专利汇可以提供长链人胰岛素样生长因子(LR3IGF-1)及其制备和应用方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新的长链人胰岛素样生长因子,其具有促进细胞和/或组织生长、增殖和/或再生的功能。另外,本发明还涉及制备该长链人胰岛素样生长因子的方法,以及该生长因子在药品、食品、保健品和 化妆品 等方面的应用。,下面是长链人胰岛素样生长因子(LR3IGF-1)及其制备和应用方法专利的具体信息内容。
1.一种长链人胰岛素样生长因子,其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
2. —种核酸分子,其编码权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子。
3. 权利要求2所述的核酸分子,其核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
4. 一种载体,其含有权利要求2或3所述的核酸分子。
5. —种宿主细胞,其特征在于,所述细胞含有权利要求4所述的载体,或者 所述细胞用权利要求2或3所述的核酸分子转化或转染而得。
6. 权利要求5所述的宿主细胞,其是酵母。
7. —种用于促进细胞增殖的组合物,其包含权利要求1所述的长链人胰岛素 样生长因子以及药学上可接受的载体。
8. 权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子在制备用于促进细胞或组织生 长、增殖或再生的药物、保健食品和/或化妆品中的应用。
9. 权利要求8所述的应用,其应用为在制备用于促进细胞增殖的药物、保健 食品或化妆品中的应用
10. 权利要求9所述的应用,其应用为在制备用于促进细胞增殖的化妆品中的 应用。
11. 制备权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子的方法,其包括,用权利 要求5或6所述的宿主细胞表达权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因 子,然后分离纯化所述长链人胰岛素样生长因子。
12. 权利要求12所述的方法,其中分离纯化步骤包括超滤。
链人胰岛素样生长因子也有助于维持其正常的细胞分裂、增殖作用,有助于 ?文善亚健康状态,保持其充沛的活力。健康人外用一定量的本发明的长链人 月夷岛素样生长因子有助于维持其皮肤细胞的分裂、增殖,改善外部形象,具
有美容的作用。
对于药物来说,给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况G口 年龄、体重、性别、病情、患病时间、身体状况等)确定。 一般而言,给药
的剂量为0.001〜100mg/kg患者体重,优选为0.01〜10mg/kg,更优选为 0,1〜lmg/kg。给药形式可以根据各种药物制剂的剂型来确定,适合的给药形式 有口服、透皮、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内等会合 药形式,优选使用喷剂或软膏。本发明的第一个方面所述的长链人胰岛素丰羊 生长因子可以单独作为药品、保健食品和/或化妆品使用,也可以添加到其j也 药品、保健食品和/或化妆品中使用。例如,本发明的纳米化制品可以添加到 常规的饮料、食品或化妆品中配合应用。
在第七个方面,本发明提供了制备本发明第一个方面所述长链人胰岛素 样生长因子的方法,其包括,用本发明第四个方面所述的宿主细胞表达本发 明第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子,然后分离纯化所述长链人月夷 岛素样生长因子。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需 要的蛋白,包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜 上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要,可利用融合蛋白的物理的、化学 的以及其它生物学特性,进行分离纯化。方法包括但不限于:裂菌(超声波 裂菌、渗透压裂菌),离心,盐析,分子筛色谱,离子交换色谱,吸附色谱(亲 和层析、金属鏊合层析),反向色谱,高效液相色谱,毛细管电泳,制备性等 电聚焦以及常规的变性、复性处理等,这些方法均是本领域技术人员所熟知 的。为了能够高效地获得长链人胰岛素样生长因子,尤其是为方便下游分离 纯化操作,优选在本发明第七个方面的方法中,用载体pPICZ-LR^IGF-l转染 Pichia pastoris酵母表达菌株GS115,其中载体pPICZ- LR3IGF-1含有本发明 第二个方面所述的核酸分子。另外,由于本发明的长链人胰岛素样生长因子 能够分泌到发酵酵母细胞的培养基中,优选在本发明第七个方面的方法中, 分离纯化所述长链人胰岛素样生长因子的步骤包括超滤。其中,本领域技术 人员能够选用合适的超滤膜来滤过和/或截留相应分子量的长链人胰岛素样生 长因子。
