一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用
阅读：1040发布：2020-05-28
专利汇可以提供一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于核酸药物载体技术领域，具体涉及一种适用于核酸 转染 的自组装纳米制剂及其制备与应用。所述自组装纳米制剂，包括组分：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺-胺。本发明首次发现，当β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺中的聚乙烯亚胺采用低分子量的聚乙烯亚胺，所形成的自组装纳米制剂，对于核酸分子具有非常好的转染效果。，下面是一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用专利的具体信息内容。
1.一种自组装纳米制剂，包括组分：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺-胺。
2.根据权利要求1所述的自组装纳米制剂，其特征在于，所述自组纳米制剂中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围是(12～72)：(10～20)：(12～48)。
3.根据权利要求1所述的自组装纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺选用接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺；(2)所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部；(3)所述金刚烷修饰的聚酰胺-胺选用连接有金刚烷的聚酰胺-胺。
4.根据权利要求3所述的自组装纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有一个及一个以上β-环糊精分子；(2)未封端前的聚乙二醇的分子量是2000～5000；(3)金刚烷通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上；(4)每个聚酰胺-胺上连接有一个及一个以上金刚烷。
5.根据权利要求4所述的自组装纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)接枝前的聚乙烯亚胺为低分子量的聚乙烯亚胺；(2)所述聚酰胺-胺是1代的聚酰胺-胺。
6.根据权利要求5所述的自组装纳米制剂，其特征在于，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围是400～2000。
7.如权利要求1～6任一项自组装纳米制剂的制备方法，包括：按配比取各组分，混合，自组装获得自组装纳米制剂。
8.由权利要求7所述方法制备获得的自组装纳米制剂。
9.如权利要求1～6任一项自组装纳米制剂或由权利要求7所述方法制备获得的自组装纳米制剂在制备核酸转染或输送载体中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述转染的对象为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞。
一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用
技术领域
[0001] 本发明属于核酸药物载体技术领域，具体涉及一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤作为死亡的重要原因，正在不断威胁着人类的身体健康，已经成为常见病、多发病。恶性肿瘤死亡率已超过心血管疾病，与病毒性疾病、老年病并称为“现代医学的三大挑战”。对于恶性肿瘤，我们依然无法攻克，尚无完备的治疗手段，只能通过手术切除、化学治疗、放射治疗、和免疫治疗等常规方法。但是随着人类对肿瘤疾病的不断深入了解，近年来在免疫治疗领域取得了突破。
[0003] 肿瘤免疫治疗在近期以来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点和热点。免疫疗法是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。近年来，在免疫治疗领域，通过基因工程改良包括T细胞在内的淋巴细胞作为“活的药物”来消灭癌细胞是癌症疗法的一个新方向。如T细胞疗法的具体过程主要分为九个步骤：(1)将白细胞从患者的血液中分离出来。 (2)通过逆流离心淘洗或其它方法富集淋巴细胞。(3)富集的淋巴细胞在体外培养环境中接受特定抗原刺激。(4)同时，通过载体导入编码CAR或TCR的基因片段。(5)这些淋巴细胞在生物反应器中分裂增殖。(6)当淋巴细胞达到足够数量后会经过清洗去除没有表达预订 CAR或TCR的T细胞。(7)浓缩后的细胞样本会接受质量检查。(8)然后冰冻成为最终产品运送到诊所。(9)诊所的医生将产品解冻，注回患者体内。在整个治疗过程中其中最为关键的步骤就是通过载体导入基因片段。
[0004] 现阶段较为常见的淋巴细胞转染的方法有病毒介导法，普通电穿孔技术，非病毒载体转染法等。病毒介导法耗时耗力，存在生物安全隐患及高成本等缺点，病毒感染引起的不可预期的免疫反应等缺陷不可被忽视。普通电穿孔技术对免疫相关的原代细胞通常存在转染效率低的问题，也无法进行下游实验。所以安全性高、副作用小、生产成木低的非病毒载体越来越受到人们的青睐，但由于T细胞是悬浮细胞，并且由于其自身的一些生物学性质，目前还没有有效的非病毒载体用于将基因片段高效的运送至T细胞内。
发明内容
[0005] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用。
