皮片后的培养基也 作为样品。
2)ELISA检测
CTLA4Ig标准品标定曲线：用CTLA4Ig标准品(R&D System USA) 制做标定曲线和曲线方程，结果见表1，根据表1结果制作CTLA4Ig标准 品的吸光值标准曲线图，见图1。表明随标准品浓度增加，吸光值也随之 增加，并呈线性相关趋势，相关系数R2＝0.9622，表明相关程度较高，说明利 用此图可以准确检测样品中0-24μg的CTLA4Ig浓度。
样品中CTLA4Ig测试：酶标板每孔加入100μl(1μg/ml)大鼠抗 CTLA4Ig的一抗(Abnova)，4℃包被过夜，洗板，然后每孔加入200μl 封闭液(1％BSA+0.02％Tween-20+PBS)4℃过夜，洗板，每孔加入100μl 样品室温反应2h，洗板，每孔加入100μl(1μg/ml)羊抗大鼠二抗 (southern biotech)，室温反应2h，洗板，每孔加入100μl底物显色 液(双氧水+邻苯二胺)，室温反应30min，加入100μl 2MH2SO4，用酶标 仪在490nm波长测定吸光度。
实验结果见表2，将表2数值带入CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线 方程(Y＝0.0444X+0.1621)，得出二乙氨乙基葡聚糖处理组匀浆中表达 CTLA4Ig量为225ng/ml，对照组匀浆中含量为130ng/ml，说明二乙氨乙 基葡聚糖处理组的Ad5-CTLA4Ig腺病毒转染猪皮组织匀浆中表达CTLA4Ig 量比对照组的高95ng/ml；二乙氨乙基葡聚糖处理组的Ad5-CTLA4Ig腺 病毒转染猪皮组织培养基中分泌的CTLA4Ig为189ng/ml，对照组为 70ng/ml，二乙氨乙基葡聚糖处理组比对照组高119ng/ml。
表1用CTLA4Ig标准品3次重复测试吸光值
表2二乙氨乙基葡聚糖处理组与对照组转染猪皮CTLA4Ig吸光值比较
实验次数 对照组匀浆 OD值 对照组培养基 分泌OD值 处理组匀浆 OD值 处理组培养基 分泌OD值 第一次 0.8127 0.4694 1.2001 1.1200 第二次 0.6534 0.5239 1.1421 0.9934 第三次 0.7518 0.4254 1.1411 0.8905 平均值 0.7393 0.4729 1.1611 1.0013
以上实施例只是用于进一步说明本发明，而不是用来限制本发明的 保护范围。凡是在本发明保护范围内所做出的具体实施方式及应用范围 上的些许变动，也属于本发明的保护范围。
序列表
<110>重庆宗申军辉生物技术有限公司
<120>一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法
<130>MP080771
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>目的引物
<400>1
aggtcaagtt caactggtac g 21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>目的引物
<400>2
cttgtactcc ttgccattca 20
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>内参引物
<400>3
tttaactctg gcaaagtgga c 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>内参引物
<400>4
ggtggaatca tactggaaca t 21
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