本发明引用了公开文献,这些文献是为了更清楚地描述本发明,它们的 全文内容均纳入本文进行参考,就好像它们的全文己经在本文中重复叙述过 一样。
为了便于理解,以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需 要特别指出的是,这些描述仅仅是示例性的描述,并不构成对本发明范围的 限制。依据本说明书的论述,本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。具体实施方式
以下所述实验方法,没有具体说明的,均按照《分子克隆实验指南》,第
三版,2002年,科学出版社(北京))所述方法进行。
实施例1
本发明LI^IGF-1基因的克隆
通过商业途径委托上海泽衡生物技术有限公司合成本发明LR3IGF-1基因并构建成表达质粒载体。克隆过程参照《分子克隆实验措南》以及所用的TaKaRa公司(日本)的T4多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶所时的操作指南进行,简要过程如下:
通过DNA自动合成仪,合成IGF-1基因的5个核酸片段(序列分别如序列表的序列3、 4、 5、 6、 7所示),用T4多核苷酸激酶(购自TaKaRa公司)将这5个核酸片段的5'端进行磷酸化,然后等摩尔比混合这5个核酸片段后于65。C变性5分钟,退火降温至16°C,加入T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接12小时。然后,取1 u L上述连接产物在50 " L反应体积中进行PCR,其中正向引物如序列表的序列8所示(引入了 EcoRI内切酶位点)、反向引物如序列表的序列9所示(引入了XbaI内切酶位点),反应条件为:以94。C变性4分钟,然后以94°C变性30秒、63°C退火30秒并72°C延伸30秒进行35个循环,最后以72°C延伸4分钟并降温至4°C。
琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物,回收约260bp大小的片段,用EcoR I和Xba I双酶切该片段,并与经这两个内切酶酶切的pPICZaA质粒(购自Invitrogen公司)用T4 DNA连接酶进行连接,转化入大肠杆菌ToplO F'中。挑出阳性克隆,抽提出其中的质粒,经测序验证无误后由上海泽衡生物技术有限公司将构建好的质粒(命名为pPICZ-LR?IGF-l)寄回。
实施例2
LR3IGF-1酵母分泌表达菌株的构建
按照《分子克隆实验指南》和Invitrogen公司的酵母转化操作指南,将pPICZ- LR3IGF-1导入Pichia pastoris酵母表达菌株GS115 (购自Invitrogen公司)。过程如下:
(1)线性化pPICZ- LR3IGF-1质粒DNA:在lOOpl反应体系中,加入20呢pPICZ- LR3IGF-1质粒DNA和20单位Pme I酶(购自New England Biolabs),于37。C酶切3小时,加入2pl200mMEDTA,终止反应。然后,加入lOOpl去离子水,加入等体积酚/氯仿,剧烈振荡混匀,13000rpm高速离心10分钟,将上清液转入新管,加入1/10体积3M醋酸钠,再加入2.5倍体积无水乙醇,混匀后于-70。C放置1小时,再在fC以13000rpm离心15分钟,弃去液体,以80%乙醇洗涤一次,空气中晾干,将沉淀重新溶解在l(Hll去离子水中,置 于(TC,待用。
(2) 制备酵母菌感受态细胞:在5mlYPD培养基(YPD培养基的配制: 9t)0ml水中溶解10g酵母抽提物和20g蛋白胨,高压灭菌后,待冷却至55~60 °C时,加入1 OOml 20%葡萄糖溶液)中接种Pichia pastoris酵母表达菌株GS115, 3『C振荡培养过夜,次日转接入500ml新的YPD2咅养基中,3CTC继续培养, 直至OD6oo达到1.3〜1.5为止。在4。C以1500rpm离心8分钟,弃去上清液, 收集沉淀的菌体,加入预冷的500ml无菌去离子水重新悬浮菌体。然后,再. 汰离心,在4。C以1500rpm离心8分钟,弃去上清液,收集沉淀的菌体,以 250ml预冷的无菌去离子水重新悬浮菌体。然后,在4°C以1500rpm离心S分 4中收集沉淀的菌体,再以20ml预冷的无菌去离子水重新悬浮菌体。最后,在 4'C以1500rpm离心8分钟收集沉淀的菌体,再用lml预冷的1M山梨醇悬 浮菌体。将该制备好的感受态细胞置于0。C,待用。
(3) 酵母菌的电融合:取80)Lll上述感受态细胞与5^il上述线性化的 pWCZ- LR3IGF-1质粒DNA混合均匀,转入0。C预冷的0.2cm电融合杯中, 于0"C放置5分钟。然后进行电击,其中电击的条件如下:1500V, 25pF, 20 Q 。然后立即加入lml预冷的1M山梨醇,混合均匀后转入一个15ml试管 中,于30。C孵育2小时。取200^1分别铺于含不同浓度Zeocin的YPDS平板