[0006] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面，提供一种自组装纳米制剂，包括组分：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺-胺。
[0008] 优选地，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可以是接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺。
[0009] 优选地，接枝前的聚乙烯亚胺为低分子量的聚乙烯亚胺。
[0010] 进一步优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是400～2000。更优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是600～1800。再优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是800。
[0011] 优选地，所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有一个及一个以上β-环糊精分子。进一步地，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有4～7个β-环糊精分子。
[0012] 优选地，所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷可通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部。
[0013] 优选地，未封端前的聚乙二醇的分子量可以是2000～5000。
[0014] 优选地，所述金刚烷修饰的聚酰胺-胺可以是连接有金刚烷的聚酰胺-胺。
[0015] 优选地，金刚烷可通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上。
[0016] 优选地，每个聚酰胺-胺上可以连接有一个及一个以上金刚烷。
[0017] 优选地，所述聚酰胺-胺可以是1代的聚酰胺-胺。
[0018] 优选地，所述自组纳米制剂中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围是(12～72)：(10～20)： (12～48)。
[0019] 本发明的第二方面，提供了前述自组装纳米制剂的制备方法，包括：按配比取各组分，混合，自组装获得自组装纳米制剂。
[0020] 优选地，金刚烷封端的聚乙二醇可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到聚乙二醇的端部。
[0021] 优选地，可将金刚烷上的氨基与聚乙二醇上的羧基进行酰胺反应，获得金刚烷封端的聚乙二醇。
[0022] 优选地，金刚烷修饰的聚酰胺-胺可通过包括如下步骤的方法获得：将1-金刚烷异氰酸酯与聚酰胺-胺反应，金刚烷可通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上。
[0023] 优选地，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可通过包括如下步骤的方法获得：将β环糊精与活化剂反应获得活化后的β-环糊精，然后将活化后的β-环糊精接枝到PEI上，获得β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺。
[0024] 优选地，所述活化剂可以是N,N'-羰基二咪唑或对甲苯磺酰氯。
[0025] 优选地，β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺，在制备时，可采用N,N'-羰基二咪唑对β环糊精进行活化。
[0026] 本发明的第三方面提供了一种由前述制备方法获得的自组装纳米制剂。
[0027] 本发明的第四方面提供了前述自组装纳米制剂在制备核酸转染或输送载体中的用途。
[0028] 所述核酸包括但不限于反义核酸、核酶、适配体、干扰RNA、sgRNA等各种核酸药物及其质粒DNA或mRNA等表达载体，表达各种生物活性分子的质粒DNA或mRNA。
[0029] 所述转染或输送可以是针对体外细胞的，也可以是针对体内细胞的。
[0030] 所述转染的对象为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032] 本发明通过对基于阳离子组分的自组装纳米制剂组成成分的筛选优化，将环糊精修饰不同分子量的聚乙烯亚胺(PEI)，以及金刚烷修饰的不同代数的聚酰胺-胺型树枝状高分子 (PAMAM)按照一定的比例混合自主装成为纳米粒子运输核酸片段，在实现有效运输核酸药物的同时，可降低载体的毒副作用，并实现了对淋巴细胞高水平的转染效果。附图说明
[0033] 图1A：实施例1中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI800)的合成反应式。
[0034] 图1B：实施例1中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI10000)的合成反应式。
[0035] 图2A：实施例1中β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺(CD-PEI800)的核磁共振氢谱。
[0036] 图2B：实施例1中6-O-(p-对甲基苯磺酸)-β-环糊精(6-OTs-β-CD)的核磁共振氢谱。
[0037] 图2C：实施例1中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI10000)的核磁共振氢谱。
[0038] 图3：实施例2中金刚烷封端的聚乙二醇(Ad-PEG)的合成反应式。
[0039] 图4：实施例2中金刚烷-聚乙二醇的核磁共振氢谱。
[0040] 图5：实施例3中金刚烷修饰的聚酰胺-胺(Ad-PAMAM)的合成反应式。
[0041] 图6：实施例4中自组装核酸纳米制剂的粒径分布。
[0042] 图7：实施例4中各自组装核酸纳米制剂的生物透射电镜表征。
[0043] 图8A：含有CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂DNA@SNP800在水中的稳定性变化表征。
[0044] 图8B：含有CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂DNA@SNP10000在水中的稳定性变化表征。
[0045] 图9：自组装核酸纳米制剂的凝胶电泳结果，其中，A表示Maker，B表示裸PGL3 质粒DNA，C表示PGL3DNA@liposome，D代表PGL3DNA@SNP800，E代表 PGL3DNA@SNP10000。
[0046] 图10A：实施例7中自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶表达质粒(PGL3)转染结果。
[0047] 图10B：实施例7中不同低分子量聚乙烯亚胺自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶表达质粒(PGL3)转染结果。图10C：不同氮磷比的自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染结果。
[0048] 图10D：实施例7中金刚烷修饰的聚酰胺-胺的组分改变，所形成的自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染结果。
[0049] 图10E：实施例7中金刚烷封端的聚乙二醇的组分改变，所形成的自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染结果。
[0050] 图11：实施例7中自组装核酸纳米制剂介导的绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)转染结果，其中，a～c表示基于CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂组的GFP阳性细胞数和荧光强度，d～f表示基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组的GFP阳性细胞数和荧光强度。
具体实施方式
[0051] 自组装纳米制剂
[0052] 本发明的自组装纳米制剂，包括组分：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺-胺。
[0053] 所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可以是接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺。
[0054] 将β-环糊精接枝到聚乙烯亚胺上，获得接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺属于本领域技术人员所公知的技术。
[0055] 接枝前的聚乙烯亚胺为低分子量的聚乙烯亚胺。进一步地，所述低分子量的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是400～2000。进一步地，所述低分子量的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是600～1800。在一些实施方式中，所述低分子量的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是600～800，也可以是800～1800。
[0056] 在一实施方式中，列举了接枝前的聚乙烯亚胺的分子量是600、800、1800，但是，其分子量并不仅限于600、800、1800。
[0057] 所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有一个及一个以上β-环糊精分子。进一步地，每条聚乙烯亚胺长链上可接枝有4～7个β-环糊精分子。在一实施方式中，列举了枝接了5个β-环糊精分子的聚乙烯亚胺长链，但是其接枝率并不仅限于此。
[0058] 所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺的结构示意图可参见图1A。
[0059] 采用金刚烷对聚乙二醇进行封端属于本领域技术人员公知的技术。例如，所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷可通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部。
[0060] 未封端前的聚乙二醇的分子量可以是2000～5000。在一实施方式中，列举了所述聚乙二醇的分子量为5000，但是并不仅限于此。
[0061] 所述金刚烷封端的聚乙二醇的结构示意图可参见图3。
[0062] 所述金刚烷修饰的聚酰胺-胺可以是连接有金刚烷的聚酰胺-胺。
[0063] 将金刚烷连接到聚酰胺-胺上属于本领域技术人员所公知的技术。例如，金刚烷可通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上。
[0064] 每个聚酰胺-胺上可以连接有一个及一个以上金刚烷。例如，每个聚酰胺-胺上可以连接有1～8个金刚烷。进一步地，每个聚酰胺-胺上可以连接有4～8个金刚烷。本发明一实施方式中，列举了连接有8个金刚烷分子的聚酰胺-胺，但是并不仅限于此。
[0065] 所述聚酰胺-胺可以是1代的聚酰胺-胺。所述聚酰胺-胺的分子量可以是1457.90。本发明实施例列举了聚酰胺-胺可以是带有1，4-二氨基丁烷芯核和胺末端的第一代聚酰胺树枝状聚合物。所述聚酰胺-胺可购于Dendritic Nanotechnologies，Inc(Mount pleasant，MI)。