(YPDS平板的配制:900ml水中溶解10g酵母抽提物、20g蛋白、182.2g山 梨醇和20g琼脂,高压灭菌后,待冷却至55〜6(TC时,加入100ml20。/。葡萄糖 溶液和lml250mg/ml的Zeocin,铺平板)上,倒置,30。C培养2天,挑取阳性 克隆,经发酵和SDS-PAGE电泳验证(过程基本同实施例3)无误后,该克隆 即为表达本发明LFeiGF-l的重组分泌表达菌株。
实施例3
LR3IGF-1的发酵和纯化
将实施例2中得到的LRSlGF-l的重组分泌表达菌株接种于100mlBMGY 培养基中,30。C振荡培养16〜18小时,当0D6QQ达到2〜6之间时,以3000g 离心8分钟,弃上清,用20ml BMGY培养基重新悬浮沉淀的菌体并力5入100% 甲醇O.lml至终浓度0.5%,于30'C继续振荡培养72小时,期间每隔24小时 补加1000/o甲醇0.1ml。
然后,以3000g离心8分钟,保留发酵上清液,弃去沉淀。向上述发酵 上清液中缓慢加入硫酸铵粉末,使硫酸铵饱和度达到80%,由此盐析沉淀出 其中的多肽和蛋白质。然后,以7000g离心盐析液15分钟,弃上清,沉淀用 10mL 20mMpH8.0的Tris-HCl溶解。接着进行2次超滤:首次超滤用截留分 子量为100000Da的超滤膜(购自Millop。re,Ultrapore),保留滤出液;然后 将滤出液用截留分子量为1000Da (购自Millopore,Ultrapore)的超滤膜进 行超滤,弃去滤出液,用10mL20mMpH8.0的Tris-HCl洗條该超滤膜,从而溶出超滤膜截留的多肽。对溶出液进行SDS-PAGE电泳并测定2S0nm处的^及光度。结果显示,相比用pPICZa A转染后获得的空白菌株发酵后的纯化液,本发明hIGF-l的溶出液在电泳图上的9kDa左右的位置上有明显的条带,其量占蛋白质总量的95%以上,即纯化获得的本发明LR3IGF-1的纯度大于95%,通过OD,值得到本发明LR3IGF-1的终产率为0.2〜0.3克/升发酵液。
实施例4
^发明LR?IGF-1促细胞增殖活性的测定
采用常规的MTT法测定本发明的LR3IGF-1 、 Gropep公司的LR3IGF-1和空白对照对细胞的促增殖作用。具体过程如下:用含10。/。胎牛血清的DME1VI培养液将Balb-3T3细胞(可购自美国ATCC,编号为ATCC20864)稀释成1.5"(^个细胞/mL。在96孔培养板上每孔分别接种200jiL上述细l包液,于37'C、 5%032培养24小时。然后,吸去每孔中的培养液,分别加入200juL用含0.4%胎牛血清的DMEM培养液稀释成不同浓度的本发明的LR3IGF-t、Gropep公司的LI^hlGF-l (购自Gropep公司)和空白对照(空白对照为含0.4%胎牛血清的DMEM培养液)液,于37。C、 5%032培养24小时。接着向每孔加入20pL5mg/mL的MTT液,于37。C、 5%(^02继续培养4小时。然后吸去每孑L中的培养液,加入150uL DMSO (购自Sigma公司),37。C放置1小时。由于活细胞可将四唑盐转化成可被DMSO溶解的有色产物,其产量与活细胞数:量成正比,因此用酶联免疫检测仪检测490nm处的吸光度,即可估算活细胞数。结果如表1所示,相对于空白对照,本发明的LR?IGF-1和Gropep公司的LR3IGF-1都能显著促进细胞增殖,而且本发明的LR3IGF-1的活性更优于Gropep公司的LR3IGF-1 。
表1本发明的LR3IGF-1和Gropep公司的LR3IGF-1对细胞的促增殖作用
浓度 OD490
空白对照 / 0.172±0.011
本发明的U^IGF-1 10ng/mL 0.218+0.017
50ng/mL 0.240+0.015
Gropep 公 司 的 LR3IGF-1 10ng/mL 0.200+0.011
50ng/mL 0.233土0.007
实施例5
本发明LR3IGF-1促皮肤创伤愈合作用的测定
按照常规方法制备大鼠烫伤模型,测定本发明LR3IGF-1对大鼠皮肤创伤的促进愈合作用。使Wistar大鼠(购自上海第二军医大学动物中心)吸入乙醚麻醉,剃净大鼠背部,并用脱毛膏脱去毛发。24小时后(即在第1天),用直径为5mm的皮肤活检用环锯在每只大鼠的背部皮肤上制作全厚度(即表皮加真皮厚度)伤口,并测定伤口面积。固定大鼠,分别将含有l)ag/inL本发明
10的LR^GF-1、 Gropep公司的LR3IGF-1或空白对照(空白对照为生理盐水) 的生理盐水50pL滴到大鼠伤口上,待自然干燥后松开大鼠, 一天如此进行两 次并测定伤口面积。结果如表2所示,相对于空白对照,本发明的LI^IGF-1 和Gropep公司的LR3IGF-1都能促进皮肤创伤愈合,减小伤口面积,而且本 发明的LR3IGF-1的活性更优于Gropep公司的LR3IGF-1 。
表2本发明的LR3IGF-1和Gropep公司的LR3IGF-1对皮肤创伤愈合的f足 进作用
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