[0066] 所述自组装纳米制剂中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺- 胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围是(12～72)：(10～20)：(12～48)。
[0067] 所述自组装纳米制剂中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺- 胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围是(24～60)：(10～20)：(12～48)。
[0068] 在一些实施方式中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围可以是(36～60)：(10～20)：(12～48)。
[0069] 在一些实施方式中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围可以是(36～48)：(10～20)：(12～48)。
[0070] 在一些实施方式中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围可以是(48～60)：(10～20)：(12～48)。
[0071] 在一些实施方式中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围可以是(36～60)：10：12。
[0072] 综上所述，所述自组装纳米制剂为一种自组装纳米制剂系统，所述自组装纳米制剂系统的组成成分中，包括三个部分具有特定结构和分子大小的分子模块A,B,C，A为用于纳米制剂自组装聚合封端，提高自组装核酸制剂生物相容性和循环时间的金刚烷封端的聚乙二醇，B为用于核酸分子结合和控制自组装核酸制剂粒径的金刚烷修饰的聚酰胺 -胺，C为用于与核酸分子结合和促进核酸分子内涵体释放的β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺。
[0073] 自组装纳米制剂的制备方法
[0074] 本发明的自组装纳米的制备方法，包括：按配比取各组分，混合，自组装获得自组装纳米制剂。
[0075] 其中，金刚烷封端的聚乙二醇可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到聚乙二醇的端部。
[0076] 亦即，可将金刚烷上的氨基与聚乙二醇上的羧基进行酰胺反应，获得金刚烷封端的聚乙二醇。
[0077] 金刚烷修饰的聚酰胺-胺可通过包括如下步骤的方法获得：将1-金刚烷异氰酸酯与聚酰胺-胺反应，金刚烷可通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上。
[0078] β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可通过包括如下步骤的方法获得：将β环糊精与活化剂反应获得活化后的β-环糊精，然后将活化后的β-环糊精接枝到PEI上，获得β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺。
[0079] 所述活化剂可以是N,N'-羰基二咪唑或对甲苯磺酰氯。
[0080] β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺，在制备时，可采用N,N'-羰基二咪唑对β环糊精进行活化。
[0081] 自组装纳米制剂在制备核酸转染或输送载体中的用途。
[0082] β环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇、金刚烷修饰的聚酰胺- 胺通过金刚烷和环糊精的分子识别自组装成纳米制剂。本发明所述自组装核酸纳米制剂可用于核酸分子的装载和输送。通过将上述自组装制剂和核酸分子混合，核酸分子通过电荷作用被包裹在自组装纳米制剂内部，通过对不同组分的分子大小及比例的优选，制备得到的自组装纳米制剂具有良好的细胞核酸运输效果。所述自组装纳米制剂作为核酸分子的载体，保留了低分子量聚乙烯亚胺低毒性的同时，解决了传统低分子量聚乙烯亚胺装载核酸分子及用于细胞转染时的低效率问题及高分子量聚乙烯亚胺作为核酸载体材料的高毒性问题，实现了高效装载核酸分子及在细胞转染中的安全高效。同时，该自组装核酸纳米制剂制备方法工艺简单，成本低且方便可行。
[0083] 所述核酸分子可以是基因药物。所述自组装核酸纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所述核酸分子之间的氮磷比例范围是(4～24)：1。进一步地，所述自组装核酸纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所述核酸分子之间的氮磷比例范围可以是(8～20)：1。再进一步地，所述自组装核酸纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所述核酸分子之间的氮磷比例范围可以是(12～20)：1。在一些实施方式中，所述自组装核酸纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所述核酸分子之间的氮磷比例范围可以是(12～16)：1。在一些实施方式中，所述自组装核酸纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所述核酸分子之间的氮磷比例范围可以是(16～20)：1。
[0084] 所述核酸分子选自但不限于反义核酸、核酶、适配体、干扰RNA、sgRNA等各种核酸分子及其质粒DNA或mRNA等表达载体，表达各种生物活性分子的质粒DNA或 mRNA等载体等载荷与转染。
[0085] 所述转染或输送可以是针对体外细胞的，也可以是针对体内细胞的。所述转染的对象为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞。
[0086] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0087] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0088] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0089] 实施例1β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺CD-PEI的合成
[0090] 一、β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺CD-PEI(MW＝800)的制备[0091] 合成反应式详见图1A。
[0092] 具体地，取0.42g(0.37mmol)β-环糊精及0.80g(5.2mmol)N,N'-羰基二咪唑(英文全称， CDI)溶于6mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温并充氮气保护条件下避光搅拌反应 1小时。反应结束后，用冷乙醚沉淀，在5000rpm条件下离心5min得到产物CD-CDI并溶解于5ml的干燥二甲基亚砜溶液。
[0093] 取1.5g(2.5mmol)的低分子量聚乙烯亚胺(MW＝800)溶解于3ml干燥二甲基亚砜溶液，在90分钟内缓慢滴加溶解于二甲基亚砜的CD-CDI，并加入0.3ml三乙胺溶液反应5小时。取反应液用截取分子量为3,500透析膜用去离子水透析，透析产物冷冻干燥，即为产物环糊精-聚乙烯亚胺800(CD-PEI800)，取适量产物溶于D2O中用于核磁共振氢谱检测，如图 2A所示，结果表明环糊精成功连接至聚乙烯亚胺。
[0094] 二、β-环糊精--高分子量聚乙烯亚胺CD-PEI(MW＝10000)
[0095] 合成反应式详见图1B。
[0096] 具体地，在500mL圆底烧瓶中将34.4g(0.03mol)β-环糊精溶于400mL质量分数为1％的氢氧化钠溶液中，搅拌至无色后将圆底烧瓶置冰水浴中预冷。在160.0min内滴加22mL 溶有5.8g(0.03mol)对甲基苯磺酰氯(p-Tscl)的乙腈溶液至圆底烧瓶反应器中室温继续搅拌过夜。反应溶液过滤后收集滤液并用1mol/L的盐酸酸化至pH 2-3，4℃下静置过夜，过滤得白色固体并用蒸馏水重结晶纯化两次，得到6-OTs-β-CD纯品。
[0097] 取适量6-OTs-β-CD产物溶于DMSO-d6中，用核磁共振氢谱法对产物6-OTs-β-CD进行表征确认，如图2B所示。
[0098] 取100mg高分子量PEI(30％wt,MW＝10kD,0.01mmol)溶于100mL DMSO溶液中，转移至500mL圆底烧瓶中，加入1.29g(1mmol)的6-OTs-β-CD，70℃搅拌反应3天。取反应液用截取分子量为3,500透析膜用去离子水透析6天，并及时更换透析液，取最终透析后所得产物冷冻干燥，即为产物CD-PEI10000。
[0099] 取适量CD-PEI10000产物溶于D2O中核磁共振氢谱检测，如图2C所示，结果表明环糊精成功连接至聚乙烯亚胺。
[0100] 实施例2金刚烷封端的聚乙二醇Ad-PEG的合成
[0101] 合成反应式详见图3。
[0102] 具体地，金刚烷(Adamantane，Ad)。称取分子量为187.74g/mol的金刚烷盐酸盐9.39mg (0.05mmol)，溶解于3ml的二氯甲烷溶液中，加入5.06mg(0.05mmol)三乙胺为反应催化剂，加入50mg(MW＝5000,0.01mmol)聚乙二醇琥珀酰亚胺，反应器在室温条件下搅拌反应2h，反应过程中充氮气保护。反应结束后，将反应液置于20ml茄型瓶中，进行减压蒸馏除去二氯甲烷溶剂，溶剂蒸干后出现白色固体。向茄型瓶中加入适量去离子水溶解白色固体，在1×104rpm条件下离心15min，取上清液加入至截留分子量为3500的透析膜中用去离子水透析过夜，透析后的溶液进行冷冻干燥得到白色粉末，即为产物金刚烷封端的聚乙二醇，核磁共振氢谱检测，如图4所示，检测结果表明金刚烷分子成功连接至聚乙二醇。
[0103] 实施例3金刚烷修饰的聚酰胺-胺Ad-PAMAM的合成
[0104] 合成反应式详见图5。
[0105] 具体地，金刚烷，简称Ad。本实施例所使用的聚酰胺-胺PAMAM是带有1，4-二氨基丁烷芯核和胺末端的第一代聚酰胺树枝状聚合物(PAMAM,G1)。所述聚酰胺-胺 PAMAM可购于Dendritic Nanotechnologies，Inc(Mount pleasant，MI)。
[0106] 将100mg(20％wt，0.07mmol)的聚酰胺-胺的甲醇溶液加入至圆底烧瓶，进行减压蒸馏将甲醇溶液去除，将粘性固体重新溶解在10ml干燥的四氢呋喃溶液中，将244.6mg(1.4 mmol)的1-异氰基金刚烷溶解于10ml干燥的四氢呋喃溶液中，将溶解后的1-异氰基金刚烷溶液加入至聚酰胺-胺的溶液中，室温搅拌反应2h后减压蒸馏除去溶液。向反应容器中加入100ml乙醚溶液产生白色固体，将抽滤后所得沉淀用乙醚100ml冲洗3次后干燥，所得产物即为金刚烷修饰的聚酰胺-胺Ad-PAMAM。根据数据分析，每个聚酰胺-胺上连接有8 个金刚烷分子。
[0107] 实施例4自组装核酸纳米制剂(DNA@SNP)的制备
[0108] 向1.5ml EP管中加入600ul去离子水，并依次加入自组装核酸纳米制剂各组分，分别为 Ad-PEG1.69nmol、Ad-PAMAM1.39nmol涡旋15s，静置2分钟，加入质粒DNA 6ug涡旋 15s，最后加入不同分子量的CD-PEI 1.5ul(10mg/ml)立即涡旋30秒，静置20分钟得自组装核酸纳米制剂(DNA@SNPs)。
[0109] 此时，自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围12：1，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是36：10：12。
[0110] 用激光散射粒度分析仪(如图6所示)以及120kV生物型透射电镜(Tecnai G2spirit Biotwin)(如图7所示，a、b表示含有CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂，c、d表示含有 CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂)等仪器进行表征。实验结果表明我们的自组装核酸纳米制剂粒径大约为100nm，分布均一，形貌规整。
[0111] 实施例5自组装核酸纳米制剂的稳定性研究
[0112] 按照上述实施例4方法制备自组装核酸纳米制剂，在0小时、2小时、4小时、8小时、 12小时、24小时等时间点取样并用Nanosight测量自组装核酸纳米制剂的粒径大小及粒子数。如图8A及如图8B所示，实验结果显示自组装核酸纳米制剂的颗粒数和粒径在不同的时间点没有明显的变化，说明我们制备的自组装核酸纳米制剂是稳定的。
[0113] 实施例6自组装核酸纳米制剂对核酸分子载荷的研究
[0114] 本发明提供了自组装核酸纳米制剂作为载体对核酸药物运输的应用研究，包括载体包装核酸药物的能力，以及对细胞是否能够实现转染的能力。
[0115] 基因治疗是否有效包括许多影响因素。首先，第一影响因素为药物载体是否有效包裹核酸药物；如果不能包裹核酸则不能实现转染。当应用非病毒载体时，只有当带负电的核酸药物与载体材料通过静电结合后形成复合物颗粒才能够具有转染活性。因此，能否将核酸药物有效包装是运输载体的重要性能之一。用于核酸药物转染的载体材料，与核酸药物都是通过正负电荷相互吸引而组装在一起，由于是通过电荷作用，电荷比起到了重要的影响，即氮/磷(N/P)比，其中N代表载体中的氨基，可以产生一单位正电荷；P为核酸药物分子中的磷酸基团，可以产生一单位负电荷。N/P比反应了载体与核酸药物的电荷比情况，必须通过实验获知，载体/核酸药物的比例为多少时，核酸药物能够被充分包装起来。在本发明中，我们采用了较为简单和直观的质量比来表示载体/核酸药物的比例，这种方式也在实际应用中更为精确，载体/核酸药物的比例均指两者的质量比。
[0116] 在优选的实施方案中，本发明通过琼脂糖凝胶阻滞实验测定了本发明制备的各种载体材料对DNA的包载能力，实验结果表明：每种载体材料均能与DNA完全结合。
[0117] 另一方面，核酸药物能否发挥疗效，其中最主要的一个原因是运输载体能否将核酸药物转染进细胞并发挥作用，本发明通过细胞转染实验测定了自组装纳米制剂对核酸药物的转染能力。其中，以质粒DNA为核酸药物模型，实验结果表明，本发明的载体材料能将质粒DNA成功转进细胞，但不同载体材料对质粒DNA的转染效率因其分子量，组成比例，所带电荷的不同而有差异。而当载体材料相同，其与DNA的比例不同时，转染效果的差异也因材料种类的不同而呈现出不同的趋势。
[0118] 称取0.6g琼脂糖至锥形瓶中，向锥形瓶中加入60mL 1×TAE缓冲溶液，微波炉加热至琼脂糖溶解，待温度降至60℃左右后加入6μL Gelred染色液，轻轻摇匀以避免产生气泡，摇匀后将琼脂糖溶液倒至琼脂糖胶平板中，静置30分钟至琼脂糖凝胶凝固后轻轻取出，放至1×TAE缓冲溶液中备用。取制备好的自组装核酸纳米制剂按每孔所加质粒DNA量为 300ng加样，以1×TAE作为电泳缓冲液，于90V电压下电泳60分钟，用凝胶成像系统拍照观察。如图9所示，自组装核酸纳米制剂的凝胶电泳结果显示，与裸DNA上样组比较，自组装核酸纳米制剂中没有明显的游离DNA跑出，并且由于DNA被包裹在SNPs内部，其DNA荧光强度也较暗，说明DNA被成功的装载在自组装核酸纳米制剂中。
[0119] 实施例7细胞转染实验
[0121] 一、自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染
[0122] Jurkat细胞准备：细胞计数，将1ml(1×106个/ml)的细胞悬液加入至24孔板中，每组设置三个平行孔。
[0123] 组别设置：阳性对照(LipofectamineTM2000组)；CD-PEI800/DNA复合组(CD-PEI800)；基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组(SNP800组)，基于CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂组(SNP10000组)。将图中的标注按上述简称替换。
[0124] 实验样品制备：基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组(SNP800组)，基于CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂组(SNP10000组)按前述方法制备。LipofectamineTM2000组和 CD-PEI800/DNA复合组按产品说明书和文献方法制备。
[0125] 转染实验：将Jurkat细胞悬液(1ml)加入至24孔板中，在1200rpm，4℃条件下离心5分钟，吸去培养基，然后将200ul装载2ug质粒DNA的实验样品加入每个孔中，放培养箱内培养4个时后加入800ul 10％FBS的RPMI1640培养基。将细胞培养板放到培养箱内继续培养24小时后参照Luciferase Assay System的操作说明检测luciferase基因的表达。如图 10所示，实验结果发现LipofectamineTM2000对照组具有较高的荧光素酶表达，而 CD-PEI800/DNA复合组(CD-PEI800)和基于CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂组(SNP10000组)的荧光素酶表达水平都很低，而基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组的荧光素酶表达则很高，并且明显高于LipofectamineTM2000对照组。说明我们的基于环糊精-低分子量聚乙烯亚胺的自组装核酸 纳米制剂的核酸 输送效果要明 显好于目前常 用的转染试 剂 LipofectamineTM2000，CD-PEI800或基于大分子聚乙烯亚胺纳米颗粒等。
[0126] 二、自组装核酸纳米制剂介导的绿色荧光蛋白质粒DNA(pGFP)的细胞转染[0127] Jurkat细胞准备：细胞计数，将1ml(1×106个/ml)的细胞悬液加入至24孔板中，每组设置三个平行孔。
[0128] 组别设置：阳性对照(LipofectamineTM2000组)；基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组(SNP800组)，实验组2(CD-PEI10000组)。
[0129] 实验样品制备：基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组(SNP800组)按前述方法制备。实验以通用转染试剂LipofectamineTM2000作为阳性对照，实验操作参照 LipofectamineTM2000操作说明书。
[0130] 转染实验：将Jurkat细胞悬液(1ml)加入至24孔板中，在1200rpm，4℃条件下离心5分钟，吸去培养基，然后将200ul装载2ug质粒的DNA的加入每个孔中，放培养箱内培养4个时后加入800ul 10％FBS的RPMI1640培养基。将细胞培养板放到培养箱内继续培养48小时后用荧光显微镜观察细胞GFP表达情况。实验结果发现基于CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂组的GFP阳性细胞数和荧光强度都明显的比LipofectamineTM2000对照组高，说明该自组装核酸纳米制剂具有比目前的商品化试剂具有更高的细胞转染效率。
[0131] 此外，改变β-环糊精-聚乙烯亚胺中，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量，其他条件不变，参照实施例4自组装核酸纳米制剂(DNA@SNP)的制备，来制备不同的自组装纳米制剂，参照实施例7中一、自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染，结果如图10B所示，可知，当接枝前的聚乙烯亚胺的分子量为600～1800的时候，均能够实现对核酸分子很好的转染。
[0132] 此外，改变自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例，参照实施例4自组装核酸纳米制剂(DNA@SNP)的制备，来制备不同的自组装纳米制剂，当自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围4：1时，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是12：10：12；当自组装纳米制剂中β-环糊精- 聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围8：1时，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是 24：10：12；当自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围12：1时，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺- 胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是36：10：12；当自组装纳米制剂中β-环糊精- 聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围16：1时，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是48：10：12；当自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围20：1时，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是60：10：12；当自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围24：1时，自组装纳米制剂中β- 环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是72：10：12。
[0133] 参照实施例7中一、自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染，结果如图10C所示，可知，当自组装纳米制剂中β-环糊精-聚乙烯亚胺是与所包载的核酸分子之间的氮磷比例范围是(12～20)：1的时候，自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是(36～60)： 10：12，均能实现对核酸分子很好的转染。
[0134] 然后，考察了金刚烷修饰的聚酰胺-胺的组分改变，所形成的自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染，结果如图10D所示，当自组装纳米制剂中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是36：(10～20)：12时，均能实现对核酸分子很好的转染。
[0135] 接下来，考察了金刚烷封端的聚乙二醇的组分改变，所形成的自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶质粒DNA(PGL3)细胞转染，结果如图10E所示，当自组装纳米制剂中β- 环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例是36：10：(12～48)时，均能实现对核酸分子很好的转染。
[0136] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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